JPH062050B2 - 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 - Google Patents
構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法Info
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- JPH062050B2 JPH062050B2 JP60292383A JP29238385A JPH062050B2 JP H062050 B2 JPH062050 B2 JP H062050B2 JP 60292383 A JP60292383 A JP 60292383A JP 29238385 A JP29238385 A JP 29238385A JP H062050 B2 JPH062050 B2 JP H062050B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成
する微生物又はプラスミド並びにその製法に関する。
する微生物又はプラスミド並びにその製法に関する。
従来の技術 酵素クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ（EC３．５．
３．３）は、クレアチニン測定のために工業的に使用さ
れている。従つて、これは、特に血清中又は尿中のクレ
アチニン含量が、健康な組織に現れる値 とは異る値で
現われる腎臓疾患の診断のための臨床分析で使用され
る。例えばクレアチンによる誘導下に、後処理に耐える
量でクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼを製造すること
ができる微生物例えばシユードモナス属菌が公知である
が、この酵素の取得可能な収率及び単離の経費は、なお
この酵素の工業的使用のためには制限要因となつてい
る。
３．３）は、クレアチニン測定のために工業的に使用さ
れている。従つて、これは、特に血清中又は尿中のクレ
アチニン含量が、健康な組織に現れる値 とは異る値で
現われる腎臓疾患の診断のための臨床分析で使用され
る。例えばクレアチンによる誘導下に、後処理に耐える
量でクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼを製造すること
ができる微生物例えばシユードモナス属菌が公知である
が、この酵素の取得可能な収率及び単離の経費は、なお
この酵素の工業的使用のためには制限要因となつてい
る。
発明が解決しようとする問題点 従つて、この欠点を有せず、殊に、クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを構成的に形成する即ちこのために誘導を
必要とすることなしに、かつこの際に従来公知のクレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼ形成体よりも著るしく良好
な収率を示す微生物が必要である。更に、本発明の目的
は、遺伝子工学的方法で、良好に培養でき、それから酵
素を経費的に好適に単離することのできる宿主微生物中
に、所定酵素の合成能力に関する遺伝子情報が存在する
ような微生物を製造することである。
ヒドロラーゼを構成的に形成する即ちこのために誘導を
必要とすることなしに、かつこの際に従来公知のクレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼ形成体よりも著るしく良好
な収率を示す微生物が必要である。更に、本発明の目的
は、遺伝子工学的方法で、良好に培養でき、それから酵
素を経費的に好適に単離することのできる宿主微生物中
に、所定酵素の合成能力に関する遺伝子情報が存在する
ような微生物を製造することである。
問題点を解決する手段 本発明によればこの課題は解決される。従つて、本発明
の目的は、構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する特徴を有するＥ・コリー又はシユードモナス・プ
チダに属する微生物である。Ｅ・コリーに属する微生物
に関して、この酵素の誘導性形成も従来は認められてい
なかつた。シユードモナス・プチダにおいては、クレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼの形成に関する情報が存在
するが、この酵素は誘導下にのみ、かつ、かなり低い活
性で形成される。
の目的は、構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する特徴を有するＥ・コリー又はシユードモナス・プ
チダに属する微生物である。Ｅ・コリーに属する微生物
に関して、この酵素の誘導性形成も従来は認められてい
なかつた。シユードモナス・プチダにおいては、クレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼの形成に関する情報が存在
するが、この酵素は誘導下にのみ、かつ、かなり低い活
性で形成される。
本発明によるＥ・コリーに属する有利な微生物は、プラ
スミドpBT２ａ−１を有する。この種の微生物は、蛋白
質のその全合成能力の５０％までをクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼの形成のために調達することができる。
スミドpBT２ａ−１を有する。この種の微生物は、蛋白
質のその全合成能力の５０％までをクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼの形成のために調達することができる。
本発明によるもう１つの有利な微生物は、プラスミドpB
T３０６．１６を有するＥ・コリー又はシユードモナス
・プチダに属する微生物である。この種の微生物は、同
様に非常に高い合成能力を有する構成性クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ形成体である。
T３０６．１６を有するＥ・コリー又はシユードモナス
・プチダに属する微生物である。この種の微生物は、同
様に非常に高い合成能力を有する構成性クレアチンアミ
ジノヒドロラーゼ形成体である。
本発明のもう１つの目的は、プラスミドpBT２ａ−１（D
SM３１４８Ｐ）及びpBT306.16（DSM３１４９Ｐ）であ
る。最初に記載のプラスミドは特に高い合成能力をＥ・
コリー属の微生物に与え、第２番目に記載のプラスミド
は、Ｅ・コリー内でもシユードモナス・プチダ内でも所
望酵素の高い表現を与える利点を有する。
SM３１４８Ｐ）及びpBT306.16（DSM３１４９Ｐ）であ
る。最初に記載のプラスミドは特に高い合成能力をＥ・
コリー属の微生物に与え、第２番目に記載のプラスミド
は、Ｅ・コリー内でもシユードモナス・プチダ内でも所
望酵素の高い表現を与える利点を有する。
前記のように、本発明による微生物もしくはプラスミド
は、遺伝子工学的方法で得ることができる。従つて、本
発明による構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する前記種属の微生物の製法は、シユードモナス・プ
チダからのDNAを ａ）Eco RＩで制限的に消化させて5.8Kb-フラグメント
を得るか又は ｂ）Eco RＩ及びPvuIIで切断して2.2Kb-フラグメントを
得、 ａ）又はｂ）で得たフラグメントをその又は同じ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断されたベクターにクローン化
し、これを選択したベクターにとつて好適なＥ・コリー
又はＰ・プチダ株中に移し、構成性クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを形成するクローンを単離することよりな
る。ここでKbは、「キロ塩基対」即ち１０００ヌクレオ
チド塩基対である。
は、遺伝子工学的方法で得ることができる。従つて、本
発明による構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形
成する前記種属の微生物の製法は、シユードモナス・プ
チダからのDNAを ａ）Eco RＩで制限的に消化させて5.8Kb-フラグメント
を得るか又は ｂ）Eco RＩ及びPvuIIで切断して2.2Kb-フラグメントを
得、 ａ）又はｂ）で得たフラグメントをその又は同じ制限エ
ンドヌクレアーゼで切断されたベクターにクローン化
し、これを選択したベクターにとつて好適なＥ・コリー
又はＰ・プチダ株中に移し、構成性クレアチンアミジノ
ヒドロラーゼを形成するクローンを単離することよりな
る。ここでKbは、「キロ塩基対」即ち１０００ヌクレオ
チド塩基対である。
クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現のための情報
は、5.8Kb-フラグメントもしくはその2.2Kbのサブフラ
グメント（これは前記方法で、制限エンドヌクレアーゼ
Eco RＩ単独で又はPvu IIと一緒になつたEco RＩで切
り出される）上に存在する。それぞれのフラグメント
は、遺伝子工学に公知の方法により、適合末端を得るた
めに同じ制限エンドヌクレアーゼで切断されたベクター
にクローン化される。有利でない場合にも、Ｅ・コリー
はシユードモナス・プチダに好適なベクターを、その切
断位置でシユードモナス・プチダからの１個又は前記の
DNA-フラグメントで補修されたベクターの修復能力及び
その形質転換性が宿主菌株内で保持されるように配置さ
れている他の制限エンドヌクレアーゼで切断することも
できる。ベクターとして、有利にプラスミドpBR３２２
を使用し、これは双方のシユードモナス・プチダDNAフ
ラグメントの１個のＥ・コリー株内への挿入により形質
転換する。当業にとつて、プラスミドpBR３２２及びそ
の誘導体で非常に良好に形質転換できる多くのＥ・コリ
ー株は公知である。他の有利なベクター（フアージ・シ
ヤロン（Phage charon）１０．pBR３２２並びにその誘
導体は同様である）はベクター市場で入手される。
は、5.8Kb-フラグメントもしくはその2.2Kbのサブフラ
グメント（これは前記方法で、制限エンドヌクレアーゼ
Eco RＩ単独で又はPvu IIと一緒になつたEco RＩで切
り出される）上に存在する。それぞれのフラグメント
は、遺伝子工学に公知の方法により、適合末端を得るた
めに同じ制限エンドヌクレアーゼで切断されたベクター
にクローン化される。有利でない場合にも、Ｅ・コリー
はシユードモナス・プチダに好適なベクターを、その切
断位置でシユードモナス・プチダからの１個又は前記の
DNA-フラグメントで補修されたベクターの修復能力及び
その形質転換性が宿主菌株内で保持されるように配置さ
れている他の制限エンドヌクレアーゼで切断することも
できる。ベクターとして、有利にプラスミドpBR３２２
を使用し、これは双方のシユードモナス・プチダDNAフ
ラグメントの１個のＥ・コリー株内への挿入により形質
転換する。当業にとつて、プラスミドpBR３２２及びそ
の誘導体で非常に良好に形質転換できる多くのＥ・コリ
ー株は公知である。他の有利なベクター（フアージ・シ
ヤロン（Phage charon）１０．pBR３２２並びにその誘
導体は同様である）はベクター市場で入手される。
pBR３２２をEco RＩ及びPvu IIで切断し、この際に生
じる2.3 kb-フラグメントを単離し、Ｐ・プチダからの
2.2 Kb Eco R I-Pvu IIフラグメントと連結させpBT３−
２と称される新規プラスミドを形成させ、これをＥ・コ
リー中に移す方法がより有利である。こうしてＥ・コリ
ーＫ１２ED８６５４（DSM３１４４）が得られる。
じる2.3 kb-フラグメントを単離し、Ｐ・プチダからの
2.2 Kb Eco R I-Pvu IIフラグメントと連結させpBT３−
２と称される新規プラスミドを形成させ、これをＥ・コ
リー中に移す方法がより有利である。こうしてＥ・コリ
ーＫ１２ED８６５４（DSM３１４４）が得られる。
前記方法でpBR３２２からの誘導体で形質転換されたＥ
・コリー株は、そのアンピシリン耐性に基づき、非常に
良好に選択できる。これらはアンピシリン耐性であり、
かつクレアチンアミジノヒドロラーゼ形成体であるの
で、形質転換されなかつた細胞は生長させることはでき
ず、生長した細胞の下で、所望の酵素を形成するものは
後に詳述する方法で容易に取り出すことができる。
・コリー株は、そのアンピシリン耐性に基づき、非常に
良好に選択できる。これらはアンピシリン耐性であり、
かつクレアチンアミジノヒドロラーゼ形成体であるの
で、形質転換されなかつた細胞は生長させることはでき
ず、生長した細胞の下で、所望の酵素を形成するものは
後に詳述する方法で容易に取り出すことができる。
本発明により、pBT３−２を有する形質転換されたＥ・
コリー細胞をプラスミドの増幅の時点にニトロソグアニ
ジンで処理し、その後、このプラスミドをこれから単離
し、改めてＥ・コリー細胞中に移し、このサイクルを場
合により繰り返し、この際に得られる特に優れたクレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼ活性を有する微生物クロー
ンから、同様に本発明の目的物であるプラスミドpBT２
ａ−１（DSM３１４８Ｐ）を得る際に、特に良好な結果
が得られる。前記のように、プラスミドを有するＥ・コ
リー細胞は、全蛋白質形成に対して５０％までのクレア
チンアミジノヒドロラーゼを生産する。
コリー細胞をプラスミドの増幅の時点にニトロソグアニ
ジンで処理し、その後、このプラスミドをこれから単離
し、改めてＥ・コリー細胞中に移し、このサイクルを場
合により繰り返し、この際に得られる特に優れたクレア
チンアミジノ−ヒドロラーゼ活性を有する微生物クロー
ンから、同様に本発明の目的物であるプラスミドpBT２
ａ−１（DSM３１４８Ｐ）を得る際に、特に良好な結果
が得られる。前記のように、プラスミドを有するＥ・コ
リー細胞は、全蛋白質形成に対して５０％までのクレア
チンアミジノヒドロラーゼを生産する。
クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの特に高い活性を有
する生じた微生物クローンを同定することのできるスク
リーニング系が得られ、この際、この種のクローンを、
クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びＨ2Ｏ2−呈色指示薬を溶解含有するアガロースプ
レートと接触させる。次いで、強い酵素形成に相応する
最も強い呈色を示すクローンを増殖のために選択する。
Ｈ2Ｏ2−呈色指示薬系としては４−アムノアンチピリン
をＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メチルアニ
リン塩有利にカリウム塩と組合せて使用するのが有利で
ある。
する生じた微生物クローンを同定することのできるスク
リーニング系が得られ、この際、この種のクローンを、
クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びＨ2Ｏ2−呈色指示薬を溶解含有するアガロースプ
レートと接触させる。次いで、強い酵素形成に相応する
最も強い呈色を示すクローンを増殖のために選択する。
Ｈ2Ｏ2−呈色指示薬系としては４−アムノアンチピリン
をＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メチルアニ
リン塩有利にカリウム塩と組合せて使用するのが有利で
ある。
本発明の方法では、Ｅ・コリー中での酵素の表現だけで
なく、Ｐ・プチダ中でも好適であるプラスミドも製造で
きる。このために、pBT２ａ−１から制限エンドヌクレ
アーゼPvu I及びPvu IIを用いる切断により2.8Kb−フラ
グメントを得、これを、他の、pBT306.1からPvu I及びS
ma Iを用いる切断により得られる１０Kb−フラグメント
と結紮するのが有利である。こうして、プラスミドpBT
306.16（DSM３１４９Ｐ）が得られ、これは、Ｅ・コリ
ー中でもＰ・プチダ中でも構成性クレアチンアミジノ−
ヒドロラーゼ形成作用をする。
なく、Ｐ・プチダ中でも好適であるプラスミドも製造で
きる。このために、pBT２ａ−１から制限エンドヌクレ
アーゼPvu I及びPvu IIを用いる切断により2.8Kb−フラ
グメントを得、これを、他の、pBT306.1からPvu I及びS
ma Iを用いる切断により得られる１０Kb−フラグメント
と結紮するのが有利である。こうして、プラスミドpBT
306.16（DSM３１４９Ｐ）が得られ、これは、Ｅ・コリ
ー中でもＰ・プチダ中でも構成性クレアチンアミジノ−
ヒドロラーゼ形成作用をする。
本発明により、酵素形成の著るしい増加が達成されるこ
とは意想外である。即ち、特定遺伝子のコピー数を高め
ることによるDNA組換え法を使用することにより高めら
れた遺伝子表現が得られることは既に多く報告された。
しかしながら、これから、シユードモナスからの遺伝子
をＥ・コリー中に移すことにより確実に遺伝子表現を高
めることに由来することはできない。実際に、DNA−組
換えによりシユードモナスからＥ・コリー中に移された
遺伝子の多くに関して、遺伝子表現の減少すら報告され
ている〔例えばスタシツシユ（Stanisisch）及びオルテ
イツ（Ortiz）による。ジヤーナル・オブ・ジエネラル
・マイクロビオロジイ（J.Gen.Microbiol.）１９７６、
９４、２８１〜289、ナカザワ（Nakazawa）等による
Ｊ．バクテリオロジイ（J.Bacteriol.）１９７８．１３
４、２７０〜２７７、リボン（Ribbons）等によるソク
・ゲン・マイクロビオロ，（Soc.Gen.Microbiol., Quar
t.）１９７８、６、２４〜２５、フランクリン（Frankl
in）等によるマイクロビオール・デグラデーション・オ
ブ・キセノビオテイクス・アンド・レカリシトラント・
コンパウンズ（Microbiol Degradation of Xenobiotics
and Recalicitrant Compounds.Leisinger Cook,Hu"tte
r und Neuesch Hrsgb.） １９８１、１０９〜１３０頁参照〕。最終的に酵素活性
蛋白質を形成するまで進行すべき種々の生物学的合成工
程を考察すると、この種の改良は予期できなかったこと
が判る。
とは意想外である。即ち、特定遺伝子のコピー数を高め
ることによるDNA組換え法を使用することにより高めら
れた遺伝子表現が得られることは既に多く報告された。
しかしながら、これから、シユードモナスからの遺伝子
をＥ・コリー中に移すことにより確実に遺伝子表現を高
めることに由来することはできない。実際に、DNA−組
換えによりシユードモナスからＥ・コリー中に移された
遺伝子の多くに関して、遺伝子表現の減少すら報告され
ている〔例えばスタシツシユ（Stanisisch）及びオルテ
イツ（Ortiz）による。ジヤーナル・オブ・ジエネラル
・マイクロビオロジイ（J.Gen.Microbiol.）１９７６、
９４、２８１〜289、ナカザワ（Nakazawa）等による
Ｊ．バクテリオロジイ（J.Bacteriol.）１９７８．１３
４、２７０〜２７７、リボン（Ribbons）等によるソク
・ゲン・マイクロビオロ，（Soc.Gen.Microbiol., Quar
t.）１９７８、６、２４〜２５、フランクリン（Frankl
in）等によるマイクロビオール・デグラデーション・オ
ブ・キセノビオテイクス・アンド・レカリシトラント・
コンパウンズ（Microbiol Degradation of Xenobiotics
and Recalicitrant Compounds.Leisinger Cook,Hu"tte
r und Neuesch Hrsgb.） １９８１、１０９〜１３０頁参照〕。最終的に酵素活性
蛋白質を形成するまで進行すべき種々の生物学的合成工
程を考察すると、この種の改良は予期できなかったこと
が判る。
蛋白質に関する情報は、デソキシリボ核酸(DNA)内に含
有されている。このDNAは、DNA−依存RNA−ポリメラー
ゼによりmRNA（メツセンジヤ−RNA）に翻訳される。こ
のように合成されたmRNAは蛋白質内のリボソームの所で
翻訳され、この際、それぞれ３個の核酸（トリプレツト
又はコドン）は、遺伝子コドンの法則に従つて特定のア
ミノ酸の形成を決定する。
有されている。このDNAは、DNA−依存RNA−ポリメラー
ゼによりmRNA（メツセンジヤ−RNA）に翻訳される。こ
のように合成されたmRNAは蛋白質内のリボソームの所で
翻訳され、この際、それぞれ３個の核酸（トリプレツト
又はコドン）は、遺伝子コドンの法則に従つて特定のア
ミノ酸の形成を決定する。
DNA−平面上の制御範囲は、どの位置でDNAの１本の鎖が
mRNAに翻訳されるか（プロモーター配列）もしくはどの
位置でmRNAの合成が停止されるか（末端配列）を決め
る。
mRNAに翻訳されるか（プロモーター配列）もしくはどの
位置でmRNAの合成が停止されるか（末端配列）を決め
る。
同様に蛋白質合成（翻訳）の平面上の停止及び開始配列
は、公知である。この際、一般に、ATG（これはｆ−メ
チオニンに翻訳される）は、蛋白質の開始を、かつ例え
ばTAA又はTAGは翻訳の終りを決定する。
は、公知である。この際、一般に、ATG（これはｆ−メ
チオニンに翻訳される）は、蛋白質の開始を、かつ例え
ばTAA又はTAGは翻訳の終りを決定する。
ポリペプチド配列の表現の程度は、多くのフアクターに
依存し、例えば特にプロモーター配列の品質、mRNA−安
定性、mRNAの２次及び３次構造、リボソーム結合位置の
品質、開始コドン(ATG)からのリボソーム結合位置の距
離、リボソーム結合位置と開始コドン(ATG)との間のヌ
クレオチド配列及び転写及び翻訳面に対する有効停止信
号の存在に依存する。遺伝子及びこれによりコードされ
た蛋白質の１次構造の正確な知識なしに、前記の遺伝子
表現の調節工程を把握することはできない。本発明以前
この正確な知識は存在しなかつたので、本発明による微
生物及びプラスミドの改良された合成能力は予期できな
かつた。
依存し、例えば特にプロモーター配列の品質、mRNA−安
定性、mRNAの２次及び３次構造、リボソーム結合位置の
品質、開始コドン(ATG)からのリボソーム結合位置の距
離、リボソーム結合位置と開始コドン(ATG)との間のヌ
クレオチド配列及び転写及び翻訳面に対する有効停止信
号の存在に依存する。遺伝子及びこれによりコードされ
た蛋白質の１次構造の正確な知識なしに、前記の遺伝子
表現の調節工程を把握することはできない。本発明以前
この正確な知識は存在しなかつたので、本発明による微
生物及びプラスミドの改良された合成能力は予期できな
かつた。
本発明の範囲では、Ｅ・コリーとして、Ｅ・コリーＫ１
２−株の有利な誘導体を使用する。そのうち、特に、例
えば次のものが有効に使用された： Ｅ・コリーＫ１２、Ｗ３３５０〔Ｐ・チオライス（Thio
llais）のthi、galk. galT、rpsl、〕（DSM３１４１） Ｅ・コリーＫ１２、ED８６５４〔Ｋ・ムレイ（Murray）
のtrp R、hsd M+、hsd R-、sup E、sup F〕（DSM２１０
２） Ｅ・コリーＫ１２、CSH〔コールド・スプリン グ・ハーバースタムザンムルング（Cold Sprin
g Harbor Stammsammlung）からのthi、trp、lac Z、rps
l〕（DSM３１４２） シユードモナス・プチダ株の宿主細胞として、野生型単
離物も実験室株も使用できる。シユードモナス・プチダ
２４４０（DSM２１０６）〔ゲン（Gen）１９８１、２３
７〜２４７参照〕を用いて特に良好な結果が得られた。
２−株の有利な誘導体を使用する。そのうち、特に、例
えば次のものが有効に使用された： Ｅ・コリーＫ１２、Ｗ３３５０〔Ｐ・チオライス（Thio
llais）のthi、galk. galT、rpsl、〕（DSM３１４１） Ｅ・コリーＫ１２、ED８６５４〔Ｋ・ムレイ（Murray）
のtrp R、hsd M+、hsd R-、sup E、sup F〕（DSM２１０
２） Ｅ・コリーＫ１２、CSH〔コールド・スプリン グ・ハーバースタムザンムルング（Cold Sprin
g Harbor Stammsammlung）からのthi、trp、lac Z、rps
l〕（DSM３１４２） シユードモナス・プチダ株の宿主細胞として、野生型単
離物も実験室株も使用できる。シユードモナス・プチダ
２４４０（DSM２１０６）〔ゲン（Gen）１９８１、２３
７〜２４７参照〕を用いて特に良好な結果が得られた。
Ｅ・コリー中での表現のためのベクター系として、本発
明によれば、前記のように、有利に市販のプラスミドpB
R３２２の遺伝学的に操作された誘導体〔ゲン（Gene）
１９７７、９５〜１１３参照〕を使用するのが有利であ
る、シユードモナス株中の表現のために、プラスミドpR
S F １０１０の遺伝学的に変換された誘導体〔ゲン（G
ene）、１９８１、２３７〜２４７参照〕を使用するの
が有利である。本発明の遺伝学的に変換されたプラスミ
ドの形成のための前記の制限エンドヌクレアーゼの使用
の際に、クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする
遺伝子フラグメントが得られ、これは、表現−ベクター
系及び宿主細胞中のベクター系の増加されたコピー数に
作用する調節源並びにその生成物を容易に選択すること
のできる（例えば抗生物質耐性）遺伝子を有する。
明によれば、前記のように、有利に市販のプラスミドpB
R３２２の遺伝学的に操作された誘導体〔ゲン（Gene）
１９７７、９５〜１１３参照〕を使用するのが有利であ
る、シユードモナス株中の表現のために、プラスミドpR
S F １０１０の遺伝学的に変換された誘導体〔ゲン（G
ene）、１９８１、２３７〜２４７参照〕を使用するの
が有利である。本発明の遺伝学的に変換されたプラスミ
ドの形成のための前記の制限エンドヌクレアーゼの使用
の際に、クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする
遺伝子フラグメントが得られ、これは、表現−ベクター
系及び宿主細胞中のベクター系の増加されたコピー数に
作用する調節源並びにその生成物を容易に選択すること
のできる（例えば抗生物質耐性）遺伝子を有する。
次に本発明を添付図面及び実施例につき詳述する。
第１図は、シユードモナス・プチダDNAからの2.2Kb−フ
ラグメント及びプラスミドpBR３２２を出発物質として
用いたプラスミドpBT３−２の製造経過を略示した図で
あり、第２図は、プラスミドRSF１０１０及びpACYC１７
７からの本発明によるプラスミドpBT３０６．１の製造
工程を示す図であり、第３図は、pBT306.1及びpBT２ａ
−１からの本発明によるプラスミドpBT３０６．１６の
形成工程を示す図であり、第４図は第１片：出発株シユ
ードモナス・プチダ、第２片：プラスミドpBT２ａ−１
を有する。Ｅ・コリー野生株ED、第４片：宿主株ED及び
第３片：比較用精製クレアチナーゼ１５μgの細胞エキ
スを付与したSDSゲルを示す図である。
ラグメント及びプラスミドpBR３２２を出発物質として
用いたプラスミドpBT３−２の製造経過を略示した図で
あり、第２図は、プラスミドRSF１０１０及びpACYC１７
７からの本発明によるプラスミドpBT３０６．１の製造
工程を示す図であり、第３図は、pBT306.1及びpBT２ａ
−１からの本発明によるプラスミドpBT３０６．１６の
形成工程を示す図であり、第４図は第１片：出発株シユ
ードモナス・プチダ、第２片：プラスミドpBT２ａ−１
を有する。Ｅ・コリー野生株ED、第４片：宿主株ED及び
第３片：比較用精製クレアチナーゼ１５μgの細胞エキ
スを付与したSDSゲルを示す図である。
次表は酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードす
るDNA配列及びこのDNA配列から生じる蛋白質配列を示し
ている。
るDNA配列及びこのDNA配列から生じる蛋白質配列を示し
ている。
陽性クローン即ち、構成性クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼを形成する微生物クローンを見つけるために、本発
明によれば、酵素免疫テストの原理により操作するスク
リーニング系を使用することができる。この際、クレア
チンアミジノヒドロラーゼに対する特異抗体を適当な担
体例えばポリビニル−シートに固定させ、このシートを
溶解されたコロニイ及びプラーク上にのせる。H2Oで洗
浄の後に、このシートを酵素接合物（例えばペルオキシ
ダーゼとの）の形の同じ特異抗体と共にインキユベート
する。この酵素を生産しうるクローンを存在させると、
抗体−抗原及び酵素標識された抗体からのサンドイツチ
が生じる。
ーゼを形成する微生物クローンを見つけるために、本発
明によれば、酵素免疫テストの原理により操作するスク
リーニング系を使用することができる。この際、クレア
チンアミジノヒドロラーゼに対する特異抗体を適当な担
体例えばポリビニル−シートに固定させ、このシートを
溶解されたコロニイ及びプラーク上にのせる。H2Oで洗
浄の後に、このシートを酵素接合物（例えばペルオキシ
ダーゼとの）の形の同じ特異抗体と共にインキユベート
する。この酵素を生産しうるクローンを存在させると、
抗体−抗原及び酵素標識された抗体からのサンドイツチ
が生じる。
抗体−ペルオキシダーゼ−接合物は適当な呈色指示薬系
で呈色し、例えばゼラチン中のテトラメチルベンジジ
ン、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート及びH2O2
からの指示薬系において、緑色斑点を示す。この系は、
蛋白質抗原１０pg〜１００pgの検出限界を示す。この種
の酵素免疫テストの製造及び適当な抗体の調整は、ベー
リンガー・マンハイム社(Boehringer Mannheim GmbH)の
テストコンビナチオン・ゲンエクスプレツシヨン（Test
kombination Genexpression）に関する指示により実施
することができる。
で呈色し、例えばゼラチン中のテトラメチルベンジジ
ン、ジオクチルナトリウムスルホスクシネート及びH2O2
からの指示薬系において、緑色斑点を示す。この系は、
蛋白質抗原１０pg〜１００pgの検出限界を示す。この種
の酵素免疫テストの製造及び適当な抗体の調整は、ベー
リンガー・マンハイム社(Boehringer Mannheim GmbH)の
テストコンビナチオン・ゲンエクスプレツシヨン（Test
kombination Genexpression）に関する指示により実施
することができる。
実施例 次に実施例につき本発明を詳述する。
例 １ Ａ）染色体 シユードモナス・プチダ（DSM２１０６）の染色体DNA
を、細胞の溶解及びガラス棒上へのDNAの巻き付け（Auf
wiCkeln）により単離し、２回のフエノール処理(phenol
isierung)及びエタノール沈澱の後に、６００μg/mlの
濃度で溶解させる〔コスロイ(Cosloy)及びオーイシ（Oi
shi）によるモレク．ゲン．ゲネト（Molec.Gen.Gene
t.）１９７３、１２４、１〜１０頁参照〕。
を、細胞の溶解及びガラス棒上へのDNAの巻き付け（Auf
wiCkeln）により単離し、２回のフエノール処理(phenol
isierung)及びエタノール沈澱の後に、６００μg/mlの
濃度で溶解させる〔コスロイ(Cosloy)及びオーイシ（Oi
shi）によるモレク．ゲン．ゲネト（Molec.Gen.Gene
t.）１９７３、１２４、１〜１０頁参照〕。
染色体DNA１０μgをEcoRI（E.C.３．１．２３．１）５
単位で制限的に、３０分間分解させ、アガロースゲル中
で消化の程度を分析する。
単位で制限的に、３０分間分解させ、アガロースゲル中
で消化の程度を分析する。
Ｂ）λシヤロン（Charon）１０DNAの単離及び精製株Ｅ
・コリーＥＤ（DSM２１０２）の細菌１０10をλフアー
ジシヤロン１０ ５×１０8と共に３７℃で２０分間イ
ンキユベートし、引続き、このバクテリアの溶解が開始
するまで完全培地５００ml中で生長させる。フアージー
及びDNA−単離の工程は、正確には、マニアチス（Mania
tis）等による文献モレキユラー・クローニング（Molec
ular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory）１９８
２、７６〜８５頁の処方に従がい行なつた。
・コリーＥＤ（DSM２１０２）の細菌１０10をλフアー
ジシヤロン１０ ５×１０8と共に３７℃で２０分間イ
ンキユベートし、引続き、このバクテリアの溶解が開始
するまで完全培地５００ml中で生長させる。フアージー
及びDNA−単離の工程は、正確には、マニアチス（Mania
tis）等による文献モレキユラー・クローニング（Molec
ular Cloning;Cold Spring Harbor Laboratory）１９８
２、７６〜８５頁の処方に従がい行なつた。
シヤロン１０DNA１０μgを完全にEco RIで切断する。A)
によるEco R Iで制限的に消化された染色体シユードモ
ナス・プチダDNA１μgをEco RＩで切断されたシヤロン
１０ＤＮＡ ３μgと酵素Ｔ4DNAリガーゼの４０単位と
共にインキユベートする。このフアージλの頭部−及び
尾部蛋白質で連結されたDNA−フラグメントの包装（Ver
packen）を試験管内で行なう。包装に必要な蛋白質の製
造並びにDNAの包装は、マニアチス(Maniatis)等による
モレキユラー・クローニング（Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory）１９８２、２５６〜２９
１に記載の方法で行なう（λDNA粒子に関する試験管内
包装系は、市場で例えばベーリンガー・マンハイムのDN
A−パツケージング・キツト（DNA-packaging Kit）であ
る）。連結されたλ及びシユードモナス・プチダDNA約
0.5ｇを、試験官内包装バツチ２０μlと共にインキユベ
ートし、６０分後に、SM緩衝液０．５ml（マニアチスに
よるモレキユラー・クローニング１９８２、４４３）を
添加し、この包装バツチの1/200量（2.5μl）を、株Ｅ
Ｄ昼夜培養物（１０-2M硫酸マグネシウム中）２００μl
と共に３７℃で１０分間インキユベートする。この細菌
懸濁液を引続きＬＢ〔ミラー（Miller）のエクスペリメ
ンツ・イン・モレキユラー・ゲネテイクス（Experiment
s in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Loborat
ory）１９７２、４３３参照〕アガロース（0.8％）３ml
と混合し、ＬＢプレート上に注ぐ。使用DNA１μg当り、
フアージプラーク（プラーク）約１０5が得られる。
によるEco R Iで制限的に消化された染色体シユードモ
ナス・プチダDNA１μgをEco RＩで切断されたシヤロン
１０ＤＮＡ ３μgと酵素Ｔ4DNAリガーゼの４０単位と
共にインキユベートする。このフアージλの頭部−及び
尾部蛋白質で連結されたDNA−フラグメントの包装（Ver
packen）を試験管内で行なう。包装に必要な蛋白質の製
造並びにDNAの包装は、マニアチス(Maniatis)等による
モレキユラー・クローニング（Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory）１９８２、２５６〜２９
１に記載の方法で行なう（λDNA粒子に関する試験管内
包装系は、市場で例えばベーリンガー・マンハイムのDN
A−パツケージング・キツト（DNA-packaging Kit）であ
る）。連結されたλ及びシユードモナス・プチダDNA約
0.5ｇを、試験官内包装バツチ２０μlと共にインキユベ
ートし、６０分後に、SM緩衝液０．５ml（マニアチスに
よるモレキユラー・クローニング１９８２、４４３）を
添加し、この包装バツチの1/200量（2.5μl）を、株Ｅ
Ｄ昼夜培養物（１０-2M硫酸マグネシウム中）２００μl
と共に３７℃で１０分間インキユベートする。この細菌
懸濁液を引続きＬＢ〔ミラー（Miller）のエクスペリメ
ンツ・イン・モレキユラー・ゲネテイクス（Experiment
s in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Loborat
ory）１９７２、４３３参照〕アガロース（0.8％）３ml
と混合し、ＬＢプレート上に注ぐ。使用DNA１μg当り、
フアージプラーク（プラーク）約１０5が得られる。
クレアチナーゼをコードする遺伝子を有するフアージの
同定のために、先に記載の酵素−免疫テストを使用す
る。この指示薬系は、６％ゼラチン中のテトラメチルベ
ンジジン６mg/ml、ジオクチルナトリウムスルホサクシ
ネート２０mg/ml及びH2O20.01％より成る。１０００プ
ラーク当り２個の陽性信号が測定される。
同定のために、先に記載の酵素−免疫テストを使用す
る。この指示薬系は、６％ゼラチン中のテトラメチルベ
ンジジン６mg/ml、ジオクチルナトリウムスルホサクシ
ネート２０mg/ml及びH2O20.01％より成る。１０００プ
ラーク当り２個の陽性信号が測定される。
c)Ｅ・コリー中のクレアチナーゼ−遺伝子の再クローニ
ング酵素免疫テストで陽性のプラーク５個から前記のよ
うにして、フアージ−DNAを調製した。
ング酵素免疫テストで陽性のプラーク５個から前記のよ
うにして、フアージ−DNAを調製した。
Eco RＩを用いる５個の種々のDNAの切断は、種々異なる
バンド（Band）と並んで5.8Kbのすべての５個のフアー
ジDNAにおける共通のDNA−バンドが示された。この5.8K
bの大きさのフラグメントは種々の制限ヌクレアーゼで
特性付けられた（第１図参照）。
バンド（Band）と並んで5.8Kbのすべての５個のフアー
ジDNAにおける共通のDNA−バンドが示された。この5.8K
bの大きさのフラグメントは種々の制限ヌクレアーゼで
特性付けられた（第１図参照）。
このEco RＩフラグメント約５μgからPvu IIの使用下に
2.2Kbフラグメントを切断した。生じるDNAフラグメント
は、低融点アガロースゲル中でその大きさに応じて分離
され、2.2Kb Eco RI-Pvu IIフラグメントが単離され
る。低融点アガロースゲルからのDNA-フラグメントの単
離は、相応するバンドを切出し、試験官（エツペンドル
フ管）内に移し、約２倍量の水を加えることにより行な
う。引続き、６５℃で、アガロースが融解するまで（５
〜１０分）インキユベートし、試料を短時間振動し、半
量のフエノール（１０mM TRIS-HCl、pH及び１mM EDTA、
TEで中和）と共に激しく振動する。この相を15000ｇで
１０分間遠心することにより分離させ、上の水相を改め
てフエノールで振出する。
2.2Kbフラグメントを切断した。生じるDNAフラグメント
は、低融点アガロースゲル中でその大きさに応じて分離
され、2.2Kb Eco RI-Pvu IIフラグメントが単離され
る。低融点アガロースゲルからのDNA-フラグメントの単
離は、相応するバンドを切出し、試験官（エツペンドル
フ管）内に移し、約２倍量の水を加えることにより行な
う。引続き、６５℃で、アガロースが融解するまで（５
〜１０分）インキユベートし、試料を短時間振動し、半
量のフエノール（１０mM TRIS-HCl、pH及び１mM EDTA、
TEで中和）と共に激しく振動する。この相を15000ｇで
１０分間遠心することにより分離させ、上の水相を改め
てフエノールで振出する。
１５０００ｇで１０分間の遠心の後に、上相をエーテル
各１mlで２回振出し、エーテルを６５℃で蒸発させ、DN
Aを３M酢酸ナトリウム（pH7.2）1/10量及びエタノール
2.5倍量て−２０℃で沈澱させる。DNAを１５０００ｇで
１０分間の遠心により沈澱させ、真空中で乾燥させ、Ｔ
Ｅ１０μl中に入れる。他のすべてのフラグメント単離
はこの工程で行なう。
各１mlで２回振出し、エーテルを６５℃で蒸発させ、DN
Aを３M酢酸ナトリウム（pH7.2）1/10量及びエタノール
2.5倍量て−２０℃で沈澱させる。DNAを１５０００ｇで
１０分間の遠心により沈澱させ、真空中で乾燥させ、Ｔ
Ｅ１０μl中に入れる。他のすべてのフラグメント単離
はこの工程で行なう。
pBR３２２ DNA約４μgをEcoR I及びPvu IIで切断し、
2.3Kbフラグメントを単離させる。このpBR３２２フラグ
メント0.2μgをＴ４DNAリガーゼ５単位の使用下に、前
記λフアージからの2.2Kb EcoＲ Ｉ−PvuIIフラグメン
ト0.5μgと共にインキユベートする。生じるプラスミド
はpBT３−２なる名称を有し、Ｅ．コリー中で生物学的
活性のクレアチナーゼをコードする。
2.3Kbフラグメントを単離させる。このpBR３２２フラグ
メント0.2μgをＴ４DNAリガーゼ５単位の使用下に、前
記λフアージからの2.2Kb EcoＲ Ｉ−PvuIIフラグメン
ト0.5μgと共にインキユベートする。生じるプラスミド
はpBT３−２なる名称を有し、Ｅ．コリー中で生物学的
活性のクレアチナーゼをコードする。
例 ２ プラスミドpBT３−２からのクレアチナーゼをコードす
るDNAを、タルマジエ（Talmadge）及びギルバート（Gil
bert）の方法〔ゲン（Gene）１９８０、１２、２３５〜
２４１参照〕で、増幅相の間にニトロソグアニジンで処
理する。引続き、プラスミド−DNAを細胞の溶解の後にC
sCl−エチジウムブロミド法で単離する〔マニアチス等
によるモレキユラー・クローニング（Molecular Cronin
ga;Cold Spring Harbor）１９８２、８８−９４参
照〕。株Ｅ．コリーＥＤ８６５４の好適な細胞をプラス
ミドDNAで形質転換し（マニアチス等によるモレキユラ
ー・クローニング、１９８２、２５０〜２５１参照）、
アンピシリン２０μg/mlを含有する完全培地プレート
（LB）上に塗抹する。３７℃で１夜インキユベートの
後、コロニーを、予めニトロセルロース瀘紙〔シユライ
ヒア（Schleicher）、シユル（Schll）ＢＡ８５〕が
載せられているＬＢプレート上で熱処理する。このプレ
ートを３７℃で１２〜１８時間培養の後、ニトロセルロ
ース瀘紙をコロニーと共に取り出し、クロロホルム／ト
ルオール(1:1)１mlが加えられたガラスペトリシヤーレ
（φ20cm）中に移す。３７℃で２０分間インキユベート
する。引続き、ニトロセルロース瀘紙を指示薬−アガロ
ースプレート上に、細胞と指示薬プレートとの間に直接
接触が生じるように置く。呈色反応は時間と個々のクロ
ーン中で合成されたクレアチナーゼの量との関係で得ら
れる。前記活性スクリーニングから、プラスミドpBT２
ａ−１（DSM３１４３）を有するクローンＥＤが単離さ
れる。このプラスミドは、細胞の可溶性蛋白質の約５０
％を構成するクレアチナーゼをコードする。この方法は
第１図に図示されている。
るDNAを、タルマジエ（Talmadge）及びギルバート（Gil
bert）の方法〔ゲン（Gene）１９８０、１２、２３５〜
２４１参照〕で、増幅相の間にニトロソグアニジンで処
理する。引続き、プラスミド−DNAを細胞の溶解の後にC
sCl−エチジウムブロミド法で単離する〔マニアチス等
によるモレキユラー・クローニング（Molecular Cronin
ga;Cold Spring Harbor）１９８２、８８−９４参
照〕。株Ｅ．コリーＥＤ８６５４の好適な細胞をプラス
ミドDNAで形質転換し（マニアチス等によるモレキユラ
ー・クローニング、１９８２、２５０〜２５１参照）、
アンピシリン２０μg/mlを含有する完全培地プレート
（LB）上に塗抹する。３７℃で１夜インキユベートの
後、コロニーを、予めニトロセルロース瀘紙〔シユライ
ヒア（Schleicher）、シユル（Schll）ＢＡ８５〕が
載せられているＬＢプレート上で熱処理する。このプレ
ートを３７℃で１２〜１８時間培養の後、ニトロセルロ
ース瀘紙をコロニーと共に取り出し、クロロホルム／ト
ルオール(1:1)１mlが加えられたガラスペトリシヤーレ
（φ20cm）中に移す。３７℃で２０分間インキユベート
する。引続き、ニトロセルロース瀘紙を指示薬−アガロ
ースプレート上に、細胞と指示薬プレートとの間に直接
接触が生じるように置く。呈色反応は時間と個々のクロ
ーン中で合成されたクレアチナーゼの量との関係で得ら
れる。前記活性スクリーニングから、プラスミドpBT２
ａ−１（DSM３１４３）を有するクローンＥＤが単離さ
れる。このプラスミドは、細胞の可溶性蛋白質の約５０
％を構成するクレアチナーゼをコードする。この方法は
第１図に図示されている。
ここに記載の直接ＮＧ−突然変異生成に対して択一的
に、異種プロモータ−例えばラクト−スプロモーター
（これは例えば市場で入手しうるプラスミド例えばpUC
−プラスミドから、DNA−フラグメントとして単離され
うる）の導入によつても、このクレアチナーゼの表現増
加が得られる。このために、プラスミドpBT３−２をEco
R I−位置で開裂させ、エキソヌクレアーゼBal３１で
各々の側から約１０〜１００BPが除かれるように処理す
る。次いで、ラクト−ス−プロモーターを、酵素Ｔ4−
リガーゼを用いて、末端の連結下に、短縮されたプラス
ミドpBT３−２中に導入連結させる。このDNAを、次いで
前記のようにニトロソ−グアニジンで突然変異させ、引
続き株ＥＤの形質転換のために使用し、クローンを前記
のプレートスクリーニングで遺伝子表現に関して試験す
る。
に、異種プロモータ−例えばラクト−スプロモーター
（これは例えば市場で入手しうるプラスミド例えばpUC
−プラスミドから、DNA−フラグメントとして単離され
うる）の導入によつても、このクレアチナーゼの表現増
加が得られる。このために、プラスミドpBT３−２をEco
R I−位置で開裂させ、エキソヌクレアーゼBal３１で
各々の側から約１０〜１００BPが除かれるように処理す
る。次いで、ラクト−ス−プロモーターを、酵素Ｔ4−
リガーゼを用いて、末端の連結下に、短縮されたプラス
ミドpBT３−２中に導入連結させる。このDNAを、次いで
前記のようにニトロソ−グアニジンで突然変異させ、引
続き株ＥＤの形質転換のために使用し、クローンを前記
のプレートスクリーニングで遺伝子表現に関して試験す
る。
前記の指示薬−アガロースプレートは、クレアチンから
の酵素クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ及びサルコキ
シンオキシダーゼにより生じたH2O2を、ペルオキシダー
ゼ（POD）を介して1/2Ｏ2とＨ2Ｏに分解し、この酸素
を、例えば４−アミノアンチピリン（４−AAP）及びＮ
−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メチルアニリ
ン、Ｋ−塩（EST）からの呈色指示薬系と反応させる。
酵素サルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの過
剰の際に、コロニー中に合成されたクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼに関する尺度を表わす青−紫色が生じる。
の酵素クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ及びサルコキ
シンオキシダーゼにより生じたH2O2を、ペルオキシダー
ゼ（POD）を介して1/2Ｏ2とＨ2Ｏに分解し、この酸素
を、例えば４−アミノアンチピリン（４−AAP）及びＮ
−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−３−メチルアニリ
ン、Ｋ−塩（EST）からの呈色指示薬系と反応させる。
酵素サルコシンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼの過
剰の際に、コロニー中に合成されたクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼに関する尺度を表わす青−紫色が生じる。
テスト原理： クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼ活性スクリーニング
系の組成 １ クレアチン 最終濃度 10mM ２ NaN3 〃 0.5mM ３ トリス(Tris)HCl(pH7.8) 〃 20mM ４ サルコシンオキシダーゼ 〃 ５U/ml ５ ペルオキシダーゼ 〃 ２．５U/ml ６ ４−ＡＡＰ 〃 0.25mg/ml ７ ＥＳＴ 〃 1.5mg/ml １〜７に記載の試薬を溶かし、同量の低融点アガロース
（２％）と混合する。６mlをペトリシヤーレ中に注ぎ、
プレートは４℃で約２週間暗所に貯蔵することができ
る。
系の組成 １ クレアチン 最終濃度 10mM ２ NaN3 〃 0.5mM ３ トリス(Tris)HCl(pH7.8) 〃 20mM ４ サルコシンオキシダーゼ 〃 ５U/ml ５ ペルオキシダーゼ 〃 ２．５U/ml ６ ４−ＡＡＰ 〃 0.25mg/ml ７ ＥＳＴ 〃 1.5mg/ml １〜７に記載の試薬を溶かし、同量の低融点アガロース
（２％）と混合する。６mlをペトリシヤーレ中に注ぎ、
プレートは４℃で約２週間暗所に貯蔵することができ
る。
例 ３ クローン化及びシユードモナス・プチダ中のクローン化
されたクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現のため
に、プラスミドRSF１０１０〔バグダサリアン（Bagdasa
rian）等によるゲン(Gene)１９８１、１６、２３７〜２
４７参照〕を使用する。RSF１０１０をPvu IIで直線化
し、プラスミドpACYC１７７〔チヤン(Chang)及びコーエ
ン(Cohen)によるＪ．バクテリオロジイ(Bacteriol.)１
９７８、１３４、１１４１〜１１５６参照〕からHae II
切断により1.4Kbフラグメントを単離した。RSF１０１０
DNA0.2μgをT4リガーゼの使用下にHae IIフラグメント
１μgと連結させると生じるプラスミドはpBT３０６．１
である（第２図）。RSF１０１０及びこのプラスミドの
誘導体は、広い宿主範囲により優れており〔ゲン(Gene)
１６（１９８１）、２３７〜２４７参照〕例えば、シユ
ードモナス属菌内でもＥ・コリー内でも増幅するのに好
適である。プラスミドpBT2a−１をPvu I及びPvu IIで切
断し、2.8Kbフラグメントを単離させ、pBT３６０．１を
Pvu I及びSma Iで切断し、１０Kbフラグメントを単離さ
せたベクタ−DNA0.5μgをPvu I−Pvu IIフラグメント0.
5μgと連結させる。Ｅ・コリーEDを形質転換させ、クレ
アチナーゼをコードするクローンを前記プレート−活性
スクリーニング系を用いて同定する。陽性クローンから
前記CsCl−エチジウムブロミド法によりプラスミドDNA
を調製する。このプラスミドは、pBT３０６．１６（DSM
１３４９Ｐ）なる名称を有する（第３図）。
されたクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現のため
に、プラスミドRSF１０１０〔バグダサリアン（Bagdasa
rian）等によるゲン(Gene)１９８１、１６、２３７〜２
４７参照〕を使用する。RSF１０１０をPvu IIで直線化
し、プラスミドpACYC１７７〔チヤン(Chang)及びコーエ
ン(Cohen)によるＪ．バクテリオロジイ(Bacteriol.)１
９７８、１３４、１１４１〜１１５６参照〕からHae II
切断により1.4Kbフラグメントを単離した。RSF１０１０
DNA0.2μgをT4リガーゼの使用下にHae IIフラグメント
１μgと連結させると生じるプラスミドはpBT３０６．１
である（第２図）。RSF１０１０及びこのプラスミドの
誘導体は、広い宿主範囲により優れており〔ゲン(Gene)
１６（１９８１）、２３７〜２４７参照〕例えば、シユ
ードモナス属菌内でもＥ・コリー内でも増幅するのに好
適である。プラスミドpBT2a−１をPvu I及びPvu IIで切
断し、2.8Kbフラグメントを単離させ、pBT３６０．１を
Pvu I及びSma Iで切断し、１０Kbフラグメントを単離さ
せたベクタ−DNA0.5μgをPvu I−Pvu IIフラグメント0.
5μgと連結させる。Ｅ・コリーEDを形質転換させ、クレ
アチナーゼをコードするクローンを前記プレート−活性
スクリーニング系を用いて同定する。陽性クローンから
前記CsCl−エチジウムブロミド法によりプラスミドDNA
を調製する。このプラスミドは、pBT３０６．１６（DSM
１３４９Ｐ）なる名称を有する（第３図）。
シユードモナス・プチダ２４４０中のプラスミドDNAの
形質転換は、正確には、フランクリンン（Franklin）の
方法Ｉマイクロビオール・デグラデーシヨン・オブ・キ
セノビオテイクス・アンド・レカリシトラント・コンパ
ウンズ（Microbiol Degradation of Xenobiotics and R
ecalicitrant Compounds,Leisinger,Cook,Hutter und N
eusch.）１９８１、109〜１３０参照〕により行なう。
このプレート活性スクリーニングを用いて、陽性クロー
ンを同定した。このことは、シユードモナス・プチダ２
４４０（この株は染色体コードされたクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを含有する）で、プラスミドコードされ
たクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現を構成的に
行なうので、可能である。この識別特性により、染色体
コードされたクレアチンアミジノヒドロラーゼとプラス
ミドコードされたクレアチンアミジノヒドロラーゼとの
間での区別ができる。
形質転換は、正確には、フランクリンン（Franklin）の
方法Ｉマイクロビオール・デグラデーシヨン・オブ・キ
セノビオテイクス・アンド・レカリシトラント・コンパ
ウンズ（Microbiol Degradation of Xenobiotics and R
ecalicitrant Compounds,Leisinger,Cook,Hutter und N
eusch.）１９８１、109〜１３０参照〕により行なう。
このプレート活性スクリーニングを用いて、陽性クロー
ンを同定した。このことは、シユードモナス・プチダ２
４４０（この株は染色体コードされたクレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを含有する）で、プラスミドコードされ
たクレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの表現を構成的に
行なうので、可能である。この識別特性により、染色体
コードされたクレアチンアミジノヒドロラーゼとプラス
ミドコードされたクレアチンアミジノヒドロラーゼとの
間での区別ができる。
例 ４ クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼの活性の測定は、ウ
レアーゼを用いる反応で生じるアンモニウムイオンを、
テスト組成物「ハルンストツフ（Harnstoff）（ベーリ
ンガー・マンハイムBest.Nr、１２４７７０）」を用いて
検出することにより行なう。
レアーゼを用いる反応で生じるアンモニウムイオンを、
テスト組成物「ハルンストツフ（Harnstoff）（ベーリ
ンガー・マンハイムBest.Nr、１２４７７０）」を用いて
検出することにより行なう。
野生型シユードモナス・プチダ２４４０をクレアチンア
ミジノ−ヒドロラーゼ活性の測定のためにクレアチン１
％を含有するＬＢ培地（５ml）中で３０℃で１夜インキ
ユベートする。細胞を遠心より収得し、５０mM燐酸塩緩
衝液 （pH7.5）中で１回洗浄する。細胞を当初量で、燐酸塩
緩衝液（５０mM、pH7.5）中に入れ、超音波処理（４×
３０秒）により溶解させる。クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼコードプラスミドを有する細胞の培養及び溶解
は、前記と同様の方法であるが、培地に誘導用のクレア
チンを含有せず、アンピシリン（プラスミドpBT３−
２、pBT２ａ−１に対して２０μg/ml）もしくはストレ
プトマイシン（プラスミドpBT３０６．１６に対して２
００μg/ml）の添加によりプラスミドを選択するように
して、行なう。培養物の生長は、シユードモナス・プチ
ダに関しては３０℃で、Ｅ・コリーに関しては３７℃で
行なう。
ミジノ−ヒドロラーゼ活性の測定のためにクレアチン１
％を含有するＬＢ培地（５ml）中で３０℃で１夜インキ
ユベートする。細胞を遠心より収得し、５０mM燐酸塩緩
衝液 （pH7.5）中で１回洗浄する。細胞を当初量で、燐酸塩
緩衝液（５０mM、pH7.5）中に入れ、超音波処理（４×
３０秒）により溶解させる。クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼコードプラスミドを有する細胞の培養及び溶解
は、前記と同様の方法であるが、培地に誘導用のクレア
チンを含有せず、アンピシリン（プラスミドpBT３−
２、pBT２ａ−１に対して２０μg/ml）もしくはストレ
プトマイシン（プラスミドpBT３０６．１６に対して２
００μg/ml）の添加によりプラスミドを選択するように
して、行なう。培養物の生長は、シユードモナス・プチ
ダに関しては３０℃で、Ｅ・コリーに関しては３７℃で
行なう。
シユードモナス・プチダ及びＥ・コリー中のクレアチン
アミジノ−フドロラーゼ このデータは、クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼのク
ローン化により、1)Ｅ・コリー細菌は新特性を有するク
レアチンアミジノ−ヒドロラーゼを合成し、2)この表現
（出発株シユードモナス・プチダとは逆に）は、Ｅ・コ
リーに関しても、シユードモナス・プチダに関しても構
成的に行われることを示している。更に、クレアチンア
ミジノ−ヒドロラーゼコード性DNAの突然変異生成によ
り、特に高い表現を得ることができることが判る（誘導
されなかつた出発株に比べたリツトル当りの活性の増
大、シユートモナスでは力価１８００、Ｅ・コリーでは
力価２８００）。
アミジノ−フドロラーゼ このデータは、クレアチンアミジノ−ヒドロラーゼのク
ローン化により、1)Ｅ・コリー細菌は新特性を有するク
レアチンアミジノ−ヒドロラーゼを合成し、2)この表現
（出発株シユードモナス・プチダとは逆に）は、Ｅ・コ
リーに関しても、シユードモナス・プチダに関しても構
成的に行われることを示している。更に、クレアチンア
ミジノ−ヒドロラーゼコード性DNAの突然変異生成によ
り、特に高い表現を得ることができることが判る（誘導
されなかつた出発株に比べたリツトル当りの活性の増
大、シユートモナスでは力価１８００、Ｅ・コリーでは
力価２８００）。
Ｅ・コリーED／pBT２ａ−１（DSM３１４３）中で、活性
は５００単位／ビオマス（湿）１ｇもしくは特異活性は
4.5ｕ／蛋白質mgである。高度精製された蛋白質の特異
活性は、９ｕ／mgであるので、Ｅ・コリー中のクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼは、可溶性蛋白質の５０％にな
る。SDS−ゲルでの粗製エキスの分析結果〔レムリ（Lae
mmli）によるナトウア（Nature）１９７０、２２７、６
８０〜６８５参照〕は、クレアチンアミジノ−ヒドロラ
ーゼは可溶性蛋白質フラクシヨンの主要バンドであるこ
とを示している（第４図、第２片）。
は５００単位／ビオマス（湿）１ｇもしくは特異活性は
4.5ｕ／蛋白質mgである。高度精製された蛋白質の特異
活性は、９ｕ／mgであるので、Ｅ・コリー中のクレアチ
ンアミジノヒドロラーゼは、可溶性蛋白質の５０％にな
る。SDS−ゲルでの粗製エキスの分析結果〔レムリ（Lae
mmli）によるナトウア（Nature）１９７０、２２７、６
８０〜６８５参照〕は、クレアチンアミジノ−ヒドロラ
ーゼは可溶性蛋白質フラクシヨンの主要バンドであるこ
とを示している（第４図、第２片）。
例 ５ 醗酵装置中での培養のために、３種の種々のＥ・コリー
宿主系即ちＥ・コリーＷ３３５０、Ｅ・コリーED８６５
４もしくはＥ・コリー CSH１を使用した。プラスミドp
BT２ａ−１を適当な細胞中に移す。個々のコロニー上で
の浄化の後に、アンピシリン２０μg/mlを含有するDYT
培地〔ミラー（Miller）のエクスペリメント・イン・モ
レキユラー・ゲネテイクス（Experiments in Molecular
Genetics,Cold Spring Harbor）、１９７２、４３３参
照〕中の前培養物を３７℃で１夜培養する。この醗酵培
地（DYT）に前培養物を接種し（イノキユラム１％）、
選択せずにプラスミド保持物（Plasmiderhalt）上で３
７℃で２０〜３０秒間生長させる。クレアチンアミジノ
−ヒドロラーゼ活性は、２５時間後に約６００ｕ／湿物
質ｇもしくは4.5ｕ／蛋白質mgである。
宿主系即ちＥ・コリーＷ３３５０、Ｅ・コリーED８６５
４もしくはＥ・コリー CSH１を使用した。プラスミドp
BT２ａ−１を適当な細胞中に移す。個々のコロニー上で
の浄化の後に、アンピシリン２０μg/mlを含有するDYT
培地〔ミラー（Miller）のエクスペリメント・イン・モ
レキユラー・ゲネテイクス（Experiments in Molecular
Genetics,Cold Spring Harbor）、１９７２、４３３参
照〕中の前培養物を３７℃で１夜培養する。この醗酵培
地（DYT）に前培養物を接種し（イノキユラム１％）、
選択せずにプラスミド保持物（Plasmiderhalt）上で３
７℃で２０〜３０秒間生長させる。クレアチンアミジノ
−ヒドロラーゼ活性は、２５時間後に約６００ｕ／湿物
質ｇもしくは4.5ｕ／蛋白質mgである。
シユードモナス・プチダの培養のために、プラスミドpB
T３０６．１６を株２４４０の適当な細胞中に移すと、P
Sプチダ（DSM３１４７）が得られる。
T３０６．１６を株２４４０の適当な細胞中に移すと、P
Sプチダ（DSM３１４７）が得られる。
個々のコロニーの浄化の後に、ストレプトマイシン２０
０μg/mlを含有するDYT培地中の培養物を３０℃で１夜
インキユベートする。培養培地（DYT）に接種し（イノ
キユラム１％）、培養物を３０℃で２０〜３０時間放置
生長させる。２５時間後の活性は約２２０ｕ／湿物質ｇ
もしくは1.8ｕ／蛋白質mgである。
０μg/mlを含有するDYT培地中の培養物を３０℃で１夜
インキユベートする。培養培地（DYT）に接種し（イノ
キユラム１％）、培養物を３０℃で２０〜３０時間放置
生長させる。２５時間後の活性は約２２０ｕ／湿物質ｇ
もしくは1.8ｕ／蛋白質mgである。
第１図はシユードモナス・プチダDNAからの2.2Kb−フラ
グメント及びプラスミドpRB 322を出発物質として用い
たプラスミドpBT３−２の製造経過を示す図であり、第
２図は、プラスミドRSF１０１０及びPACYC１７７からの
プラスミドpBT３０６．１の製造経過を示す図であり、
第３図はpBT３０６．１及びpBT２ａ−１からの本発明に
よるプラスミドpBT３０６．１６の形成経過を示す図で
あり、第４図は、出発株シユードモナス・プチダ(1)、
プラスミドpBT２ａ−１を有するＥ・コリー野生株ED
(2)、宿主株EDからの細胞エキス(4)及び比較用の精製ク
レアチナーゼ(3)を付与したSDSゲルを示す図である。
グメント及びプラスミドpRB 322を出発物質として用い
たプラスミドpBT３−２の製造経過を示す図であり、第
２図は、プラスミドRSF１０１０及びPACYC１７７からの
プラスミドpBT３０６．１の製造経過を示す図であり、
第３図はpBT３０６．１及びpBT２ａ−１からの本発明に
よるプラスミドpBT３０６．１６の形成経過を示す図で
あり、第４図は、出発株シユードモナス・プチダ(1)、
プラスミドpBT２ａ−１を有するＥ・コリー野生株ED
(2)、宿主株EDからの細胞エキス(4)及び比較用の精製ク
レアチナーゼ(3)を付与したSDSゲルを示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 クラウス・ボーカンプ ドイツ連邦共和国トウツイング・フオン- キユールマン‐シユトラーセ 15 (56)参考文献 Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 40，［５］1011−1018（1976)
Claims (11)
- 【請求項１】構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを
形成し、シュードモナス・プチダのＤＮＡから、 ａ） Eco RIで制限的に消化させて５．８Ｋｂ−フラグ
メントを単離するか又は ｂ） Eco RI及びPvu IIを用いて切断して２．２Ｋｂ
−フラグメントを単離する ことにより得られた、クレアチンアミジノヒドロラーゼ
をコード化するＤＮＡを含有する組換えプラスミドでの
形質転換により得られたことを特徴とする、Ｅ．コリー
又はシュードモナス・プチダに属する微生物。 - 【請求項２】プラスミドpBT２ａ−１（ＤＳＭ３１４８
Ｐ）を有する、特許請求の範囲第１項記載のＥ．コリー
に属する微生物。 - 【請求項３】プラスミドpBT３０６．１６（ＤＳＭ３１
４９ｐ）を有する、特許請求の範囲第１項記載のＥ．コ
リー又はシュードモナス・プチダに属する微生物。 - 【請求項４】構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを
形成するＥ．コリー又はシュードモナス・プチダに属す
る微生物を製造する方法において、シュードモナス・プ
チダからのＤＮＡを ａ） Eco RIで制限的に消化させて、５．８Ｋｂ−フラ
グメントを得るか又は ｂ） Eco RI及びPvu IIを用いて切断して２．２Ｋｂ
−フラグメントを得、 ａ）又はｂ）で得たフラグメントを、この又は同じ制限
エンドヌクレアーゼで切断されたベクターにクローン化
し、これを選択されたベクターに好適なＥ．コリー又は
Ｐ．プチダ菌株内に移し、この構成性クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを形成するクローンを単離することを特
徴とする、Ｅ．コリー又はシュードモナス・プチダに属
する微生物の製法。 - 【請求項５】プラスミドpBR３２２をEco RIで切断し、
この切断位置に５．８Ｋ−フラグメントを挿入し、得ら
れたプラスミドをＥ．コリー内に移す、特許請求の範囲
第４項記載の方法。 - 【請求項６】pBR３２２をEco RI及びPvu IIで切断し、
２．３Ｋｂ−フラグメントを単離し、Ｐ．プチダからの
２．２Ｋｂ Eco RI−Pvu IIフラグメントと連結して
プラスミドpBT３−２を形成させ、これをＥ．コリー内
に移す、特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】形質転換されたＥ．コリーをアンピシリン
耐性に関して選択する、特許請求の範囲第４項から第６
項までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】pBT３−２を含有し、形質転換されたＥ．
コリー細胞を、このプラスミドの増幅時点にニトロソグ
アニジンで処理し、その後、これからプラスミドを単離
し、改めてＥ．コリー細胞内に移し、場合により、この
サイクルを繰り返し、特に優れたクレアチンアミジノヒ
ドロラーゼ活性を有するクローンから、プラスミドpBT
２ａ−１を取得する、特許請求の範囲第５項又は第６項
記載の方法。 - 【請求項９】プラスミドRSF１０１０をPvuIIで切断し、
こうして得た切断位置に、プラスミドPACYC１７７からH
aeIIで切出された１．４Ｋｂ−ＤＮＡ−フラグメントと
結紮させ、この際、プラスミドpBT３０６．１を得、こ
れをPvuＩ及びSmaＩで切断し、生じた１０Ｋｂ−フラグ
メントを、pBT２ａ−１のPvuI及びPvuIIでの切断により
得られる２．８Ｋｂ−フラグメントと結紮させ、プラス
ミドpBT３０６．１６を得る、特許請求の範囲第８記載
の方法。 - 【請求項１０】形質転換された菌株の形成クローンを、
クレアチン、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及びＨ2Ｏ2−呈色系を溶解含有するアガロースプレー
トと接触させ、強い呈色を起こさせるクローンを選択す
る、特許請求の範囲第４項から第９項までのいずれか１
項に記載の方法。 - 【請求項１１】Ｈ2Ｏ2−呈色指示薬系として、４−アミ
ノアンチピリンをＮ−エチル−Ｎ−（スルホエチル）−
３−メチルアニリン塩と組合せて使用する、特許請求の
範囲第１０項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853500184 DE3500184A1 (de) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| DE3500184.4 | 1985-01-04 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5189871A Division JPH07102140B2 (ja) | 1985-01-04 | 1993-07-30 | 組換えｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61162170A JPS61162170A (ja) | 1986-07-22 |
| JPH062050B2 true JPH062050B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=6259284
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60292383A Expired - Lifetime JPH062050B2 (ja) | 1985-01-04 | 1985-12-26 | 構成性クレアチンアミジノヒドロラーゼを形成する微生物及びその製法 |
| JP5189871A Expired - Lifetime JPH07102140B2 (ja) | 1985-01-04 | 1993-07-30 | 組換えｄｎａ |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5189871A Expired - Lifetime JPH07102140B2 (ja) | 1985-01-04 | 1993-07-30 | 組換えｄｎａ |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0187138B1 (ja) |
| JP (2) | JPH062050B2 (ja) |
| AT (1) | ATE74964T1 (ja) |
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| CA (1) | CA1309960C (ja) |
| CZ (1) | CZ279427B6 (ja) |
| DE (2) | DE3500184A1 (ja) |
| DK (1) | DK3086A (ja) |
| ES (1) | ES8704543A1 (ja) |
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| SK (1) | SK278079B6 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
| JPS62208281A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-12 | Kikkoman Corp | クレアチナ−ゼの製造法 |
| JPS62205786A (ja) * | 1986-03-07 | 1987-09-10 | Kikkoman Corp | 新規な組み換え体ｄｎａ |
| DE3803175A1 (de) * | 1987-05-12 | 1988-11-24 | Boehringer Mannheim Gmbh | Stabile creatinamidinohydrolase-mutanten |
| JPS6437292A (en) * | 1987-08-04 | 1989-02-07 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of creatinase and use thereof |
| JP2527035B2 (ja) * | 1989-06-16 | 1996-08-21 | 東洋紡績株式会社 | クレアチニン・アミドヒドロラ―ゼをコ―ドする遺伝子を含有するｄｎａ断片、該ｄｎａ断片を有する組換えベクタ―及び該組換えベクタ―を有する形質転換体、並びにクレアチニン・アミドヒドロラ―ゼの製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS51118884A (en) * | 1975-04-05 | 1976-10-19 | Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho | Process for preparing creatine amidinohydrolase |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
| DE3500184A1 (de) * | 1985-01-04 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mikroorganismus und plasmid fuer konstitutive creatinamidinohydrolase-bildung sowie verfahren zur herstellung derselben |
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1985
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- 1985-12-27 YU YU204985A patent/YU204985A/sh unknown
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1986
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- 1986-01-03 DE DE8686100066T patent/DE3684787D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1986-01-03 UA UA4002500A patent/UA6152A1/uk unknown
- 1986-01-03 CZ CS8675A patent/CZ279427B6/cs unknown
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- 1986-01-06 US US06/816,565 patent/US4861717A/en not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-07-30 JP JP5189871A patent/JPH07102140B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ４０，［５１０１１−１０１８（１９７６） |
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