JPH062053B2 - 植物の組織培養方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はニチニチソウのカルスまたは腫瘍組織を用いて
効率良くアルブチンを製造するための組織培養方法に関
する。

［従来の技術］ 従来アルブチンの製造方法には合成法（Arther D.Jaret
t-corp of Delaware U.S.P.3201385）とウワウルシ（Ar
ctostaphylos uva-ursi）、コケモモ（Vaccinium vitis
-idaea）などの天然植物から抽出する方法がある。

［発明が解決しようとする問題点］ 合成法は、１）グルコースのアセチル化、２）ベンジル
エーテルの付加、３）脱アセチル化、４）脱ベンジル
化、の４工程からなり非常に繁雑であること、また抽出
法については、天然のウワウルシやコケモモのアルブチ
ン含有量が、それぞれ乾燥重量の5.0〜7.5％、4.0〜7.0
％と少ないうえに抽出の際に大量の鉛を使用する。鉛を
使用する方法は直接人体に摂取されたり、接触するよう
な医薬、農薬、化粧料添加物、食品添加物などに使用す
るための物質あるいはその原料を製造する方法として
は、重金属である鉛混入の危険があり、かつ使用済の重
金属を含む廃液の処理、廃棄などにも難点があり不適当
である。

本発明者等はこれら従来技術の問題点を解決する手段と
して、植物のカルス又は腫瘍組織を組織培養しアルブチ
ンを採取する方法について研究した結果、培地中にハイ
ドロキノンを添加することにより大量のアルブチンが培
養物中に蓄積することを見出し、先に特許出願をした。
しかしながら本法においても、収率を上げる目的で基質
としてのハイドロキノンの添加量を増やすとかえって変
換効率が下り、結果として収率が低下するという欠点を
有していた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は上記の事情に鑑み、アルブチンを高収率で
得る組織培養方法について鋭意研究を重ねた結果、アル
ブチンの生産に用いる植物のカルスまたは腫瘍組織を継
代培養する際に一定量以下のハイドロキノンを培地に添
加して継代培養すると上記目的が達成できることを見出
し、この知見にもとずいて本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は１mM以下のハイドロキノンを添加した
培地でニチニチソウのカルスまたは腫瘍組織を継代培養
することによりアルブチン生成能に優れた培養物を誘導
する植物組織培養方法を提供するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

まずニチニチソウの芽生え（幼植物）の根、胚軸、子
葉、成熟植物の根、茎、葉、葉柄、花、花粉などの細胞
群又は組織片を出発原料として、これを通常の方法にて
オーキシンやサイトカイニンを添加した培地で培養すれ
ばカルスが誘導される。この場合、材料としていずれの
植物の器官の細胞群、組織を使用しても難易の差はある
がカルスは誘導される。使用する培地はムラシゲ・スク
ーグ培地に寒天をまぜたものが通常用いられるがこれに
限らず、White,Gamborg,Nitsch.Heller.Schenk-Hildebr
andt,Nitsch-Nitsch,Kohlenbach-Schmidtなどのいずれ
の培地を用いてもよい。勿論、寒天を含まない液体培地
でもカルスは誘導できる。また一般にカルス誘導に際し
てはオーキシンが必要とされるが、２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸（2,4-D）、α−ナフタリン酢酸（NAA）、
２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（2,4,5-T）、
インドール酢酸（IAA）などいずれを添加してもよい。
またサイトカイニンもゼアチン、６−ベンジルアデニ
ン、カイネチン、リボシルゼアチン、イソペンテニルア
デニンなどいずれを添加してもよい。添加するオーキシ
ンの濃度は、10^-7Mから10^-5Mの範囲であり、サイトカイ
ニンの濃度も10^-8Mから10^-4Mの範囲である。この様にし
て誘導したカルスは上記培地に寒天を加えない液体培地
に植え継ぎ振盪培養を行う。もちろん寒天を含む培地で
もカルスは分裂生長する、液体振盪培養では通気のため
に回転式振盪培養機か往復式振盪培養機で常に振盪す
る。回転数は50rpmから150rpmの範囲であればいずれで
もよいが、110rpm程度が望ましい。培養中、光は照射し
てもしなくてもよい。培養温度は２０℃から３０℃であ
るが、そのうちでも27℃程度が望ましい。カルスは週１
回新しい培地に植え継ぎ、継代培養する。継代培養は１
mM以下のハイドロキノンを含む培地にて行なわれる。ハ
イドロキノンの濃度が高過ぎるとカルスは増殖できない
ので、0.01mM乃至１mMの数段階の濃度の培地にて培養
し、その中で最も高濃度の培地で増殖したカルスを選び
植えつぐようにする。このような操作を繰り返すとカル
スのハイドロキノンに対する耐性は次第に高まってく
る。

液体培養で継代しているカルスを、ハイドロキノンを含
む培地での継代培養に切り換える時期については特に制
限はないがカルスを誘導してから時を経ない方が、カル
スはより早くハイドロキノンに対する耐性を獲得するの
で好ましい。

ハイドロキノンを含む培地での継代培養を少なくとも３
ヶ月以上継続した後、植えつぎ後３日目から１０日目の
間に10mM以下のハイドロキノンを再び添加するとすみや
かに多量のアルブチンが培地中に生産される。

［実施例］ 次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明する。本
発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ オーキシン類として2,4−Ｄを2.2×10^-6M含み寒天を含
まないムラシゲ‐スクーグ培地（ＫＣ社製、以下同じ）
180mlづつを500mlの三角フラスコに分注したものをオー
トクレーブで滅菌した。

実験に使用したニチニチソウのカルスは以下のような処
理を施した。なお、培養条件は全て27℃、光無照射下で
行ない、振盪培養する場合は回転式振盪培養装置（いわ
しや科学製）を用いて110rpmで行なった。すなわち、常
法によりニチニチソウの茎より誘導したカルスをハイド
ロキノン（三井石油化学製、以下同じ）0.02mM、0.2m
M、0.5mM、１mMをそれぞれ含むムラシゲ・スクーグ培地
に移植したところ0.5mM以上のハイドロキノンを含む培
地では増殖しなかった。0.2mM以下の実験区ではカルス
が増殖してきたので、0.2mM区のカルスを再び0.2mMハイ
ドロキノンを含む培地で数回継代培養を行なった。かか
るカルスを0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mMのハイ
ドロキノンを含む培地にそれぞれ移植した。0.6mM以下
の実験区で遅いながらもカルスが増殖してきたので、こ
のカルスを0.6mMハイドロキノンを含む培地で１年以上
継代培養を続けた。このような処理を経たカルス２ｇ
（生重量）を含む20ｍｌ細胞懸濁液をオートクレーブ殺
菌済の500ｍｌコルベンに植え込んだ。培養５日目にハ
イドロキノン88.1mgを水溶液として培地に添加した。

また比較例としてハイドロキノン無添加の培地で継代培
養したカルスを準備し、その他は実施例と同条件のもの
を１０本培養した。６日目、培養液を東洋濾瀘紙No.２
で吸引濾過し残渣を充分純水で洗浄した。残渣を200ｍ
ｌなす型フラスコに移し、100ｍｌの純水を加えて ３
分間、ヒスコトロン（日音速理科器械製作所製）でホモ
ジナイズし、湯浴上100℃で２時間熱水抽出を行なっ
た。これを遠心分離により上澄液をストックし、これを
シリカゲルカラム（Wako gel C-300、和光純薬製）にか
け、混合溶出液（クロロホルム：メタノール：水＝30:1
0:1）で溶出し、溶媒を留去してアルブチンを結晶とし
て205mg得た。比較例では120mgであった。

実施例２，３および比較例２，３ リンスマイヤー・スクーグの培地（極東製薬工業製）を
使用した他は実施例１と同様の条件で培養を行った。培
養６日目にハイドロキノンを110mg（実施例２）、132mg
（実施例３）を添加し、７日目に実施例１の要領で抽出
し、高速液体クロマトグラフィー（日本分光製）で定量
した。溶媒は５％メタノール（ph2.1）を使用し、流量
1.5ｍｌ／min．，検出波長230nmの条件で行なった。カ
ラムはＯＤＳカラム（センシュウ科学製，ＳＳＣ−ＯＤ
Ｓ−１６１）を使用した。その結果、アルブチンの収量
は259mg（実施例２），306mg（実施例３）であった。一
方ハイドロキノン処理をしないまま継代培養したカルス
を使った比較例では収量101mg（比較例２），69mg（比
較例３）であった。

表１に実施例１〜３および比較例１〜３のアルブチン生
産量と転換率を示す。ただし数値は10フラスコで生産さ
れた総量の平均値である。

本発明によって生産されたアルブチンの機器分析による
データは、紫外吸収、赤外吸収、¹³Ｃ核磁気共鳴の各ス
ペクトル分析において、市販されているアルブチン（シ
グマ社製）のものと一致した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１mM以下のハイドロキノンを添加した培地
   でニチニチソウ(Catharanthus roseus L.)のカルスまた
   は腫瘍組織を継代培養することによりアルブチン生成能
   に優れた培養物を誘導する植物組織培養方法。