JPS6296088A - 抗腫瘍性物質の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗腫瘍性物質の製法に係り、さらに詳しくは、
ある梱の高等植物中に産生・蓄積される抗ＩＩ［！！劫
注性物質組織培養法を用い°Ｃ尚効率で取得する方法に
関する・ 〔従来の技術〕 菌類などの下等植物由来の抗腫瘍性物質に加えて、最近
新たに高等植物中に含まれるアルカロイド等にも強い抗
腫瘍活性を示すものがあることが見い出され〔例えばド
ールス（Ｄｏｕｒｕｓ　）ら、リーセント・リザルツ・
イン・キャンサー・リサーチ（Ｒｅｃｅｎｔ　Ｒｅ５ｕ
ｌｔｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）、
７０巻、２１〜４４頁（１９８０年）〕、その治療薬へ
の応用が検討されている。

ところで、上記の抗［ｉ癌性物質の場合も含め一般に高
等植物中の活性成分の取得・活用に当っては以下の如き
制約ないしは問題点がある。

即ち、高等植物の場合−通常土中に播いた種子から栽培
するか、あるいは挿し本等植物体の一部の栄養繁殖によ
って栽培した植物の全草、果実あるいは種子から溶媒抽
出法等により活性成分を分離・取得することが行われる
が、このような植物の栽培による方法の場合には、温度
、気候、土質等により植生分布が限定されるという基本
的な制約があることに加えて、植物の生育は気象条件に
よって大きく左右されるため、年毎に収穫量や植物中の
活性物質の含有量に変動が生じ、安定にかつ効率よく該
物質を取得することは大変困難である。

高等植物中の活性物質の分離・取得に際してみられる上
記の如き問題点を解決する方法として、植物組織を培養
し、培養物中に産生・蓄積された活性物質を採取する所
謂組織培養による方法が知られており、抗腫瘍性物質に
関しても、カンブトテカ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ　）
属に鵬する植物中に含まれる抗腫瘍性物質であるカンプ
トテシン（Ｃａｍｐｔｏ−ｔｈθｃｉｎ）を、組織培養
法によって無定形培養物（所謂カルス）から採取するこ
とが提案されている（Ｓａｋａｔｏ等、アグリカルチエ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒ
ｉｃａｌｔｕｒａｌ　＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　）、８８（１）、２１７〜２１８（１９
７４））、　　Ｌ／カルながら、カルスから抗！１ｌＩ
ｉ瘍性物質を採取する方法の場合には、上記のカンプト
テシンの例を含め一般にカルス中の抗腫瘍性物質の含量
が１．母植物体中のそれの数十分の１もしくはそれ以下
にしかならないという難点があり、未だ実用化されるに
至っていない。

一方、組織培養によって不定芽を分化せしめ、該不定芽
から抗腫瘍性物質を採取することが、セファロタフスス
（Ｃｅｐｈａｌｏｔａ：ｃｕｓ　）属の植物〔有効物質
：ハリントニン（ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ　）　］
について試みられている（日本植物生理学会　１９８２
年度年会講演要旨集第１５６頁）が、この場合も培養物
中の有効物質の含量が上記のカルスに於けると同様に母
−物体中のそれに道かに及ばない結果しか得られていな
い。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者等は、か＼る現状に鑑み、高等植物中の抗腫瘍
性物質をより有利番こ取得する方法につき鋭意研究を続
けた結果、後述の特定の植物にあっては、意外にも、組
織培養による培養物から分化誘導した不定芽および不定
根中に、自然栽培下の母植物と同程度の含量の抗腫瘍性
物質が産生蓄積され、組織培養の利点である高い増殖度
と相俟って、この場合栽培植物によるよりも一層効率よ
く該物質を生産することが可能となることを見い出し本
発明を完成した。

本発明の目的は、高等植物由来の抗腫瘍性物質を、自然
環境の影響を受けることのない完全に制御された環境下
での組織培養法を用いることにより、再現性よくかつよ
り効率的に製造する方法を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

即ち、本発明は、ブテルリキア（ｐｕｔｔｅｒｌｉｃｋ
−１ａ）ＩｊｉｌＬ、カンプトテカ（Ｃａｍｐｔｏｔｈ
ｅｃａ　）属、ノタポディテス（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔ
ｅｓ　）属またはポドフィルム（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕ
ｍ　）属に属する植物の組織または細胞群を培養し、培
養物から不定芽および／または不定根を分化誘導せしめ
、該不定芽および／または不定根中に産生・蓄積された
抗腫瘍性物質を採取することを特徴とする抗腫瘍性物質
の製法である。

本発明に於て不定芽および不定根とは、植物の組織ある
いは細胞群の培養によって、該培養組織あるいは細胞群
それ自体から、もしくはそれらから派生した脱分化細胞
（カルス）から分化誘導される茎、葉等および根、ひげ
根、根毛等の形状を備えた組織を意味する。

また、本発明に係る植物中に含まれる抗腫瘍性物質とし
ては、プチルリキア属の植物にあってはメイタンシンが
、カンプトテカ属およびノタポディテス属の植物にあっ
てはカンプトテシンが、またポドフィルム鵬の植物にあ
ってはポドフィロトキシンがそれぞｉｔ代表的なものと
しＣ挙げられる。

本発明に係る植物にあっＣは、組織培養によって優られ
る不定芽（根）中に、そ口ら抗腫瘍性物質が母植物の含
量と同程度蓄積されるが、か＼る事実は本発明を俟って
初めて明らかとなったところであり、また前記した従来
技術よりすれば全く予想外のことである。

本発明方法が進用される植物中プテルリキア属としては
例えばプテルリキア・ヴエルコサ（Ｐｕ　−ｔｔｅｒｌ
ｉｃｋｉａ　ｖｅｒｒｕｃｏｓａ　）等が、カンプトテ
カ属としては例えばカンプトテカ・アキュミナタ（Ｃａ
−ｍｐｔｏｔｈｅｃａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ　）等が、
ノタポディテス属としては例えばノタポディテス・フォ
エティダ（Ｎｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ　ｆｏｅｔｉｄａ
　）　（ノタポディテス属はマピア（Ｍａｐｐｉａ　）
　属とも称され、従う°Ｃノタポディテス・フォエティ
ダはまたマピア・フォエティダ（Ｍａｐｐｉａ　ｆｏｅ
ｔｉｄａ）と呼ばれることもあるが、本明細書に於゛Ｃ
は統一的な名称として前者を用いる〕等が、またポドフ
ィルム鵬とし′Ｃは例えばポドフィルム・ペルタツム（
Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ　ｐθ−１ｔａｔｕｍ　）　、
ポドフィルム・ブレインク（Ｐｏｄｏｐｈｙ−１１ｕｍ
　ｐｌｅｉｎｔｈａ　）、ボドフィルム・エモディ（Ｐ
ｏ−ｄｈ７１１皿ｅｍｏｄｉ　）等が挙げられる。これ
ら植物のうちでも、カンプトテカーおよびポドフィルム
属に属する植物の場合は、特に不定芽（根）の増殖性が
良好であって目的とする抗ｐｍｍ性物質をとりわけ高効
率で製造することができる。

本発明に於て、それら植物の組織培養は例えは以下のよ
、うにして行われる。

即ち、植物を九本下でよく水洗した後、葉、茎、根部等
に切り分け、これをエタノール、塩化ベンザルコニウム
、次亜塩素酸ソーダ等を用い“Ｃ殺菌し、引き続いて滅
菌水で洗浄し、試験管又は三角フラスコに入れた培地上
にＭ置する。培地とじては、リンスマイヤー・スクーグ
、ムラシゲ・スクーグ、Ｂ５、ニッチ＆ニッチ、ホワイ
ト等の基本培地に糖類、ビタミン類および生長調節物質
等を配合したものが用いられる。基本培地としては、組
物組繊培養に於て通常使用されるものであればいづれで
も適用可能であり上記に限定されない。

生長調節物質としては、例えばインドール−８−酢酸（
ＩＡＡ）、インドール−８−酪酸（ＩＢム）、α−ナフ
タレン酢１！Ｊ（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキ
シｉ！＋１：１ｌ（２，４−Ｄ）等（Ｄ　オー　＊　シ
：／　類、カイネチン（Ｋｎ）、６−ベンジルアデニン
（６−ＢＡ）４のサイトカイニン類等が挙げられ、これ
らは単独で、または逸宜組合わせて使用される。

か＼る培地中で２２〜８０°Ｃで培養を続けると、約１
週間から４週間程度で培養物から不定芽あるいは不定根
の分化が起こる。この際、不定芽（根）の発生社は、生
長調節物質であるオーキシン類とサイトカイニン類の配
合量、組織培養に供した植物組織および光照射条件に主
として依存するが、これらのｋｍ条件は、植物の種類に
よつ°Ｃ相違する。

本発明に係る植物についてこれらの条件を示すと、まず
プテルリキア属の植物におい°Ｃは、ｌｏ−４〜ｌ０−
７Ｍのオーキシンと１０−’−１０−’　Ｍのサイトカ
イニンを含有する培地中で、１６〜２４時間、５．００
０〜ｔ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏルクスの光照射と８〜θ時間の
晴朗保持とを交互に行なうＣ葉から培養を開始すると不
定芽を得やすく、一方、不定根はｌｏ−ｓ　〜・１０　
　Ｍのオーキシンとｚｏ−’＝ｎｏ″″８Ｍのサイトカ
イニンを含有′する培地で０〜４時向、１，０００〜５
，０００ルクスの元ハα射と２４〜２０時間の隘も保持
とを交互に行なって葉の組織から培養を開始すると得ら
れ易い。

また、カンブトテカ属の植物におい′Ｃは、ｌＯ″〜１
０　　Ｍのオーキシンと１０＝ｌＯＭのサイトカイニン
を含有する培地中で８〜１６１１３間、２．０００〜５
，０００ルクスの光照射と１６〜８時間の晴朗保持とを
交互に行なうＣ実生（芽生え）から開始するのが不定芽
の分化には適し°Ｃおり、不定根の分化につい′Ｃは１
０−６〜１０−’Ｍのオーキシンとｌｏ−７〜１０−”
ｙのサイトカイニンを含有する培地中で０〜４時間の１
，０００〜５，０００ルクスの光照射と２４〜２０時間
の晴朗保持とを交互に行なって実生から開始するのが良
い。

ノタポディテス属の植物についてもカンプトテカ属の植
物と同様の培養条件を用いることができる。

さらに、ポドフィルム鵜の植物においては、オーキシン
とサイトカイニンとを１：１０〜ｌ：１００の配合比率
で、かつそｎぞれ１０−７〜ｌ０−８Ｍおよび１Ｏ−６
〜ｌ　Ｏ−’　Ｍの濃度範囲で含む培地中で培養すると
不定芽を得やすく、一方不定根の分化については、オー
キシンとサイトカイニンとを１００　：　１〜ｌ：１の
配合比率で、かつそれぞれＩ　Ｏ−’〜１０−’Ｍおよ
び１０〜１０　　Ｍの濃度範囲で含む培地中での培養が
適しＣいる。

なお１以上のいずれの場合も、不定芽よりは不定根を分
化誘導せしめるようにした方が一般に増殖性が良好であ
って好ましい。

また、不定芽あるいは不定根の分化に際して。

植物の種類によ）Ｃはカルス化が先行することがあるが
、この場合にはカルスから再分化した不定芽（根）を分
は取って培地に植え継ぐと新たな発芽、発根がみられる
ので、以後上記と同様の条件下に培養を進めればよい。

この様にして得られる不定芽および不定根は、母植物の
もつ抗腫瘍性物質を、しかも母植物と略々同程度の含有
率で含んでおり、これを常法に従うＣアルコール等の浴
媒を用いて抽出処理することにより該物質を容易に分離
、採取することができる。

以上の本発明方法によれば、自然環境等の影響を受ける
ことがなく、また増殖性にすぐれた組織培養法により抗
腫瘍性物質を高含量で含む高等植物組織を収得すること
が可能であり、かくしてこ＼に、従来の栽培法による場
合比して遥かに再現性がよく、かつ改善された高い効率
を有する抗腫瘍性物質の製造法が提供される。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

なお、実施例中不定芽（根）の増殖度の測定および抗腫
瘍性物質の精製、定量は次のようにしＣ行った。

（１）不定芽（根）の増殖度 ８回目の継代培養における植え継ぎ時の不定芽（根）の
新鮮型ｆｉＡ（ｆ）と植え継ぎ後３週間培養を行った時
の不定芽（根）の新鮮］ｔＢ（ｆ）とから次式により増
殖度ｃ倍）を求めた。

（２）抗腫瘍性゛物質の精製・定量 不定芽（根）を凍結乾燥し９５％エタノールで抽出して
得られた抽出物を液体クロマトグラフィー（ＯＤＳシリ
カカラム、溶離液ニアセトニトリル／水＝５０１５０）
　　および［１クロマトグラフイー（ＯＤＳシリカ）に
付し、標品との比較により目的とする抗腫瘍性物質を単
離、精製した後、こ＼に得られた精製物について、紫外
線吸収スペクトル、蛍光スペクトルおよび質量分析スペ
クトルによって同定ならびに定量を行うた。

実施例１゜ 充分水洗したカンブトテカ・アキュミナタの実生を７０
％エチルアルコールを用いて２〜３分間予備殺菌し、引
き続いて０．２％塩化ベンザルコニウム水溶液で２分間
、更に１％次亜塩素酸ナトリウム水溶液で５〜ＩＯ分間
滅菌した０次に滅菌蒸留水で薬剤を完全に除去した実生
を無菌下、外植片とした。これを、Ｉ　Ｅ　Ａ　１０”
　Ｍ、６−ＢＡＩＯ’Ｍを添加し、３％の蔗糖と１％の
寒天を含むｐＨ５，７に調節したリンスマイヤースクー
グ培地上に置床し、２５°Ｃで１６時間、５，０００ル
クスの白色光照射下での培養と、８時間暗所下での培養
とを交互に行なったところ、１週間後に不定芽が分化し
た。

これを何回か継代培養して不定芽の数を増やしたものを
材料としてカンプトテシンの抽出精製ならびに定量を行
った（本発明例１）。

また比較のため、ＩＢＡおよび６−ＢＡの添加量をそれ
ぞれ１０−’Ｍとするほかは上記と同様に継代培養して
得られたカルスについてもカンプトテシンの抽出精製な
らびに定量を行った（比較例１）。

それらの結果と、母植物体のカンプトテ力・アキュミナ
タの葉についての試験結果（対照例１）を第１表に示し
た。

第　　１　表 １゛ ネ 辻 ■ ［： 第１表の結果から、カンプトテカ・アキュミナタの外植
片を組織培養して得られる不定芽（本発明例１）は母体
植物と同程度の抗腫瘍性物質（カンプトテシン）を含有
しており、またその増殖度も良好であることが判る。な
お、比較例１のカルス中には母体植物の１し、。以下の
抗腫動性物質（カンプトテシン）しか含まれＣいないが
、前記した５ａｋａｔｏ等の試験結果でもカルス中の抗
腫瘍性物質（カンプトテシン）の含有率は０．０００２
５％と母体植物中のそれの１／１ｏであり、本発明方法
の優位性が明らかである。

実施例２゜ 基本培地としてリンスマイヤースクーグ培地に代えてＢ
５培地を用い、また生長調節物質としてＩＢＡＩＯ−’
Ｍと６−ＢＡＩＯ−’Ｍの代りにＮＡＡＩＯ−４ＭとＫ
ｎ　ｌ　Ｏ−’　Ｍ　　を添加するほかは実施例１と同
様の条件下に培養を行って不定根を分化誘導せしめ、こ
れを継代培養した。

この時の不定根の増殖度は１２．２倍と極めて高く、ま
た不定根中の抗ｍｍ性物質（カンプトテシン）の含有率
は０．００７％であって母体植物（カンプトテカ・アキ
ュミナタ）の根のそれ（０，００８％）とはソ同じ値を
示した。

実施例３゜ 供試植物とし−Ｃカンプトテカ・アキュミナタに代替し
てノタボディテス・フォエティダを、また基本培地とし
゛Ｃリンスマイヤースクーグ培地に代えてホワイト培地
をそれぞれ用い、かつ生長調節物質としてＩＢＡＩＯ−
’Ｍと６−ＢＡＩＯ−’Ｍ　　の代りに２．４−Ｄ　ｌ
　Ｏ−＠Ｍと６−ＢＡＩＱ−”Ｍを上記基本培地に添加
するほかは実施例１と同様の条件下に培養を行っ゛Ｃ不
定根を分化誘導せしめ、こｎを継代培養した。

こ＼で得られた不定根について増殖度と抗腫瘍性物Ｉｊ
ｊ（カンプトテシン）の含有率を求めたところ、増殖度
は９．６倍であり、また抗腫腸性物質の含有率は母体植
物Ｃノタボディテス・フォエティダ）の根のそれと同じ
０．００７％の高い値を示した。

実施例４゜ ボドフィルム属の一品種、ポドフィルム・ベル、タツム
の根を用い、滅菌細断の過程を実施例１と同様の操作を
行なってのち、切片を、ホワイト基本培地に蔗糖８％、
２．４−Ｄ　ｌ　Ｏ−”Ｍ　、　６−ＢＡ　ｌ　Ｏ−”
Ｍを添加した１％寒天培地上番こ置床したところ、カル
ス（脱分化細胞）が形成されたが、このカル賭さらに再
分化不定根が誘導された。この組織は、カルス→不定根
の形態で増殖を続け、同じ培地に継代するとカルス、／
不定根が大量に得られる。この時の不定根の増殖度は８
．２倍であった。また、この不定根３７５ｇから打１出
・精製操作により、杓１３ηの抗腫瘍性物質（ポドフィ
ロトキシン）が得られ、該物質の収率は０．００８５％
であった。

一方、対照として使用した母体植物（ボドフィルム・ペ
ルタツム）の根からのポドフィロトキシンの収率はｏ、
ｏｏａｏ％であり、培養物（不定根）は植物根と同等の
もしくはそｎ以上のポドフィロトキシンを含有している
と判明した。

実施例５゜ プテルリキア属の一品Ｕプテルリキア・ヴエルコサの葉
を用い、滅菌操作過程を実施例１と同様に行なってのち
、切片をニッチ＆ニッチ基本培地に蔗糖８％、ＩＡＡ　
ｔ　Ｏ−’Ｍ、　Ｋｎｔ　Ｏ−’Ｍを添加した１％寒天
培地上に置床したところ、カルスが形成されたが、この
カルスからは再分化不定芽が出混じ、カルス→不定芽の
形で増殖をくり返した。同じ培地にて継代すると不定芽
が大量に得られた。

この時の不定芽の増加度は６．４倍であった。

また、この不定芽４００ｆから抽出・精製操作により、
約５岬の抗腫腸性物質（メイタンシン）が得られ、その
収率は０．００１２５％であった。

一方、対照として、母体植物（プテルリキア・ヴエルコ
サ）の茎葉から得られたメイタンシンの収率は０．００
１２０％であり、該培養物（不定芽）は植物体（茎葉）
と同等のメイタンシンを含有していることが判明した。

なお、ＩＡＡを１０−’　Ｍ　、またＫｎをＩＯ’Ｍと
するほかは上記と同様にして培養を行った場合に生じた
カルスについて分析したところ、メイタンシンは検出不
可能であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）プテルリキア（Ｐｕｔｔｅｒｌｉｃｋｉａ）属、
   カンプトテカ（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）属、ノタポデ
   ィテス（Ｎｏ−ｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ）属またはポドフ
   ィルム（Ｐｏｄｏｐｈ−ｙｌｌｕｍ）属に属する植物の
   組織または細胞群を培養し、培養物から不定芽および／
   または不定根を分化誘導せしめ、該不定芽および／また
   は不定根中に産生・蓄積された抗腫瘍性物質を採取する
   ことを特徴とする抗腫瘍性物質の製法。