JPH06205668A - アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】アシルアミノ酸ラセマーゼを有利に生産する微
生物を探索する。 【構成】アシルアミノ酸ラセマーゼを有利に生産する微
生物を各種土壌中に探索したところ、アシルアミノ酸ラ
セマーゼ生産菌アミコラトプシス・スピシーズＴＳ−１
−６０を見いだした。 【効果】光学活性アミノ酸の製造に利用できる有用な酵
素であるアシルアミノ酸ラセマーゼを、アミコラトプシ
ス・スピシーズ ＴＳ−１−６０を用いて、工業的に有
利に製造できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるアシルアミ
ノ酸ラセマーゼの製造に用いられる新規微生物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】アシルアミノ酸ラセマーゼは、放線菌に
広く分布し、光学活性なＮ−アシルアミノ酸を対応する
光学対掌体に変換する光学活性のアミノ酸には作用しな
い特異な酵素であって、その詳細な性質についてはすで
に明らかにされている（特開平１−１３７９７３，日本
農芸化学会１９９０年度大会講演要旨集，３６８頁，１
９９０年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このようなアシルアミ
ノ酸ラセマーゼは、光学活性アミノ酸の製造に利用でき
る有用な酵素である。しかしながら、該酵素を安価に効
率良く製造する方法の開発は十分とは言えず、さらに有
利な方法がのぞまれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な現状に鑑み、研究を重ね、アミコラトプシス・スピシ
ーズ ＴＳ−１−６０（Amycolatopsis sp. ＴＳ−１
−６０，ＩＦＯ １５０７９，ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９
２）がアシルアミノ酸ラセマーゼを有利に生産すること
を見出し、更に鋭意研究を重ねた結果本発明を完成し
た。即ち、本発明はアシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を
有する新規微生物アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ
−１−６０および該微生物を用いるアシルアミノ酸ラセ
マーゼの製造法を提供するものである。

【０００５】上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ For Fermentation、Osaka；Ｉ
ＦＯ）における受託番号を、またＦＥＲＭ ＢＰ番号
は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ）における受託番号をそれぞれ示し、以下同様であ
る。アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０
は、本発明者らにより滋賀県の土壌より分離されたアシ
ルアミノ酸ラセマーゼ生産菌で、その菌学的性質を示す
と、下記の通りである。

【０００６】（ａ）形態 １）液体培養 本菌の胞子あるいは菌糸をトリプチカーゼ・ソイ・ブロ
スなどの栄養液体培地に接種後、２８℃、１〜２日振盪
培養すると、菌糸は細かく断裂し、その形態は多形態を
示す。 ２）平板寒天培養 基生菌糸は、寒天培地中にジグザグ状を呈した生育をす
る。気菌糸は、一般に直線状からやや屈曲状（ＲＦ）を
呈する。また、気菌糸どおしが絡み合った菌糸塊が観察
される（ＩＳＰ−２およびＩＳＰ−７）。胞子は、一般
に円筒状を呈し、その大きさは（０.３〜０.５×０.６
〜２.３μm）と長さにおいて多様性を示した。その表面
は平滑である。

【０００７】（ｂ）菌体組成 細胞壁成分のジアミノピメリン酸はｍｅｓｏ型で糖はア
ラビノース，ガラクトースが検出され細胞壁はタイプI
V，Ａに属する。ミコール酸は検出されずメナキノンは
９（Ｈ₂，Ｈ₄）でホスホリピドは、タイプII（有：ジホ
スファチジィルグリセロール，ホスファチジィルエタノ
ールアミン，ホスファチジィルイノシトール，ホスファ
チジィルイノシトールマンノサイド，無：ホスファチジ
ィルコリン）であった。

【０００８】（ｃ）各種培地における生育状態 ＴＳ−１−６０株の各種培地上の生育状態は〔表１〕に
示す通りである。括弧内に 示す色の記号はコンテナー
・コーポレーション・オブ・アメリカ社製のカラー・
ハーモニー・マニュアル第４版に記載のものを用いた。

【表１】 各種培地上での生育 （ｃ）生理的性質 生育温度範囲：イースト・麦芽寒天培地上，１３−３
７℃（最適生育温度２０−３０℃） ゼラチンの液化：陰性 スターチの加水分解：陰性 脱脂牛乳の凝固：陰性 脱脂牛乳のペプトン化：陰性 メラニン様色素の生成：陰性

【００１０】（ｄ）炭素源の同化性 陽性：グルコース，キシロース，フラクトース，マンニ
トール，イノシトール，アラビノース 陰性：シュークロス，ラフィノース，ラムノース 以上の菌学的性状から、ＴＳ−１−６０株はアミコラト
プシス属に属する菌株であるので、本発明者らはＴＳ−
１−６０株をアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１
−６０と称することとした。アミコラトプシス・スピー
シーズ ＴＳ−１−６０をそれ自体公知の方法で培養す
る。放線菌を培養する場合は、培地は、種培地として３
％ グリセロール、０.５％ ポリペプトン、０.３％
肉エキス、０.０５％ Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニ
ン、pＨ７.２を、生産培地としては１.７％ パンクレ
アチン処理カゼイン、０.３％ パパイン処理脱脂大豆
粉、０.５％ 食塩、０.２５％ リン酸水素二カリウ
ム、１％ グルコース、０.０５％ Ｎ−アセチル−Ｄ
Ｌ−メチオニン、pＨ７.０を用いる。培養は、通常１５
〜４０℃、好ましくは２４〜３０℃で１０〜９６時間、
好ましくは２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹
拌を加えることもできる。

【００１１】培養終了後、それ自体公知の方法で細胞と
上清とを分離する。細胞内に残存するアシルアミノ酸ラ
セマーゼは、当分野における通常の方法、例えば超音波
破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕法、摩砕な
どの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破砕法などによ
り細胞を破砕し抽出する。このようにして得られた抽出
液中に含まれるアシルアミノ酸ラセマーゼは通常の蛋白
質精製法、例えば塩析、等電点沈殿、ゲルろ過、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィーなどに付して精製され、目的
とするアシルアミノ酸ラセマーゼを得ることができる。
上記で得られるアシルアミノ酸ラセマーゼ活性は公知の
方法（特開平１−１３７９７３号）で測定される。すな
わち、 測定法Ａ：適当量の酵素を含む反応液（２５ｍＭ Ｎ−
アセチル−Ｄ−メチオニン、２ｍＭ 塩化コバルト、Ｌ
−アミノアシラーゼ ４Ｕ／ｍｌ，５ｍＭ トリス塩酸
バッファー（ｐＨ７.５））５００μｌを、３０℃、５
分間反応させた後、１００℃、３分間加熱し反応を停止
した。生成したＬ−メチオニンを高速液体クロマトグラ
フィーで定量した。酵素の単位（Ｕ）はＬ−メチオニン
が１分間に１μmol生成される量を１単位（Ｕ）とし
た。 測定法Ｂ：Ｌ−アミノアシラーゼを含まない測定法Ａの
反応液を、３０℃、５分間反応させ、０．５ｍｌの塩酸
（２Ｎ）を加え反応を停止させた。加水分解（１２０
℃，６０分間）後、水酸化ナトリウム（１Ｎ)で中和
し、生成したＬ−メチオニンを高速液体クロマトグラフ
ィーで定量した。

【００１２】

【実施例】

実施例１Amycolatopsis sp. ＴＳ−１−６０株からのアシルアミ
ノ酸ラセマーゼの精製Amycolatopsis sp. ＴＳ−１−６０を酵母エキス−麦芽
エキス寒天斜面培地（ＩＳＰ２培地）に２８℃、７日培
養して形成させた胞子の１白金耳を２００ml容三角フラ
スコに２０ml分注滅菌した種培地（３％ グリセロー
ル、０.５％ ポリペプトン、０.３％ 肉エキス、０.
０５％ Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、pＨ７.２）
に接種し、回転振盪機上（２００rpm）で２８℃、４８
時間培養した。この培養液８mlを滅菌した１５ml容バイ
アル瓶に分注し、−８０℃で凍結保存し、これを凍結保
存菌液とした。第一シードは、上記種培地に凍結保存菌
液１mlを接種し同一条件下で培養し調製した。第二シー
ドは、第一シード培養菌液２０mlを２リットル容坂口フ
ラスコに分注滅菌した５００ml種培地に接種し、往復振
盪機上（７８spm）で２８℃、７２時間培養し調製し
た。酵素の生産は、生産培地（１.７％ パンクレアチ
ン処理カゼイン、０.３％ パパイン処理脱脂大豆粉、
０.５％ 食塩、０.２５％ リン酸水素二カリウム、１
％ グルコース、０.０５％ Ｎ−アセチル−ＤＬ−メ
チオニン、pＨ７.０）１００リットルを２００リットル
容発酵槽に分注滅菌し、これに第二シード培養液４リッ
トルを移植し、通気（８０vvm）撹拌（１６０rpm）しな
がら２８℃で４２時間培養した。培養液９８リットルを
連続遠心分離機（１３０００×ｇ、シャープレス）を用
いて集菌し湿菌体１,８８０ｇを得た。これを５リット
ルの５０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.５）に懸濁し、
最終濃度１mg／mlになるように卵白リゾチームを添加し
た。懸濁液を３０℃に保ち、２〜３時間ゆっくり撹拌し
ながら溶菌させ、菌体内から漏出してくるＤＮＡを分解
するため小量のDNase Ｉを添加した。溶菌後、液温を５
５℃に上昇させ撹拌しながら３０分間熱処理を行った。
この溶液を熱処理すると、ＬおよびＤ−アミノアシラー
ゼ活性の約６０〜７０％が失活し、全蛋白量では約７０
％の蛋白が不溶化した。熱処理溶液に硫酸アンモニウム
を２０％飽和度になるよう添加後、沈澱物を遠心分離機
（１８１００×ｇ、３０分間）を用いて除き、上清４リ
ットルを得た。上清を予め２０％飽和度硫酸アンモニウ
ムを含む５０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.５）で平衡
化したブチル−トヨパール６５０Ｍカラム（６０×４２
０mm １リットル）に４００ml／ｈの流速で通過させ、
３リットルの同緩衝液で洗浄した。続いて硫酸アンモニ
ウムの飽和度を５％ずつ段階的に減少させた同緩衝液を
１リットルずつ流して溶出した。アシルアミノ酸ラセマ
ーゼは硫酸アンモニウム１５％飽和度から１０％に変わ
った時点で、Ｄ−アミノアシラーゼはそれからやや遅れ
てそれぞれ溶出した。アシルアミノ酸ラセマーゼ画分を
集め、脱塩後、予め５０mＭトリス塩酸緩衝液（pＨ７.
５）で平衡化したにＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラ
ム（３０×４７０mm，５００ml）に吸着させた。２リッ
トルの同緩衝液で洗浄し、つづいて同緩衝液に含まれる
食塩の濃度を直線的に変化させ（０〜０.５Ｍ）溶出し
た。これにより混在する小量のＤ−およびＬ−アミノア
シラーゼを除去した。活性画分を集め、限外濾過膜（Ｐ
Ｍ１０，グレースジャパン）を用いて脱塩濃縮後、分子
ふるいカラム（Ｇ３０００ＳＷ，２１.５×６００mm
東ソー）を装着した全自動分取型ＨＰＬＣ（ＨＬＣ−８
３７，東ソー）を用い、０.２Ｍ食塩を含む５０mＭリン
酸緩衝液（pＨ７.０）を４ml／minの速度で流し分子ふ
るいクロマトグラフィーを行った。得られた活性画分は
電気泳動的に均一であり蛋白の精製度はリゾチーム処理
液から約３４０倍、収率は約２８％であった。以上の結
果を〔表２〕に示す。

【００１３】

【表２】 ─────────────────────────────── ステップ 総蛋白質 総活性 比活性 純度 収率 (mg) (units) (units/mg) (fold) (％) ─────────────────────────────── リゾチーム処理 134000 1950 0.015 1.0 100 加熱処理 39900 1550 0.039 2.6 80 BUTYL-Toyopearl 537 1140 2.12 141 59 DEAE-Toyopearl 194 781 4.03 268 40 G3000SW 107 542 5.07 338 28 ───────────────────────────────

【００１４】実施例２Amycolatopsis sp. TS-1-60株由来のアシルアミノ酸ラ
セマーゼの性質 実施例１で示した方法で調製した酵素の性質を調べた。
酵素活性の測定は前記測定法Ａ又はＢのいずれかで行っ
た。 Ａ）基質特異性 光学活性Ｎ−アシルアミノ酸には作用するが、対応する
光学活性なアミノ酸には作用しなかった。アシル基の中
では炭素数３のプロピオニル基に対し最も高い活性を示
した。活性は測定法Ｂに準じ測定し、各基質に対する活
性はＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンに対する活性を１０
０とした相対値で〔表３〕に示した。

【表３】 Ac:N-アセチル， CA:N-クロロアセチル,Fr:N-ホルミ
ル, Pr:N-プロピオニル,Bu:N-ブチリル

【００１５】Ｂ）至適ｐＨ 至適ｐＨは７．４から７．８であった。測定法Ａにおい
てトリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）の代わりにビス
トリス塩酸バッファー（ｐＨ６.０，６.４，６.６，６.
８，７.０，７.２），トリス塩酸バッファー（７.０，
７.４，７.６，７.８，８.０，８.４，９.０，９.５，
１０.０）を用いた。生成したＬ−メチオニンの量比か
ら相対活性を求め、その結果を〔図１〕に示した Ｃ）至適温度 反応至適温度は４０℃から５０℃であった。測定法Ａに
おいてＬ−アミノアシラーゼを除いた反応液を用い反応
後、Ｌ−アミノアシラーゼ１Ｕを加え３０℃，３０分間
反応させた。生成したＬ−メチオニンの量比から相対活
性を求め、その結果を〔図２〕に示した。 Ｄ）熱安定性 本酵素は６０℃，３０分間処理で７３％の残存活性を示
した。熱処理は各温度で３０分間行い、活性の測定は測
定法Ａに従い行った。その結果を〔図３〕に示した。 Ｅ）分子量 分子量の測定はゲル濾過クロマトグラフィー法およびＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）法により行った。ゲル濾過クロマトグラフィーはＴ
ＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．５×６００ｍｍ，
東ソー（株))カラムを用い、０．２Ｍの塩化ナトリウム
を含む５０ｍＭリン酸緩衝液を移動相として０．５ｍｌ
／ｍｉｎの流速で行った。分子量は約３０万と推定され
た。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＳＤＳ−ＰＡＧプレート１０／
２０（第一化学薬品（株))を用い、６０ｍＡ定電流で行
った。サブユニットの分子量は約４万と推定された。

【００１６】Ｆ）金属塩の影響 本酵素活性は塩化コバルトまたは硫酸マンガンを１ｍＭ
添加した場合、無添加に比べて４倍から５倍促進され
た。また、硫酸第一鉄を１０ｍＭ添加した場合、本酵素
の活性は約４倍促進された。活性の測定は測定法Ｂに準
じて行い、生成したＬ−メチオニンの量比から相対活性
を求めた。各種金属塩が本酵素活性に及ぼす影響につい
て調べた結果を〔表４〕に示した。

【表４】 金属塩の酵素活性に及ぼす影響 ────────────────────────── 金属塩 濃度（ｍＭ） 相対活性（％） ────────────────────────── なし １００ MgSO₄・7H₂O １ １３９ MnSO₄・4~6H₂O １ ３８６ FeSO₄・7H₂O １ １０４ １０ ３８２ CoCl₂・6H₂O １ ４９６ NiCl₂・6H₂O １ １５７ CuSO₄・5H₂O １ １５０ １０ ０ ZnSO₄・7H₂O １ １５４ AlCl₃・6H₂O １ ７１ １０ ０ PdCl₂ １ ７ SnCl₂・2H₂O １ ７１ BaCl₂・2H₂O １ ７５ CaCl₂・2H₂O １ ２５ NaCl １ １０４ KCl １ ８２ ──────────────────────────

【００１７】Ｇ）阻害剤の影響 ＳＨ阻害剤ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ＰＣＭＢ）は
１ｍＭで本酵素活性を９４％阻害した。活性の測定は測
定法Ｂに準じて行い、生成したＬ−メチオニンの量比か
ら相対活性を求めた。各種阻害剤が本酵素活性に及ぼす
影響について調べた結果を〔表５〕に示した。

【表５】 阻害剤の酵素活性に及ぼす影響 ────────────────────────────────── 阻害剤 濃度（ｍＭ） 相対活性（％） ────────────────────────────────── なし １００ 硫酸ヒドラジン １ ７２ ジフェニルカルバジド １ ６９ 塩酸ヒドロキシルアミン １ ８６ Ｎ−エチルマレイミド １ ８９ Ｐ−クロロ安息香酸第二水銀(PCMB) １ ６ フェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF) １ ８２ Ｎα−Ｐ−トシル−Ｌ−リシンクロロ メチルケトン塩酸塩 １ ８５ エチレンジアミン四酢酸(EDTA) １ ９０ ５ ３ ──────────────────────────────────

【００１８】

【発明の効果】本発明によると、光学活性アミノ酸の製
造に利用できる有用な酵素であるアシルアミノ酸ラセマ
ーゼを収率よく工業的に有利に製造できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２Ｂで得られた酵素活性とｐＨの関係

【図２】実施例２Ｃで得られた酵素活性と反応温度の関
係

【図３】実施例２Ｄで得られた酵素安定性と温度との関
係

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を有する
   アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０。
2. 【請求項２】アミコラトプシス・スピーシーズ ＴＳ−
   １−６０を培養し、培養液中にアシルアミノ酸ラセマー
   ゼを培養物中に蓄積させ、それを採取することを特徴と
   するアシルアミノ酸ラセマーゼの製造法。