JPH062060B2 - ブタ膵臓性カリクレインの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はカリクレインの精製法に係り、殊にブタ膵臓性
カリクレインの精製法に係る。

（従来の技術） カリクレインは血漿中や組織中のキニノーゲンから生理
活性ペプチドやキニンを特異的に且つ迅やかに遊離させ
る蛋白分解酵素であり、種々の動物の体液や組織内に存
在していることが知られている。このカリクレインは血
流増加、血圧降下作用等の薬理作用を有しており、既に
循環器系医薬品として例えば高血圧症、脳血管障害、動
脈硬化症等の治療薬として使用されており、その需要は
近年増加する傾向にある。

カリクレインはヒトの尿からも抽出精製されるが、工業
的には通常哺乳動物の臓器、殊にブタの膵臓を給源とし
て抽出精製することにより製造されている。医薬品とし
て用いるためにカリクレインを高度に精製する従来法と
しては硫安塩析、溶媒沈澱、カチオン及びアニオン交換
体を用いたイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
等、或いはこれらを適宜組合せる方法や、高価な試薬で
ある阻害剤を用いるアフィニティークロマトグラフィー
等が採用されて来た。

（発明が解決しようとする問題点乃至発明の目的） 本発明者等は、ブタ膵臓性カリクレインに関して鋭意研
究した結果、従来の精製方法によっては分離し得なかっ
た夾雑蛋白の中にカリクレインの品質を劣化させるプロ
テアーゼが含有されていることを見出した。即ち、分子
量及び等電点がカリクレインと極めて近似しているため
に従来の精製法を実施する場合にカリクレインと同様の
挙動を示し、トリプシンやキモトリプシンＡと明らかに
異なる少なくとも２種類のプロテアーゼが、従来のブタ
膵臓性カリクレイン精製品に存在することを見出したの
である。これらのプロテアーゼについて検討を重ねた結
果、基質特異性や阻害剤の作用の仕方等に相違はある
が、カゼイン分解能を有する特異性の低いプロテアーゼ
であり、カリクレインの失活作用やキニン分解作用を有
する酵素であることが判明した。

従って、このようなプロテアーゼが存在しているので、
従来のブタ膵臓性カリクレイン製剤は安定性等の製剤品
質が低下してしまっているものと推定される。

それ故に、本発明の主たる目的は、従来の精製法におい
ては見逃されて来た上記のようなプロテアーゼをも分離
除去することができ、斯くて安定性の更に高いブタ膵臓
性カリクレインの精製法を提供することにある。

本発明の副次的目的は、カリクレインの需要性が既述の
ように高まっている点に鑑みて、大量に且つ安価に高純
度のブタ膵臓性リカクレインを工業的に生産する精製法
を提供することにある。

（問題を解決し且つ目的を達成するための手段及び作
用） 本発明によれば、式 水不溶性担体−Ｘ−Ｒ （式中Ｘは−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨＯＨＣＨ_２−Ｏ−基を意味
し、Ｒは炭素数４以上の脂肪族又は芳香族炭化水素残基
を意味する） にて表わされる、疎水性基結合水不溶性担体に粗製ブタ
膵臓性カリクレイン含有液を接触させてブタ膵臓性カリ
クレインを吸着させる工程と、吸着されたブタ膵臓性カ
リクレインと夾雑物とを疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにより分離する工程とを具備していることを特徴と
する、ブタ膵臓性カリクレインの精製法により、上記の
問題点が解決されると共に上記の目的が達成される。

上記式においてＲで示される疎水性基として、脂肪族炭
化水素残基の場合にはブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘ
プチル、オクチル、ノニル基等を挙げることができ、又
芳香族炭化水素残基の場合にはフェニル、トリル、ナフ
チル。フェナントリル基等を挙げることができる。水不
溶性担体としては不活性且つ不溶性であり、しかも親水
性を有しているものが要求され、このような水不溶性担
体としては例えばアガロース（登録商標Ｓepharose：フ
ァルマシア、ファイン、ケミカルズ社、スウェーデン
国）、デキストラン（登録商標Ｓephadex：ファルマシ
ア、ファイン、ケミカルズ社、スウェーデン国）、セル
ロース（登録商法Ｃellex：バイオ、ラッド社、米
国）、ポリアクリルアマイドゲル（登録商標Ｂio−Ｇe
l：バイオ、ラッド社、米国）等を用いることができ
る。上記式においてＸにて示される結合基の導入は、上
記のＲにて示される疎水性基を有している脂肪族アルコ
ール類（ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘ
プタノール、オクタノール等）又はフェノール類（フェ
ノール、クレゾール、ナフトール等）をエピクロルヒド
リン法（Ｓ．Ｈjertn等「ジャーナル、オブ、クロマ
トグラフィー」第１０１巻２８１頁、１９７４年）によ
り、上記のような水不溶性担体に結合させることにより
実施することができる。

尚、アリール基結合担体としてフェニルセファローズ
（上記式中ＲはＣ_６Ｈ_５）が、又アルキル基結合担体と
してオクチルセファローズ（上記式中ＲはＣ_８Ｃ_１７）
がそれぞれファルマシア、ファイン、ケミカルズ社（ス
ウェーデン国）から市販されているので、これらを購入
し疎水性基結合水不溶性担体として用いることもでき
る。

本発明方法において原料として使用される粗製ブタ膵臓
性カリクレインはイオン交換樹脂例えばＤＥＡＥ−セフ
ァローズ等で部分精製したものであることができる。こ
の部分精製ブタ膵臓性カリクレインの溶液調製や疎水性
基結合水不溶性担体の平衡化は塩化ナトリウム、塩化カ
リウム、硫酸アンモニウム等の電解質を適当な濃度、好
ましくは１Ｍ以上含有する適当な緩衝液、好ましくはｐ
Ｈ６〜８、殊に好ましくはｐＨ６．５〜８の緩衝液を用
いて行われる。

調製された粗製の、即ち上記の部分精製ブタ膵臓性カリ
クレイン含有液と平衡化させた疎水性基結合水不溶性担
体と接触させれば、カリクレインと除去されるべき夾雑
プロテアーゼは疎水性基結合水不溶性担体に吸着され
る。この吸着は主に疎水性基と酵素分子間の疎水性相互
作用によって生起する。カリクレインと夾雑プロテアー
ゼとはこの疎水性相互作用に差があるので、本発明方法
ではこれを利用して両者が分離される。

この分離を行うために本発明方法において採用される疎
水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性基結合水不
溶性担体にカリクレインと夾雑プロテアーゼとを吸着さ
せた後に、溶液のイオン強度（電解質濃度）を下げる
か、或いは溶液の疎水性を高めることにより実施するこ
とができ、前者の場合には例えばグラディエント溶出法
やステップワイズ溶出法を採用することにより、又、後
者の場合には例えばエチルアルコールやエチレングリコ
ール等の有機溶媒を添加する溶出法を採用することによ
り行なうことができる。

尚、このような疎水性相互作用クロマトグラフィー自体
は公知であり、ヒト尿カリクレインの精製に適用するこ
とも報告されているが（特開昭５７−２０３０１５公
報）、ヒト尿と比較する場合にブタ膵臓における蛋白の
種類は極めて多様であり、従って疎水性相互作用クロマ
トグラフィーをヒト尿カリクレインの精製に用いること
ができても、これをブタ膵臓性カリクレインの精製に適
用し得るものとは云い得ないのが実情であることに留意
され度い。

（実施例及び試験例） 次に実施例及び試験例に関連して本発明を具体的に説明
する。尚、各実施例に記載の特性値は下記の測定法によ
り測定されたものである。

ａ）カリクレイン活性 国立衛生試験所製のカリジノゲナーゼ標準品をスタンダ
ードとして、カリクレインに特異的な合成基質であるＨ
−Ｐ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニン−パラニ
トロアニリド（商品コードＳ−２２６６、スウェーデン
国カビ社製）を用いて測定する。

ｂ）プロテアーゼ活性 ハンマーステンカゼイン（西ドイツ国Ｅ．メルク社製）
を基質としてカゼイン水解活性を測定し、測定された活
性単位をクニッツ（Ｋunitz）単位で表わしてプロテア
ーゼ活性とする。

ｃ）蛋白量 波長２８０nmにおける吸光度（Ａ２８０nm）又はローリ
ーフォリン（Ｌowry−Ｆolin）法により測定したローリ
ー蛋白量で表示する。

実施例１ 粗製ブタ膵臓性カリレイン（イオン交換樹脂を用いて部
分精製されたものであって、総カリクレイン活性６２０
ＩＵ、カリクレイン比活性１８ＩＵ／Ａ２８０、カゼイ
ン水解活性１．８２Ｕ／Ａ２８０を有するもの）を３Ｍ
−ＮａＣｌ含有緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化精製ブ
タ膵臓性カリクレイン含有液を調製する。一方、２０ｍ
のフェニルセファローズをカラムに充填し、上記の緩
衝液にてフェニルセファローズを平衡化させ、次いでこ
のカラムに上記の粗製ブタ膵臓性カリクレインを含有液
を導通させて吸着処理を行なった。その後、上記の緩衝
液で洗浄し、ついで３ＭからＯＭのＮａＣｌ含有緩衝で
グラディエント溶出を行なうことによりカリクレインを
分離させた。溶出液を脱塩濃縮して得られた精製ブタ膵
臓性カリクレインは総カリクレイン活性が５８０ＩＵ、
回収率９３％、カリクレイン比活性が４５０ＩＵ／Ａ２
８０（純度上昇度２５倍）であり、カゼイン水解活性が
０．０７Ｕ／Ａ２８０であった。

実施例２ 粗製ブタ膵臓性カリクレイン（イオン交換樹脂を用いて
部分精製されたものであって、総カリクレイン活性７９
００ＩＵ、カリクレイン比活性３３ＩＵ／Ａ２８０、カ
ゼイン水解活性０．７６Ｕ／Ａ２８０のもの）を２．５
Ｍ−ＮａＣｌ含有緩衝液（ｐＨ８．０）にて平衡化させ
て調製する。一方、１００ｍｌのフェニルセファロー
ズをカラムに充填し、上記の緩衝液にてフェニルセファ
ローズを平衡化させ、次いでこのカラムに上記の粗製ブ
タ膵臓性カリクレイン含有液を導通させて吸着処理を行
なった。その後上記の緩衝液で洗浄し、次いで１Ｍ−Ｎ
ａＣｌ含有緩衝液でステップワイズ溶出を行うことによ
りカリクレインを分離させた。溶出液を脱塩濃縮して得
られた精製ブタ膵臓性カリクレインは総カリクレイン活
性が７０００ＩＵ、回収率８８％、カリクレイン比活性
が４７０ＩＵ／Ａ２８０（純度上昇度１４倍）であり、
カゼイン水解活性が０．０４Ｕ／Ａ２８０であった。

実施例３ 粗製ブタ膵臓性カリクレイン（イオン交換樹脂を用いて
部分精製されたものであって。総カリクレイン活性１５
００ＩＵ、カリクレイン比活性３６ＩＵ／Ａ２８０、カ
ゼイン水解活性０．８９Ｕ／Ａ２８０のもの）を１Ｍ−
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４含有緩衝液（ｐＨ６．５）にて平衡
化させて粗製ブタ膵臓性カリクレイン含有液を調製す
る。一方、２５ｍｌのオクチルセファローズをカラムに
充填し上記の緩衝液にてオクチルセファローズを平衡化
させ、次いでこのカラムに上記の粗製ブタ膵臓性カリク
レイン含有液を導通させて吸着処理を行なった。その
後、上記の緩衝液にて洗浄し、次いで０．２Ｍの（ＮＨ
_４）_２ＳＯ_４含有緩衝液でステップワイズ溶出を行なう
ことによりカリクレインを分離させた。溶出液を脱塩濃
縮して得られた精製ブタ膵臓性カリクレインは総カリク
レイン活性が１２３０ＩＵ、回収率８２％、カリクレイ
ン比活性が５２０ＩＵ／Ａ２８０（純度上昇度１４倍）
であり、カゼイン水解活性が０．０５Ｕ／Ａ２８０であ
った。

実施例４ 粗製ブタ膵臓性カリクレイン（イオン交換樹脂を用いて
部分精製されたものであって、総カリクレイン活性１７
６０ＩＵ、カリクレイン比活性３０Ｉ／Ａ２８０、カゼ
イン水解活性／１０８Ｕ／Ａ２８０のもの）を１．５Ｍ
−（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４含有緩衝液（ｐＨ６．５）にて平
衡化させて粗製ブタ膵臓性カリクレイン含有液を調製す
る。一方、２５ｍのオクチルセファローズをカラムに
充填し、上記の緩衝液にてオクチルセファローズを平衡
化させ、次いでこのカラムに上記の粗製ブタ膵臓性カリ
クレイン含有液を導通させて吸着処理を行なった。その
後上記の緩衝液にて洗浄し、３０％エチレングリコール
と１．５Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４とを含有する緩衝液で
溶出させることによりカリクレインを分離させた。溶出
液を脱塩濃縮して得られた精製ブタ膵臓性カリクレイン
は総カリクレイン活性が１５１０ＩＵ／Ａ２８０、回収
率８６％、カリクレイン比活性が４５０ＩＵ／Ａ２８０
（純度上昇度１５倍）であり、カゼイン水解活性が０．
０７Ｕ／Ａ２８０であった。

試験例１ 実施例１〜４において原料として用いられた粗製（部分
精製）ブタ膵臓性カリクレイン及び実施例１〜４におい
て得られた精製ブタ膵臓性カリクレインを用いｐＨ７の
緩衝液により調製したブタ膵臓性カリクレイン溶液を対
照及び被験試料とし、除菌フィルタを通した後に３７℃
密封条件下で各試料をインキュベートした。合成基質で
あるＨ−Ｐ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニン−
パラニトロアニリド（商品コードＳ−２２６６、スウェ
ーデン国カビ社製）を用いて各試料のカリクレイン活性
をインキュベートから０日（即ちインキュベート前）並
びに０．２５、１及び２日経過後に測定し、０日の活性
を１００％とした時の残存率（残存活性）を調べた結果
は第１図のグラフに示される通りであった。

このグラフから、原料の部分精製物に関してはカリクレ
イン活性が次第に低下してゆくのに対し、本発明方法に
より得られた精製物ではインキュベートから２日経過後
においても初期の活性が保持されており、安定性が極め
て高いことが判る。

試験例２ 健康状態が良好な家兎を２日間絶食させた後に、ウレタ
ン１．５ｇ／kgの皮下注射による麻酔下で開腹し、回腸
下部３０〜４０cm支配下の腸間膜動脈及び静脈にカニュ
ーレを施し且つ両端を結紮した腸管内に下記の被験物質
（Ａ〜Ｅ）を投与し、人工栄養液（デキストラン６％を
含有する３７℃のクレブス−リンガ−重炭酸緩衝液（９
５％Ｏ_２−５％ＣＯ_２で飽和）〕を潅流させ、静脈側に
至った潅流液を定時間毎に採取して検体とし、合成基質
であるＰro−Ｐhe−Ａrg−ＭＣＡ（プロリル−フェニル
アラニル−アルギニン−４−メチルクマリル−７−アミ
ド、ペプチド研究所製）の水解活性をＳＢＴI（大豆ト
リプシンインヒビター）存在下に測定し、得られた測定
値をカリクレイン国際単位に換算した結果は後記の表に
示される通りであった。

被験物質及び投与量： Ａ（対照）： 変性カリクレイン ５００ＩＵ／動物 塩酸Ｌ−リジン ０．５ｍｇ 塩酸Ｌ−アルギニン ０．５ｍｇ／動物 Ｂ： 精製カリクレイン（実施例１） ５００ＩＵ／動物 塩酸Ｌ−リジン ０．５ｍｇ 塩酸Ｌ−アルギニン ０．５ｍｇ／動物 Ｃ： 精製カリクレイン（実施例２） ５００ＩＵ／動物 塩酸Ｌ−リジン ０．５ｍｇ 塩酸Ｌ−アルギニン ０．５ｍｇ 牛血清アルブミン ２．０ｍｇ／動物 Ｄ： 精製カリクレイン（実施例３） ５００ＩＵ／動物 コンドロイチン硫酸ナトリウム １．０ｍｇ／動物 Ｅ： 精製カリクレイン（実施例４） ５００ＩＵ／動物 カルボキシメチルセルロースナトリウム １．０ｍｇ／動物 上記の表に示される結果から、本発明方法により精製さ
れたブタ膵臓性カリクレインは腸管吸収性に優れている
ことが判る。この腸管吸収性向上は、精製工程でカリク
レインに構造上の変化が生じなかったためと推定され
た。

（発明の効果） 本発明によるブタ膵臓性カリクレインの精製法は低コス
トで容易に、従って工業的規模で実施することができ、
且つカリクレイン活性を低下させキニン分解作用を有す
る酵素であって従来のブタ膵臓性カリクレインの精製法
では見逃されて来た夾雑プロテアーゼを有効に除去する
ことができ、その結果として本発明方法により得られる
精製物は原料の粗製乃至部分精製物と比較して純度的に
１１〜２５倍精製され、カゼイン水解活性が１／20程度
に低減されて安定性が著しく向上し、しかも予期せぬこ
とに腸管吸収性も向上するのである。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明方法により得られたブタ膵臓性カリクレイ
ンとその原料である部分精製ブタ膵臓性カリクレインを
緩衝液中でインキユベートし、カリクレイン活性を経時
的に測定し、残存活性として表わした安定性試験結果を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 上田 潤子 三重県員弁郡北勢町麻生田麻野3546―１ 三和北勢寮内 (72)発明者 森岡 章博 三重県員弁郡北勢町麻生田麻野3546―１ 三和北勢寮内 (56)参考文献 特開昭57−203015 Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ．Ｐ ｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（1981）Ｐ. 883−896

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 水不溶性担体−Ｘ−Ｒ （式中Ｘは−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨＯＨＣＨ_２−Ｏ−基を意味
   し、Ｒは炭素数４以上の脂肪族又は芳香族炭化水素残基
   を意味する） にて表わされる、疎水性基結合水不溶性担体に粗製ブタ
   膵臓性カリクレイン含有液を接触させてブタ膵臓性カリ
   クレインを吸着させる工程と、吸着されたブタ膵臓性カ
   リクレインと夾雑物とを疎水性相互作用クロマトグラフ
   ィーにより分離する工程とを具備していることを特徴と
   する、ブタ膵臓性カリクレインの精製法。
2. 【請求項２】Ｒがオクチルである疎水性基と結合した水
   不溶性担体が用いられることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項に記載のブタ膵臓性カリクレインの精製法。
3. 【請求項３】疎水性基結合水不溶性担体がオクチルセフ
   ァローズであることを特徴とする、特許請求の範囲第１
   又は２項に記載のブタ膵臓性カリクレインの精製法。
4. 【請求項４】Ｒがフェニルである疎水性基と結合した水
   不溶性担体が用いられることを特徴とする、特許請求の
   範囲第１項に記載のブタ膵臓性カリクレインの精製法。
5. 【請求項５】疎水性基結合水不溶性担体がフェニルセフ
   ァローズであることを特徴とする、特許請求の範囲第１
   又は４項に記載のブタ膵臓性カリクレインの精製法。