JPH062075B2 - 抗ヒトポストヘパリンプラズマ由来リポ蛋白リパーゼモノクローナル抗体およびその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はヒトポストヘパリンプラズマ由来のリポ蛋白リ
パーゼ（以下、ＬＰＬということもある）に対するモノ
クローナル抗体およびその製造方法に関するものであ
り、臨床診断薬や生化学的試薬の分野において有用であ
る。

従来技術と解決課題 ＬＰＬは、カイロミクロンや超低密度リポ蛋白質（VLD
L）の如きヒトリポ蛋白を水解する酵素である。血清の
如きヒト体液中のＬＰＬの増減を知ることは種々の疾
患、特に高リポ蛋白血症や肥満および動脈硬化症などの
病態の解明の指標として有望視されている。

抗ＬＰＬポリクローナル抗体はＬＰＬをマウスやウサギ
に非経口投与（免疫）し、その抗血清を採取し、抗体価
をチエックすることにより得られる。この場合、製造ロ
ット毎に抗体価や性質を異にする抗体が得られる。本発
明者らは、免疫したウサギから必要最少量の抗血清（ポ
リクローナル抗体）を使用に応じて採取する一方でウサ
ギを可能な限り生存させることにより、ほぼ一定の性質
を有するポリクローナル抗体をある程度継続して得てき
た。しかし、この方法ではウサギの死が抗体供給源の喪
失となり、有利な方法ではない。また、抗原たるＬＰＬ
は健常人の血漿中にほとんど見い出されず、ヘパリン溶
液を静脈注射したヒトの血漿（ヒトポストヘパリンプラ
ズマまたはヘパリン還流ヒト血漿ということもある）中
に低濃度で存在するにすぎない。加えて、ＬＰＬは−20
℃での放置や凍結乾燥により徐々にその酵素活性を失な
い、また他の蛋白質の非共存下ではガラス容器に容易に
吸着する。このように抗たるＬＰＬの確保は極めて困難
である。従って、使用の都度ポリクローナル抗体を調製
することは、非現実的である。

かかる事情から抗ＬＰＬモノクローナル抗体を製造する
ことが切望されている。しかし、本発明者らは５度に渡
り、通常の細胞融合技法による抗ＬＰＬモノクローナル
抗体生産性融合細胞の創製を試みたが、目的物は得られ
なかった。

そこで本発明者らは細胞融合技法の全工程を詳細に検討
し、常法どおり脾臓細胞や胸腺細胞の如き支持細胞の存
在下に融合を行うと支持細胞に混在するマクロファージ
がＬＰＬを生産し、これと融合細胞（ハイブリドーマ）
が生産したモノクローナル抗体との間に抗原抗体反応が
おこり、その結果、スクリーニングに支障をきたすこと
が、検討をかさねる内に推定されるようになり、そこで
支持細胞の非存在下にスクリーニングをあえて行ってみ
たところ本発明のモノクローナル抗体生産性融合細胞が
樹立できるとの知見を得、本発明を完成した。

課題を解決するための手段 本発明は、ＬＰＬ定量用試薬や生化学的試薬として有用
な下記性質を有する抗ＬＰＬモノクローナル抗体に関す
る： 酵素活性を持つＬＰＬならびに酵素活性を失った同
酵素を認識する、 次の物と実質的に反応しない、 ヒト肝トリグリセライドリパーゼ ヒト膵リパーゼ ヒトシュードコリンエステラーゼ。

発明のモノクローナル抗体は次の工程、 (1) 抗体生産細胞調製工程、 (2) 融合・スクリーニング・クローニング工程、 (3) モノクローナル抗体製造工程、および (4) モノクローナル抗体精製工程、 を実施することにより得られる。以下、各工程について
説明する。

(1) 抗体生産細胞調製工程 抗体生産細胞は抗原たるＬＰＬで十分免疫した動物の脾
臓より採取できる。

抗原たるＬＰＬは高純度のものを大量に用いるのが最も
好ましい。ＬＰＬは、例えば、心臓手術における血液廃
液から精製される。心臓手術の際、人工心肺装置が用い
られ、体内血液を補う意味でヘパリンを加えた血液が、
同装置をとおして体内に還流され、術後は廃棄される。
この血液からポストヘパリンプラズマが得られる。ポス
トヘパリンプラズマからのＬＰＬの精製は、例えば、ヘ
パリン−セファロース処理、ヒドロキシアパタイト処
理、セファデクッスＧ−150によるゲル濾過などを合理
的に組み合わせることにより実施され、SDS−ポリアク
リルアミド電気泳動において単一のバンドを有するＬＰ
Ｌが得られる。

免疫は、抗原たるＬＰＬをマウスやラットの如き哺乳動
物に投与することにより行える。免疫条件、例えば抗原
たるＬＰＬの使用量、投与部位、アジュバントの種類や
その使用量などの条件は、従来の抗血清を得る場合の条
件がそのまま採用される。通常、免疫はフロインド完全
アジュバントとＬＰＬを含む乳濁液をマウスの如き哺乳
動物に非経口投与し、３週間間隔で数回追加免疫をする
ことにより行われる。免疫は、抗原たるＬＰＬの失活な
どを考慮して、ＬＰＬの精製に引きつづいて行うのがよ
い。最終免疫から２〜５日後に十分免疫した哺乳動物の
脾臓から抗体生産細胞を採取できる。

(2) 融合・スクリーニング・クローニング工程融合
は、融合促進剤の存在下、上記抗体生産細胞ならびに公
知の自己増殖性骨髄腫細胞（以下ミエローマ細胞とい
う）を公知の融合用無血清培地に懸濁し、混合すること
により行える。

一般にミエローマ細胞は、工程(1)で用いた被免疫動物
と同種の動物由来のものであってハイブリドーマ選択培
地で生育できず、かつ、それ自身が抗体を分泌しないも
のが好ましい。このようなミエローマ細胞としては、例
えば市販されているマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-U
1あるいはこれと同等物が挙げられる。

両細胞の混合比は、通常ミエローマ細胞１に対し抗体生
産細胞１〜20である。細胞融合促進剤としては、例えば
ポリエチレングリコールが用いられ、分子量1,000〜7,5
00のものが好ましい。

融合細胞、すなわちハイブリドーマの培養は少なくとも
２回行われる。第１回目の培養は96穴培養皿において行
われる。第１回目の培養は、融合促進剤を洗浄除去しミ
エローマ細胞用培地に懸濁したハイブリドーマを96穴培
養皿にまき、これを約37℃において５％炭酸ガス−空気
中で温置することにより行える。培養中、ＨＡＴ培地の
如き公知のハイブリドーマ選択培地を添加し、その割合
を徐々に高める。このような培地交換によりハイブリド
ーマ以外の細胞は死滅する。

目的とするハイブリドーマのスクリーニング（１次スク
リーニング）は、培養液中の抗体価を調べることにより
行える。１次スクリーニングは、ニトロセルロース膜付
き96穴培養皿に抗原たるＬＰＬを固定したものを準備
し、これに培養上清を加えて抗原抗体反応を行わせし
め、これに抗lgG−ピオチン複合物、更にアビジン−ビ
オチン−パーオキシダーゼ複合物を順次反応させ、常法
によりパーオキシダーゼ活性を測定することにより実施
できる。パーオキシダーゼ活性が認められる場合を抗体
価陽性と判定する。

第２回目の融合細胞の培養は24穴培養皿において行われ
る。すなわち第２回目の培養は、第１回目の培養におい
て陽性と判定された培養物を24穴培養皿にまき、第１回
目と同様にして培養することにより実施できる。細胞密
度を一定に保持し、融合細胞の増殖を助長する支持細胞
（マウスの脾細胞や胸腺細胞など）は、培養物の抗体価
の検定をさまたげるので、第１回目ならびに第２回目の
培養をつうじて添加されることはない。このような制御
された条件でようやく増殖してきた第２回目の培養上清
について２次ならびに３次スクリーニングを行う。

２次スクリーニングは、１次スクリーニングと同様なＬ
ＰＬ固定ニトロセルロース膜を有する穴とそうでない穴
とを準備しておき、これらの穴に第２回目の培養上清を
添加し、以下１次スクリーニングと同様な操作を行い、
ＬＰＬ固定膜の穴が陽性で、そうでない穴が陰性の培養
物を選択する。

１次および２次スクリーニングは、ＬＰＬ固定化ニトロ
セルロース膜を用いる方法であり、ＬＰＬを固定化する
際、ＬＰＬの抗原性は失なわれていないが、そのリパー
ゼ活性は喪失している。そこで３次スクリーニングで
は、リパーゼ活性を指標とする抗体価の検定を行う。す
なわち、３次スクリーニングは、第２回目の培養上清に
ＬＰＬを反応させ抗原抗体複合物を形成せしめ、この複
合物を第２抗体を用いて沈殿として捕足せしめ、その上
清のＬＰＬのリパーゼ活性を測定することにより実施で
き、リパーゼ活性が低いほど抗体価が高いと判断され
る。ＬＰＬのリパーゼ活性は放射性元素で標識された基
質、例えば¹⁴Ｃトリオレインを用いて測定できる。な
お、特公昭57-21998号明細書に開示されている合成基質
BALBを用いるリパーゼ活性の測定法は、上清中のリパー
ゼ活性が弱いので適用できない。

このようにしてスクリーニングした培養物について限界
希釈法を適用することにより目的とする抗ＬＰＬモノク
ローナル抗体を生産するクローン化ハイブリドーマが創
製できる。このハイブリドーマは継代培養または凍結に
より半永久的に保存できる。

(3) モノクローナル抗体の製造工程 前工程で得たクローン化ハイブリドーマをin vitroまた
はin vivoで培養すれば本発明のモノクローナル抗体が
生産できる。

in vitroでの培養は、96穴培養皿中での数個のハイブリ
ドーマの培養から始め、徐々にスケールアップすること
により行える。またin vivoでの培養は、融合細胞の増
殖を容易にさせるためのプリスタン（pristane）処理を
したマウスにハイブリドーマを腹腔内に接種することに
より実施でき、10〜20日後にはモノクローナル抗体を含
む腹水が蓄積される。

一般に、in vitroでの培養は高純度のモノクローナル抗
体を得たいときに行われ、in vivoでの培養は大量のモ
ノクローナル抗体を得たいときに行われる。ＬＰＬの定
量にはin vivoでの培養で蓄積された腹水をそのまま利
用することもできるが、必要に応じ更に精製してもよ
い。

(4) モノクローナル抗体精製工程 必要に応じて行われるin vitroでの培養物またはin viv
oの培養で蓄積された腹水からのモノクローナル抗体の
分離精製は、通常の物理化学的手段、例えば塩析、透
析、不溶性担体と結合しているプロテインＡを用いるア
フィニティークロマトグラフィーの如き各種カラムクロ
マトグラフィーなどの手段を合理的に組合せることによ
り行える。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は特にＬ
ＰＬ定量用試薬として有用である。本発明のモノクロー
ナル抗体を用いるＬＰＬの定量は酵素標識抗ＬＰＬモノ
クローナル抗体と不溶化抗ＬＰＬモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体を用いるサンドイッチＥＩＡ法によ
り実施できる。

具体例 実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。

なお、以下では次の培地を用いた。

細胞融合用無血清培地（フロー社） RPMI-1640培地に以下を添加した培地。

50U/mlペニシリンＧ 50μｇ／mlストレプトマイシン ＨＡＴ培地 RPMI‐1640培地に以下を添加した培地。

15％ウシ胎児血清（非必須アミノ酸含有） ２mMグルタミン １mMピルビン酸ナトリウム 50U/mlペニシリンＧ 50μｇ/mlストレプトマイシン 13.61mg/ヒポキサンチン 0.18mg/アミノプテリン 3.88mg/チミジン 実施例１ モノクローナル抗体の製造 (1) ハイブリドーマの創製 抗原の調製 抗原たるＬＰＬは、心臓手術において用いられ、不要に
なったヘパリン添加血液から得たポストヘパリンプラズ
マ21を２回のヘパリン結合セファロースカラム処理、
ヒドロキシアパタイトカラム処理およびセファデックス
G-150カラム処理により精製したものを直ちに免疫抗原
として用いた。なお、精製ＬＰＬはＳＤＳ‐ポリアクリ
ルアミド電気泳動法で単一バンドを示し、その分子量は
61キロダルトンと推定された。

抗体生産細胞の調製 ＬＰＬを含む0.15M NaCl−0.01Mリン酸緩衝液(pH 7.2)
の0.6mlに等量のフロインド完全アジュバント（ディフ
コ社）およびマンニドモノオレート溶液の２滴を加えて
乳化したもの0.5ml（蛋白量として80μｇのＬＰＬ含
有）をBALB／ｃマウス（静岡実験動物協同組合）皮内お
よび皮下に分けて投与し、３週間間隔で３回同様に免疫
する。最終免疫後４日後に脾臓を取り出して抗体生産細
胞を採取する。

融合と第１回目の培養 対数増殖期にあるマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-U1
(ATCCカタログ番号CRL1597）の５×10⁷個と抗体生産細
胞の１×10⁸個を混合し、の培地で遠心（400×ｇ、10
分）洗浄後、37℃に保温した0.5mlのポリエチレングリ
コール1500（和光純薬）−RPMI-1640培地（１：１）を
徐々に加え、ゆっくり攪拌する。90秒後、37℃に保温し
た10mlの培地を同様にして加える。10分後、更に10ml
の培地を加えた後、遠心（400×ｇ、10分）し上清を
除去する。得られるペレットに200mlの培地を徐々に
加える。この0.2mlずつを96穴培養皿にまき、37℃にお
いて５％炭酸ガス−空気中で培養する。５，10，15日後
に新らしい培地0.05mlずつを穴に加える。培養開始７
日後にハイブリドーマの生育が始り、15日目には80％の
穴に生育が認められる。

抗体価の検定（１次スクリーニング） 培養15日後の培養液の抗体価を次のようにして調べた。

ニトロセルロース膜付き96穴培養皿（ミリタイターＨ
Ａ：日本ミリポア社）をトリス緩衝液（20mMトリス、50
0mMNaCl、pH7.5）で吸引洗浄し、膜を同緩衝液で平衡化
する。これに30ngのＬＰＬを含む0.1％ＢＳＡ溶液２μ
ｌを加え、室温で１時間放置し、ツイーン20（0.05％）
を含む同トリス緩衝液400μｌで２回吸引洗浄する。こ
れに１％ＢＳＡ含有同トリス緩衝液250μｌを穴に添加
後、吸引し、ツイーン20含有同トリス緩衝液400μｌで
２回吸引洗浄する。穴に培養上清100μｌを添加し、室
温で１晩放置し、ツイーン20を含む同トリス緩衝液400
μｌで吸引洗浄する。穴に抗マウスIgG抗体−ビオチン
複合物溶液（ベクター社）の45μｌをツイーン含有同ト
リス緩衝液10mlで希釈した溶液100μｌを添加し、吸引
後、室温で放置する。１時間後、これをツイーン20含有
同トリス緩衝液400μｌで３回吸引洗浄し、穴にアビジ
ン−ビオチン−パ−オキシダーゼ複合物溶液（ＡＢＣ試
薬：ベクター社）の90μｌをツイーン含有同トリス緩衝
液10mlで希釈した溶液100μｌ添加し室温で１時間放置
する。吸引後、バイオラッド社製のパーオキシダーゼ活
性測定用試薬を用い、手順に従ってパーオキシダーゼ活
性を測定する。

第２回目の培養 １次スクリーニングで抗体価が陽性である培養物を第１
回目と同様にして24穴培養皿中で培養する。培養開始後
３日目にハイブリドーマの生育が始まり７日後には90％
以上の穴に生育が認められる。

２次スクリーニング 第２回目の培養上清について、先に説明した方法で２次
スクリーニングを実施し、ＬＰＬ固定化ニトロセルロー
ス膜において陽性であり、かつＬＰＬ非固定化膜におい
て陰性の培養物120種を選択する。

３次スクリーニング ２次スクリーニングで選択した120種の培養物につい
て、以下の３次スクリーニングを実施する。

第２回目の培養上清100μｌと20μｌのＬＰＬ溶液（５n
gのＬＰＬを0.1 ％ＢＳＡ水溶液に溶解）とを混合し、
氷上で２時間放置後、指示書に従って調製した20μｌの
第２抗体（抗マウスIgGウサギ抗体）溶液（マイルス
社）を添加し、氷上で放置する。２時間後、遠心（7500
×ｇ、10分間）し、上清を得る。上清110μｌ、指示書
に従って調製した40μｌのアポ蛋白Ｃ−IIを含む¹⁴Ｃ‐
トリオレイン溶液（ニュイングランドニュクリア社）お
よび150μｌの10％ＢＳＡ−0.4Ｍトリス緩衝液（pH 8.
2）を混合し、37℃で20分間温置する。反応混液にヘプ
タン−クロロホルム−メタノール（６：7.5：8.4）混液
３mlおよび0.5Ｎ水酸化ナトリウム水溶液0.5mlを加え、
よく振る。混液を遠心（7500×ｇ、10分間）し、水層
（上清）を分離し、遊離した¹⁴Ｃ脂肪酸を液体シンチレ
ータ法で測定する。

クローニング １〜２次スクリーニングにおいて陽性であり、３次スク
リーニングで高抗体価と判定された培養物15種を96穴培
養皿にハイブリドーマ１個／穴になるように培地で希
釈し、培養する。このような限界希釈培養をくりかえす
ことによりクローニングを行い、クローン化ハイブリド
ーマを得る。

(2) モノクローナル抗体の製造 前項で得たハイブリドーマの１×10⁷個を、予めプリス
タン（アルドリッチ社）0.5mlを腹腔内投与したBALB/c
マウスの腹腔内に接種する。15日目に目的とするモノク
ローナル抗体を含む腹水８ml／マウスを得る。

(3) モノクローナル抗体の性質 かくして得られるモノクローナル抗体の性質は次のとお
りである。

酵素活性を持つＬＰＬならびに酵素活性を失った同
酵素を認識する。

次のリパーゼ類と実質的に反応しない。

ヒト肝トリグリセライドリパーゼ ヒト膵リパーゼ ヒトシュードコリンエステラーゼ はスクリーニング工程で酵素活性を失ったＬＰＬなら
びに酵素活性を失っていないＬＰＬを抗原として使用し
たことから明らかである。また、のリパーゼ類と抗Ｌ
ＰＬモノクローナル抗体が交差反応しないことは、先に
述べた３次スクリーニングにおいて、ＬＰＬの代りに上
記リパーゼ類を添加するほかは同様な操作を行い、得ら
れる上清のリパーゼ活性を同様にして測定し、その回収
率がほぼ100％であることから確認した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，878（２），168 −176（1986)

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の性質を有する抗ヒトポストヘパリン
   プラズマ由来のリポ蛋白リパーゼモノクローナル抗体； (a) ヒトポストヘパリンプラズマ由来の酵素活性を持
   つリポ蛋白リパーゼならびに酵素活性を失った同酵素を
   認識する、 (b) 次の酵素と実質的に反応しない、 ヒト肝トリグリセライドリパーゼ ヒト膵リパーゼ ヒトシュードコリンエステラーゼ
2. 【請求項２】抗体生産性細胞と自己増殖性骨髄腫細胞と
   を融合し、これを培養し、請求項１記載のモノクローナ
   ル抗体を生産する融合細胞を選択し、選択した融合細胞
   に請求項１記載のモノクローナル抗体を生産せしめるこ
   とからなるモノクローナル抗体の製造方法において、融
   合細胞の上記培養および選択を実質的に支持細胞の非存
   在下に行うことを特徴とする請求項１記載のモノクロー
   ナル抗体の製造方法。