JPH062079B2 - マグネシウムの定量法 - Google Patents
マグネシウムの定量法Info
- Publication number
- JPH062079B2 JPH062079B2 JP24775984A JP24775984A JPH062079B2 JP H062079 B2 JPH062079 B2 JP H062079B2 JP 24775984 A JP24775984 A JP 24775984A JP 24775984 A JP24775984 A JP 24775984A JP H062079 B2 JPH062079 B2 JP H062079B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- magnesium
- concentration
- atp
- absorbance
- present
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 (イ)産業上の利用分野 この発明は、マグネシウムの定量法に関する。
更に詳しくは、２種類の酵素を分析試薬としたマグネシ
ウムの定量法に関する。
ウムの定量法に関する。
(ロ)従来技術 現在、臨床検査室において、キレート法であるキシリジ
ルブルー法が、血清中のマグネシウムを定量する方法と
して最もよく使用されている。
ルブルー法が、血清中のマグネシウムを定量する方法と
して最もよく使用されている。
このキシリジルブルー法は、比色定量試薬としてキシリ
ジルブルーを用いたもので、ホウ砂緩衝液でpH9にした
８０％エタノール溶液中、赤色錯体をマグネシウムと生
成する性質を利用した方法である。
ジルブルーを用いたもので、ホウ砂緩衝液でpH9にした
８０％エタノール溶液中、赤色錯体をマグネシウムと生
成する性質を利用した方法である。
しかしながら、かような方法では、マグネシウムの選択
性が悪いため、得られた値に大きなバラツキが生じると
いう問題点がある。
性が悪いため、得られた値に大きなバラツキが生じると
いう問題点がある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、まず検体中のグルコー
スやATPを定量する反応原理である次式， （式中、ATPは、アデノシン5'−三リン酸、ＡＤＰは、
アデノシン5'−二リン酸、NADP+は、酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれ意味す
る。
スやATPを定量する反応原理である次式， （式中、ATPは、アデノシン5'−三リン酸、ＡＤＰは、
アデノシン5'−二リン酸、NADP+は、酸化型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸をそれぞれ意味す
る。
において、上記ヘキソキナーゼ反応には、マグネシウム
が必要であり、このマグネシウムイオンがATPと結合
し、ATP-Mgの形になつてはじめてヘキソキナーゼの基質
になる天に着目した。そして更に研究の結果、マグネシ
ウムイオン濃度が、ATP濃度と等モル近辺になるまで
は、ヘキソキナーゼの反応速度が、マグネシウムイオン
濃度に従つて増加するが、マグネシウムイオン濃度がAT
Pのモル濃度を越えると、マグネシウムイオン濃度に関
係なく、ヘクソキナーゼの反応速度は一定になる点を見
出し、これに基づいてマグネシウムの定量を行なう点に
想着し、この発明に到達した。
が必要であり、このマグネシウムイオンがATPと結合
し、ATP-Mgの形になつてはじめてヘキソキナーゼの基質
になる天に着目した。そして更に研究の結果、マグネシ
ウムイオン濃度が、ATP濃度と等モル近辺になるまで
は、ヘキソキナーゼの反応速度が、マグネシウムイオン
濃度に従つて増加するが、マグネシウムイオン濃度がAT
Pのモル濃度を越えると、マグネシウムイオン濃度に関
係なく、ヘクソキナーゼの反応速度は一定になる点を見
出し、これに基づいてマグネシウムの定量を行なう点に
想着し、この発明に到達した。
(ハ)目的 この発明は、前記問題点に鑑みなされたものであり、ヘ
キソキナーゼとグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下、Ｇ６PDHと省略）の２種類の酵素を分析試薬とし、
それによつてマグネシウムの選択性が良く、検出感度が
高くかつ測定値にバラツキを生じないマグネシウムの定
量法を提供することを主目的とする。
キソキナーゼとグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下、Ｇ６PDHと省略）の２種類の酵素を分析試薬とし、
それによつてマグネシウムの選択性が良く、検出感度が
高くかつ測定値にバラツキを生じないマグネシウムの定
量法を提供することを主目的とする。
(ニ)構成 かくしてこの発明によれば、検体中に含まれるマグネシ
ウムの測定予定濃度より過剰量のアデノシン5'−三リン
酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸を添加した混合物に、ヘキソキナーゼとグルコース−
６−リン酸脱水素酸素を反応させて還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸を生成させ、波長３４
０nmにおける吸光度を求め、既知濃度のマグネシウムと
の吸光度と比較して、検体中のマグネシウム濃度を定量
することを特徴とするマグネシウムの定量法が提供され
る。
ウムの測定予定濃度より過剰量のアデノシン5'−三リン
酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸を添加した混合物に、ヘキソキナーゼとグルコース−
６−リン酸脱水素酸素を反応させて還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸を生成させ、波長３４
０nmにおける吸光度を求め、既知濃度のマグネシウムと
の吸光度と比較して、検体中のマグネシウム濃度を定量
することを特徴とするマグネシウムの定量法が提供され
る。
この発明の最も特徴とする点は、前述のごとく、マグネ
シウムイオン濃度とATP濃度の間に相関関係を見出した
点にある。
シウムイオン濃度とATP濃度の間に相関関係を見出した
点にある。
このことを第１図で説明する。図において縦軸は３４０
nmにおける還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（以下、NADPHと省略）の吸光度変化量、横軸
はマグネシウムの濃度（単位ｍＭ）をそれぞれ示し、○
は０．２５（ｍＭ）、●は０．５０（ｍＭ）、 は１．５０（ｍＭ）のATP濃度のものを示す。図から明
らかなように、マグネシウムイオン濃度がATP濃度を越
えると、マグネシウム濃度に関係なく、NADPHの波長３
４０nmにおける吸光度が一定になる。つまり前述したよ
うなマグネシウムイオンがATPと結合し、ATP-Mgの形に
なつてはじめてヘキソキナーゼの基質になるということ
と考え合わせてみると、波長３４０nmにおけるNADPHの
吸光度を、まず種々の既知濃度のマグネシウムについて
求め、それを指標とし、それと未知濃度のマグネシウム
を含む検体について求めた吸光度とを比較すれば、検体
中の未知濃度のマグネシウム濃度を定量できることにな
る。
nmにおける還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（以下、NADPHと省略）の吸光度変化量、横軸
はマグネシウムの濃度（単位ｍＭ）をそれぞれ示し、○
は０．２５（ｍＭ）、●は０．５０（ｍＭ）、 は１．５０（ｍＭ）のATP濃度のものを示す。図から明
らかなように、マグネシウムイオン濃度がATP濃度を越
えると、マグネシウム濃度に関係なく、NADPHの波長３
４０nmにおける吸光度が一定になる。つまり前述したよ
うなマグネシウムイオンがATPと結合し、ATP-Mgの形に
なつてはじめてヘキソキナーゼの基質になるということ
と考え合わせてみると、波長３４０nmにおけるNADPHの
吸光度を、まず種々の既知濃度のマグネシウムについて
求め、それを指標とし、それと未知濃度のマグネシウム
を含む検体について求めた吸光度とを比較すれば、検体
中の未知濃度のマグネシウム濃度を定量できることにな
る。
この発明に用いるヘキソキナーゼ及びG6PDHとしては、
従来の血液中グルコース検出用のものをそのまま用いる
ことができる。またこの発明の対象とする検体は、通
常、血清のまま被検液として反応に供せられる。
従来の血液中グルコース検出用のものをそのまま用いる
ことができる。またこの発明の対象とする検体は、通
常、血清のまま被検液として反応に供せられる。
この発明における吸光度の変化は、適当な光度計を用い
て測定できる。適当な光度計としては、たとえば、自記
分光光度計ＵＶ−２４０（（株）島津製作所製）等が挙
げられる。
て測定できる。適当な光度計としては、たとえば、自記
分光光度計ＵＶ−２４０（（株）島津製作所製）等が挙
げられる。
なお、かような光度計に、マイクロプロセツサを用いた
マグネシウム濃度換算器とリンクすれば、自動測定が可
能となる。かような濃度換算は、検量からのフアクター
計算及びデータ入力により容易にプログラム設定するこ
とができる。
マグネシウム濃度換算器とリンクすれば、自動測定が可
能となる。かような濃度換算は、検量からのフアクター
計算及びデータ入力により容易にプログラム設定するこ
とができる。
(ホ)実施例 以下、実施例で本発明を詳説するが、これによつてこの
発明は限定されるものではない。
発明は限定されるものではない。
実施例１ （マグネシウム濃度と吸光度との相関） マグネシウム濃度と吸光度との相関関係を求めるため
に、各マグネシウム濃度における吸光度を測定した。
に、各マグネシウム濃度における吸光度を測定した。
まず、0.5ｍＭのATP、0.5ｍＭのNADP、１１１ｍＭのグ
ルコースを含む５０ｍＭのPH8.5のTirs-Hcl緩衝液3.0ml
に、各既知濃度のマグネシウム標準液（１、２、３、
４、５及び６mg/dl）0.02mlをそれぞれ添加し、５分
間、30℃で予備インキユベートした後１４units/mlのヘ
キソキナーゼ及び３０units/mlのG6PDHからなる酵素溶
液(50μ)を加え３０℃で１５分間インキユベート後、
反応停止剤として0.2ＭのEDTA・４Na溶液0.1mlを加え、
分光光度計ＵＶ−１２０−０２（（株）島津製作所製）
にて、波長３４０nmにおけるNADPHの吸光度を求めた。
ルコースを含む５０ｍＭのPH8.5のTirs-Hcl緩衝液3.0ml
に、各既知濃度のマグネシウム標準液（１、２、３、
４、５及び６mg/dl）0.02mlをそれぞれ添加し、５分
間、30℃で予備インキユベートした後１４units/mlのヘ
キソキナーゼ及び３０units/mlのG6PDHからなる酵素溶
液(50μ)を加え３０℃で１５分間インキユベート後、
反応停止剤として0.2ＭのEDTA・４Na溶液0.1mlを加え、
分光光度計ＵＶ−１２０−０２（（株）島津製作所製）
にて、波長３４０nmにおけるNADPHの吸光度を求めた。
一方、上記既知濃度のマグネシウム標準液の代わりに種
々の患者血清0.02mlを添加し、上記と同様にして吸光度
を求めた。更にわかりやすくするために、これらの手順
を第１表にまとめる。
々の患者血清0.02mlを添加し、上記と同様にして吸光度
を求めた。更にわかりやすくするために、これらの手順
を第１表にまとめる。
表中、(a)は０．５ｍＭのATP、0.5ｍＭのNADP、１１１
ｍＭのグルコースを含む５０ｍＭのpH8.5のTris-Hcl緩
衝液，(b)は、0.2のエチレンジアミン四酢酸・四ナトリ
ウム，(c)は、１４units／mlヘキソキナーゼと３０unit
s／mlのG6PDHをそれぞれ示す。
ｍＭのグルコースを含む５０ｍＭのpH8.5のTris-Hcl緩
衝液，(b)は、0.2のエチレンジアミン四酢酸・四ナトリ
ウム，(c)は、１４units／mlヘキソキナーゼと３０unit
s／mlのG6PDHをそれぞれ示す。
得られた結果を第２図に示す。縦軸は吸光度、横軸は時
間(分)である。
間(分)である。
また各既知濃度のマグネシウム標準液からの結果をもと
にして第３図に示す検量線を作成した。縦軸は、３４０
nmにおけるNADPHの吸光度、横軸は、マグネシウム濃度
（mg／dl）である。
にして第３図に示す検量線を作成した。縦軸は、３４０
nmにおけるNADPHの吸光度、横軸は、マグネシウム濃度
（mg／dl）である。
（考案） 吸光度変化からの計算により、マグネシウムイオンは４
回繰り返し使用されていることがわかつた。
回繰り返し使用されていることがわかつた。
なお、Albertyは、ATP-MgのマグネシウムイオンとATPへ
の平衝定数は1.0×１０-4、ADP-Mgのマグネシウムイオ
ンとADPへの平衡定数は9.8×１０-4であるので、該２式
より、ATPとADPのモル濃度が等しい場合、ATP-Mgの親和
製（アフイニテイー）はADP-Mgの親和性の約１０倍であ
ると報告している。
の平衝定数は1.0×１０-4、ADP-Mgのマグネシウムイオ
ンとADPへの平衡定数は9.8×１０-4であるので、該２式
より、ATPとADPのモル濃度が等しい場合、ATP-Mgの親和
製（アフイニテイー）はADP-Mgの親和性の約１０倍であ
ると報告している。
一方、本発明においては、0.5ミリモル濃度のATPを使用
しているので、試験管内のATPとADP、すなわちATPとマ
グネシウムイオンとのモル比は約５０：１になるため、
その結果、ATP-Mgの親和性はADP-Mgの親和性の約５００
倍にもなる。それゆえ、ヘキソキナーゼ反応によつて作
られたADP-Mgのマグネシウムは直ちにATPと結合してATP
-Mgになり、基質として繰り返し使用されると考えられ
る。
しているので、試験管内のATPとADP、すなわちATPとマ
グネシウムイオンとのモル比は約５０：１になるため、
その結果、ATP-Mgの親和性はADP-Mgの親和性の約５００
倍にもなる。それゆえ、ヘキソキナーゼ反応によつて作
られたADP-Mgのマグネシウムは直ちにATPと結合してATP
-Mgになり、基質として繰り返し使用されると考えられ
る。
比較例１ （従来法との相関） 本発明によつて得られた血清マグネシウムの結果と従来
法の一つであるキシリジルブルー法によつて得られた結
果との相関を第４図に示した。
法の一つであるキシリジルブルー法によつて得られた結
果との相関を第４図に示した。
図から明らかなように、本発明方法による測定値は、キ
シリジルブルー法の測定値より約１３％程、低い値を示
した。
シリジルブルー法の測定値より約１３％程、低い値を示
した。
更に本発明によつて得られた結果と、現在、血清マグネ
シウムの最も正確な測定法であると言われている原子吸
光法によつて得られた結果との相関を第５図に示した。
シウムの最も正確な測定法であると言われている原子吸
光法によつて得られた結果との相関を第５図に示した。
図から明らかなように両方法による値は非常によく一致
し、本発明による方法が正確度の高いものであることが
わかる。
し、本発明による方法が正確度の高いものであることが
わかる。
なお、血清中には、約７０％にイオン型マグネシウムと
約３０％のタンパク質結合マグネシウムが存在すると言
われている。本発明方法はマグネシウムイオンだけを測
定しているにもかかわらず、総マグネシウムを測定して
いる原子吸光法によつて得られた結果と一致しているた
め、本発明方法も血清中の総マグネシウムを測定してい
ると考えられる。これは、ATP-Mgの親和性が、ADP-Mgの
親和性より、はるかに大きいと同様に、タンパク質とマ
グネシウムの親和性よりもATP-Mgの親和性がはるかに大
きいために、タンパク質結合マグネシウムのマグネシウ
ムが、ＡＴＰにとられて反応系に入つていくため、血清
中の総マグネシウムを測定していると思われる。
約３０％のタンパク質結合マグネシウムが存在すると言
われている。本発明方法はマグネシウムイオンだけを測
定しているにもかかわらず、総マグネシウムを測定して
いる原子吸光法によつて得られた結果と一致しているた
め、本発明方法も血清中の総マグネシウムを測定してい
ると考えられる。これは、ATP-Mgの親和性が、ADP-Mgの
親和性より、はるかに大きいと同様に、タンパク質とマ
グネシウムの親和性よりもATP-Mgの親和性がはるかに大
きいために、タンパク質結合マグネシウムのマグネシウ
ムが、ＡＴＰにとられて反応系に入つていくため、血清
中の総マグネシウムを測定していると思われる。
比較例２ （妨害イオンの検討） 本発明方法が、マグネシウムイオン以外のイオンによつ
て、どのように影響されるか、種々のイオンを添加して
マグネシウムを定量した。その結果を第２表に示した。
て、どのように影響されるか、種々のイオンを添加して
マグネシウムを定量した。その結果を第２表に示した。
表から明らかなように、試験されたイオンの中では、マ
ンガンイオンだけが正の誤差、たとえば、３mg／dlのマ
ンガンイオンは約１０％程、高い値を与えているが、通
常、血清中には、このような高濃度のマンガンイオンは
存在しないので、分析上、妨害イオンの問題はないこと
がわかる。
ンガンイオンだけが正の誤差、たとえば、３mg／dlのマ
ンガンイオンは約１０％程、高い値を与えているが、通
常、血清中には、このような高濃度のマンガンイオンは
存在しないので、分析上、妨害イオンの問題はないこと
がわかる。
(ヘ)効果 この発明の方法によれば、マグネシウム濃度の定量を正
確に行うことができ、またキシリジルブルー法に比べて
選択性が良く、得られた値にバラツキをほとんど生じな
い優れたものとなる。
確に行うことができ、またキシリジルブルー法に比べて
選択性が良く、得られた値にバラツキをほとんど生じな
い優れたものとなる。
また、マイクロプロセツサを用いた自動化も容易である
という効果も備えている。
という効果も備えている。
第１図は、ATP濃度のマグネシウム濃度との関係から吸
光度を求めるためのグラフ、第２図は、マグネシウム標
準液と患者血清との吸光度をそれぞれ示したグラフ、第
３図は、吸光度とマグネシウム濃度との相関関係を求め
た検量線、第４図は、本発明方法と１従来法とのマグネ
シウム濃度の相関関係を示すグラフ、第５図は、本発明
方法と他の１従来法との第４図相当図である。
光度を求めるためのグラフ、第２図は、マグネシウム標
準液と患者血清との吸光度をそれぞれ示したグラフ、第
３図は、吸光度とマグネシウム濃度との相関関係を求め
た検量線、第４図は、本発明方法と１従来法とのマグネ
シウム濃度の相関関係を示すグラフ、第５図は、本発明
方法と他の１従来法との第４図相当図である。
Claims (1)
- 【請求項１】検体中に含まれるマグネシウムの測定予定
濃度より過剰量のアデノシン５′−三リン酸と酸化型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を添加した
混合物に、ヘキソキナーゼとグルコース−６−リン酸脱
水素酸素を反応させて還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸を生成させ、波長３４０nmにおける
吸光度を求め、既知濃度のマグネシウムとの吸光度と比
較して、検体中のマグネシウム濃度を定量することを特
徴とするマグネシウムの定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24775984A JPH062079B2 (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | マグネシウムの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24775984A JPH062079B2 (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | マグネシウムの定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61124398A JPS61124398A (ja) | 1986-06-12 |
| JPH062079B2 true JPH062079B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=17168237
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24775984A Expired - Lifetime JPH062079B2 (ja) | 1984-11-22 | 1984-11-22 | マグネシウムの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062079B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5925570A (en) * | 1991-12-25 | 1999-07-20 | Iatron Laboratories, Inc. | Method of measuring metals in samples of living body |
-
1984
- 1984-11-22 JP JP24775984A patent/JPH062079B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61124398A (ja) | 1986-06-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rosenberg et al. | An enzymatic-spectrophotometric determination of pyruvic and lactic acid in blood: methodologic aspects | |
| Chromý et al. | Determination of serum creatinine by Jaffe method and how to calibrate to eliminate matrix interference problems. | |
| JPH0653078B2 (ja) | 無機リンの測定法 | |
| GB1601771A (en) | Kinetic method for determination of glucose concentrations with glucose dehydrogenase | |
| Ishihara et al. | Enzymatic determination of ammonia in blood plasma | |
| Masayoshi et al. | A new enzymatic method to determine creatine | |
| WO1992020817A1 (fr) | Determination tres precise d'une quantite de d-glucose-6-phosphate, et composition a cet effet | |
| JPH02104298A (ja) | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 | |
| US3649198A (en) | Diagnostic method for the determination of uric acid in blood | |
| JPH062079B2 (ja) | マグネシウムの定量法 | |
| CN112255219A (zh) | 一种1,5-脱水山梨醇的测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN111057746A (zh) | 一种肌酸激酶同工酶测定试剂盒 | |
| JP3170320B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| JP2994831B2 (ja) | コレステロールの定量法および定量用試薬 | |
| WO2011013464A1 (ja) | デヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法および測定用キット | |
| Mazzachi et al. | A manual spectrophotometric method for the measurement of serum sodium and potassium by enzyme activation | |
| JP3217180B2 (ja) | 物質の測定法 | |
| JP2761768B2 (ja) | Ｎａｄｈの定量法及びそれを用いた胆汁酸の定量法 | |
| JP5633669B2 (ja) | Ａｄｐの測定方法およびａｄｐ測定用キット | |
| DiCesare | Optimum kinetic enzymatic procedures for glucose and triglycerides in plasma and serum | |
| EP0387697A2 (en) | Determination of aminotranferases | |
| JPS5931696A (ja) | クレアチニンの定量方法 | |
| EP0022757B1 (en) | Method for determining creatine kinase in samples containing atp | |
| JPH012598A (ja) | カルシウムの測定方法 | |
| JP3078881B2 (ja) | 生体試料中の成分測定法 |