JPH012598A - カルシウムの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素を用いた間接的カルシウムの測定方法に
関する。

〔従来の技術〕

カルシウム特に、血清中の微量なカルシウムの定址分析
は、実用基準法である原子吸光法やイオンクロマトグラ
フィーなどがあるが、臨床診断領域においては、Ｃａｎ
ｎａ　ｒｔｙ−Ｂｒ　ｉｇｇ＠の方法を基盤にした、い
わゆるｏ　−ｃｐｃ法が最も用いられている。

しかし、ｏ−ｃｐｃ法は、共存イオン、特にマグネシウ
ムが、カルシウム測定値にプラス誤差を与える為、８−
オキシキノリンの添加、−領域の厳密な調製などにより
、その影響を排除しているが、完全に満足のいく測定法
ではない。つまり、マグネシウムのいんぺい剤としての
８−オキシキノリンは、その添加量を増加していけば、
マグネシウムの影響は押さえられるが、過量状態になる
と、目的のカルシウムの呈色も相当減少してしまう、ま
た、−範゛囲は１Ｏ１８〜１１．２の範囲にあることが
膳ましいが、よシ正確なカルシウム量を求めるには、そ
の範囲はｐＨ１１，０±０．０５が理想であシ、そのｖ
Ｉ４Ｉ！ｉは、微妙なる操作を必要とする。さらにｏ−
ｃｐｃ法ではタンｉ４り質の影響を受けるため測定前に
、除タ／ノクク操作も必要とし、操作的にも煩雑であっ
た。

〔本発明が解決しようとする問題点〕

このように、特に血清中の微量なカルシウムを測定する
場合、ｏ−ｃｐｃ法では、除タンｚ４り操作後、共存イ
オン特にマグネシウムの影響を排する為、８−オキシキ
ノリンの添加、モして至適−の厳密な設定を必要とする
。しかしながら、正確なカルシウム量を求めるには、決
っして満足のいく測定法ではない、つまシ過剰の８−オ
キシキノリンの存在によるカルシウムの呈色の減少、及
び至適−範囲外でのカルシウム量の減少並びに厳密な一
般定を要する方法は、日頃のルーチン業務には適してい
ない０本発明は上記のような問題点を解決した正確で操
作の簡易なカルシウムの測定方法を提供しようとするも
のである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記測定法の問題点、特にマグネシウム
の影響を避けるべく鋭意研究の結果、カルシウムを沈澱
させるシュウ酸を酸化するシュウ酸オキシダーゼを用い
た、シュウ酸量の酵素的測定法に着目し、カルシウム特
に血清中のカルシウムの測定に応用したところ、従来法
のマグネシウムによる問題点を一挙に解決することを見
出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明はカルシウムをシュウ酸塩として沈澱
せしめ、過剰のシュウ酸をシュウ酸オキシダーゼで酸化
し、発生する過酸化水素にょシ、ペルオキシダーゼの存
在下色原体を発色させ、比色測定することによりカルシ
ウム量を求めること全特徴とする、カルシウム測定方法
である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明においては、カルシウムイオンを含む血清等の試
料に一定量の過剰のシュウ酸又はカルシウム塩よシイオ
ン化の高い水溶性シュウ酸塩を加え、カルシウムイオン
を不溶性のシュウ酸カルシウム塩として沈澱させ、水溶
液中に残存するシュウ酸の量を測定することにより、間
接的にカルシウムの量を測定する。なお、ここにシュウ
酸とは水溶性シュウ酸塩として存在するシュウ酸が含ま
れる。モしてシュウ酸の定量には、シュウ酸オキシダー
ゼにより過酸化水素を発生させペルオキシダーゼの存在
下色原体を発色させる比色測定法を用いる。

本発明の反応系路は、以下の通りである。

Ｃａ”＋Ｎａ２Ｃ２０４−＊　ＣａＣ２Ｏ４↓十過剰な
０２０　ｍ　’　−＋　２Ｎ　ａ　”シュウ酸オキシダ
ーゼ Ｃ２Ｏ４”＋２Ｈ＋＋０　　　　　　　　２ＣＯ２＋Ｈ
２Ｏ２ノ母ルオキシダーゼ Ｈ２Ｏ２＋色原体　　　　　　　　　発色体＋Ｈ２゜本
発明に用いられる水溶性シュウ酸塩としてはシ、つ酸ナ
トリウム、シュウ酸アンモニウム尋であシ、好ましくは
ＪＩＳ−次標準であシ、純度的にも信頼をおける点から
シュウ酸ナトリウムが用いられる。

本発明が血清に対して実施される場合においては、シュ
ウ酸は好ましくはシュウ酸ナトリウムの１０〜４０　ｍ
ｍｏｌ／Ａ！　の水性試液として用いられ、特に好まし
い濃度は３０　ｍｍｏｌ／Ｊである・本発明におけるシ
ュウ酸の比色測定はＣｌ１ｎ。

Ｃｈ＠ｎ、、２９ニア００−７０２．１９８３等に詳述
されておシ、色原体や測定操作等も一般に用いられてい
るものが利用可能である。

シュウ酸の比色測定に用いられる試薬としては例えば以
下の如きものが例示される・ ・シ、つ酸測定試薬Ａ 尿、中シュウ酸測定法キットである“シュウ酸「アスカ
・シグマ」＃（アスカ紬薬（株）製）ｆ：用い、以下の
濃度になるよう試薬調製した。

３−（ジメチルアミノ）ベンゾイックアシッド　：　　
３．０ｍｍｏｌペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　
　　　：５０００Ｕ／ｌシユウ酸オキシダーゼ　　　　
　　　　　　　：　　１００Ｕ／Ｊ３−メチル−２−ベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン　：　　０．２ｍｍｏｌト
リス緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　：　　０
．１ｍｍｏｌ（測定波長５９０ｎｍ） 〔実施例〕 以下、実施例によシ更に具体的に説明する。

一実施例１− カルシウム標準液（１０，０１９／ｄｉ）に、マグネシ
ラＡｌ　＃１３．４１５．１０＄１５＊１００ｍｍｏｌ
／ｊ！となるよう試料を調製し、以下の測定方法でカル
シウムを定量した。

試料溶液、精製水（盲検用）及び標準溶液各２００μノ
に３０　ｍｍｏｌ／ｌのシュウ酸ナトリウム試薬５０μ
ｌ’に加え室温に６０分間放置した。シュウ酸ナトリウ
ム試液とカルシウムの至適反応時間は、室温におい【１
０分間でほぼ反応は終了するが、より精度を上げるため
に６０分間とした。（第１図参照図中、イ、口、ハ、二
はシュウ酸ナトリウム濃度がそれぞれイ：　１０　ｍｍ
ｏｌ／ｌ、口：　２０ｍｍｏｌ／ｌ。

ハ：　３０　ｍｍｏｌ／ｌ、二：　４０　ｍｍｏｌ／／
のグラフである。）カルシウム濃度は１０　ｍ９／ｄｌ
でおる。遠心分離後上清２０μＥに前記シュウ酸測定試
薬Ａ０．５ｍｊｔ−加え３７℃、４０分間加温する。次
に、精製水５ｄを加え、精製水を対照に５９０　ｎｍで
比色定置し、共存マグネシウムの影響を観たところ、表
１に示すごとく全く、影響は無かった。

表　　１ 共存Ｍｇ濃度（ｍｍｏ　１／ｌ）　　　　カルシウム定
量値（１ｔ）１　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０．０４２　　　　　　　　　　　　１０．０５３　　
　　　　　　　　　　　　　　１０．００４　　　　　
　　　　　　　　９．９７５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　９．９６１０　　　　　　　　　　　　１
０．０５１５　　　　　　　　　　　　　９．９９１０
０　　　　　　　　　　　　　９．９８一実施例２一 実施例１に従い、血清中のカルシウムを測定した。また
比較のため従来法のｏ−ｃｐｃ法でも測定した。結果を
表２に示す。

表　　２ 表２に示す如く、本流の測定値と、従来法による測定値
との間には、良好な相関性が認められた。

（ｙ　＝１．０１８３！−０，１０−ｒ＝０．９８４）
〔発明の効果〕 本発明のカルシウムの定量法は、その含有試料に試薬を
添加し、反応終了後比色測定するだけで、従来法におけ
る、除タン７４’り操作、マグネシウムの影響を排する
為のいんぺい剤添加によるカルシウム呈色の減少、至適
−の設定の煩雑性などの問題点を解消し、精度良くカル
シウムの定量を行うことが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、シュウ酸ナトリウム溶液とカルシウムとの反
応時間をシュウ酸ナトリウムの濃度別にその関係を表わ
したグラフであるー 放ｌｌｑ場Ｃ分】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. カルシウムをシュウ酸塩として沈澱せしめ、過剰のシュ
   ウ酸をシュウ酸オキシダーゼで酸化し、発生する過酸化
   水素により、ペルオキシダーゼの存在下、色原体を発色
   させ、比色測定することによりカルシウム量を求めるこ
   とを特徴とする、カルシウム測定方法。