JPH06209798A - 化学蛍光標識遺伝子プローブおよび遺伝子プローブ試験におけるその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、アクリジニウム誘導体標識遺伝子
プローブの製造および精製方法、並びに遺伝子プローブ
試験におけるそれら遺伝子プローブの使用に関する。 【構成】 本発明の標識遺伝子プローブは、次の式 【化１】 （式中、Ｂはヌクリオチド化学で慣用的な塩基、Ａ¹〜
Ａ⁶はアクリジニウム誘導体、Ｚ¹〜Ｚ⁵はアルキル、ア
リールなどを表わす。式の詳細は明細書に記載されてい
る）で表わされる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アクリジニウム誘導体で標識し
た遺伝子プローブの製造および精製方法、並びに遺伝子
プローブ試薬におけるこれらプローブの使用に関する。
蛍光化合物は、既に広範囲の用途に用いられている。そ
れらは、バイオアッセー、酵素免疫アッセーおよび蛍光
免疫アッセーのインジケーターとして（W.P. Collins,
“免疫分析の別法”（Alternative Immunoassays)，Joh
n Wiley & SonsLtd., チチェスター（1985）参照）、さ
らにまた核酸ハイブリダイゼーションアッセー（J.A. M
atthewsら、 “Analytical Biochemistry", 151, 205〜2
89, 1985参照）においても用いられている。化学蛍光化
合物は、連続注入分析において、液体クロマトグラフィ
ーのポストカラム検出装置において、流体研究におい
て、さらに人工的な発光源として用いられている。アク
リジン誘導体は、食品の検査工程および環境分析での使
用についても好適している。

【０００２】核酸のハイブリダイゼーションアッセーに
おけるアクリジニウム標識の使用は、欧州特許出願公開
公報第２７３１１５号、欧州特許出願公開公報第３１０
３１２号、欧州特許出願公開公報第３１３２１９号およ
び国際特許出願第８９／０２８９６号に記載されてい
る。最初に挙げた特許出願を除いて、これらの場合はす
べて、アクリジニウムエステル化合物が記載されている
が、これらは安定性が比較的低いという欠点がある。こ
のことは、当該アクリジニウム化合物で標識される遺伝
子プローブの合成、精製および貯蔵安定性における問題
に直接つながり、その結果、アッセーシステムにそのよ
うな遺伝子プローブを用いることの適切性という問題が
生じる。

【０００３】欧州特許出願公開公報第４０７８１６号
は、スペーサーを介して化学蛍光化合物で標識された塩
基、ウラシルを有するヌクレオチド誘導体を開示する。
本発明の目的は、したがって当該技術分野の現状と比較
して有利な特性を有する蛍光標識遺伝子プローブを提供
することであり、同様に新規な遺伝子プローブの有利な
特性に基づいて明瞭な利点を示す遺伝子プローブアッセ
ーを提供することである。驚くべきことに、この目的
は、１個または２個以上のアクリジニウム誘導体で標識
された遺伝子プローブ、およびこの新規な遺伝子プロー
ブの利点を利用する遺伝子プローブアッセーを提供する
ことによって達成される。

【０００４】本発明は、したがって下記の式（XI）の遺
伝子プローブに関する:

【化５】 式中、Ｒ¹⁴は水素、ヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ¹⁵、
アジド、ハロゲンまたはαもしくはβ位保護ヒドロキシ
ルもしくはメトキシ基（ここでＲ¹⁵は、Ｃ₁−Ｃ₁₈−ア
ルキル（好ましくはＣ₁−Ｃ₈−アルキル）、Ｃ₆−Ｃ₂₀
−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）−アリール−（Ｃ₁−Ｃ₈）
−アルキルまたは−(ＣＨ₂)_c−〔ＮＨ(ＣＨ₂)_c〕_d−Ｎ
Ｒ¹⁶Ｒ¹⁶′（ここでｃは２から６までの整数で、ｂは０
から６までの整数で、Ｒ¹⁶およびＲ¹⁶′はそれぞれ別個
に水素、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキルまたは（Ｃ₁−Ｃ₄）−アル
コキシ−（Ｃ₁−Ｃ₆）−アルキル、好ましくはメトキシ
エチルである）で、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素ま
たはヨウ素である）であるか、または−〔Ｚ⁶−
Ａ⁶〕_xo″の基（ここでＺ⁶、Ａ⁶およびｘｏ″は下記で
与えられる意味を有する）で、Ａ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴、Ａ
⁵およびＡ⁶は、式（Ｉ）のアクリジニウム誘導体で、こ
れは式（Ｉ）のＲ⁴を介して式（XI）のＺ¹、Ｚ²、Ｚ³、
Ｚ⁴、Ｚ⁵およびＺ⁶に結合しており、Ｂは、ウラシルは
別としてヌクレオチド化学分野では普遍的な塩基、例え
ば天然塩基（例えばアデニン、シトシン、グアニンおよ
びチミン）または非天然塩基（例えばプリン、２,６−
ジアミノプリン、７−デアザアデニン、７−デアザグア
ニン、Ｎ⁴Ｎ⁴−エタノシトシン、Ｎ⁶Ｎ⁶−エタノ−２,
６−ジアミノプリン、５−メチルシトシンおよびシュー
ドイソシトシン）であり、Ｍはオキシ、メチレン、フル
オロメチレンまたはジフルオロメチレンであり、Ｕはオ
キシ、スルファネジイル、イミノまたはメチレンで、Ｖ
はヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ₁−Ｃ₁₈−ア
ルコキシ（好ましくはＣ₁−Ｃ₆−アルキル）、Ｃ₆−Ｃ
₂₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）−アリール−（Ｃ₁−
Ｃ₈）−アルキル、ＮＨＲ¹⁵、ＮＲ¹⁶Ｒ¹⁷または式、(Ｏ
ＣＨ₂ＣＨ₂)_m′Ｏ(ＣＨ₂)_n′ＣＨ₂Ｒ¹⁸の基（ここで、
Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶は上記の意味を有し、Ｒ¹⁷はＣ₁−Ｃ₁₈
−アルキル（好ましくはＣ₁−Ｃ₈−アルキルで特にＣ₁
−Ｃ₄−アルキル）、Ｃ₆−Ｃ₂₀−アリールまたは（Ｃ₆
−Ｃ₁₀）−アリール−（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキル、またＮ
Ｒ¹⁶Ｒ¹⁷の場合には、Ｒ¹⁶とそれらと結合している窒素
原子と一緒になって５−から６−員環複素環を形成する
が、これはＯ、ＳおよびＮを含む群から選ばれる異種原
子をさらに含むことができ、Ｒ¹⁸は水素、またはヒドロ
キシ、アミノ、ＮＨＲ¹⁶、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯ
ＯＲ¹⁹もしくはハロゲンのような官能基（ここで、Ｒ¹⁹
はＣ₁−Ｃ₄−アルキル−（好ましくはメチル）で、Ｒ¹⁶
およびハロゲンは上記の意味を有する）であり、ｍ′は
１から１００まで、好ましくは３から２０まで、特に好
ましくは３から８までの整数で、ｎ′は０から１８ま
で、好ましくは０から１５までの整数である）であり、
Ｗはオキソ、チオキソまたはセレンオキソであり、Ｘは
オキシ、チオ、ＮＨまたはメチレンであり、Ｙはオキ
シ、チオ、ＮＨ、メチレンまたは保護基であり、Ｚ¹、
Ｚ²、Ｚ³、Ｚ⁴およびＺ⁵は、それぞれ別個にＣ₁−Ｃ₃₀
−アルキル、Ｃ₆−Ｃ₃₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）−ア
リール−（Ｃ₁−Ｃ₂₀）−アルキルまたはＣ₁−Ｃ₃₀−ア
ルコキシで、これら置換基は場合により、Ｃ₁−Ｃ₈−ア
ルキル、Ｃ₆−Ｃ₂₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）−アリー
ル−（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈−アルコキシ、
イミノ、ヒドロキシル、ＮＨＲ¹⁵、チオ、燐酸（phosph
ate）、ピロ燐酸（pyrophosphate）または三燐酸（trip
hosphate）（ここでＲ¹⁵は上記の意味を有する）によっ
て一置換または多置換されており、ｏｏ′は、０から１
０までの整数で、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｙｏ′およびｘ
ｏ″は変数、ｏｏ′、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｙｏ′また
はｘｏ″の少なくとも１つが０ではないということを条
件として、それぞれ別個に０または１で、ｐ′は１から
１００までの整数で、さらに、２′および３′位のカギ
括弧は、２′および３′位のそれぞれに結合している基
ＵおよびＲ¹のそれぞれ並びにＹおよびＲ¹のそれぞれ
は、反対周りで３′および２′位のそれぞれにも配置さ
れうるということを表しており、この場合、各ヌクレオ
チドはそのＤまたはＬ構造として存在しうる。

【０００５】ヌクレオチド鎖内のヌクレオチドからまた
別のヌクレオチドにと繰り返し出現する基、Ａ、Ｂ、
Ｍ、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｕ、Ｖ、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、並びに変数ｏｏ′、ｘｏおよびｘｏ″
は、異なるヌクレオチドでは互いに別の意味をもつこと
ができる。

【０００６】本発明の範囲内では、“燐酸（phosphat
e）”は、次の式の基を意味すると理解される：

【化６】 式中、Ｕ、Ｖ、ＷおよびＸは上記の意味を有する。式
（XI）の好ましい遺伝子プローブは下記のようなもので
ある：Ｂはウラシルを含む、ヌクレオチド化学では慣用
的な塩基で、ｘｏおよびｙｏは、いずれの場合にも０で
ある。

【０００７】本発明は、好ましくは式（XI）の以下のよ
うな遺伝子プローブに関する：式中、Ｂはβ位の上記の
塩基で、ＭはＯで、Ｒ¹⁴はＨまたはＯＨで、Ｙはオキシ
またはＮＨで、Ｍ、Ｕ、ＶおよびＷはＯで、Ｚ¹、Ｚ²、
Ｚ³、Ｚ⁴およびＺ⁵は、それぞれ別個にＣ₁−Ｃ₃₀−アル
キル、Ｃ₆−Ｃ₃₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）−アリール
−（Ｃ₁−Ｃ₂₀）−アルキルまたはＣ₁−Ｃ₃₀−アルコキ
シ（場合によってイミノおよび／またはヒドロキシルに
よって置換されている）で、ｐ′は５から５０までの整
数で、ｏｏ′は０から３までの整数で、変数ｘｏ′、ｙ
ｏ′、ｘｏ″およびｏｏ′の２つは０ではなく、さら
に、残りのすべての置換基は上記の意味を有している。

【０００８】本発明は、特に好ましくは、その置換基が
式（XI）の好ましい具体例について最後に記載した意味
を有する、式（XI）の以下のような遺伝子プローブに関
する：式中、ｐ′は１０から３０までの整数で、ｏｏ′
は０または１で、このとき変数ｘｏ′、ｙｏ′、ｘｏ″
およびｏｏ′の１つだけがいずれの場合においても１で
あり、残余の変数はいずれの場合においても０である。

【０００９】さらに、本発明は特に好ましくは、置換基
および変数ｐ′について最後に記載した意味を有する式
（XI）の遺伝子プローブにも関し、式中、ｏｏ′は１
で、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｙｏ′およびｘｏ″は０であ
る。

【００１０】本発明は、特にまた、置換基および変数
ｐ′について最後に記載した意味を有する式（XI）の遺
伝子プローブに関し、式中、ｘｏ′は１で、ｘｏ、ｙ
ｏ、ｙｏ′、ｘｏ″およびｏｏ′は０である。本発明
は、さらにまた、特に置換基および変数ｐ′について最
後に記載した意味を有する式（XI）の遺伝子プローブに
関し、式中、ｙｏ′は１で、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｘ
ｏ″およびｏｏ′は０である。

【００１１】上記アクリジニウム誘導体（Ａ１−Ａ６）
（それらの構造および調製は、既に欧州特許出願公開公
報第２５７５４１号および欧州特許出願公開公報第３３
００５０号に開示されている）は、次の式（Ｉ）の化合
物で：

【化７】 式中：Ｒ¹は水素、アルキル、１から１０個の炭素原子
を有するアルケニルもしくはアルキニルラジカル、また
はベンジルもしくはアリール基で、Ｒ²およびＲ³は水
素、１から１０個の炭素原子をもつアルキル基、置換も
しくは未置換アミノ基、カルボキシル、アルコキシ、シ
アノもしくはニトロ基、またはハロゲンで、Ｒ⁴は、次
の式（II）および（III）の残基で、

【化８】 式中、Ｒ⁵は、１〜１００個のヌクレオチド含有オリゴ
ヌクレオチド（例えば特に、ＤＮＡおよびＲＮＡ中のオ
リゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列（標
的））との結合に変換される反応基で、Ｒ⁶は水素、１
から１０個の炭素原子をもつアルキル、アルケニルもし
くはアルコキシ基、または置換アミノ基、ベンジル基、
アリール基、ヘテロアルキル基もしくは複素環（これら
は各々、１から１０個の炭素原子を有するヒドロキシ
ル、アミノ、アルキルアミノ、アルキル、アルケニルも
しくはアルコキシ基、ポリアルコキシまたはアリールオ
キシ基で置換されていてもよく、また複素環基で置換さ
れていてもよいが、最後に挙げた置換基は、それらに関
する限り複素環化合物もしくはアミンによって置換され
ていてもよく、また一緒になって、Ｏおよび／または
Ｓ、および／またはＮＨまたはＮ−アルキルを有する複
素環を形成することもできる）で、Ｘはアリール基で、
これは直接またはアルキルもしくはオキシアルキル基を
介して窒素もしくは硫黄原子に結合し、さらにアルキル
またはオキシアルキル基を介してＲ⁵基に結合している
か（これは、アルキル、アルケニル、ヒドロキシル、ア
ミノ、アルコキシ、ポリアルコキシもしくはアリールオ
キシ基および／または異種原子によって一置換または多
置換されていてもよい）、または脂肪族、芳香族脂肪族
もしくは芳香族（必ずしも天然である必要はない）、ア
ミノカルボン酸の残基であるか、またはＲ⁶がＣ₁−Ｃ₆
−アルキルによって一置換もしくは多置換されているフ
ェニル基である場合はフェニル基である。

【００１２】化学蛍光をそこなわない陰イオンは、例え
ばテトラフルオロボレート、パークロレート塩、ハロゲ
ン化物、アルキルサルフェート、ハロスルホネート、ア
ルキルスルホネートまたはアリールスルホネートであり
うる。他のいずれの陰イオンも、化学蛍光を消光または
減弱させないかぎり用いることができる。ヘテロアルキ
ル基または複素環基は、好ましくは、本発明の化合物の
水溶性を高めることができる異種原子、例えば窒素、酸
素、硫黄もしくは燐またはそれらの組み合わせを含む。
特に適切な複素環は、例えばモルフォリン、ピペリジ
ン、テトラヒドロフランおよびジオキサンである。

【００１３】式（Ｉ）から（III）の特に重要なアクリ
ジニウム誘導体は、Ｘが次の式（IV）の基である：

【化９】 式中、Ｒ⁷は、式−(ＣＨ₂)_n−または（(ＣＨ)_m−Ｏ)_n−
の置換基（ここでｎは０から４、ｍは１から６）で、Ｒ
⁸は、Ｒ⁷に対してオルト、メタもしくはパラ位にある式
−(ＣＨ₂)_p−の置換基、式−(Ｏ−(ＣＨ₂)_m−)_pもしく
は−((ＣＨ₂)_m−Ｏ−)_p′のポリアルキレンオキシド基
（好ましくは、ここではｐ＝１から６）、または１から
４個の炭素原子を有する分枝もしくは非分枝炭化水素基
であり、置換基Ｒ⁹からＲ¹¹は、水素または３０個まで
の炭素原子をもつ直鎖もしくは分枝炭化水素基（ここで
はまた１個または２個以上の−ＣＨ₂−単位をＯ、Ｓ、
ＳＯ、ＳＯ₂、ＮＨまたはＮ−アルキルで置き換えるこ
とができる）で、さらにこれら置換基のうち２個は環状
に結合していてもよい。

【００１４】基Ｒ⁵を適切に選択することによって、ア
クリジニウム誘導体は、興味の対象である生物学的物質
の官能基と温和な条件下ですら選択的に結合することが
できる。適切な反応基は以下に集められたものから見出
すことができる：

【化１０】

【化１１】

【００１５】多くの場合、本発明の好適なアクリジニウ
ム誘導体は、Ｒ⁵が次の式（Ｖ）の基であることが分か
った：

【化１２】 さらに、次の式（VI）のアクリジニウム化合物は特に好
適であることが分かった：

【化１３】

【００１６】式（VI）では、Ｘは次の式（VII）の基で
ある：

【化１４】 ここで、ｎは０から４、特に２から４で、Ｒ¹²およびＲ
¹³は、それぞれ別個に水素、アルキル基、１から４個の
炭素原子をもつアルコキシ基、(−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂)_n
−ＯＲ−基（ここでｎは１から８で、Ｒはモルホリノエ
チルまたは１から４個の炭素原子をもつアルキル基、ま
たはＮ,Ｎ−ジメチルアミノエチル基）であるか、また
は一緒になってエチレンジオキシ基を形成し、さらにＡ
^-は請求項１に記載された意味を有する。

【００１７】式（VII）の最後に述べた化合物のうちと
りわけ好ましいものは、順に以下のようなものである：
Ｘがｐ−エチレンフェニル基で、 １） Ｒ¹²はＨでＲ¹³はｐ−メトキシ基であるか、また
は ２） Ｒ¹²はＨでＲ¹³は次の式（VIII）のｐ−アルコキ
シ基であるか、

【化１５】 または、 ３） Ｒ¹²はｏ−メトキシ基で、Ｒ¹³はｐ−メトキシ基
であるか、または ４） Ｒ¹²およびＲ¹³は一緒になって３,４−エチレン
ジオキシ基（例えば次の式（IX）の化合物）を形成す
る。

【００１８】

【化１６】 特に好適な別のアクリジニウム誘導体は次の式（Ｘ）を
有する：

【化１７】 ここで、Ｒ⁶は１から４個の炭素原子をもつアルキル基
またはフェニル基で、これは、それぞれ１から４個の炭
素原子をもつ３個までのアルキルもしくはアルコキシ
基、または−(Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂)_n−ＯＲ基（ｎは１か
ら８で、ＲはモルホリノエチルもしくはＮ,Ｎ−ジメチ
ルアミノエチル基、または１から４個の炭素原子を有す
るアルキル基）、またはエチレンジオキシ基で置換され
ていてもよく、Ｘは請求項１または２に記載された意味
を有するか、またはＲ⁶は、いずれの場合にも１から４
個の炭素原子をもつ３個までのアルキル基で置換するこ
とができるフェニル基で、Ｘはオルト−、メタ−または
パラ−フェニレン基である。

【００１９】本発明にしたがって用いられる上記のアク
リジニウム化合物は、続いて直接またはスペーサーを介
してオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと反応
させることができる。この場合、１個（または数個）の
ヌクレオチドまたはスペーサーは官能基（例えばアミノ
またはスルフヒドリル基）を有し、これは上記に挙げた
標識反応基と反応する。このように修飾されたヌクレオ
チドは、また市販されている。

【００２０】さらに、本発明はとりわけ実施例に挙げた
遺伝子プローブに関する。 遺伝子プローブアッセー：サンプル中の標的配列を決定
する、本発明の遺伝子プローブアッセーでは、上記の遺
伝子プローブとのハイブリダイゼーションが必要とな
る。種々の形式の遺伝子プローブアッセーがあるが、原
則的に２つのカテゴリーに分類される： １．ホモジニアス遺伝子プローブアッセー ホモジニアス遺伝子プローブアッセーは、実施が簡単な
ことおよび設備が自動化できることが特色であるが、検
出感度はしばしば低いことが不利な点である。このまし
い具体例は、ハイブリダイゼーション保護アッセー（Ch
in. Chem. 35／8, 1989, 1588-1594）、キッシングプロ
ーブ法（Nachr. Chem. Tech. Lab. 37／7, 1989, 698）
およびエネルギー転移の法則（Analytical Biocemistry
169,1988, 18）である。本発明の遺伝子プローブは、
ホモジニアス遺伝子プローブ試験に用いることができ
る。その微小環境に応じてそれらが（選択的に）安定で
あることにより、これらの遺伝子プローブは、ハイブリ
ダイゼーション保護アッセー用に特に適切である（実施
例６）。

【００２１】 ２．ヘテロジニアス遺伝子プローブアッセー ヘテロジニアス遺伝子プローブアッセーは、実施という
観点からはホモジニアス法と比べて複雑であるが、他
方、検出感度は一般に高くなっている。本発明の遺伝子
プローブはヘテロジニアス遺伝子プローブアッセーに用
いることができる。好ましい具体例を以下に挙げる：ブ
ロット法（Analytical Biocemistry 169,1988, 1-2）、
鎖置換アッセー（Clin. Chem. 32／9, 1986, 1631-163
6）、（磁性付加）微粒子法（欧州特許出願公開公報第
２８１３９０号）またはこの固相法による分離。検出す
べき標的またはハイブリッドは、これら固相に直接また
は間接的に（例えば、捕捉プローブ（Clin. Chem. 35／
9, 1989, 1826-1831）または他の高度な活性および特異
性を有する系（例えばビオチン／（ストレプト）アビジ
ン（Clin. Chem. 37／5, 1991, 632-633）または抗原／
抗体相互反応（Analytical Biochemistry 169, 1988, 6
-9）を介して）と結合させることができる。固相として
磁性粒子を用いる場合には、過剰遺伝子から雑種分子
（ハイブリッド）の分離は、吸着挙動またはイオン相互
反応の違いによって達成することができる（欧州特許出
願公開公報第２８１３９０号）。

【００２２】本発明の遺伝子プローブは、固相として磁
性粒子を用いるヘテロジニアス遺伝子プローブ試験での
使用が特に好適である（実施例７）。溶液中でそれらが
安定であるということは、本発明の遺伝子プローブの実
質的な利点を示す。ジェンプローブ社（Gen Probe）製
の市販遺伝子プローブ(アクリジニウムエステル標識)と
の安定性の比較は、表１に記録されている。３７℃およ
び５０℃での負荷試験では、本発明の遺伝子プローブ
は、１０日を越えたときでもシグナルの減少は全く示さ
ない。対照的に、市販プローブは、それぞれこの時点で
の本来のシグナル活性の７０％および２３％しかもって
いない。

【００２３】通常の遺伝子プローブと比較して、驚くべ
きことに、本発明の遺伝子プローブ中に使用されている
アクリジニウム誘導体の、通常のアクリジニウム誘導体
よりも高い安定性から結論しえるものよりも、本発明の
遺伝子プローブの安定性は高い。本発明のこの極めて高
い安定性は表２に示したデータから明瞭である：１３日
にわたって３７℃または５０℃に曝した場合、遊離アク
リジニウム化合物（“自己標識”（own label））シグ
ナル安定性は出発値のおよそ８０から８５％に減少する
（明瞭なシグナル減少は、１から２日後すでに認めるこ
とができる）が、一方、本発明の遺伝子プローブ内に結
合形で存在する同一のアクリジニウム化合物（“自己標
識を伴う遺伝子プローブ”）のシグナル安定性は、１０
日間の観察が終わるまで完全に安定である。

【００２４】表３のデータは、本発明の遺伝子プローブ
内のアクリジニウム誘導体の顕著な安定性は、９５℃ま
での極めて高い温度でさえも４または８時間にわたって
維持されることを示している。また別の利点は、その高
い安定性の故に、本発明の遺伝子プローブは凍結乾燥形
ではなくすぐに使用できる溶液として用いることができ
るという事実によってもたらされる。

【００２５】量子の高収量による、本発明の遺伝子プロ
ーブで使用されるアクリジニウム誘導体のより大きい感
度は、図１および図２から明瞭である：図１によれば、
本発明の遺伝子プローブで用いられるアクリジニウム誘
導体の検出の下方限界はおよそ０.６attomolで、したが
ってジェンプローブ社（図２）のアクリジニウムエステ
ルの下方検出限界であるおよそ５attomolよりもおよそ
１０倍低い（優れている）。

【００２６】極めて僅かの標的濃度を検出するために、
標的付加およびまたはシグナル増幅の実施がしばしば求
められる。一般に標的増幅は、検出すべき標的（ＤＮＡ
またはＲＮＡ配列）が極めて低い濃度で存在し、遺伝子
プローブとのハイブリダイゼーション反応では検出不可
能であるか、または、まれにしか検出できない場合に実
施される。

【００２７】遺伝子プローブで現在用いられている標識
では、せいぜいサンプル中のおよそ１０³から１０⁴標的
分子を検出できるだけである。しかし例えばウイルスの
検出については、極端な場合、ただ１個の標的配列を検
出しなければならない。この感度を達成すために、ハイ
ブリダイゼーションの前に標的増幅を実施しなければな
らない。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（最も重要な標
的増幅系）では、特異的合成は、増幅すべき二重鎖ＤＮ
Ａの熱変性（およそ９５℃）で開始する。続いて、２本
のオリゴヌクレオチド開始ＤＮＡ配列（プライマー）と
それら相補的な配列とのアニーリングをおよそ５５℃で
行ない、その後ＤＮＡポリメラーゼによってアニーリン
グされたプライマーを（およそ７２℃で）伸長させる。
プライマーは、このＤＮＡ配列のうち反対の鎖と分子雑
種形成し（ハイブリダイズし）、２種のプライマー間の
標的ＤＮＡ配列をポリメラーゼが転写できるような方向
に並べ、反応混合物中の利用可能なヌクレオチドを用い
て標的ＤＮＡ配列を合成させる。

【００２８】ポリメラーゼによる生成物はそれ自体この
プライマーともまた相補的であり、さらにこのプライマ
ーとまた結合するので、ＤＮＡ増幅のそれぞれのサイク
ルによって、前のサイクルで合成された標的ＤＮＡの量
は２倍になる。その結果、特異的な標的ＤＮＡコピーは
２ⁿ（ｎは実施された増幅サイクルの数）で指数関数的
に増幅する。３０サイクル後には、およそ１０⁶倍の増
幅が達成される。全工程は熱安定ポリメラーゼを用いる
ことによって自動化できる。Ｑβレプリカーゼ（ＲＮＡ
ポリメラーゼ）を用いる増幅は、重要性を増しつつある
また別の代表的な標的増幅方法である。ＰＣＲと対照的
に、ハイブリダイゼーションはまずＤＮＡプローブで開
始し、ハイブリダイゼーション反応の生成物はその後増
幅される。

【００２９】リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）では、ＤＮＡ鎖
当たり２種の合成オリゴヌクレオチド（各々２５塩基）
が用いられ、標的配列上で互いにはずれて直接ハイブリ
ダイズするこれら２種のプローブとともに標的（例えば
５０塩基の標的配列）を増幅させる。プローブはまた、
相補的な鎖上の標的についても合成される。隣接するプ
ローブは、異なる標識（例えばビオチンまたは蛍光）を
付加されていないその末端で標識されている。４種のヌ
クレオチドを患者サンプルを含む混合物に過剰に加え
る。

【００３０】サンプルの二重鎖ＤＮＡの変成は高温（お
よそ７５℃）で起る。およそ５０℃まで温度を下げた
後、プローブは標的の相補的配列とハイブリダイズす
る。この温度では、テルムス＝テルモフィリス（Thermu
s thermophilus）の熱耐性ＤＮＡリガーゼは、近くの２
種のプローブと結合する。再び温度を８５℃まで上昇さ
せることによって、結合プローブ対から標的配列を分離
させるが、これはそれ自体また別の新しい標的として働
き、したがって、初めにあった標的配列を指数関数的に
増幅させることができる。

【００３１】転写増幅系（ＴＡＳ）では、ＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼによって認識される配列は、増幅され
るべき標的配列のｃＤＮＡコピー中に取り込まれる。標
的配列の増幅は、ｃＤＮＡコピーを多数のＲＮＡコピー
に転写することによって達成される。増幅に基づく核酸
配列は、ＲＮＡおよびＤＮＡの連続的、均質的および定
温的増幅の代表的なものであり、簡単で（特別な装置を
必要としない）、迅速である。

【００３２】本発明の遺伝子プローブは、増幅標的生成
物とハイブリダイズさせることができる。ＰＣＲ（Labo
r Praxis, 12月号、1988; Clin. Chem. 37／11, 1991,
1893-1894)、 Ｑβレプリカーゼ（Nature 339, 401-402;
Clin. Chem. 35／9, 1989,1826-1831; Clin. Chem. 37
／9, 1991, 1682-1685）、 ＬＣＲ（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88, 1991, 189-193）、ＴＡＳ（Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86,1989, 1173-1177）およびＮＡＳＢ
Ａ（Nature 350, 1991, 91-92）は、好ましい標的増幅
系の代表である。さらに、用いられるアクリジニウム誘
導体の高い安定性により、“シグナル組み込み”標的増
幅（Clin. Chem. 37／9, 1991, 1626-1632）を実施する
こともできる。

【００３３】シグナル増幅系は、遺伝子プローブの直接
標識が満足できる感度を提供することができないか、ま
たは検出されるべき標的とハイブリダイズする能力が障
害されている場合に好んで用いられる。ビオチン／（ス
トレプト）アビジン系では、遺伝子プローブは、温和な
条件下でビオチン付加され、当該遺伝子プローブのハイ
ブリダイゼーション特性は、それによって完全に維持さ
れる。その後、標識（ストレプト）アビジンが加えられ
る。一般に、様々な種類の標識、または別な増幅系（例
えば酵素系）が標識に用いられる。標識過剰の場合です
ら、極めて高いビオチンおよび（ストレプト）アビジン
間の親和性が維持される。

【００３４】同様なアプローチを抗原標識抗体系の場合
もとることができる。原則として、対応する抗体が利用
可能な物質は、いずれも抗原として用いることができ
る。この場合、当該物質は比較的小さな分子（ハプテ
ン）であることが好ましいが、これは、ビオチンに似て
対応する遺伝子プローブの調製に容易に用いることがで
きる。抗体も、（ストレプト）アビジンに似て、様々な
方法で標識することができる。しかし抗原抗体間の親和
性は、一般にビオチン／（ストレプト）アビジン系の場
合よりも１０^-3から１０^-7倍低い。さらに、比較的強い
標識度により、免疫反応の低下が生じる。ジゴキシゲニ
ン／抗ジゴキシゲニン抗体は、抗原抗体系の代表的な例
である。

【００３５】クリスマスツリー法は以下のように実施さ
れる：標識遺伝子プローブ１は、検出されるべき標的の
相補配列とハイブリダイズする。標識遺伝子プローブ２
は、異なる標的配列または遺伝子プローブ１のいずれか
とハイブリダイズすることができる。原則として、この
工程は自由に継続させることができる。さらに、２つの
具体例は区別することができる。第一の具体例では、異
なる成分は次々と互いにハイブリダイズするが；第二の
具体例では、標的は先に記載したように同様な態様で調
製された、予め形成されたプローブ複合体とハイブリダ
イズする。

【００３６】触媒レポーター付着系（例えばデュポンの
ＥＬＡＳＴ^R）では、固相に固定された酵素が、さらに
新たなシグナル発生酵素分子を結合させる反応を触媒す
る。例えば、ペルオキシダーゼ酵素は、固相に結合させ
たビオチン分子とともにビオチン−チラミドの反応を触
媒する。続いて、酵素標識ストレプトアビジンが添加さ
れる。酵素標識の特性は自由に選択でき、したがって発
色性、蛍光性物質を用いることができる。

【００３７】リポゾーム系は下記の態様で実施できる：
遺伝子プローブはアクリジニウム標識で標識される。続
いて、標識特異的抗体が添加されるが、これは同一また
は異なる標識分子を充填したリポゾームをもっている。
リポゾームは、洗剤（例えばトリトン−Ｘ）によつて破
壊される。続いて、放出標識分子のシグナルを求める。

【００３８】ビオチン標識（ストレプト）アビジン複合
体（Clin. Chem. 37／5, 1991, 632-633)、 標識抗原抗
体複合体（Analytical Biochemistry 169, 1988, 6-
9）、クリスマスツリー法（1987 Elsevier Science Pub
lishers B.V., 253-264）、触媒レポーター付着（J. of
Immunological Methods 125, 1989, 279-285）および
標識充填リポゾーム（Clin. Chem. 37, 1991, 1519-152
0; J. of Bioluminescence& Chemiluminescence 4, 198
9, 88-89）は、本発明の遺伝子プローブを用いる場合の
好ましいシグナル増幅系の代表的なものである。

【００３９】さらに、本発明の遺伝子プローブの高い安
定性によって、新規なシグナル増幅系が可能になった。
これらは、ハイブリダイゼーションの後、標識を損なう
ことなく加熱によって二重鎖の分離を可能にするもので
ある。シグナル増幅は、再利用可能な標識を基に構築さ
れる。このタイプのシグナル増幅系の必須の特色は以下
の通りである：ハイブリダイゼーション検出アッセーに
したがい、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く種
々の加水分解の後、磁性粒子分離を実施する。この方法
では、バックグラウンドシグナルは極めて低く抑えるこ
とができる。特異的シグナルを増幅するために、続いて
雑種分子（ハイブリッド）を加熱によって切断する。特
異標識抗体を添加する。この抗体は、種々の方法で標識
できる、例えば、ビオチン標識の場合は標識（ストレプ
ト）アビジンによって達成され、抗原標識の場合には特
異標識抗体による。（ストレプト）アビジンまたは抗体
で用いられる標識は、本発明の遺伝子プローブで用いら
れるアクリジニウム標識の１つであっても、また他のい
ずれの標識でもよい。酵素の場合には、酵素増幅系（An
nales de Biologie Clinique 47, 1989, 527-532；“Ｅ
ＬＡＳＴ^Ｒ”デュポン社製）も加えることができる。

【００４０】しかし特異標識抗体は、同一または異なる
標識分子を充填したリポゾームをまた担持することがで
きる。リポゾームは洗剤、例えばトリトン−Ｘの添加に
よって開裂させることができる。その後、放出標識分子
のシグナルを求める。本発明の遺伝子プローブは、特に
ビオチン−（ストレプト）アビジン系、抗原／抗体系お
よびリポゾーム系に好適である。

【００４１】また、アクリジニウム化合物は、既に導入
されている増幅系の他の標識と比べて明瞭な利点を有す
る。例えば、予め作成したプローブ複合体を、クリスマ
スツリー法に用いることができる。当該標識の顕著な安
定性のゆえに、高い温度で異なる遺伝子を連続的にハイ
ブリダイズする手段による、このような特質をもつ複合
体の調製はいかなる問題も生じない。

【００４２】遺伝子プローブの調製：固相法によるオリ
ゴヌクレオチド合成は、ポリマー支持体にその３′−ヒ
ドロキシルまたはアミノ基を介して結合しているヌクレ
オチドから開始するという、それ自体既知の方法によっ
て実施される。該ポリマー支持体は、例えばＣＰＧ（多
孔性調整ガラス）またはTentaGel（Rapp社製、チュービ
ンゲン）のような有機樹脂である。ヌクレオチドは、官
能基付加支持体に適切なスペーサー（例えばスクシネー
ト、オキサレート、またはビスヒドロキシエチルスルフ
ィドリンカー）を介してジカルボン酸または燐酸のエス
テルまたはアミドとして結合させる。合成の完了後、支
持体からオリゴヌクレオチドを切断することが可能とな
り、遊離アミノ基は、化学蛍光標識とのオリゴヌクレオ
チド誘導化のために作用する。オリゴヌクレオチドの遊
離アミノ基と反応するヒドロキシスクシンイミドエステ
ルは、化学蛍光アクリジニウム誘導体を導入するための
好ましい試薬として働く。

【００４３】反応性遊離アミノ基の導入には、オリゴヌ
クレオチド合成の修飾が必要である。市販の試薬は、製
造元の指示書にしたがいアミノ基を３′末端（例えば
３′アミノ修飾物質ＣＰＧ（ＭＷＧバイオテックＧｍｂ
Ｈ，Ebersberg、ドイツ）に、５′末端（例えばＣ₂から
Ｃ₁₂の５′アミノ修飾物質、ＭＷＧバイオテックＧｍｂ
Ｈ）に、またはヌクレオチド間、すなわちオリゴヌクレ
オチドのいずれの部位（５′分枝修飾物質Ｃ₃、ＭＷＧ
バイオテックＧｍｂＨ）にも導入することができる。修
飾チミン誘導体（アミノ修飾物質−ｄＴ、ＭＷＧ）また
はグッドチャイルド（Goodchild, Bioconjugate Chem.
1, 165（1990））が記載したような同様な核酸塩基を介
することによって、また別の可能性が出現する。さら
に、グッドチャイルドの文献（pp １７０〜１７３）に
また別の試薬が記載されているが、これはアミノまたは
チオール基をオリゴヌクレオチドに導入することを可能
にする。

【００４４】アミノ修飾またはチオール修飾ヌクレオチ
ドを有するオリゴヌクレオチド（これはまた化学蛍光色
素で標識するために適している）の調製は、欧州特許出
願公開公報第４９０２８１号に開示されている。実施例
１４ａでは、２６塩基のオリゴヌクレオチドの合成が説
明されているが、このオリゴヌクレオチドは、その５′
末端にアミノアルキルホスフェート残基を有する。この
修飾５′末端の構造は次の式（６４）で表される：

【化１８】 Ｂ＝アデニン、グアニン、チミン、シトシン、２,６−
ジアミノプリン、イノシンまたは５−フルオロウラシル
で、ｍ＝６である。

【００４５】ユニット（６４）の調製は、ホスフォルア
ミダイト法にしたがい次の式（７０）の５′アミノ修飾
物質の支援によって達成される：

【化１９】 ＭＭＴＲ＝モノメトキシトリチル、ｎ＝２、３、６、１
２。

【００４６】実施例１４ｂは３′アミノ修飾オリゴヌク
レオチドを開示するが、これは３′アミノ修飾物質ＣＰ
Ｇ（式（７１））から出発し、標識的なホスフォルアミ
ダイト化学を用いて得ることができる。この修飾３′末
端の構造は次の式（６５）で表される：

【化２０】 Ｂ＝アデニン、グアニン、チミン、シトシン、２,６−
ジアミノプリン、イノシンまたは５−フルオロウラシ
ル。

【００４７】

【化２１】 ＦＭＯＣ＝フルオレニルメチルオキシカルボニル 反応性アミノ基をヌクレオチド内（＝ヌクレオチド間）
ではなくオリゴヌクレオチド配列内に含むオリゴヌクレ
オチドの合成は、式（７２）の分枝修飾物質との縮合に
よって可能である（実施例１４ｃ）。ヌクレオチド間修
飾の構造は式（６６）で表される：

【化２２】

【化２３】

【００４８】ヌクレオチド間リンケージにアミノアルキ
ルホスフォルアミダイト残基を有するオリゴヌクレオチ
ド（式（６７））の調製は、式（７３）のメトキシホス
フォルアミダイトとの縮合によって達成される。式（７
３）を、０.１Ｍヨウ素およびトリフルオロアセチルヘ
キサメチレンジアミン（式（６７）でＸ＝ＮＨおよびｎ
＝６）と反応させホスフォルアミダイトを得る（実施例
１４ｄ）。

【００４９】

【化２４】 Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、Ｓ；ｎ＝２から１８。

【化２５】 Ｂ′＝チミン、Ｎ⁴−ベンゾイルシトシン、Ｎ⁶−ベンゾ
イルアデニン、Ｎ²−イソブチリルグアニン、ＤＭＴｒ
＝ジメトキシトリチル、Ｒ＝ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＮまたはＣＨ
₃。

【００５０】対応する態様で、式（６８）のオリゴヌク
レオチドは、式（７４）の支持体から出発し、合成の最
後にＮａＩＯ₄またはＨ₂Ｏ₂／Ｎａ₂ＷＯ₄で酸化され、
アンモニアで切断される支持体を生成することによって
得られる（実施例１４ｅ）。

【００５１】

【化２６】

【化２７】

【００５２】実施例１２ｆでは、その３′末端に３′ア
ミノヌクレオチドを含むヌクレオチドである、式（６
９）のオリゴヌクレオチドの調製が行われる。この合成
は、そのホスフォルアミデート結合が８０％合成終了時
に酢酸で切断される、式（７５）のＣＰＧ支持体から出
発することによって実施される：

【化２８】

【化２９】

【００５３】実施例１４ａから１４ｆは、遊離アミノ基
を有するオリゴヌクレオチドを調製する方法の代表的な
選択例であるが、このオリゴヌクレオチドは、実施例１
５に記載したように化学蛍光標識の活性化誘導体とその
後反応させる。アミノ基の他に、以下のような他の官能
基も標識の適切な反応基と反応させることができる:

【化３０】 化学蛍光アクリジニウム誘導体を導入するための好まし
い試薬は、実施例１５に記載したように、オリゴヌクレ
オチドの遊離アミノ基と反応するそれらのヒドロキシス
クシンイミドエステルを含む。

【００５４】種々のアクリジニウム誘導体のオリゴヌク
レオチド結合時の安定性における比較実験：以下のアク
リジニウム誘導体が用いられた： １） “Ａｃ−ヘキスト”、本発明の遺伝子プローブ調
製に用いることができるアクリシセニウム誘導体。 ２） “Ａｃ−アボット”、欧州特許出願公開公報第２
７３１１５号（アボット社）にしたがいＤＮＡプローブ
試薬での使用に適しているはずであるアクリジニウム誘
導体。

【００５５】実施例１５に記載するように、スクシンイ
ミドエステルＡｃ−ヘキストおよびＡｃ−アボットを、
同一条件下で式（６５）のオリゴヌクレオチドと反応さ
せた場合、Ａｃ−ヘキストだけが安定な生成物を生じた
が、Ａｃ−アボットでは反応完了前にすら分解生成物が
見られた。この反応は、ＨＰＬＣ（pH６.８）でモニタ
ーした。吸収は、２６０nmで時間（分）の関数として吸
収単位（ＡＵＦ）で求めた。Ａｃ−ヘキストと式（６
５）の反応（ピークＡ、図３〜５、実施例１４参照、＝
実施例７６、ここでＲ＝Ｈ）では、式（７６）の標識オ
リゴヌクレオチドが連続的に生じる（ピークＢ、図３〜
５）。（図３：２日後の吸収測定、図４：３日後の測
定、図５：４日後の測定）。

【００５６】

【化３１】 Ａｃ−アボットによる式（６５）の標識の場合は、ＨＰ
ＬＣで検出できる分解生成物（ピークＣ、図６〜８）
は、出発材料（ピークＡ）から極く少量の生成物（ピー
クＢ、図６〜８）が生じるときに実際出現する。（図
６：２日後の吸収測定、図７：３日後の測定、図８：４
日後の測定）。Ａｃ−ヘキストで標識した式（７６）の
オリゴヌクレオチドの場合のみ、ＨＰＬＣ精製またはゲ
ル電気泳動による精製で均質な生成物を調製することが
可能であったが、一方、比較実験で示したようにＡｃ−
アボットで標識したオリゴヌクレオチドは、精製過程中
にも分解した。

【００５７】さらに、一連の標識反応を、ピリジンの存
在下と同様に異なるpH値（pH６.８、pH７.３およびpH
８.０）でテストした。いずれの場合でも、Ａｃ−ヘキ
ストはＡｃ−アボットより優れていた。したがって、オ
リゴヌクレオチド式（６５）は、ピリジン／Ｈ₂Ｏ／ア
セトニトリル（２：２：１、ｖ：ｖ：ｖ）中でＡｃ−ヘ
キストとだけ反応させることができるが、一方、Ａｃ−
アボットは殆ど全く反応しない（ＨＰＬＣデータ、図９
参照）。さらにまた、Ａｃ−ヘキストの場合には、分解
生成物はＨＰＬＣで検出されない。

【００５８】

【実施例】

実施例１ Ｎ−フェニル−Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルベ
ンゼンスルフォニル）アクリジン−９−カルボキサミド
（１） ３６０mgの４−（ジメチルアミノ）ピリジンおよび１
６.６mlのトリエチルアミンを、３００mlの塩化メチレ
ン中のベンジル４−（Ｎ−フェニルスルファミド）ベン
ゾエート１１ｇに加え、１０分後、８.３４ｇのアクリ
ジン−９−カルボニルクロリドヒドロクロリドを加え、
混合物を加熱し１６時間還流させる。冷却溶液を２Ｎの
ＮａＯＨで軽く撹拌し、有機層を分離し水で洗浄し、さ
らにＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ濃縮する。残留物をトルエ
ン／ヘプタンから再結晶化する。 収量：７０％、融点：１６１〜１６３℃。 ＮＭＲ(ＤＭＳＯ, １００ ＭＨｚ)：δ＝５.５ppm(ｓ,
２Ｈ), δ＝６.８〜８.６ppm(ｍ, ２２Ｈ)。

【００５９】Ｎ−フェニル−Ｎ−（４−カルボキシベン
ゼンスルフォニル）アクリジン−９−カルボキサミドヒ
ドロブロミド（２） ８.５８ｇのＮ−フェニル−Ｎ−（４−ベンジルオキシ
カルボニルベンゼンスルフォニル）アクリジン−９−カ
ルボキサミド（１）を氷酢酸中の３３％ＨＢｒの３０ml
で２時間６０℃で加熱し、冷却後６０mlのジイソプロピ
ルエーテルを加え、沈殿を吸引で濾過し真空中で乾燥さ
せる。 収量：９５％、融点：２５５℃。 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ, １００ ＭＨｚ)：δ＝６.８〜９ppm
(ｍ)。

【００６０】Ｎ−フェニル−Ｎ−（４−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルベンゼンスルフォニル）アクリジン
−９−カルボキサミド（３） ２.８mlのトリエチルアミンを２５０mlのテトラヒドロ
フラン中のＮ−フェニル−Ｎ−（４−カルボキシベンゼ
ンスルフォニル）アクリジン−９−カルボキサミドヒド
ロブロミド（２）５.６３ｇに加え、混合物を−１５℃
に冷却し、さらに０.９６mlのクロル蟻酸エチルを加え
る。続いて、混合物を２０分撹拌し、１.１５ｇのＮ−
ヒドロキシスクシンイミドを加え、混合物を−１５℃で
３時間撹拌し、室温まで温める。その後一晩撹拌する。
沈殿物を吸引で濾過し、濾液を濃縮して残留物を塩化メ
チレンに取り、得られた溶液を水、ＮａＨＣＯ₃溶液お
よび水で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させる。有機層を
濃縮し、残留物をトルエンで再結晶化させる。 収量：５０％、融点ケ２５６℃（分解）。 ＮＭＲ（ＤＭＳＯ, １００ ＭＨｚ）：δ＝２.９５ppm
（ｓ，４Ｈ）、δ＝６.８〜８.７ppm（ｍ，１７Ｈ）。

【００６１】Ｎ−フェニル−Ｎ−（４−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルベンゼンスルフォニル）−１０−メ
チルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオロスル
ホネートまたはトリフルオロアセテート（４） １.１６ｇのＮ−フェニル−Ｎ−（４−スクシンイミジ
ルオキシカルボニルベンゼンスルフォニル）アクリジン
−９−カルボキサミド（３）を、６０mlの１,２−ジク
ロロエタン中で０.３mlのメチルフルオロスルホネート
とともに室温で２４時間撹拌し、分離する沈殿物を吸引
で濾過し真空中で乾燥させる。 収量：６５％。

【００６２】電解質としてトリフルオロ酢酸を容積で
０.１％含む、アセトニトリル／水の混合物を用いＲＰ
−１８シリカゲル（メルク社製）で調製用中等度圧クロ
マトグラフィーの後、そのトリフルオロ酢酸塩を黄色粉
末として得る。 IR：3420 cm^-1(br), 3100(br), 1805(w), 1770(m), 174
5(s), 1700(m), 1385(m), 1280(m), 1255(s), 1230(s),
1205(s)。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.95ppm(s, 4H), δ=4.75ppm
(s, br, 3H), δ=7.0〜9.0ppm(m, 17H)。 質量スペクトル：m/z＝５９４：Ｍ⁺(陽イオン)

【化３２】

【００６３】実施例２ Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（４−スクシンイ
ミジル−オキシカルボニルベンゼンスルフォニル）−１
０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオ
ロスルホネートまたはトリフルオロアセテート（８）の
調製は、ベンジル４−〔Ｎ−（４′−メトキシフェニ
ル）スルファミド〕ベンゾエートおよびアクリジン−９
−カルボニルクロリドヒドロクロリドから出発し（４）
の合成と類似の態様で実施される（実施例１参照）。分
光光学的性状および個々の合成工程の収量は下記に示
す。

【００６４】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（４
−ベンジルオキシカルボニルベンゼンスルフォニル）ア
クリジン−９−カルボキサミド（５） 収量：７０％、融点：１８２〜１８３℃ NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=3.5ppm(s, 3H), δ=5.5ppm(s,
2H), δ=6.35〜6.63ppm(d, br, 2H), δ=7.05〜7.2ppm
(d, br, 2H), δ=7.35〜8.5ppm(m, 17H)。

【００６５】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（４
−カルボキシベンゼンスルフォニル）アクリジン−９−
カルボキスアミドヒドロブロミド（６） 収量：９５％、融点：２７３℃（分解）。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=3.5ppm(s, 3H), δ=6.4〜6.6p
pm(d, br, 2H), δ=7.05〜7.2ppm(d, br, 2H), δ=7.7
〜8.5ppm(m, 12H)。

【化３３】

【００６６】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（４
−スクシンイミジルオキシカルボニルベンゼンスルフォ
ニル）アクリジン−９−カルボキサミド（７） 収量：５０％、融点：２３２〜２３４℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.95ppm(s, 4H), δ=3.5ppm
(s, 3H), δ=6.4〜6.6ppm(d, br, 2H), δ=7.05〜7.25p
pm(d, br, 2H), δ=7.8〜8.6ppm(m, 12H)。 IR：3050cm^-1 1805(w), 1780(m), 1740(s), 1700(m), 1
505(m), 1370(m), 1250(m), 1200(s), 1185。

【００６７】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（４
−スクシンイミジルオキシカルボニルベンゼンスルフォ
ニル）−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサ
ミドフルオロスルホネートまたはトリフルオロアセテー
ト（８） この物質は反応中に沈殿せず、溶液を濃縮して残留物を
ジイソプロピルエーテルで撹拌することによって得られ
る。 収量：８０％。 電解質としてトリフルオロ酢酸を０.１容量％含むアセ
トニトリル／水の混合物を用いて、ＲＰ−１８シリカゲ
ル（メルク社製）で調製用中等度圧クロマトグラフィー
（ＭＰＬＣ）を行ない、そのトリフルオロ酢酸塩が黄色
粉末として得られる。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.95ppm(s, 4H), δ=3.5ppm
(s, 3H), δ=4.8ppm(s, br, 3H), δ=6.45〜6.7ppm(d,
br, 2H), δ=7.2〜7.4ppm(d, br, 2H), δ=7.7〜9ppm
(m, 12H)。 質量スペクトル：m/z＝６２４Ｍ⁺(陽イオン) IR：3440cm^-1(br), 3100, 2950, 1805(w), 1775(m), 17
40(s), 1695(m), 1610(m), 1505(m), 1375(m), 1280
(m), 1250(s), 1205(s)。

【００６８】実施例３ Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（３−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルベンゼンスルフォニル）−１０
−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオロ
スルホネートまたはトリフルオロアセテート（１２）の
調製は、ベンジル３−〔Ｎ−（４′−メトキシフェニ
ル）スルファミド〕ベンゾエートおよびアクリジン−９
−カルボニルクロリドヒドロクロリドから出発して、
（４）の合成と類似の態様で実施される（実施例１参
照）。個々の合成工程の収量および分光光学的性状は下
記に示す。

【００６９】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（３
−ベンジルオキシカルボニルベンゼンスルフォニル）ア
クリジン−９−カルボキサミド（９） 収量：７０％、融点：１６８〜１７０℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=3.5ppm(s, 3H), δ=5.45ppm
(s, 2H), δ=6.5ppm(s, br, 2H), δ=7.1ppm(br, 2H),
δ=7.3〜8.8ppm(m, 17H)。

【００７０】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（３
−カルボキシベンゼンスルフォニル）アクリジン−９−
カルボキサミドヒドロブロミド（１０） 収量：９０％、融点：２６４℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=3.5ppm(s, 3H), δ=6.4〜6.6p
pm(d, br, 2H), δ=7.0〜7.2ppm(d, br, 2H), δ=7.6〜
8.8ppm(m, 12H)。

【００７１】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（３
−スクシンイミジルオキシカルボニルベンゼンスルフォ
ニル）アクリジン−９−カルボキサミド（１１） 収量：５０％、融点：２２３〜２２５℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.95ppm(s, 4H), δ=3.5ppm
(s, 3H), δ=6.4〜6.6ppm(d, br, 2H), δ=7.0〜7.2ppm
(d, br, 2H), δ=7.4〜8.9ppm(m, 12H)。 IR：3500cm^-1(br), 3060, 2950, 2840, 1805(w), 1785
(m), 1740(s), 1700(m),1510(m), 1380(m), 1250(m), 1
205(s)，1165(m)。

【００７２】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−（３
−スクシンイミジルオキシカルボニルベンゼンスルフォ
ニル）−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサ
ミドフルオロスルホネートまたはトリフルオロアセテー
ト（１２） 収量：９０％。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.95ppm(s, 4H), δ=3.55ppm
(s, 3H), δ=4.8ppm(s, br, 3H), δ=6.45〜6.7ppm(d,
br, 2H), δ=7.05〜7.3ppm(d, br, 2H), δ=7.5〜8.9pp
m(m, 12H)。 IR：3500cm^-1(br), 3080, 2950, 1805(w), 1780(m), 17
40(s), 1700(m), 1610(m), 1510(m), 1380(m), 1250
(m), 1205(s), 1170(s)。 質量：m/z＝６２４Ｍ⁺(陽イオン）

【００７３】電解質としてトリフルオロ酢酸を０.１容
量％を含むアセトニトリル／水の混合物を用いて、ＲＰ
−１８シリカゲル（メルク社製）で調製用中等度圧クロ
マトグラフィー（ＭＰＬＣ）を行ない、そのトリフルオ
ロ酢酸塩が粗フルオロスルホネートから黄色粉末として
得られる。

【化３４】

【００７４】実施例４ Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ〔４−（２−ベンジ
ルオキシカルボニルエチル）ベンゼンスルフォニル〕ア
クリジン−９−カルボキサミド（１３） ４６０mgの４−（Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジンお
よび２２.１mlのトリエチルアミンを、ジクロロメタン
４００ml中の１７ｇのベンジル４′−〔Ｎ−（４−メト
キシフェニル）スルファミド〕−３−フェニルプロピオ
ネートに加え、１０分後に１１.１２ｇのアクリジン−
９−カルボニルクロリドヒドロクロリドを加え、さらに
加熱して６時間還流させる。冷却溶液を２ＮのＮａＯＨ
で簡単に撹拌し、有機層を分離し、Ｈ₂Ｏで洗浄して硫
酸マグネシウム上で乾燥させ濃縮する。残留物をカラム
クロマトグラフィーで精製する。

【００７５】

【化３５】 収量：６０％、融点：１３０〜１３２℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.7〜3.0ppm(d, br, 2H), δ=
3.0〜3.3ppm(d, br, 2H), δ=5.1ppm(s, 2H), δ=6.5pp
m(d, br, 2H), δ=7.1ppm(d, br, 2H), δ=7.35ppm(s,
5H), δ=7.5〜8.3ppm(m, 12H)。

【００７６】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ〔４−
（２−カルボキシエチル）ベンゼンスルフォニル〕アク
リジン−９−カルボキサミドヒドロブロミド（１４） ６.３ｇの（１３）を３０mlの３３％ＨＢｒ／氷酢酸中
で６０℃で２時間加熱する。冷却後、６０mlのジイソプ
ロピルエーテルを加え、沈殿物を吸引で濾過し真空中で
乾燥させる。

【００７７】

【化３６】 収量：９０％、融点：２３７℃（分解）。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.7ppm(d, br, 2H), δ=3.１p
pm(d, br, 2H), δ=3.5ppm(s, br, 3H), δ=6.5ppm(d,
br, 2H), δ=7.0〜8.4ppm(m, 15H)。

【００７８】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベ
ンゼンスルフォニル〕アクリジン−９−カルボキサミド
（１５） １.４１mlのトリエチルアミンをテトラヒドロフラン５
０ml中の（１４）の３.１ｇに加え、この混合物を−２
０℃に冷却し、０.４７４mlのクロル蟻酸エチルを加え
る。続いて混合物を２０分撹拌し、５７５mgのＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドを加え、この混合物を−２０℃で
３時間撹拌する。その後、撹拌しながら一晩室温に置
く。沈殿物を吸引で濾過し、濾液を濃縮して残留物をジ
クロロメタンまたは酢酸エチルに取り、得られた溶液を
水、ＮａＨＣＯ₃溶液および水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で
乾燥させる。

【００７９】

【化３７】 有機層を濃縮し、残留物をトルエンで再結晶化させる。 収量：５０％。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.8ppm(s, 4H), δ=3.2ppm(s,
br, 4H), δ=3.5ppm(s,br, 3H), δ=6.5ppm(d, br, 2
H), δ=7.2ppm(d, br, 2H), δ=7.6〜8.4ppm(m,12H)。 IR：3400cm^-1(br), 3060, 2930, 1815(w), 1780(w), 17
40(s), 1690(m), 1600(w), 1510(m), 1370(m), 1250
(m), 1203(m), 1175(m)。

【００８０】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベ
ンゼンスルフォニル〕−１０−メチルアクリジニウム−
９−カルボキサミドフルオロスルホネートまたはトリフ
ルオロアセテート（１６） ０.４mlのメチルフルオロスルホネートをジクロロメタ
ン６０ml中の（１５）１.２７ｇに−２０℃で加える。
混合物を−２０℃で２時間撹拌し、続いて室温まで温め
一晩放置する。トルエンの添加に際して、黄色固体が沈
殿する。吸引で濾過し真空中で乾燥させる。 収量：８０％。

【００８１】実施例１から３に記載したように調製用Ｍ
ＰＬＣに続いて高純度の（１６）がトリフルオロ酢酸塩
として得られる。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.9ppm(s, 4H), δ=3.2ppm(s,
br, 4H), δ=3.5ppm(s,br, 3H), δ=4.8ppm(s, br, 3
H), δ=6.5ppm(br, 2H), δ=7.2ppm(br, 2H), δ=7.6〜
9.0ppm(m, 12H)。 IR：3400cm^-1(br), 3160, 2970, 1810(w), 1785(w), 17
40(s), 1695(m), 1600(w), 1555(w), 1370(m), 1290
(m), 1250(m), 1210(m), 1170(m)。 質量スペクトル：m/z＝６５２Ｍ⁺(陽イオン)

【化３８】

【００８２】実施例５ Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４−（４−スク
シンイミジルオキシカルボニルブチル）ベンゼンスルフ
ォニル〕−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキ
サミドフルオロスルホネート（２０）の調製は、ベンジ
ル４−〔Ｎ−（４−メトキシフェニル）スルファミド〕
−５−フェニルバレレートおよびアクリジン−９−カル
ボニルクロリドヒドロクロリドから出発し、（１６）の
合成と類似の態様で実施される。個々の合成段階の収量
および分光光学的性状は下記に示される。

【００８３】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（４−ベンジルオキシカルボニルブチル）ベンゼンス
ルフォニル〕アクリジン−９−カルボキサミド（１７）

【化３９】 収量：４０％、粘稠油、部分的に凝固する。 NMR(CDCl₃, 100 MHz)：δ=2.85ppm(m, 4H), δ=2.45ppm
(t, br, 2H), δ=2.8ppm(t, br, 2H), δ=3.5ppm(s, 3
H), δ=5.15ppm(s, 2H), δ=6.3ppm(d, 2H), δ=6.9ppm
(d, 2H), δ=7.3〜8.3ppm(m, 17H)。

【００８４】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（４−カルボキシブチル）ベンゼンスルフォニル〕ア
クリジン−９−カルボキサミドヒドロブロミド（１８）

【化４０】 収量：９５％。融点：分解、１５３〜１５５℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=1.7ppm(s, br, 4H), δ=2.3pp
m(m, br, 2H), δ=2.8ppm(s, br, 2H), δ=3.5ppm(s, 3
H), δ=6.5ppm(br, 2H), δ=7.05ppm(br, 2H),δ=7.5〜
8.5ppm(m, 12H)。

【００８５】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（４−スクシンイミジルオキシカルボニルブチル）ベ
ンゼンスルフォニル〕アクリジン−９−カルボキサミド
（１９）

【化４１】 収量：２５％、融点：分解、７５〜８０℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=1.8ppm(br, 4H), δ=2.3ppm
(s, 2H), δ=2.85ppm(s, br, 6H), δ=3.5ppm(s, br, 3
H), δ=6.5ppm(d, br, 2H), δ=7.05ppm(d, br, 2H),
δ=7.5〜8.3ppm(m, 12H)。

【００８６】Ｎ−（４−メトキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（４−スクシンイミジルオキシカルボニルブチル）ベ
ンゼンスルフォニル〕−１０−メチルアクリジニウム−
９−カルボキサミドフルオロスルホネート（２０）

【化４２】 収量：９０％。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=1.8ppm(br, 4H), δ=2.3ppm
(s, br, 2H), δ=2.8ppm(s, br, 6H), δ=3.5ppm(s, b
r, 3H), δ=4.8ppm(br, 3H), δ=6.5ppm(br, 2H),δ=7.
05ppm(br, 2H), δ=7.5〜9.0ppm(m, 12H)。 IR：3340cm^-1(br), 3060(w), 2930(m), 2870(w), 1810
(w), 1785(w), 1740(s),1695(m), 1600(w), 1550(w), 1
510(m), 1460(w), 1370(m), 1290(s), 1250(s),1205
(s), 1170(s)。 質量スペクトル：m/z＝６８０Ｍ⁺(陽イオン)

【００８７】実施例６ Ｎ−（２,４−ジメトキシフェニル）−Ｎ−〔４−（２
−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベンゼン
スルフォニル〕−１０−メチルアクリジニウム−９−カ
ルボキサミドフルオロスルホネート（２４）の調製は、
ベンジル４′−〔Ｎ−（２,４−ジメトキシフェニル）
−スルファミド〕−３−フェニルプロピオネートおよび
アクリジン−９−カルボニルクロリドヒドロクロリドか
ら出発して、（１６）の合成と類似の態様で実施され
る。個々の合成工程における収量および分光光学的性状
は下記に示す。

【００８８】Ｎ−（２,４−ジメトキシフェニル）−Ｎ
−〔４−（２−ベンジルオキシカルボニルエチル）−ベ
ンゼンスルフォニル〕アクリジン−９−カルボキサミド
（２１）

【化４３】 収量：５０％、融点：７４℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.9ppm(d, br, 2H), δ=3.1pp
m(d, br, 2H), δ=3.3ppm(s, 3H), δ=3.4ppm(s, 3H),
δ=5.1ppm(s, 2H), δ=5.9〜6.2ppm(m, 2H), δ=7.0ppm
(d, 1H), δ=7.35ppm(s, 5H), δ=7.5〜8.2ppm(m, 12
H)。

【００８９】Ｎ−（２,４−ジメトキシフェニル）−Ｎ
−〔４−（２−カルボキシエチル）−ベンゼンスルフォ
ニル〕アクリジン−９−カルボキサミドヒドロブロミド
（２２）

【化４４】 収量：９５％。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.75ppm(d, br, 2H), δ=3.05
ppm(d, br, 2H), δ=3.3ppm(s, 3H), δ=3.5ppm(s, 3
H), δ=5.95〜6.3ppm(m, 2H), δ=7.05(d, 1H),δ=7.6
〜8.6ppm(m, 12H), δ=9.2ppm(s, br, 2H)。

【００９０】Ｎ−（２,４−ジメトキシフェニル）−Ｎ
−〔４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチ
ル）ベンゼンスルフォニル〕アクリジン−９−カルボキ
サミド（２３）

【化４５】 収量：４５％、融点：１０５℃、分解。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.9ppm(s, 4H), δ=3ppm(br,
2H), δ=3.2ppm(s, 3H),δ=3.4ppm(s, 3H), δ=5.9〜6.
3ppm(m, 2H), δ=7.0ppm(d, 1H), δ=7.5〜8.4ppm(m, 1
2H)。 IR(KBr ディスク)：3440cm^-1(br), 3060(w), 2930(w),
2850(w), 1815(w), 1785(w), 1740(s), 1695(m), 1600
(w), 1510(m), 1460(w), 1440(w), 1365(m), 1320(w),
1290(w), 1240(m), 1210(s), 1165(m), 1085(m)。

【００９１】Ｎ−（２,４−ジメトキシフェニル）−Ｎ
−〔２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベ
ンゼンスルフォニル〕−１０−メチルアクリジニウム−
９−カルボキサミドフルオロスルホネート（２４）また
はトリフルオロアセテート

【化４６】 収量：８０％、融点：１３５℃、分解。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.9ppm(s, 4H), δ=2.95〜4.2
ppm(m, 10H), δ=4.8〜5.0ppm(s, br, 3H), δ=6.05〜
6.25ppm(m, 1H), δ=7.6〜9.0ppm(m, 14H)。 IR(KBr ディスク)：3430cm^-1(m), 2950(w), 2870(w), 2
825(w), 1810(w), 1780(m), 1750(s), 1695(m), 1610
(m), 1555(w), 1510(m), 1465(m), 1380(m), 1285(m),
1250(m), 1210(s), 1170(m)。

【００９２】高純度の（２４）が、実施例１から３に記
載したように調製用ＭＰＬＣによってトリフルオロアセ
テートとして得られる。

【００９３】実施例７ Ｎ−（３,４−エチレンジオキシフェニル）−Ｎ−〔４
−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）ベ
ンゼンスルフォニル〕−１０−メチルアクリジニウム−
９−カルボキサミドフルオロスルホネート（２８）の合
成は、ベンジル４′−〔Ｎ−（３,４−エチレンジオキ
シフェニル）−スルファミド〕−３−フェニルプロピオ
ネートおよびアクリジン−９−カルボニルクロリドヒド
ロクロリドから出発して、実施例４と類似の態様で実施
される。個々の工程の収量およびその分光光学的性状は
下記に示す。

【００９４】Ｎ−（３,４−エチレンジオキシフェニ
ル）−Ｎ−〔４−（２−ベンジルオキシカルボニルエチ
ル）ベンゼンスルフォニル〕アクリジン−９−カルボキ
サミド（２５）

【化４７】 収量：５０％、融点：９１.５℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.9ppm(d, br, 2H), δ=3.1pp
m(d, br, 2H), δ=4.0ppm(s, br, 4H), δ=5.1ppm(s, 2
H), δ=6.3〜6.8ppm(m, 3H), δ=7.3ppm(s, 5H),δ=7.6
〜8.3ppm(m, 12H)。

【００９５】Ｎ−（３,４−エチレンジオキシフェニ
ル）−Ｎ−〔４−（２−カルボキシエチル）ベンゼンス
ルフォニル〕アクリジン−９−カルボキサミドヒドロブ
ロミド（２６）

【化４８】 収量：９５％、融点：＞２００℃。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.7ppm(m, 2H), δ=3.05ppm
(m, 2H), δ=4.0ppm(s, br, 4H), δ=6.3〜6.8ppm(m, 3
H), δ=7.5〜8.6ppm(m, 12H), δ=9.6ppm(s, br, 2H)。

【００９６】Ｎ−（３,４−エチレンジオキシフェニ
ル）−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルエチル）ベンゼンスルフォニル〕アクリジン−９−
カルボキサミド（２７）

【化４９】 収量：４５％、融点：１４０℃、分解。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.7〜2.9ppm(d, s, superimpo
sed 6H), δ=3.0ppm(d,2H), δ=4.0ppm(s, br, 4H), δ
=6.3〜6.8ppm(m, 3H), δ=7.5〜8.4ppm(m, 12H)。 IR(KBr ディスク)：3420cm^-1(br), 3060(m), 2980(m),
2980(m), 1810(w), 1790(w), 1740(m), 1695(s), 1590
(m), 1460(w), 1430(w), 1410(w), 1370(m), 1300(m),
1225(s), 1175(s)。

【００９７】Ｎ−（３,４−エチレンジオキシフェニ
ル）−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルエチル）ベンゼンスルフォニル〕−１０−メチルア
クリジニウム−９−カルボキサミドフルオロスルホネー
ト（２８）

【化５０】 収量：８０％、融点：１１０℃、分解。 NMR(DMSO, 100 MHz)：δ=2.85ppm(s, 4H), δ=3.0〜3.3
ppm(s, s, br, 4H), δ=3.8〜4.5ppm(m, br, 4H), δ=
4.75〜5.1ppm(s, br, with shoulder, 3H), δ=6.3〜9.
0ppm(m, 15H)。

【００９８】実施例８ Ｎ−（４−カルボキシフェニル）−４−トルエンスルホ
ンアミド（２９） ３００mlのｉ−プロピルエーテル中の４−トルエンスル
フォニルクロリドの１９０.５ｇ（１モル）の溶液を１
滴づつ、炭酸水素ナトリウム２５２ｇ（３モル）および
水２.５リットル中の４−アミノ安息香酸１３９.１ｇ
（１モル）の混合物に２０から３０℃で加える。塩化ス
ルフォニルが消費されるまで、この混合物を激しく２か
ら４時間撹拌する。水溶液を分離し、濃塩酸でpH１に調
整し、沈殿物を酢酸プロピルに取る。抽出物を２Ｎの塩
酸で２度、さらに水で１度洗浄し、硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、蒸発脱水する。２４０ｇ（理論の８２.５
％）のＮ−（４−カルボキシフェニル）−４−トルエン
スルホンアミドが得られる。

【００９９】

【化５１】 ¹H-NMR(DMSO d₆)：δ=2.3(s, CH), 7.1(d, 芳香族, 2
H), 7.3(d, 芳香族, 2H),7.6〜7.9(m, 芳香族, 4H), 1
0.75(ブロード), 12.7(ブロード)。

【０１００】Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルフェ
ニル）−４−トルエンスルホンアミド（３０） １００mlのジメチルホルムアミド中の１１.６４ｇ（４
０ミリモル）のＮ−（４−カルボキシフェニル）−４−
トルエンスルホンアミド、５.０６ｇ（４０ミリモル）
の塩化ベンジルおよび５.２０ｇ（４４ミリモル）のジ
イソプロピルエチルアミンの溶液を１４０℃で４時間加
熱する。反応完了後、真空中で溶液を蒸発脱水する。１
１.８ｇ（理論値の７８％）のＮ−（４−ベンジルオキ
シカルボニルフェニル）−４−トルエンスルホンアミド
が得られるが、これをメタノールで再結晶化する。

【０１０１】

【化５２】 ¹H-NMR(DMSO d₆)：δ=2.3(s, CH₃), 5.3(s, CH₂), 7.1
〜7.3(dd, 4 芳香族, H),7.4(s, C₆H₅), 7.7〜7.9(dd,
4 芳香族, H), 10.8(ブロード, NH)。

【０１０２】Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルフェ
ニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−アクリジン
−９−カルボキサミド（３１） １０mlのテトラヒドロフラン中のトリエチルアミン２.
１ml（１５ミリモル）を、無水テトラヒドロフラン２０
ml中の１.５ｇ（４ミリモル）のＮ−（４−ベンジルオ
キシカルボニルフェニル）−４−トルエンスルホンアミ
ド、１.２３ｇ（４.４ミリモル）のアクリジンカルボニ
ルクロリドヒドロクロリドおよび０.０２ｇのジメチル
アミノピリジンの溶液に１滴づつ２５℃で加える。温度
を６０℃に上げる。

【０１０３】反応終了後、結晶化する生成物をメタノー
ルで撹拌し、吸引で濾過し酢酸エチルで再結晶化する。 収量：１.５７ｇ（理論値の６７.０％）。

【０１０４】

【化５３】 ¹H-NMR(CDCl₃)：δ=2.5(s, CH₃), 5.2(s, CH₂), 7.3(s,
C₆H₅), 7.0〜8.2(m, 16芳香族, H)。

【０１０５】Ｎ−（４−カルボキシフェニル）−Ｎ−
（４−トルエンスルホニル）−アクリジン−９−カルボ
キサミドヒドロブロミド（３２） １.１７ｇ（２mmol)のＮ−（４−ベンジルオキシカルボ
ニルフェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−ア
クリジン−９−カルボキサミドを、１０mlの３３％強度
の臭化水素／氷酢酸溶液とともに撹拌しながら６０℃で
４時間加熱する。冷却後、沈殿物を吸引で濾過し、真空
中で乾燥させる。

【０１０６】

【化５４】 収量：１.００ｇ（理論値の８７％）。¹ H-NMR(TFA)：δ=2.6(s, CH₃), 7.3〜8.6(m, 16 芳香
族, H), 11.65(s, NH)。 MS：496(M⁺)

【０１０７】Ｎ−（４−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルフェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−ア
クリジン−９−カルボキサミド（３３） ０.１１ｇ（１mmol）のクロロ蟻酸エチルを−１５℃で
撹拌しながら、２５mlの無水テトラヒドロフラン中の
０.５７ｇ（１mmol）のＮ−（４−カルボキシフェニ
ル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−アクリジン−
９−カルボキサミドヒドロブロミドおよび０.２１ｇ
（２mmol）のトリエチルアミンの溶液に加える。混合物
を同じ温度で１時間撹拌し、その後、０.１２ｇ（１mmo
l）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを加える。さらに
１時間後、混合物を室温に１５時間放置する。続いて真
空中で蒸発脱水し、残留物を酢酸エチルに取り、溶液を
水、炭酸水素ナトリウム溶液および水で洗浄して、硫酸
ナトリウム上で乾燥させる。蒸発脱水後、０.４２ｇ
（理論値の７０.８％）の目的生成物が得られる。

【０１０８】

【化５５】 ¹H-NMR（TFA)：δ=2.6(s, CH₃), 3.1(s, CH₂-CH₂), 7.0
〜8.6(m, 16 芳香族, H)。

【０１０９】Ｎ−（４−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルフェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−１
０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオ
ロスルホネート（３４） ０.８５ｇ（７.５mmol）のメチルフルオロスルホネート
を２５℃で撹拌しながら、３０mlの１,２−ジクロロエ
タン中の０.５９ｇ（１mmol）のＮ−（４−スクシンイ
ミジルオキシカルボニルフェニル）−Ｎ−（４−トルエ
ンスルホニル）−アクリジン−９−カルボキサミドの溶
液に加える。反応生成物を４時間以内に沈殿させる。吸
引で濾過し乾燥させた後、０.４３ｇ（理論値の６０.８
％）の目的生成物が得られる。

【０１１０】

【化５６】 ¹H-NMR（TFA)：δ=2.6(s, Ar-CH₃), 3.1(s, CH₂-CH₂),
4.9(s, N-CH₃), 7.3〜8.8(m, 16 芳香族, H)。

【０１１１】実施例９ Ｎ−（４−スクシンイミジルオキシカルボニルメチルフ
ェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−１０−メ
チルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオロスル
ホネートは、Ｎ−（４−カルボキシメチルフェニル）−
４−トルエンスルホンアミドから実施例８と同じ態様で
得られる。

【０１１２】Ｎ−（４−カルボキシメチルフェニル）−
４−トルエンスルホンアミド(３５）

【化５７】 ¹H-NMR（DMSO)：δ=2.3(s, CH₃), 3.5(s, CH₂), 7.0(A
B, C₆H₄), 7.3〜7.6(AB,C₆H₄), 10.2(s, NH)。

【０１１３】Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルメチ
ルフェニル）−４−トルエンスルホンアミド(３６）

【化５８】 収量；理論値の３５％。¹ H-NMR（DMSO)：δ=2.3(s, CH₃), 3.6(s, COCH₂), 5.1
(s, OCH₂), 6.9〜7.7(m,13 芳香族 H), 10.2(s, NH)。

【０１１４】Ｎ−（４−ベンジルオキシカルボニルメチ
ルフェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−アク
リジン−９−カルボキサミド(３７）

【化５９】 収量：理論値の３５％。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=2.55(s, CH₃), 3.3(s, COCH₂), 5.0
(s, O-CH₂), 6.7〜8.2(m, 21 芳香族 H)。

【０１１５】Ｎ−（４−カルボキシメチルフェニル）−
Ｎ−（４−トルエンスルホニル）−アクリジン−９−カ
ルボキサミドヒドロブロミド(３８）

【化６０】 収量：理論値の９５％。¹ H-NMR(TFA)：δ=2.65(s, CH₃), 3.55(s, CH₂), 6.8〜
8.6(m, 16 芳香族 H)。

【０１１６】Ｎ−（４−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルメチルフェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニ
ル）−アクリジン−９−カルボキサミド(３９）

【化６１】 収量：理論値の７１％。¹ H-NMR(TFA)：δ=2.65(s, トルエン CH₃), 3.0(s, CH₂-
CH₂), 3.6(ブロード, COCH₂), 6.9〜8.5(m, 芳香族)。

【０１１７】Ｎ−（４−スクシンイミジルオキシカルボ
ニルメチルフェニル）−Ｎ−（４−トルエンスルホニ
ル）−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミ
ドフルオロスルホネート(４０）

【化６２】 収量：理論値の８０％。¹ H-NMR(TFA)：δ=2.6(s, トルエン CH₃), 2.9(s, CH₂-C
H₂), 3.6(ブロード, COCH₂), 4.9(s, N-CH₃), 6.8〜8.9
(m, 芳香族)。

【０１１８】実施例１０ Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエ
チル）−フェニル〕−Ｎ−（４−トルエンスルホニル）
−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミドフ
ルオロスルホネートは、Ｎ−〔４−（２−カルボキシエ
チル）−フェニル〕−４−トルエンスルホンアミドから
実施例８と同じ態様で得られる。

【０１１９】Ｎ−〔４−（２−カルボキシエチル）−フ
ェニル〕−４−トルエンスルホンアミド(４１）

【化６３】 収量：理論値の４４％。¹ H-NMR(DMSO)：δ=2.3(s, CH₃), 2.4〜2.8(m, CH₂-C
H₂), 7.0(AB, 4H), 7.2〜7.8(AB, 4H), 10.1(s, NH)。

【０１２０】Ｎ−〔４−（２−ベンジルオキシカルボニ
ルエチル）−フェニル〕−４−トルエンスルホンアミド
(４２）

【化６４】 収量：理論値の７８％。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=2.35(s, CH₃), 2.4〜3.0(m, CH₂-CH
₂), 5.1(s, O-CH₂), 7.0〜7.8(13, 芳香族 H, NH)。

【０１２１】Ｎ−〔４−（２−ベンジルオキシカルボニ
ルエチル）−フェニル〕−４−トルエンスルホニル)ア
クリジン−９−カルボキサミド(４３）

【化６５】 収量：理論値の７７％。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=2.2〜2.8(m, 7H), 5.0(s, CH₂), 6.
65〜7.0(AB, 4 芳香族 H), 7.3〜8.3(m, 17 芳香族
H)。

【０１２２】Ｎ−〔４−（２−カルボキシエチル）−フ
ェニル〕−Ｎ−（４−トルエンスルホニル)アクリジン
−９−カルボキサミドヒドロブロミド(４４）

【化６６】 収量：理論値の６５％。¹ H-NMR(CD₃OD)：δ=2.1〜2.8(m, CH₂-CH₂), 2.5(s, C
H₃), 6.7〜8.5(16 芳香族H)。

【０１２３】Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキシ
カルボニルエチル）−フェニル〕−Ｎ−（４−トルエン
スルホニル)アクリジン−９−カルボキサミド(４５）

【化６７】 収量：理論値の９０％。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=2.6(s, CH₃), 2.7(ブロード, CH₂-C
H₂), 2.8(s, CH₂-CH₂),6.6〜8.3(16 芳香族 H)。

【０１２４】Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキシ
カルボニルエチル）−フェニル〕−Ｎ−（４−トルエン
スルホニル)アクリジン−９−カルボキサミドフルオロ
スルホネート(４６）

【化６８】 収量：理論値の８４％。¹ H-NMR(TFA)：δ=2.6(s, CH₃), 2.3〜3.3(ブロードベー
ス, 11H, s, 3, 1), 4.9(s, N-CH₃), 6.7〜8.8(16 芳香
族 H)。

【０１２５】実施例１１ Ｎ−〔４−（２−Ｎ−メチルモルホリンイオエトキシ）
−フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルカル
ボニルエチル）フェニルスルホニル〕−１０−メチル−
アクリジニウム−９−カルボキサミドジフルオロスルホ
ネートは、先行する実施例と類似の態様で得られる。相
違する工程は以下の反応工程で述べる。

【０１２６】tert−ブチル３−（４−クロロスルホニル
フェニル）−プロピオネート(４７） ２５ｇ（０.１ml）の３−（４−クロロスルホニルフェ
ニル）−プロピオン酸、１２mlのtert−ブタノール、６
０mlのｉ−ブテンおよび３mlの濃硫酸をオートクレーブ
で−１５℃で混合し、室温で２４時間激しく撹拌する。
反応混合物を再び−１５℃に冷却し、過剰の炭酸水素ナ
トリウム溶液で撹拌し、塩化メチレンで抽出して、最後
に真空中で蒸発脱水させる。

【０１２７】

【化６９】 収量：２０.４ｇ（理論値の６７％）。生成物はヘキサ
ンで再結晶化する。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=1.4(s), 2.6(m), 3.0(t), 7.4(m),
7.95(m)。 MS：m/z=305(M⁺ H) ３−（４−クロロスルホニルフェニル）−プロピオン酸
は、既知の方法で３−フェニルプロピオン酸およびクロ
ロスルホン酸から調製された。

【０１２８】４−（２−モルホリノエトキシ）アニリン
（４８） ２５ｇ（０.１mol）の４−（２−モルホリノエトキシ）
−ニトロベンゼンを、４００mlの半濃縮塩酸中の顆粒化
錫７５ｇとともに４時間還流下で沸騰させる。冷却後、
混合物を３３％強度の塩酸４００mlに注ぎ入れ、ｉ−プ
ロピルエーテルで抽出し、有機層を乾燥させ蒸発脱水す
る。２０ｇ（理論値の９０％）の目的生成物を得る。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=2.5(t), 2.7(t), 3.5（ブロード）,
3.7(t), 4.0(t), 6.6(m)。 MS：m/z=222(M⁺)。

【０１２９】同じ生成物が、パラジウム／活性炭上でメ
タノール中でニトロ化合物を水素添加することによって
得られる。

【０１３０】

【化７０】 ニトロ化合物は、Bull. Soc. Chim. (フランス、1955、
1353-62)にしたがって調製される。

【０１３１】Ｎ−〔４−（２−モルホリノエトキシ）−
フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−ｔ−ブトキシカルボニル
エチル）−フェニルスルホンアミド〕（４９） ９.３ｇ（３０mmol）のｔ−ブチル４−クロロスルホニ
ル−フェニルプロピオネートの透明溶液、６.９ｇの４
−（２−モルホリノエトキシ）アニリンおよび１５０ml
の塩化メチレン中の０.３ｇのジメチルアミノピリジン
を、室温で１０時間放置した後、飽和炭酸水素ナトリウ
ム溶液で洗浄し、続いて１／３に濃縮し、９０％塩化メ
チレンおよび１０％メタノールの混合物を用いてキーゼ
ルグールカラムでクロマトグラフィーに付す。溶出液の
主分画を蒸発脱水させる。

【０１３２】

【化７１】 収量：９ｇ（理論値の６１.２％）。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=1.35(s), 2.5(m), 2.7〜3.0(m), 3.
7(m), 4.0(t), 6.7〜7.0(m), 7.2〜7.7(m)。 MS：m/z=491(M⁺ H)。

【０１３３】Ｎ−〔４−（２−モルホリノエトキシ）−
フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−ｔ−ブトキシカルボニル
エチル）−フェニルスルホニル〕−９−アクリジンカル
ボキサミド（５０） ５０mlの３３％濃度の水酸化ナトリウム、３０mgのジメ
チルアミノピリジン、１.２ｇの塩化テトラブチルアン
モニウムおよび１.５５ｇ（５.６mmol）の９−アクリジ
ンカルボニルクロリドヒドロクロリドを、５０mlの塩化
メチレン中のＮ−〔４−（２−モルホリノエトキシ）−
フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−ｔ−ブトキシカルボニル
エチル）−フェニルスルホンアミド〕の２.０ｇ（４.１
mmol）の溶液に激しく撹拌しながら加える。６時間後、
有機層を分離し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、さらに蒸発脱水させる。

【０１３４】

【化７２】 収量：２.８ｇ（理論値の９８％）。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=1.4(s), 2.3〜2.5(m), 2.5〜2.8
(m), 3.0〜3.3(t), 3.6〜3.9(m), 6.3(d), 6.9(d), 7.4
〜8.3(m)。 MS：m/z=695(M⁺ H)。

【０１３５】Ｎ−〔４−（２−モルホリノエトキシ）−
フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−カルボキシエチル）−フ
ェニルスルホニル〕−９−アクリジンカルボキサミド
(５1） ０.７ｇ（１mmol）のＮ−〔４−（２−モルホリノエト
キシ）−フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−ｔ−ブトキシカ
ルボニルエチル）−フェニルスルホニル〕−９−アクリ
ジンカルボキサミドを、５mlのトリフルオロ酢酸に溶解
し、室温で一晩放置する。溶液を水圧ポンプによる真空
下で蒸発させ、残留物を水に溶かし、濾液を酢酸ナトリ
ウムでpH４に緩衝化する。生じた生成物を塩化メチレン
で抽出し、抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ蒸発脱
水させる。

【０１３６】

【化７３】 収量：０.６ｇ（理論値の９４％）。¹ H-NMR(DMSO)：δ=2.6〜3.0(m), 3.0〜3.3(m), 3.6〜4.
0(m), 4.0〜4.4(m), 5.8〜6.6(m), 6.8〜7.0(m), 7.3〜
8.4(m)。 MS：m/z=639(M⁺)。

【０１３７】Ｎ−〔４−（２−モルホリノエトキシ）−
フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキシ
カルボニルエチル）−フェニルスルホニル〕−９−アク
リジンカルボキサミド(５２）

【化７４】 収量：理論値の９５％。¹ H-NMR(CDCl₃)：δ=2.3〜2.7(m), 2.8(s), 2.9〜3.4
(m), 3.5〜3.9(m), 3.9〜4.3(m), 6.2〜7.0(m), 7.3〜
8.3(m)。 MS：m/z=736(M⁺)。

【０１３８】Ｎ−〔４−（２−メチルモルホリンイオエ
トキシ）−フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミ
ジルオキシカルボニルエチル）フェニルスルホニル〕−
１０−メチル−アクリジニウム−９−カルボキサミドジ
フルオロスルホネート(５３）

【化７５】 収量：理論値の８４％。化合物を水に溶かしたとき、透
明な黄色溶液を生じる。¹ H-NMR(DMSO)：δ=2.85(s), 3.1(s), 3.2〜4.4(m), 4.7
5(s), 6.4〜8.3(m)。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3120, 3080, 3060, 2960, 1815, 178
5, 1740, 1695, 1610, 1555, 1510, 1380, 1270, 1215,
1140。

【０１３９】実施例１２ Ｎ−メトキシ−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジルオキ
シカルボニルエチル）−ベンゼンスルホニル〕−１０−
メチルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオロス
ルホネートまたはトリフルオロアセテート（５７）の調
製は、ベンジル４−（Ｎ−メトキシスルファミド）−３
−フェニルプロピオネート（５３）およびアクリジン−
９−カルボニルクロリドヒドロクロリドから出発して、
化合物１６（実施例４）の合成と類似の態様で実施され
る。個々の合成工程における収量および分光光学的性状
は下記に示す。

【０１４０】Ｎ−メトキシ−Ｎ−〔４−（２−ベンジル
オキシカルボニルエチル）−ベンゼンスルホニル〕−ア
クリジン−９−カルボキサミド（５４） 収量：７２％。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3080(w), 3040(w), 3010(w), 2960
(m), 2950(m), 1730(s), 1700(s), 1595(m), 1455(m),
1380(s), 1295(m), 1230(s), 1195(s), 1180(vs),1145
(m), 1095(m), 980(m), 955(m), 765(s)。¹ H-NMR(100 MHz；Ｄ−トリクロロメタン)：δ〔ppm〕=
2.69〜2.90(m, 2H), 3.05〜3.29(m, 2H), 3.61(s, br,
3H), 5.13(s, 2H), 7.26〜7.43(m, 9H), 7.48(d,br, 2
H), 7.65〜7.85(m, 2H), 8.04(d, br, 2H), 8.15〜8.30
(m, 2H)。

【０１４１】Ｎ−メトキシ−Ｎ−〔４−（２−カルボキ
シエチル）−ベンゼンスルホニル〕−アクリジン−９−
カルボキサミドヒドロブロミド（５５） 収量：定量的、融点：１７５〜１７７℃（分解）。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3650〜3300(m, br), 3080(w), 3060
(w), 3040(w), 3200〜2000(br), 2960(m), 2910(m), 28
80(m), 2720(m), 2660(m), 2620(m), 1700(vs), 1640
(s), 1470(m), 1430(m), 1375(s), 1250(m), 1170(s),
1195(s), 950(m), 755(m)。¹ H-NMR(100 MHz；D₆-DMSO)：δ〔ppm〕=2.63〜2.88(m,
2H), 2.95〜3.20(m, 2H), 3.64(s, br, 3H), 4.02(s, 1
H), 7.18〜7.53(AA′XX′スペクトル, 4H), 7.60〜8.59
(m, 8H), 14.20(s, br, 1H)。 質量スペクトル〔EI, 70 eV；CI(イソブタン)：m/z：46
4 M⁺(陽イオン)。

【０１４２】Ｎ−メトキシ−Ｎ−〔４−（２−スクシン
イミジルオキシカルボニルエチル）−ベンゼンスルホニ
ル〕アクリジン−９−カルボキサミドヒドロブロミド
(５６） 収量：５５％。¹ H-NMR(100 MHz, D₆-DMSO)：δ〔ppm〕=2.84(s, 4H),
2.90〜3.38(m, 4H), 3.73(s, br, 3H), 7.28〜7.88(m,
br, 8H), 7.96〜8.31(m, br, 4H)。

【０１４３】Ｎ−メトキシ−Ｎ−〔４−（２−スクシン
イミジルオキシカルボニルエチル）−ベンゼンスルホニ
ル〕−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミ
ドフルオロスルホネートまたはトリフルオロアセテート
（５７） 収量：７５％。¹ H-NMR(100 MHz, D₆-DMSO)：δ〔ppm〕=2.75〜2.90(m,
4H), 3.24(s, br, 4H),3.65(s, br, 3H), 4.93(s, br,
3H), 7.38〜8.19(m, br, 8H), 8.38〜8.63(m, br, 2H),
8.93(d, br, 2H)。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3090(w), 2960(w), 2930(w), 2870
(w), 1815(m), 1790(s), 1745(vs), 1695(s), 1615(m),
1600(w), 1555(m), 1465(m), 1430(m), 1380(s),1210
(vs), 1190(vs), 1095(s), 770(s), 725(s), 670(s)。 質量スペクトル（ＦＡＢ；マトリックス：３−ニトロベ
ンジルアルコール（ＫＣＩは添加または非添加））：m/
z＝５７６Ｍ⁺（陽イオン）。

【０１４４】実施例１３ Ｎ−〔４−（３,６,９−トリオキサ−１−ウンデシルオ
キシ）フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−スクシンイミジル
オキシカルボニルエチル）−ベンゼンスルホニル〕−１
０−メチルアクリジニウム−９−カルボキサミドフルオ
ロスルホネートまたはトリフルオロアセテート（６３）
は、実施例１１と類似の態様で得られる。個々の合成工
程における収量およびその分光光学的性状は下記に示
す。４−（３,６,９−トリオキサ−１−ウンデシルオキ
シ）アニリン（５８）は、実施例１１で化合物（４７）
について述べたように、ニトロ化合物を還元することに
よって得られる。ニトロ化合物は、米国特許第２４８５
７１２号（１９４９）〔ＣＡ４４（１９５０）２５５６
ｉ〕にしたがって調製した。

【０１４５】４−（３,６,９−トリオキサ−１−ウンデ
シルオキシ）アニリン（５８）¹ H-NMR(100 MHz, CDCl₃)：δ〔ppm〕=1.20(t, 3H), 2.9
7(s, br, 2H), 3.51(q,2H), 3.54〜4.13(m, 14H), 6.50
〜6.84(m, 4H)。

【０１４６】Ｎ−〔４−（３,６,９−トリオキサ−１−
ウンデシルオキシ）フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−ｔ−
ブトキシカルボニルエチル）−フェニルスルホンアミ
ド〕（５９）¹ H-NMR(100 MHz, CDCl₃)：δ〔ppm〕=1.20(t, 3H), 1.3
9(s, 9H), 2.41〜2.63(m, 2H), 2.80〜3.05(m, 2H), 3.
53(q, 2H), 3.60〜3.75(m, 8H), 3.77〜3.91(m,2H), 3.
98〜4.13(m, 2H), 6.75, 6.98(AA′XX′スペクトル, 4
H), 7.24, 7.61(AA′XX′, スペクトル 4H)。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3280(m, br), 3070(w), 2980(s), 29
30(s), 2880(s), 1725(s), 1660(m), 1510(s), 1555
(m), 1370(s), 1340(m), 1300(m), 1250(m), 1170(s),
1115(m), 1095(m)。

【０１４７】Ｎ−〔４−（３,６,９−トリオキサ−１−
ウンデシルオキシ）フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−ｔ−
ブトキシカルボニルエチル）−フェニルスルホニル〕−
９−アクリジンカルボキサミド（６０） 収量：７０％。¹ H-NMR(100 MHz, CDCl₃)：δ〔ppm〕=1.17(t, 3H), 1.4
5(s, 9H), 2.55〜2.78(m, 2H), 3.01〜3.25(m, 2H), 3.
50(q, 2H), 3.54〜3.88(m, 12H), 6.33, 6.89(AA′XX′
スペクトル, 4H), 7.41〜7.83(m, 8H), 8.02〜8.18(m,
4H)。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3080(w), 3060(w), 2980(m), 2920
(m), 2880(m), 2860(m), 1740(s), 1690(s), 1600(m),
1510(m), 1360(s), 1250(s), 1175(s), 1160(s), 1150
(s), 1060(m), 950(m)。 質量スペクトル（ＦＡＢ；マトリックス：３−ニトロベ
ンジルアルコール（ＫＣＩは添加または非添加））：m/
z＝７４２Ｍ⁺（陽イオン）。

【０１４８】Ｎ−〔４−（３,６,９−トリオキサ−１−
ウンデシルオキシ）フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−カル
ボキシエチル）−フェニルスルホニル〕−９−アクリジ
ンカルボキサミド（６１）¹ H-NMR(100 MHz, CDCl₃)：δ〔ppm〕=1.18(t, 3H), 2.7
0〜2.95(m, 2H), 3.05〜3.28(m, 2H), 3.50(q, superim
posed, 2H), 3.52〜3.90(m, 12H), 6.35, 6.90(AA′X
X′スペクトル, 4H), 7.36〜7.85(m, 8H), 8.02〜8.28
(d, br, 4H)。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3450(br), 3300〜2400(br), 3080
(m), 3060(m), 2980(s), 2920(s), 2880(s), 1735(vs),
1690(vs), 1600(s), 1505(vs), 1450(m), 1355(vs), 1
250(vs), 1210(s), 1170(vs), 1140(s), 1125(s), 1105
(s), 1050(s), 950(s), 930(m), 860(m)。

【０１４９】Ｎ−〔４−（３,６,９−トリオキサ−１−
ウンデシルオキシ）フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−スク
シンイミジルオキシカルボニルエチル）−フェニルスル
ホニル〕−９−アクリジンカルボキサミド（６２） 収量：４５％¹ H-NMR(100 MHz, CDCl₃)：δ〔ppm〕=1.18(t, 3H), 2.8
3(s, br, 4H), 3.04〜3.30(m, 4H), 3.49(q, 2H), 3.53
〜3.89(m, 12H), 6.33, 6.86(AA′XX′スペクトル, 4
H), 7.50〜7.85(m, 8H), 8.00〜8.25(m, 4H)。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3070(w), 3060(w), 2980(m), 2930
(m), 2860(m), 1815(m), 1785(m), 1740(vs), 1690(v
s), 1600(m), 1505(vs), 1450(m), 1360(vs), 1290(s),
1250(vs), 1205(vs), 1170(vs), 1140(s), 1110(s), 1
080(s), 945(m), 855(m), 770(m), 760(m), 660(m), 65
0(m)。 質量スペクトル（ＦＡＢ；マトリックス：３−ニトロベ
ンジルアルコール（ＫＣｌは添加または非添加））：m/
z＝７８３Ｍ⁺（陽イオン）。

【０１５０】Ｎ−〔４−（３,６,９−トリオキサ−１−
ウンデシルオキシ）フェニル〕−Ｎ−〔４−（２−スク
シンイミジルオキシカルボニルエチル）−ベンゼンスル
ホニル〕−１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキ
サミドフルオロスルホネートまたはトリフルオロアセテ
ート（６３） 収量：４１％。

【０１５１】精製は実施例１〜３で記載したように調製
用ＭＰＬＣで実施される。 IR(KBr)〔cm^-1〕：3120(w), 3070(w), 2980(m), 2960
(m), 2930(m), 2900(m), 2880(m), 1810(m), 1785(m),
1740(s), 1690(s), 1610(m), 1505(m), 1380(s), 1255
(s), 1210(s), 1175(s), 1130(s), 1090(s), 935(m), 7
70(m), 670(m)。 質量スペクトル（ＦＡＢ；マトリックス：３−ニトロベ
ンジルアルコール（ＫＣｌは添加または非添加））：m/
z＝７９８Ｍ⁺（陽イオン）。

【０１５２】

【化７６】

【０１５３】

【化７７】

【０１５４】実施例１４ 式（６４）から（６９）のオリゴヌクレオチドの調製 ａ） 式（６４）のオリゴヌクレオチドの調製 5′d(H₂N-(CH₂)₆-O-pGGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT)3′ （６４） ３′−Ｏ−スクシネートとして０.２μmolの５′−Ｏ−
ジメトキシトリチルチミジンを結合させる支持体を、以
下の試薬で順次処理する： １．無水アセトニトリル ２．ジクロロメタン中の３％トリクロロ酢酸 ３．無水アセトニトリル ４．式（７３）の５′−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレ
オシド−３′−燐酸シセイソプロピルアミダイドのβ−
シアノエチルエステル、４μmol（第１回目の反応サイ
クルでは、Ｂ′＝Ｎ⁶−ベンゾイルアデン−１−イル）
および０.１５mlの無水アセトニトリル中の２５μmolの
テトラゾール ５．アセトニトリル ６．ルチジン４０％およびジメチルアミノピリジン１０
％を含むＴＨＦ中の２０％酢酸無水物 ７．アセトニトリル ８．ヨウ素(ＴＨＦ／水／ピリジン(７０：２０：５、v/
v/v）中に１.３ｇ)。

【０１５５】縮合工程No. ４で、Ｎ⁶−ベンゾイル−と
してアデノシンを、Ｎ⁴−ベンゾイルとしてシトシン
を、Ｎ²−イソブチリル−ヌクレオシド誘導体としてグ
アニンを、未保護分子としてチミンを前記の順にしたが
い用いる。

【０１５６】１から８までの工程（簡潔に反応サイクル
と呼ぶ）は、２４回繰り返して上記のシーケンスを構成
する。次の２６回目の反応サイクルでは、５′−Ｏ−ジ
メトキシトリチル−２′−デオキシヌクレオシド−３′
−ホスホルアミダイドの代わりに、式（７０）の５′−
アミノ修飾剤ホスホルアミダイドが工程４の縮合に用い
られる。合成が完了したあと、ジメトキシトリチル基の
除去は、工程１から３に記載したように行われる。オリ
ゴヌクレオチドは、アンモニアで１.５時間処理するこ
とによって支持体から切断され、同時にβ−シアノエチ
ル基は除去される。このオリゴヌクレオチドはまだアミ
ノ保護基を含んでいるので、さらにアンモニアでおよそ
２５℃２４時間処理する必要がある。生じた５′−アミ
ノアルキルホスフェートオリゴヌクレオチドの粗生成物
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＦＰＬＣまたは
ＨＰＬＣで精製する。性状は、エレクトロスプレー式陰
イオン質量スペクトルで調べる。

【０１５７】 ｂ） 式（６５）のオリゴヌクレオチドの調製 5′d(GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATp-O-CH₂-CH(OH)-CH₂-NH₂)3′ （６５） ３′−アミノプロパンジオール−修飾オリゴヌクレオチ
ドは、式（７１）の３′−アミノ修飾支持体を合成開始
時に用いるという点を除き、実施例ａ）に記載したよう
に合成され、第１回目の縮合は５′−Ｏ−ジメトキシト
リチル−チミジン−３′−ホスホルアミダイドを用いて
実施し、さらに、２６回の反応サイクルは上記の流れに
したがい構成する。式（７０）の５′−アミノ修飾剤を
用いる縮合は不要である。

【０１５８】 ｃ） 式（６６）のオリゴヌクレオチドの調製 5′d(GGCCGTTACCCCp-O-CH₂-CH(CH₂NH₂)-O-pCCTACTAGCTAAT)3′ （６６） この連続工程では、３′末端から１４番目のヌクレオチ
ドは、アミノプロパンジオールユニットで置換された。
合成は、１４回目の縮合工程ではＮ⁶−アデノシン−
３′−ホスホルアミドの代わりに式（７２）の分枝修飾
剤を用いるという点を除いて、実施例ａ）と類似の態様
で実施される。５′−誘導化は不要である。

【０１５９】 ｄ） 式（６７）のオリゴヌクレオチドの調製 5′d(GGCCGTTACCCCp{-NH-(CH₂)-NH}ACCTACTAGCTAAT)3′ （６７） この連続工程では、３′末端から１４番目と１５番目の
間のヌクレオチド間ホスホジエステル基は、アミノアル
キルホスホルアミデート基によって置換された。合成
は、１４回目の縮合工程では式（７３）のＮ⁶−アデノ
シン−３′−メトキシホスホルアミダイドを用いるとい
う点を除き、実施例ａ）と類似の態様で実施する。No．
８の工程の酸化は、ヨウ素水の代わりにＮ−トリフルオ
ロアセチルヘキサメチレンジアミン／ＴＨＦ（１：２、
v/v）中の０.１Ｍヨウ素を用いて実施する。５′−誘導
化は行わない。

【０１６０】 ｅ） 式（６８）のオリゴヌクレオチドの調製 5′d(GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAATp{-NH-(CH₂)₆-NH₂})3′ （６８） この連続工程では、オリゴヌクレオチドの３′末端は、
アミノアルキルホスホルアミデートとして誘導された。
合成は、式（７４）の支持体が合成開始時に用いられ、
第１回目の縮合は５′−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジ
ン−３′−メトキシホスホルアミダイド（式（７３）、
Ｂ＝チミン）を用いて行われ、その後の酸化反応（工程
No．８）はヨウ素水の代わりにＮ−トリフルオロアセチ
ルヘキサメチレンジアミン／ＴＨＦ（１：２＝ｖ：ｖ）
中の０.１Ｍヨウ素を用いて実施されるという点を除
き、実施例ｄ）と類似の態様で実施される。５′−誘導
化は行わない。合成の終わりに、ビスヒドロキシエチル
スルフィド・リンカーは、それ自体既知の方法でＮａＷ
Ｏ₄／Ｈ₂Ｏ₂で酸化され、塩基感受性ビスヒドロキシエ
チルスルホニル・リンカーを生じる。

【０１６１】 ｆ） 式（６９）のオリゴヌクレオチドの調製 5′d(GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-NH₂)3′ （６９） ３′−アミノ−オリゴヌクレオチドの合成は、式（７
５）の３′−デオキシ−３′−アミノチミジン支持体が
合成開始時に用いられるという点を除き、実施例ｂ）に
記載したように行う。合成の終わりに、ホスホルアミデ
ート結合を切断するために、さらに酸（８０％強度の酢
酸、１２時間、２５℃）で処理する。

【０１６２】実施例１５ アクリジニウム誘導体（１６）で標識した式(XI)のオリ
ゴヌクレオチドの調製 式（６５）（５−ＯＤ₂₆₀＝１５０μｇ）のオリゴヌク
レオチドを標識緩衝液５００μｌに溶かし、アセトニト
リル中の（１６）の１％濃度溶液５００μｌと混合し、
この混合物を室温で２日間撹拌する。標識緩衝液は、９
００mlの水に０.８９ｇの燐酸二水素カリウム、１６.６
４ｇの燐酸水素二ナトリウムおよび８.７７ｇの塩化ナ
トリウムを溶かし、水酸化ナトリウムを加えてpH８.０
とし、水で希釈し容量を１リットルとする。標識反応を
完了させるために、２度に別けてさらに（１６）の５０
０μｌを加え、その都度混合物をさらに１日２５℃で撹
拌する。反応終了後に、反応混合物を凍結乾燥し、この
残留物をＰＤ−１０カラム（ファルマシア製、Freibur
g）で脱塩する。さらに精製するために、得られた生成
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（１７％ポリアク
リルアミド、７Ｍウレア、３２００ボルト−時間）で精
製し、さらにＰＤ−１０で脱塩した。

【０１６３】実施例１６ E. coli検出用ホモジニアス遺伝子プローブアッセー 標準物質またはコントロール５０μｌをポリスチレンの
小試験管にピペットで入れる。実施例１５で調製した
３′末端標識遺伝子プローブの５０μｌ（２.５×１０⁶
ＲＬＵ、１Ｍのトリス緩衝液（pH７）を続いて加え、
６０℃で１５分間ハイブリダイズする。続いて３００μ
ｌの選別試薬（四ホウ酸塩０.２Ｍ、pH８）を加え、混
合物を３秒間２度振り動かす。その後この試験管を５分
間冷却する。測定は、アナライザー試薬１（０.１Ｍの
ＨＮＯ₃、０.１％Ｈ₂Ｏ₂）およびアナライザー試薬２
（１ＭのＮａＯＨ、１Ｍウレア、１％臭化セチルトリメ
チルアンモニウム）をそれぞれ３００μｌに加えてベル
トルド・オートクリニルマート(Berthold Autoclinilum
at)で行う。測定時間は１秒／サンプルである。

【０１６４】実施例１７ E. coli検出ヘテロジニアスアッセー 標準物質またはコントロール５０μｌをポリスチレンの
小試験管にピペットで入れる。実施例１５と類似の態様
でオリゴヌクレオチド（６６）から調製した、５０μｌ
の内部標識遺伝子プローブ（２.５×１０⁶ＲＬＵ、１Ｍ
トリス緩衝液、pH７）を続いて加え、６０℃で１５分間
ハイブリダイズする。その後、１mlの分離試薬（０.４
Ｍの燐酸緩衝液および０.５％のトリトンＸ−１００（p
H６）を含む磁性粒子アクチベーター並びに４.６％固形
分および最終濃度０.０１mg／mlの８２％磁鉄鉱成分を
含むアドバーンストマグネチクス社製磁性粒子）を加
え、混合物を２度振り動かし、続いて６０℃１０分イン
キュベートする。その後磁性粒子を５分間分離する。上
清を捨て、試験管に５mlの洗浄緩衝液（ＮａＯＨ（pH１
１）、トリトンＸ−１００）を加える。その後の分離工
程を２０分行う。続いてもう一度上清を捨て、磁性粒子
を残存洗浄緩衝液中でボルテックスミキサーで撹拌す
る。光誘発および測定は実施例１６で述べたように行
う。

【０１６５】

【表１】

【０１６６】

【表２】

【０１６７】

【表３】

【０１６８】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の遺伝子プローブのアクリジニウム誘導
体の検出下方限界を示す。

【図２】ジエンプローブ製のアクリジニウムエステルの
検出下方限界を示す。

【図３】式６５をＡｃ−ヘキストと反応させた式７６の
標識オリゴヌクレオチドの２日後の吸収測定の結果を示
す。

【図４】式６５をＡｃ−ヘキストと反応させた式７６の
標識オリゴヌクレオチドの３日後の吸収測定の結果を示
す。

【図５】式６５をＡｃ−ヘキストと反応させた式７６の
標識オリゴヌクレオチドの４日後の吸収測定の結果を示
す。

【図６】式６５をＡｃ−アボットで標識したものの２日
後の吸収測定の結果を示す。

【図７】式６５をＡｃ−アボットで標識したものの３日
後の吸収測定の結果を示す。

【図８】式６５をＡｃ−アボットで標識したものの４日
後の吸収測定の結果を示す。

【図９】ピリジン／Ｈ₂Ｏ／アセトニトリル中でのオリ
ゴヌクレオチド（６５）とＡｃ−アボットとを反応させ
た場合のＨＰＬＣデータを示す。

【図１０】ピリジン／Ｈ₂Ｏ／アセトニトリル中でのオ
リゴヌクレオチド（６５）とＡｃ−ヘキストとを反応さ
せた場合のＨＰＬＣデータを示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の式（XI）の遺伝子プローブ： 【化１】 式中、 Ｒ¹⁴は水素、ヒドロキシル、アミノ、ＮＨＲ¹⁵、アジ
   ド、ハロゲンまたはαもしくはβ位の保護ヒドロキシル
   もしくはメトキシ基であるか（ここで、Ｒ¹⁵はＣ₁−Ｃ
   ₁₈−アルキル（好ましくはＣ₁−Ｃ₈−アルキル）、Ｃ₆
   −Ｃ₂₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）−アリール−（Ｃ₁−
   Ｃ₈）−アルキルまたは−(ＣＨ₂)_c−〔ＮＨ(ＣＨ₂)_c〕_d
   −ＮＲ¹⁶Ｒ¹⁶′（ここで、ｃは２から６までの整数で、
   ｂは０から６までの整数で、Ｒ¹⁶およびＲ¹⁶′は、それ
   ぞれ別個に水素、Ｃ₁−Ｃ₆−アルキルまたは（Ｃ₁−
   Ｃ₄）−アルコキシ−（Ｃ₁−Ｃ₆）−アルキル（好まし
   くはメトキシエチル）））、または−〔Ｚ⁶−Ａ⁶〕_xo″
   基で、 Ａ¹、Ａ²、Ａ³、Ａ⁴、Ａ⁵およびＡ⁶はアクリジニウム誘
   導体で、それらは式（XI）のＺ¹、Ｚ²、Ｚ³、Ｚ⁴、Ｚ⁵
   およびＺ⁶に結合しており、 Ｂはウラシル以外のヌクレオチド化学では普遍的な塩基
   であり、 Ｍはオキシ、メチレン、フルオロメチレンまたはジフル
   オロメチレンで、 Ｕはオキシ、スルファネジイル、イミノまたはメチレン
   で、 Ｖはヒドロキシル、メルカプト、ＳｅＨ、Ｃ₁−Ｃ₁₈−
   アルコキシ（好ましくはＣ₁−Ｃ₆−アルコキシ）、Ｃ₁
   −Ｃ₁₈−アルキル（好ましくはＣ₁−Ｃ₆−アルキル）、
   Ｃ₆−Ｃ₂₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）−アリール−（Ｃ
   ₁−Ｃ₈）−アルキル、ＮＨＲ¹⁵、ＮＲ¹⁶Ｒ¹⁷または式
   （ＯＣＨ₂ＣＨ₂)_m′Ｏ(ＣＨ₂)_n′ＣＨ₂Ｒ¹⁸の基であり
   （ここで、Ｒ¹⁵およびＲ¹⁶は上記の意味を有し、Ｒ¹⁷は
   Ｃ₁−Ｃ₁₈−アルキル（好ましくはＣ₁−Ｃ₈−アルキ
   ル、特にＣ₁−Ｃ₄−アルキル）、Ｃ₆−Ｃ₂₀−アリール
   または（Ｃ₆−Ｃ₁₀−）−アリール−（Ｃ₁−Ｃ₈）−ア
   ルキルであるか、または、ＮＲ¹⁶Ｒ¹⁷の場合にはＲ¹⁶お
   よびそれらと結合している窒素原子と一緒になって５−
   から６−員環の複素環を形成するが、それはさらにＯ、
   ＳおよびＮを含む群から選ばれる異種原子を含むことも
   でき、Ｒ¹⁸は水素、またはヒドロキシル、アミノ、ＮＨ
   Ｒ¹⁶、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＯＲ¹⁹またはハロゲ
   ンのような官能基（ここでＲ¹⁹はＣ₁−Ｃ₄−アルキル
   （好ましくはメチル）で、Ｒ¹⁶およびハロゲンは上記の
   意味を有する）であり、ｍ′は１から１００まで、好ま
   しくは３から２０、特に好ましくは３から８の整数で、
   ｎ′は０から１８、好ましくは０から１５の整数であ
   る）、 Ｗはオキソ、チオキソまたはセレンオキソで、 Ｘはオキシ、チオ、ＮＨまたはメチレンで、 Ｙはオキシ、チオ、ＮＨ、メチレンまたは保護基であ
   り、 Ｚ¹、Ｚ²、Ｚ³、Ｚ⁴およびＺ⁵は、それぞれ別個にＣ₁−
   Ｃ₃₀−アルキル、Ｃ₆−Ｃ₃₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）
   −アリール−（Ｃ₁−Ｃ₂₀）−アルキルまたはＣ₁−Ｃ₃₀
   −アルコキシであり（その置換基は場合により、Ｃ₁−
   Ｃ₈−アルキル、Ｃ₆−Ｃ₂₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₄）
   −アリール−（Ｃ₁−Ｃ₈）−アルキル、Ｃ₁−Ｃ₈−アル
   コキシ、イミノ、ヒドロキシル、ＮＨＲ¹⁵（ここでＲ¹⁵
   は上記の意味を有する）、チオ、ホスフェート、ピロホ
   スフェートまたはトリホスフェートによって一置換また
   は多置換されている）、 ｏｏ′は０から１までの整数で、 ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｙｏ′およびｘｏ″は、変数ｏ
   ｏ′、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｙｏ′またはｘｏ″のうち
   少なくとも１個は０ではないということを条件として、
   それぞれ別個に０または１で、 ｐ′は１から１００までの整数であり、そしてｐ′のカ
   ギ括弧は２′位または３′位を表している。
2. 【請求項２】 Ｂがウラシルを含む、ヌクレオチド化学
   では普遍的な塩基であり、ｘｏおよびｙｏがそれぞれの
   場合に０である、請求項１に記載の遺伝子プローブ。
3. 【請求項３】 Ｂがβ位にある塩基で、ＭがＯで、Ｒ¹⁴
   がＨまたはＯＨで、ＹがオキシまたはＮＨで、Ｍ、Ｕ、
   ＶおよびＷがＯで、Ｚ¹、Ｚ²、Ｚ³、Ｚ⁴およびＺ⁵が、
   それぞれ別個に、場合によってイミノおよび／またはヒ
   ドロキシルで置換されたＣ₁−Ｃ₃₀−アルキル、Ｃ₆−Ｃ
   ₃₀−アリール、（Ｃ₆−Ｃ₁₂）−アリール−（Ｃ₁−
   Ｃ₂₀）−アルキルまたはＣ₁−Ｃ₃₀−アルコキシで、
   ｐ′が５から５０までの整数で、ｏｏ′が０から３まで
   の整数であって、変数ｘｏ′、ｙｏ′、ｘｏ″およびｏ
   ｏ′の２つが０ではない、請求項１および２に記載の遺
   伝子プローブ。
4. 【請求項４】 ｐ′が１０から３０までの整数で、ｏ
   ｏ′が０または１であって、変数ｘｏ′、ｙｏ′、ｘ
   ｏ″およびｏｏ′の１つが１であることができ、残りの
   変数がそれぞれの場合において０である、請求項１から
   ３の１つまたは２つ以上に記載の遺伝子プローブ。
5. 【請求項５】 ｏｏ′が１で、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｙ
   ｏ′およびｘｏ″が０である、請求項１から４の１つま
   たは２つ以上に記載の遺伝子プローブ。
6. 【請求項６】 ｘｏ′が１で、ｘｏ、ｙｏ、ｙｏ′、ｘ
   ｏ″およびｏｏ′が０である、請求項１から５の１つま
   たは２つ以上に記載の遺伝子プローブ。
7. 【請求項７】 ｙｏ′が１で、ｘｏ、ｙｏ、ｘｏ′、ｘ
   ｏ″およびｏｏ′が０である、請求項１から６の１つま
   たは２つ以上に記載の遺伝子プローブ。
8. 【請求項８】 次の式（Ｉ）のアクリジニウム誘導体の
   １つまたは２つ以上を含む請求項１から６の１つまたは
   ２つ以上に記載の遺伝子プローブ： 【化２】 式中、 Ｒ⁴は、実際に行われた、必要によってはスペーサーを
   介するオリゴヌクレオチドまたは次の式（II）もしくは
   （III）のラジカルとの結合を表し、 【化３】 ここで、Ｒ⁵は、オリゴヌクレオチド（例えば特にＤＮ
   ＡおよびＲＮＡ中のオリゴヌクレオチドおよびポリヌク
   レオチド配列（標的））との結合に変換される反応基で
   あり、 Ｒ⁶は水素、１から１０個の炭素原子を有するアルキ
   ル、アルケニルもしくはアルコキシ基、または置換アミ
   ノ基、ベンジル基、アリール基、ヘテロアルキル基もし
   くは複素環（これらはまた各々ヒドロキシル、アミノ、
   アルキルアミノ、アルキル、アルケニルまたはアルコキ
   シ（１から１０個の炭素原子を有する）、ポリアルキル
   オキシもしくはアリールオキシ基、または複素環基によ
   って置換されていてもよいが、最後に挙げた置換基は、
   それらに関するかぎり、複素環化合物またはアミンで置
   換されていてもよいが、また一緒になってＯおよび／ま
   たはＳおよび／またはＮＨまたはＮ−アルキルを有する
   複素環形成してもよい）であり、 Ｘはアリール基（これは直接、またはアルキルもしくは
   オキシアルキル基を介して窒素または硫黄原子に結合
   し、さらに、アルキルまたはオキシアルキル基を介して
   Ｒ⁵基に結合し、アルキル、アルケニル、ヒドロキシ
   ル、アミノ、アルコキシ、ポリアルコキシまたはアリー
   ルオキシ基および／または異種原子で一置換または多置
   換されていてもよい）であるか、または脂肪族、芳香脂
   肪族もしくは芳香族（必ずしも天然である必要はない）
   の残基、アミノカルボン酸、またはＲ⁶がＣ₁−Ｃ₆−ア
   ルキルで一置換または多置換されているフェニル基の場
   合はフェニル基であり、 Ｒ¹は水素、１から１０個の炭素原子を有するアルキ
   ル、アルケニルもしくはアルキニル基、またはベンジル
   もしくはアリール基で、 Ｒ²およびＲ³は水素、１から１０個の炭素原子を有する
   アルキル基、置換もしくは未置換アミノ基、またはカル
   ボキシル、アルコキシ、シアノもしくはニトロ基または
   ハロゲンである。
9. 【請求項９】 Ｘが次の式（IV）の基である請求項８に
   記載の遺伝子プローブ： 【化４】 式中、 Ｒ⁷は式−(ＣＨ₂)_n−または（(ＣＨ₂)_m−Ｏ)_n−（ここ
   でｎ＝０から４で、ｍ＝１から６）の式の置換基で、 Ｒ⁸は、Ｒ⁷に対してオルト、メタまたはパラ位にある、
   式−(ＣＨ₂)_p−の置換基であるか、または式−(Ｏ−(Ｃ
   Ｈ₂)_m−)_pもしくは−((ＣＨ₂)_m−Ｏ−)_p′のポリアルキ
   レンオキシド基（ここで好ましくはｐ＝１から６）であ
   るか、または１から４個の炭素原子を有する分枝もしく
   は直鎖炭化水素基で、 置換基Ｒ⁹からＲ¹¹は水素、または３０個までの炭素原
   子を有する直鎖もしくは分枝炭化水素基で、この場合、
   １つまたは２つ以上の−ＣＨ₂単位はまたＯ、Ｓ、Ｓ
   Ｏ、ＳＯ₂、ＮＨまたはＮ−アルキルで置き換えられて
   いてもよく、これら置換基の２つは環の形で結合してい
   てもよい。
10. 【請求項１０】 Ａ１からＡ６の基の少なくとも１つが
    水素である、式（XI）の化合物を、Ｒ⁵が式（XI）の化
    合物の官能基と化学結合を形成する反応基である式
    （Ｉ）の化合物と反応させる、請求項１から９の１つま
    たは２つ以上に記載の遺伝子プローブの製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１から９の１つまたは２つ以上
    に記載の遺伝子プローブを用いる、ホモジニアスアッセ
    ー原理が実施される、液体サンプル中のオリゴヌクレオ
    チドまたはポリヌクレオチド標的（ＲＮＡまたはＤＮ
    Ａ）を検査する遺伝子プローブアッセー。
12. 【請求項１２】 請求項１から９の１つまたは２つ以上
    に記載の遺伝子プローブを用いる、ヘテロジニアスアッ
    セー原理が実施される、請求項１１に記載の遺伝子プロ
    ーブアッセー。
13. 【請求項１３】 標的が、標的を増幅した後ハイブリダ
    イゼーションで検査される、請求項１１または１２に記
    載の遺伝子プローブアッセー。
14. 【請求項１４】 １つまたは２つ以上のシグナル増幅系
    がさらに用いられる、請求項１１から１３の１つまたは
    ２つ以上に記載の遺伝子プローブアッセー。