JPH06339378A - 液相核酸アッセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプローブ - Google Patents

液相核酸アッセイおよびそこで有用なポリヌクレオチドプローブ

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JPH06339378A
JPH06339378A JP5233589A JP23358993A JPH06339378A JP H06339378 A JPH06339378 A JP H06339378A JP 5233589 A JP5233589 A JP 5233589A JP 23358993 A JP23358993 A JP 23358993A JP H06339378 A JPH06339378 A JP H06339378A
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JP5233589A
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Michael Steven Urdea
スティーブン アーディア ミカエル
Brian Warner
ワーナー ブライアン
Thomas Horn
ホーン トーマス
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 特別な核酸配列の検出のための方法および組
成物を提供する。 【構成】 以下の構造式１によって示される修飾ヌクレ
オチド： 【化１】 ここでＲ1は検出可能な標識により誘導体を作りうる反
応基であり；Ｒ2はアミド結合、チオエーテル結合もし
くはジスルフィド結合、またはそれらの組み合わせを含
む任意の結合部分であり；Ｒ3は水素、メチル、臭素、
フッ素およびヨウ素から成る群から選ばれ；Ｒ4は水
素、酸感受性で塩基安定性のブロッキング基およびアシ
ルキャッピング基から成る群から選ばれ；Ｒ5は水素ま
たはリン誘導体であり；Ｒ6はＨ、ＯＨ、またはＯＲ
で、この場合のＲは酸感受性で塩基安定性の保護基であ
り；そしてxは１から８を含む範囲の整数である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は一般に液相核酸アッセイ
およびそこで有用なポリヌクレオチドプローブに関す
る。本発明はまた、プローブの中に組み込まれる標識化
された修飾ヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】関連文献 MeinkothおよびWahl、Anal. Biochem.、(1984) 138：26
7-284にはハイブリダイゼーション技術に関する総説記
事が記載されている。またドットブロットアッセイに関
しては、Learyら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (198
3) 80：4045-4049も参照せよ。サンドイッチハイブリダ
イゼーションについてはRankiら、 Curr. Top. Microbi
ol. Immunology (1983)、pp.308ffに記述されている。
またRankら、Gene (1983) 21：77-85、Virtanenら、Lan
cet (1983) 381-383、および米国特許第4,486,539号も
参照せよ。EPA123,300には、核酸配列検出に使用するビ
オチン−アビジン複合体が記載されている。SungはNuc
l. Acids Res. ９(22)：6139-6151(1981)およびJ. Org.
Chem. 47：3623-3628 (1982)で、修飾ヌクレオチドの
合成、およびオリゴヌクレオチド合成における改変構造
の応用について検討を行なっている。修飾ヌクレオチド
はまた、Draper、Nucleic Acids Res. 12：２：989-100
2 (1984)にも記載されており、RNA中のシチジン残基を
リポーター分子と結合するよう修飾させることが示唆さ
れている。最近の研究でも、DNA中のシチジン残基の同
様の修飾についての示唆がなされている（Anal. Chem.
157 (2):199 (1986))。ヨーロッパ特許出願第063879号
（出願日1982年４月６日）、およびPCT出願第PCT/US84/
00279号にも修飾ヌクレオチドおよびその応用について
記載されている。
【０００３】DNA配列のクローン化と合成が容易になる
に従って、関心のある特別な核酸配列を検出できる機会
が非常に多くなってきた。病原体、病変、抗原などを検
出する場合、もう免疫複合体の使用に依存しなくても済
むようになった。特別の決定因子部位を検出するよりも
むしろ、特別な細胞と関係のあるDNA配列もしくはRNA配
列を検出することができるようになった。この方法で、
病気は診断され、表現型と遺伝子型が分析され、さらに
多形性、細胞間の関係などがしらべられる。
【０００４】DNA配列分析はその大部分が、配列の固相
支持体への結合、およびこの結合配列への相補配列のハ
イブリダイゼーションに関するものであった。アニーリ
ングと複合化の段階は通常長時間を要し、また非特異的
なバックグランドの信号を最小にするために注意深い洗
浄が必要である。より迅速で、操作段階の数を最小限に
し、しかも信号／ノイズ比の大きい核酸配列分析のため
の新技術開発には、実質的な関心がある。
【０００５】本出願はこのような技術において有用なポ
リヌクレオチドプローブを目的としたものでもある。現
在使用されている大部分のポリヌクレオチドプローブ
は、例えば3Ｈ、32Ｐ、14Ｃあるいは125Ｉのアイソトー
プで放射標識されている。これらの物質は、例えば32Ｐ
標識ATPを使用したキナーゼ化による放射活性部分の直
接導入、トリチウム化H2Oでの平衡化、その他によって
比較的簡単に合成され得る。しかしながら、よく知られ
ているようにこのような放射標識の使用には欠点があ
り、放射活性のない他の検出可能種が好ましい。
【０００６】ヌクレオチドに他の非放射性の検出可能種
を導入するためには、ヌクレオチドにある種の化学修飾
を施すことが必要である。ヌクレオチドの修飾は、修飾
反応がいづれもRNAまたはDNA分子をそのままの状態に保
つに充分なほど穏やかで、なおかつ得られるヌクレオチ
ドの修飾産物が正常な塩基対合やスタッキングの相互作
用に参加できるものでなければならないので、難しい高
感度の手順であることが広く認められている。これらを
考慮に入れると、ヌクレオチド置換位置は代表的には、
文献にもみられるようにピリミジンの5-位およびプリン
の8-位に限られてくる（例えばヨーロッパ特許出願0638
79（上記引用）を参照せよ）。
【０００７】他の点についても考慮に入れなければなら
ない。検出可能標識がヌクレオチド鎖の内部にあるより
もむしろ鎖の一端にある場合は、ハイブリダイゼーショ
ン中に塩基対合が妨害される可能性がある。さらに、大
量に安価に合成できる非放射標識化プローブでさえ提供
することは困難であることが判った。従って、多くの既
知のプローブはその応用の可能性が限定されている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特別
な核酸配列の検出のための方法および組成物を提供する
ことにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明のアッセイ法は、
第１の標識セットおよび第２の捕獲セットの２組の試薬
を使用して試料中の核酸配列を検出するアッセイ法であ
って、以下の工程（１）、（２）および（３）を包含す
る：（１）該試料、該標識試薬セットのメンバーおよび
該第２の捕獲試薬セットのメンバーを液体媒質中で相補
対の結合条件下で結合する工程、ここで該試料は一本鎖
型の分析物を含有し、該標識試薬セットのメンバーは以
下のもの：（ａ）１個または複数個の標識核酸プローブ
であって、異なるプローブは異なる第１の分析物相補配
列と第１の標識試薬認識配列とを有する；および（ｂ）
該第１の認識配列に相補的な核酸配列と標識との結合体
であって、ここで該標識は直接または間接的に検出可能
信号を与える；を含有し、そして該第２の捕獲試薬セッ
トのメンバーは以下のもの：（ｃ）１個または複数個の
捕獲核酸プローブであって、異なるプローブは異なる第
２の分析物相補配列と第２の捕獲試薬認識配列とを有す
る；および（ｄ）該第２の認識配列に相補的な核酸配列
と特異結合対の第１のメンバーとの結合体；および
（ｅ）分離手段；を含有し、該第２の認識配列に相補的
な該核酸配列は該分離手段と結合していてもよく、この
場合（ｄ）は使用されないものとする；（２）該分離手
段を使用して標識を結合相および非結合相へ分離する工
程；および（３）該分析物の存在を結合または非結合の
標識の量で検出する工程；を包含し、そのことにより上
記目的が達成される。
【００１０】２組の試薬が使用され、これらは捕獲セッ
トおよび標識セットと称される。各セットは少なくとも
２つのメンバーをもっている。標識セットは（１）第１
の分析物相補配列−第１の標識試薬認識配列１個または
１群結合体を含む第１のプローブセット；および（２）
１個または１群の、該第１の認識配列の相補配列−標識
結合体、をもっている。捕獲セットは次の（１）（２）
および（３）をもっている：（１）第２の分析物相補配
列が第２の捕獲試薬ポリヌクレオチド認識配列と結合し
たもの１個または１群を含む第２のプローブセット；
（２）分離メンバーまたは好ましくは捕獲結合体を特定
する第１の特異結合対メンバーと結合している該第２の
捕獲認識配列の相補配列１個または１群；および（３）
（２）が分離メンバーをもたない場合は第１の相補特異
結合対メンバーに結合した分離メンバー。
【００１１】一本鎖の核酸サンプルを、アニーリング条
件下でこの２セットの相補配列を含有するプローブと結
合して、続いて捕獲結合体および任意に標識結合体を加
えることにより、分析物の特異結合対メンバーおよび任
意に標識との複合体が提供され得る。プローブとハイブ
リダイズした分析物配列は、分離手段を有する複合体と
結合させ、プローブ結合分析物を非結合分析物から分離
することにより、分離する。標識があらかじめ添加され
ていない場合には、第１の認識配列−標識結合体を、ハ
イブリダイズする条件下で、分離メンバーを含む相に加
える。そして標識がどちらかの相で検出され得る。
【００１２】本発明を他の見地からみると、次の構造式
１を有する修飾された誘導体化可能なヌクレオチドが提
供される。
【００１３】
【化４】
【００１４】ここでＲ1は検出可能標識により誘導体を
作ることができる反応基で、この反応基としてはアミ
ン、カルボキシル、チオールがあり、さらに種々の合成
操作に対して保護されるものである。Ｒ2は通常タンパ
クを標識するのに用いられるような任意の結合部分で、
これにはアミド結合、チオエーテル結合またはジスルフ
ィド結合、またはこれらの組み合わせが含まれる。Ｒ3
は水素、メチル基、臭素、フッ素およびヨウ素から成る
群から選ばれる。Ｒ4はその構造を固相支持体に共有結
合するような固着基である水素、またはジメトキシトリ
チルやピキシルのような一般に塩基に安定で酸感受性の
ブロッキング基である。Ｒ5はその構造を固相支持体に
共有結合する固着基である水素、または3'位におけるヌ
クレオチドの添加を可能ならしめる、例えばＰＯ3Ｈ2、
ホスホトリエステル、ホスホジエステル、亜リン酸塩、
ホスホロアミダイト、Ｈ−リン酸塩またはホスホロチオ
エイトのようなリン誘導体である。Ｒ6はＨ、ＯＨまた
はＯＲであり、ここでＲはRNA合成における保護部分と
して有用な官能基であり、xは１から８までの整数であ
る。本発明は、Ｒ1部分を検出可能標識で誘導体化する
段階を含む上記修飾ヌクレオチドの生成方法をも包含し
ている。
【００１５】また別の観点からみると、１個以上の上記
修飾ヌクレオチドを使用して核酸プローブが提供され
る。このプローブは、多数の１本鎖ポリヌクレオチド鎖
または２本鎖ポリヌクレオチド鎖を含むサンプルの選別
に用いることができるし、所望配列があればそれをハイ
ブリダイゼーションによって標識することもできる。
【００１６】以下に本発明を詳細に説明する。
【００１７】１．サンドイッチアッセイ法 ２セットの試薬を使用して核酸配列を検出するための方
法と組成物が提供される。核酸分析物に相補的な核酸配
列および任意配列に相補的な核酸配列と、特異結合対メ
ンバーとの組み合わせを使用することにより、検出可能
標識は試料中に存在する分析物の量に比例して２相に分
離し得る。核酸配列を溶液中でアニーリングするように
しておくと、固相表面でのアニーリングに比較してアッ
セイ時間を実質的に短縮することができ、また所望分離
および洗浄段階の数を限定することができ、あまり重大
ではなくなるので、検査技師の誤差を減少することがで
きる。相補配列を含有する試薬を変性期間中あるいは終
了時に過剰に添加して、２本鎖DNAの復元を阻止し、溶
液中に拡散させることにより分析物鎖と速やかに反応さ
せることができる。固相支持体への結合の速度も、支持
体に結合する結合対メンバーが多量に存在することによ
り加速することができる。さらに、最後の試薬として標
識結合体を加えることにより、分析物は高度に濃縮され
た形で存在し得る。
【００１８】上記のごとく、この方法では２セットの試
薬を使用している。第１のセットは分析物配列を標識す
る。第２のセットはアッセイ培地で分析物に結合する標
識物質を非結合標識物質から分離する手段を提供する。
【００１９】第１のセットすなわち標識セットは少なく
とも２試薬を含み、10〜30種類またはそれ以上の試薬を
含む可能性もある。第１の試薬は核酸試薬のサブセット
であり、このサブセットの各メンバーはそれぞれ２つの
核酸領域をもっている。サブセットの各メンバーの第１
の核酸領域は分析物の配列に相補的な領域である。第２
のヌクレオチド配列は標識試薬のための認識部位とな
る。この第２の配列は、サンプル中の内在性配列に遭遇
しないよう選択される。
【００２０】サブセットは、少なくとも15ヌクレオチド
(nt)、一般には少なくとも25nt、より一般的には少なく
とも50ntで、約５kbより多くない、一般には約１kbより
多くない、好ましくは約100ntより多くない分析物配列
に相補的な領域をもっている。分析物に相補的な配列
は、5'と3'末端の一方または両方で非特異的配列と結合
する。もし、アッセイで偽陽性となるような配列に結合
しないよう正しく選択されているならば、非相補配列は
どの長さでもよく、一般には10kbより少なく、より一般
的には５kbより少ない。
【００２１】相補配列は他の試薬が分析物に結合する領
域を残しておくように選択される。一般には、少なくと
も25ntの領域が利用できるよう残されている。この場
合、試薬サブセットの個々のメンバーの配列に相補的な
分析物配列は実質的に隣接しているかまたは分離してお
り、そしてあるサブセットのメンバーは他のサブセット
のメンバーでおきかえることができる。２つのサブセッ
ト間の結合の特殊パターンは分析物の配列に応じて広く
変化する。
【００２２】試薬配列は従来の方法による合成により、
またクローニングによって調製され、標識に適応するよ
うに修飾される。
【００２３】分析物に相補的な配列セットは種々の考察
のもとに選択される。分析物の性質からみると、共通配
列、多形性と関係のある配列、特殊表現型または特殊遺
伝子型、特殊菌株、などが興味深い。従って、標識相補
配列は、分析物に関する情報をもたらす捕獲セットの他
の相補配列と関連して選択される。
【００２４】標識化された配列は標識プローブの第１の
認識配列に相補的な配列を含む。標識配列は、直接また
は間接的に検出可能信号を提供する分子を１個以上含ん
でいる。標識物質は相補配列の個々のメンバーに結合す
るか、もしくは複数個の標識物質をもつ末端尾部または
末端メンバーとして存在する。配列と結合した標識物質
を提供する種々の方法が文献に報告されている。例えば
以下を参照せよ：Learyら、Proc. Natl. Acad. Sci. US
A (1983) 80:4045; RenzおよびKurz、Nucl. Acids Res.
(1984) 12:3435;RichardsonおよびGumport、Nucl. Aci
ds Res. (1983)11:6167;Smithら、Nucl. Acids Res. (1
985) 13:2399;MeinkothおよびWahl、Anal. Biochem. (1
984) 138:267. 標識物質は共有結合または非共有結合で
相補配列に結合している。
【００２５】使用される標識物質は放射性核種、螢光発
光物質、化学発光物質、染料、酵素、酵素基質、酵素補
助因子、酵素阻害剤、酵素サブユニット、金属イオンな
どである。実例となる特別な標識物質にはフルオレセイ
ン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、
ウンベリフェロン、ルミノール、NADPH、α−β−ガラ
クトシダーゼ、西洋ワサビ（horseradish)、パーオキシ
ダーゼなどが含まれる。
【００２６】標識化配列は合成により都合よく調製する
ことができる。好都合な官能性を有する末端基を供する
ことにより、この官能性を利用して種々の標識化物質が
結合される。従って、カルボキシ、チオール、アミン、
ヒドラジンまたは他の官能基を準備して、これに、配列
との二本鎖構造形成に悪影響を与えることなく、種々の
標識物質を結合させることができる。すでに示したよう
に、標識配列に相補的な配列と結合した複数の標識物質
を有する分子を準備することができる。その代わりにま
た、標識配列に結合した配位子を用意して、配位子に結
合させるため標識化受容体を使用して標識化した分析物
複合体を提供することもできる。
【００２７】試薬の第２のセットは、分析物に結合した
標識物質を非結合標識物質から分離するための手段を与
えてくれる。分離手段または捕獲手段には少なくとも１
個の捕獲プローブ、一般にはサブセットを規定する複数
個のプローブが含まれ、これは分析物に相補的な配列の
第２のサブセットと認識部位とを含む２個のポリヌクレ
オチド配列領域を含んでいる。この第２のサブセットは
標識プローブの相補配列からなる第１のサブセットとは
異なり、また認識部位は第１サブセットの標識プローブ
の認識配列とは異なっている。捕獲プローブのための認
識部位の第２セットは、上記のごとく、標識プローブに
対する認識部位の第１セットの間に存在する。捕獲配列
は、標識プローブの選択を方向づける考察のもとに、上
記と同じ方法で選択され、合成される。従って捕獲プロ
ーブ調製にも同じ制約が含まれている。
【００２８】分離手段は捕獲認識配列に相補的な配列に
直接結合されるのであるが、むしろ特異結合対メンバー
が相補配列に結合されるのが好ましい。特異結合対メン
バーには配位子または受容体があるが配位子の方が好ま
しい。配位子としては天然に存在する受容体を利用し
得、あるいはまた調製される分子であり得る。従って天
然に存在する配位子としてはビオチン、チロキシン、酵
素基質、ステロイドなどがあげられる。自然に存在する
配位子の代わりに、いかなるハプテンでも抗体の製造に
使用することができる。配位子は一般に分子量が少なく
とも約125で、一般的には分子量は約5000より小さく、
もっと一般的には分子量は約2000より小さく、そして分
子量は約1000より小さいことが好ましい。
【００２９】受容体は一般に蛋白分子であり、抗体、ア
ビジン、チロキシン結合グロブリンなどのような天然に
存在する蛋白、レクチン、酵素などを含む。受容体は一
般に分子量が少なくとも約10,000、もっと一般的には分
子量は12,000より大きく、そして一般には分子量は約10
0万より小さい。
【００３０】特異結合対メンバーをいずれか都合のよい
手段で第２の認識配列に結合させる。すでに述べたよう
に、末端塩基に都合のよい官能基をもつように配列を合
成し、これを連結部位として使用する。特異結合対メン
バー、そのサイズおよび官能基の性質の特別な選択に従
って、１個または複数個の特異結合対メンバーが相補配
列に結合される。その代わりに大きな特異結合対メンバ
ーを用いた場合は、複数個の配列がその結合対メンバー
に結合される。捕獲結合体が調製され、こうすることに
より、相補認識配列のアニーリングに際して特殊結合対
メンバーからの干渉、および配位子−受容体結合に際し
て二本鎖形成からの干渉は、もしあったとしてもごく小
さい。
【００３１】あるいはまた、受容体は捕獲プローブの認
識配列を特別に認識する付加的なヌクレオチド配列であ
る場合もある。
【００３２】分離手段は、分析物と結合した標識物質を
非結合標識物質から迅速かつはっきり分離させる支持体
ならばいずれも使用し得る。従って、分離手段には粒子
または、例えば遠心分離管、カラム、ミクロ滴定用プレ
ートウェル、フィルター、試験管などの種々の容器の固
い壁面が使われる。粒子としては約0.4〜200μ範囲の大
きさが好ましく、もっと一般には約0.8〜4.0μである。
粒子の材質はラテックス、ガラスなど手近かな材質のも
のを使用し得る。
【００３３】相同な核酸配列はホモ二本鎖（homoduple
x）を与えるような完全な相補性をもっていなくてもよ
い。多くの場合、塩基の15％以下、一般には10％以下が
５個またはそれ以上のメンバーのループを無視して間違
った結合をしているような、ヘテロ二本鎖（heterodupl
ex）で十分である。
【００３４】分析物核酸の試料は、生物由来の液体や固
体、食品、手近かな物質など種々の源から得られ、プロ
ティナーゼK/SDS、カオトロピン酸塩などの種々の手段
を用いてハイブリダイゼーション分析用に調製される。
また、分析物核酸の平均サイズを、制限酵素、超音波処
理、化学的分解（例：金属イオン）などの酵素的、物理
的または化学的方法によって低減させると便利である。
断片は0.1kbと小さくてもよいが、一般には少なくとも
約0.5kbで１kb以上が普通である。
【００３５】この方法を遂行する場合、分析物配列は一
本鎖型で提供される。配列が一本鎖型で自然界に存在す
る場合には変性は必要とされない。しかし、配列が二本
鎖型で存在する場合には配列を変性する。変性はアルカ
リ、一般には約0.05〜0.2Mの水酸化物、フォルムアミ
ド、界面活性剤、熱、またはそれらの組み合わせのよう
な種々の方法で行われる。変性は標識プローブおよび／
または捕獲プローブの存在下で行われ、それゆえ反応条
件がアニーリング条件に変わるとプローブは存在する相
補配列のどれかと結合する。例えば、熱とアルカリを採
用すると、中和と冷却によりアニーリングが開始する。
【００３６】多くの場合、変性期間中に標識物質または
分離手段のいずれかを存在させることは避ける方が好ま
しい。変性中に存在する高温、非水性溶媒、塩、その他
の物質は、標識物質および／もしくは分離手段の分解や
好ましくない変化を起こさせることになる。それゆえ多
くの場合、変性はプローブの存在下で行われ、そこで冷
却後プローブの一本鎖DNAへの迅速なアニーリングが生
じ、続いて低温でかつ、中性pH、低イオン強度その他の
ような穏やかな条件下で、他の試薬を添加するようなや
り方で行われる。
【００３７】通常は、プローブの期待される分析物モル
に対する比は少なくとも１：１、好ましくは少なくとも
約1.5：１、そしてさらに好ましくは２：１であればよ
く、100：１またはそれ以上のように高い場合もある。
各プローブの濃度は一般に約10-9から10-6Mの範囲で、
試料の核酸濃度は10-21から10-12Mである。
【００３８】アニーリング条件が達成された後またはそ
れ以前に、標識化された第１の認識配列と捕獲第２認識
配列を加えハイブリダイズさせる。あるいはまた、標識
化された第１の認識配列は捕獲および分離後に加えるこ
ともできる。
【００３９】バックグランドを大いに減少させ、格別高
い感度が得られるような好ましい実施例は次のような配
列を使用している。二本鎖分析物を使用する場合には、
分析物をプローブまたは相補配列の存在下で変性させる
か、またはプローブを変性直後にアニーリング条件下で
添加する。アニーリングに充分な時間をかけたのち複合
体を分離手段と結合させ、これによって複合体は支持体
と結合する。いかなるバックグランドのDNAや非特異的
結合DNAも洗い流され、次の段階で標識物質の非特異的
結合が起こらないようにする。次に固相支持体を洗浄し
てあらゆる非特異結合標識物質を取り除き、非特異結合
標識物質が実質的に少ないバックグランドを提供する。
【００４０】図１の第２部について考察してみよう。実
際には、上部の長い棒で示される分析物はAおよびBのプ
ローブと結合している。ここでAは標識結合体に対する
相補配列を供し、Bは特異結合対メンバー、この場合ビ
オチン、に対する相補配列を供している。このようにA
およびBのプローブと分析物はアニーリング条件下で互
いに結合していることになり、これによりプローブと分
析物間で複合体形成が生じるであろう。ビオチン結合体
B'は、プローブと一緒に含まれることもでき、または分
離段階で分析物複合体を含有する溶液に添加することも
できる。B'がBにアニーリングするために充分時間をか
けたのち、生じたビオチン化分析物複合体をアビジンが
結合した固相支持体に加える。特異結合対メンバーが複
合体を形成するのに充分時間をかけたのち、固相支持体
を洗浄して非特異DNAを取り除き、次に標識化配列、こ
の場合A'に結合したフルオレセインであるが、を添加す
る。標識化配列をアニーリング条件下で添加し、二本鎖
形成に充分時間をかけたのち、非特異結合および過剰の
標識化結合体を洗い去り、表面の螢光を測定する。
【００４１】いくらか短いプロトコールは、図１第１部
に示した構成により提供される。この場合、プローブA
とBをアニーリング条件下で分析物に添加し、これによ
って分析物複合体が形成され得る。分析物複合体形成に
充分な時間をおいたのち、分析物複合体溶液を固相支持
体に添加し、捕獲プローブがB'Cと示されている配列と
の複合体形成によって固相支持体に結合するように充分
時間をかける。過剰DNAを洗い去り、次にフルオレセイ
ン標識化配列A'を加え、混合物を充分な時間をかけてア
ニールさせて標識物質とプローブ間で複合体を形成させ
る。過剰の非特異結合標識物質を洗い去り、図１第１部
に示した構成が提供される。
【００４２】一般に、変性段階は約５〜25分を要し、普
通は約５〜15分かかる。一方アニーリング段階は一般に
約30分〜２時間を要し、普通は約１時間で完了する。ア
ニーリングは若干温度を上げて遂行することができ、一
般には約20℃〜50℃の範囲で、もっと一般的には約25℃
〜40℃、特に37℃で行われる。
【００４３】一般に水性培地が使われ、特に種々の添加
物を含む緩衝水性培地が使用される。使用される添加物
としては低濃度の界面活性剤（0.1〜１％）、塩、例え
ばクエン酸ナトリウム（0.017〜0.170M）、Ficoll、ポ
リビニルピロリドン、キャリア核酸、キャリア蛋白など
がある。特異結合対メンバーの性質により、ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルフォキサイドおよびフォルム
アミドのような種々の溶媒が水性培地に加えられる。こ
れらの他の溶媒は２〜50％の割合で存在する。
【００４４】アニーリング培地の厳重な調節は温度、塩
濃度、溶媒系などで行われる。従って関心のある配列の
長さと性質により、この厳重性は変わってくる。例えば
配位子−受容体の対を使った分離段階については、培地
は、特異結合対複合体形成に対しての条件を最適にする
ようまたは最適に近くなるように変えられる。従って、
pHは一般に約６〜９の範囲、好ましくは約７に調整され
る。これはアニーリング培地に約0.1〜0.5Mの緩衝培地
例えばリン酸緩衝生理食塩水を約0.5〜２容、一般には
約１容加えることにより容易に達成することができる。
この培地は分離手段と共に加えられ、混合物は少なくと
も５分、一般には約10分で、約60分よりは短く、一般に
は約15〜45分、もっと一般的には約30分インキュベート
すると充分である。
【００４５】次に相を分離手段の性質に従って分離す
る。粒子については、遠心分離または濾過により上澄液
を捨てるかまたは上澄液を分離して粒子の分離を行う。
粒子がアッセイされる場合は、粒子を充分に、一般には
１〜５回、適当な緩衝培地例えばPBSで洗う。分離手段
が壁または支持体である場合は、上澄液を分離または廃
棄し、粒子について指示された方法で壁を洗う。
【００４６】標識物質の性質に従って種々の技術が標識
物質の存在を検出するために使われる。螢光物質に対し
ては非常に多くの異なる螢光測定器が使用できる。酵素
については、螢光生成物または着色生成物のいずれかを
提供して、螢光測定法、分光光度法または視覚化により
測定できる。免疫検定法および免疫検定法に適用できる
技術で採用されてきた種々の標識物質は、本主題のアッ
セイにおいても採用することができる。
【００４７】２．核酸プローブ 上記のアッセイ法に関する有用な核酸プローブは、１個
またはそれ以上の修飾ヌクレオチドから調製されるプロ
ーブである。ここで使用される場合次の定義を適用す
る：“誘導体化可能”ヌクレオチドとは、ピリミジンの
4-位に、検出可能な標識物質と反応することができる官
能基を含有するように修飾されたヌクレオチドである。
誘導体化可能ヌクレオチドの例は、4-位がアルキルアミ
ンで修飾され、構造上遊離のアミン基が存在しているも
のである。
【００４８】“誘導体化した”ヌクレオチドとは、ピリ
ミジンの4-位の誘導体化可能官能基が検出可能標識物質
と共有結合で、さもなければ直接または間接的に結合し
ているヌクレオチドである。
【００４９】“アルキルアミンヌクレオチド”とは、ピ
リミジンの4-位にアルキルアミン基をもち、その位置で
遊離のアミン基を提供できるような形でその構造に結合
しているヌクレオチドである。
【００５０】“ポリヌクレオチド”とは、少なくとも最
低２個のヌクレオチドを含有しているヌクレオチド鎖構
造である。ここで提供される“ポリヌクレオチドプロー
ブ”は、上記のごとく、少なくとも２個のヌクレオチド
をもち、そのうちの少なくとも１個は構造式１に示した
のと実質的に同じ構造をもつ修飾ヌクレオチドを含有し
ているような、ヌクレオチド鎖構造である。
【００５１】“検出可能標識物質”とは、複合体または
試薬の検出能の使命をになっている部分とする。一般
に、標識物質の最も一般的なタイプは螢光発光団、発色
団、放射性同位元素および酵素である。
【００５２】“螢光発光団（Fluorophore)”とは、検出
可能領域で螢光を放つことができる物質または物質部分
とする。典型的には、この螢光は可視領域にあり、定量
のための一般法がある。一般的に使用される螢光発光団
としてはフルオレセイン（一般にはフルオレセインイソ
チオシアン酸塩〔FITC〕、またはフルオレセインアミン
の形で供給される）、ローダミン、ダンシルおよびウン
ベリフェロンがあげられる。構造式２〜５はここで使用
されるヌクレオチドの位置の番号付けを示したものであ
る。
【００５３】
【化５】
【００５４】好ましい実施例では構造式１の修飾ヌクレ
オチドの置換基は次の通りである。Ｒ1は、検出可能標
識物質により誘導体化可能な反応基であり、-ＮＨ2、-
ＣＯＯＨまたは-ＳＨが好ましい。
【００５５】Ｒ2は、任意のリンカー部分で、アミド結
合、チオエーテル結合またはジスルフィド結合、または
その組み合わせが含まれる。Ｒ2は、普通タンパクを標
識物質に結合させるのに使用されるような、異種二官能
性リンカーが好ましい。ほとんどの場合、タンパクまた
は他の構造上の遊離アミノ基がカルボン酸または非結合
Ｒ2化合物の活性化されたエステル部分と反応して、ア
ミド結合を介してリンカーと結合する。リンカーをヌク
レオチドと結合させる方法は他にもある。特に好ましい
リンカーの例としては次のものがあげられる：
【００５６】
【化６】
【００５７】ここでｘは、１〜８までの整数である。
【００５８】構造式１でわかるように、リンカーが存在
する場合はこれはアルキルアミン官能基-ＮＨ-(ＣＨ2)x
-を通じてヌクレオチド構造に結合している。ここでxは
１〜８までの整数で、アルキルアミン官能基はピリミジ
ン塩基の4-位に存在する。
【００５９】上記のごとく、Ｒ3は水素、メチル、臭
素、フッ素またはヨウ素である。このように、ヌクレオ
チドの塩基は、5-位が前述のＲ3置換基で任意に置換さ
れたピリミジンである。
【００６０】Ｒ4は、修飾ヌクレオチドが末端5'構造で
ある場合は典型的には水素であり、またはポリヌクレオ
チド合成に有用な適切なブロッキング基である。適切な
ブロッキング基の例としては、置換されたおよび非置換
のアラルキル化合物を含む。このアラルキル化合物にお
けるアリール基は、例えばフェニル基、ナフチル基、フ
ラニル基、ビフェニル基などである。また置換基数は０
〜３、一般には０〜２で、置換基には中性または極性、
電子供与または吸引型のあらゆる妨害性のない安定な基
が含まれる。この置換基は一般に１〜10、普通１〜６原
子で、一般に０〜７炭素原子を有する。置換基として
は、脂肪族基、脂環族基、芳香族基または複素環基であ
り、一般に脂肪族系飽和ハロゲン化炭化水素例えばトリ
フルオロメチル、ハロ、チオエーテル、オキシエーテ
ル、エステル、アミド、ニトロ、シアノ、スルフォン、
アミノ、アゾなどである。
【００６１】ヌクレオチド鎖合成間の１またはそれ以上
の段階でＲ4位の水素原子またはブロッキング基をより
安定な“キャピッング”基で置きかえる方が望ましい。
適切なキャピッング基には安定なエステルを与えるアシ
ル基があげられる。アシル基は有機または無機で、カル
ボキシル、ホスホリル、ピロホスホリルなどを含む。特
に興味深いのはアルカノイン酸で、より特別に興味深い
のはアリール置換アルカノイン酸であり、ここで酸は炭
素原子が少なくとも４個で、炭素原子は約12個より多く
なく、一般には炭素原子は約10個を越えず、またアリー
ル、一般にはフェニル、置換アルカノイン酸は一般に炭
素原子８〜12個である。酸素（オキシ)、ハロゲン、窒
素、例えばシアノ基などの種々の異種原子も存在し得
る。大概カルボン酸エステルは塩基不安定、弱酸安定、
特に約50℃以下の温度、より特別には約35℃以下で安
定、また約２より高いpH、より特別には約４より高いpH
で安定である。
【００６２】修飾ヌクレオチドはＲ4位を通じて支持体
に結合するので、3'(Ｒ5)位で標識化したまたは標識化
していないヌクレオチドの付加が可能となる。このよう
な場合にはＲ4は下に記載されるごとく固着基である。
支持体に共有結合しているとサンプルの選別中都合がよ
く、ハイブリッドヌクレオチド鎖をサンプルから分離す
る時間および複雑さが実質的に減少する。構造式１の修
飾ヌクレオチドが5'位で１個またはそれ以上の付加ヌク
レオチドと結合する場合には、Ｒ4置換基は3'リン酸塩
基を通じて結合しているこのような付加ヌクレオチドで
置きかえられる。
【００６３】Ｒ5は、示した通り、水素、またはＰＯ3Ｈ
2、ホスホトリエステル、ホスホジエステル、亜リン酸
塩、ホスホロアミダイト、Ｈ−リン酸塩またはポリヌク
レオチド合成に適したホスホチオエイトのようなリン誘
導体であり、その誘導体は3'位にヌクレオチドの連続付
加を可能にしている。より一般的には、このようなリン
誘導体は構造式９と構造式10で与えられる：
【００６４】
【化７】
【００６５】ここでXは好ましくは水素または脂肪族基
（特に飽和脂肪族基）、アリール基およびアラルキル基
である。この飽和脂肪族基は、β−ヘテロ置換脂肪族
基、置換メチレン基である。このβ−ヘテロ置換脂肪族
基において、β−置換基は、残留基かまたはプロトン活
性化基のいずれかとして容易にβ−脱離に関与する電子
吸引基である。この置換メチレンにおいて、置換基は種
々あり、誘起効果や共鳴効果によってこのメチレン上に
負電荷を維持している。リン反応基の性質に応じて異な
った基が選ばれる。従ってホスホロクロリダイト、ホス
ホロアミダイト、リン酸塩、トリリン酸塩、亜リン酸
塩、などのどれが使用されるかによって、それに適した
特別のホスホロエステル基が選ばれ得る。
【００６６】同様に、Yについて採用される基は、オリ
ゴマー化に使用されるリン誘導体の性質に依存し得る。
ホスホロアミダイトが使用される場合はYは-NT1T2の構
造を有する。この場合T1とT2は同一または相異なり、炭
化水素であってもよく、または０〜５、一般には０〜４
のヘテロ原子を有し得る。このヘテロ原子は、主に酸素
をオキシとして、イオウをチオとして、窒素をアミノ
（特にtert−アミノ、-NO2、シアノ）として含有してい
る。この２つのTはともに用いられ、合計１〜３個、一
般には１〜２個の複素環メンバーおよび１〜３個の環状
部分をもつモノまたはポリ複素環を形成している。一般
に２個のTは合計２〜20個、より一般的には２〜16個の
炭素原子を有する。この場合、このTは脂肪族（脂環族
を含む）、特に飽和脂肪族で、１価または両方がともに
用いられるならば２価の反応基である。この２価の反応
基は、置換または非置換の複素環を限定している。
【００６７】このアミンには、ジメチルアミン、ジエチ
ルアミン、ジイソプロピルアミン、ジブチルアミン、メ
チルプロピルアミン、メチルヘキシルアミン、メチルシ
クロプロピルアミン、エチルシクロヘキシルアミン、メ
チルベンジルアミン、メチルシクロヘキシルメチルアミ
ン、ブチルシクロヘキシルアミン、モルフォリン、チオ
モルフォリン、ピロリドン、ピペリジン、2,6-ジメチル
ピペリジン、ピペラジンのような飽和２級アミン、およ
び類似の飽和モノサイクリック窒素複素環が含まれる。
Ｒ5もまた3'位の１個またはそれ以上の付加ヌクレオチ
ドの結合点を表している。その場合Ｒ5はリン酸塩で、
この様な付加ヌクレオチドは、一般にリン酸塩基を介し
て結合している。
【００６８】5'位と同様に、修飾ヌクレオチドは3'位、
すなわちＲ5を介して支持体に結合している。このよう
にヌクレオチドが支持体に結合している場合には、Ｒ5
は下に記述されるように固着基である。
【００６９】Ｒ6はデオキシリボーズの場合にはHであ
る；リボーズの場合にはOHである；そしてRNA合成期間
中は修飾から-OH部分を保護する適切なブロッキング基
である。ここで有用なブロッキング基には一般にＲ4と
して上に揚げたものが含まれ、ブロッキング基の特別な
選択は当業者には明らかであろう。RNA合成中Ｒ6位で好
まれるブロッキング基としてはｔ−ブチルジメチルシリ
ル、置換メチルエーテル類、ｏ−ニトロベンジルエーテ
ル、レブリン酸エステルのようなエステル類、および構
造式11（テトラヒドロピラニル）と構造式12（4-メトキ
シテトラヒドロピラニル）で与えられる下記のピラニル
構造化合物が含まれる：
【００７０】
【化８】
【００７１】特に好ましいブロッキング基はｏ−ニトロ
ベンジルである。その他の適切なブロッキング基の例は
Green,T.W.、Protective Groups in Organic Synthesi
s、NewYork:Wiley & Sons、1981に記載されている。
【００７２】修飾ヌクレオチドは通常、複合体形成の検
出を可能ならしめるように標識物質で誘導体化される。
広範囲の標識物質が使用され、そのうち１個または他の
標識物質は所望の感度、測定機器、使用される特別なプ
ロトコール、合成の容易さ、などを考慮して選ばれる。
使用される標識物質としては酵素、螢光発光化合物、発
色化合物、放射線核種、酵素基質、補助因子、自己不活
化阻害剤、特異結合対メンバー、特にハプテン類、など
が含まれる。検出に関係する分子は修飾ヌクレオチドに
共有結合しているか、または特異結合対すなわち配位子
や受容体を介して間接的に結合している。配位子と受容
体の例としてはビチオン−アビジン、ハプテン−抗体、
配位子−表面膜受容体、金属−キレートなどがある。
【００７３】上記で示唆したごとく、修飾ヌクレオチド
はオリゴヌクレオチド合成のためＲ4またはＲ5位のいづ
れかで支持体に共有結合しているのが好ましい。種々の
支持体が使用され、シリカ、ポラシルＣ、ポリスチレ
ン、制御細孔ガラス(CPG）、キースラガー（珪藻土）、
ポリ（ジメチルアクリルアミド）、ポリ（アクリルモノ
ホライド）、ポリ（テトラフルオロエチレン）上にポリ
スチレンを付着したもの、セルロース、Sephadex LH-2
0、Fractosil 500などが揚げられる。
【００７４】支持体の性質により、種々の官能基がアン
カーとして機能する。上記のごとくこれらの“固着（ア
ンカー）”基は3'または5'位すなわちそれぞれＲ5また
はＲ4位にある。シリカやガラスのようなケイ素含有支
持体に対しては、置換アルキルまたはアリールシリル化
合物がシロキサンまたはシロキシミン結合を形成するの
に用いられる。有機ポリマー類、エーテル類、エステル
類、アミン類、アミド類、スルフィド類、スルフォン類
およびリン酸塩類も使用することができる。ポリスチレ
ンのようなアリール基に対してはハロメチル化が官能基
形成に用いられ、この場合ハロ基は次にオキシ、チオ
（スルホンに酸化される）、アミノ、ホスホ（ホスフィ
ン、亜リン酸塩またはリン酸塩として）、シリルなどで
置換される。珪藻土成分（例：キースラガー）では活性
化はポリアクリル酸誘導体によって行われ、活性官能基
はアミノ基と反応してアミン結合を形成する。多糖類は
無機エステル類、例えばリン酸塩で官能基を形成し、こ
の場合他の酸素は鎖をつなぐのに用いられる。ポリアク
リル酸誘導体では、カルボキシルまたは側鎖官能基、例
えばN-ヒドロキシエチルアクリルアミドを従来の方法で
結合基を結合するのに用いる。
【００７５】構造式１の修飾ヌクレオチドは、既に示唆
したごとく、ポリヌクレオチドプローブ合成のための基
質として使用することができる。付加ヌクレオチドは5'
位に連続的に、例えば、ホスホロアミダイト法（Beauca
geおよびCaruthers、Tetrahedron Lett. 22(20)：1859-
62 (1981))、またはホスホトリエステル法(Itakura、J.
Biol. Chem. 250：4592 (1975)）その他の方法によっ
て付加される。あるいは3'位にBelagajeおよびBrush、N
uc. Acids Research 10：6295 (1982)）によって付加さ
れる。またはその両方が行われる。連続的に付加される
ヌクレオチドは標識化されていないか、または構造式１
に従って修飾され、Ｒ1部分で標識物質により誘導体化
される。従って、１個またはそれ以上の標識物質が一端
よりむしろポリヌクレオチド鎖内に存在する。
【００７６】このポリヌクレオチドプローブは、構造式
１で与えられる構造と実質的に同じ構造をもつ修飾ヌク
レオチドを少なくとも１個含んでいる。すなわち構造式
13で与えられる構造を有する修飾ヌクレオチドを少なく
とも１個有する：
【００７７】
【化９】
【００７８】ここでＲ1は検出可能標識物質で誘導体化
される反応基で、Ｒ2はアミド結合、チオエーテル結合
またはジスルフィド結合、またはそれらの組合せを含む
任意の結合部分で、Ｒ3は水素、メチル、臭素、フッ素
およびヨウ素からなる群から選ばれ、Ｒ6はＨ、ＯＨま
たはＯＲ(Ｒは酸感受性、塩基安定性の保護基で、xは１
〜８までの整数である。ポリヌクレオチドプローブは、
標識物質の性質および検出機構に従って１個または複数
個の標識物質をもっている。例えば、標識物質が螢光発
光性の場合、螢光消滅を避けるため螢光発光種間に少な
くとも３〜12オンク゛ストロームの距離を保たねばならない。
【００７９】このようにして標識化されたポリヌクレオ
チドプローブは、本出願者の共同出願第807,624号に記
載のアッセイ、あるいは酵素、抗体および固相支持体と
の結合を含む他のあらゆる番号の出願に記載されたアッ
セイで使用される。本出願者の新規オリゴヌクレオチド
プローブに関するこのような１使用法のDNAの既知配列
の検出にある。プローブを例えば標準ラテックス固相支
持体に、またはビチオン−標識化プローブの場合にはア
ビジン支持体に付着するように調製する。分析予定の一
本鎖または二重鎖DNA配列を含む試料を、ハイブリッド
核酸複合体が形成されるのに充分な時間をかけてプロー
ブに接触させ、このようなあらゆる複合体を螢光、ビチ
オンまたは他の検出可能標識を使って検出する。
【００８０】修飾ヌクレオチドの合成：本発明は構造式
１の新規修飾ヌクレオチドの合成方法にも関連してい
る。好ましい実施例では、構造式14または構造式15をも
つピリミジンヌクレオチドが提供される：
【００８１】
【化１０】
【００８２】ここでＲ3は上述に同じ、Ｒ4とＲ5は水
素、Ｒ6はＯＨまたはＨである。糖の環の5'位は−−ま
た糖がデオキシリボースよりむしろリボースである場合
には2'位も同様に−−ジメトキシトリチル基（実施例３
参照）または他の適当な保護基の付加によって、以後の
反応段階中修飾に対して保護され、付加反応は実質的に
完全を期するため充分に時間をかける。同様に、3'ヒド
ロキシル基もシリルまたは他の適当な官能基で保護され
る（実施例４参照）。特に適切な保護基の例としては、
上記の“Ｒ6”で述べたようなもの、すなわち置換メチ
ルエーテル類、エステル類、ピラニル類その他が揚げら
れる。
【００８３】ヌクレオシドがチミンまたはウラシル、ま
たは５位がＲ3置換基で修飾されたウラシル、すなわち
ピリミジンまたは４位にアミノ置換基よりむしろオキシ
基をもつ置換ピリミジンである場合は、カルボニルは、
例えば１−（メシチレン−２−スルホニル）−テトラゾ
ル(MS-tet)のような活性化剤または他の適当な縮合剤と
の反応によってアミン部分に変換される。ここで使用さ
れる活性化剤には構造式E1−SO2−E2で表される他のス
ルホニル化合物が含まれる。この場合E1はテトラゾイ
ル、ニトロトリアゾイル、トリアゾイル、イミダゾイ
ル、ニトロイミダゾイルなどであり、またE2はアリール
基、またはメシチレンのような置換アリール基などであ
る。他のクラスの適当な活性化剤は構造式16ａおよび16
ｂで表される：
【００８４】
【化１１】
【００８５】ここでE1は上で定義された通りであり、X
はハロゲン置換基で塩素が好ましい。構造式16ｂではE1
は活性化剤を含有する溶液中に存在しているがそれとは
結合していない。一般にどのような活性化剤でも使用さ
れ、これは環構造に１個以上のハロゲン置換基、好まし
くは塩素がついており、これは反応後エチレンジアミン
や類似の試薬で置きかえることができる。この変換の
後、エチレンジアミンのようなアルキルジアミンと反応
させピリミジン環の４位に-ＮＨ-(ＣＨ2)xＮＨ2官能基
をもつヌクレオチドを得る（実施例５、６参照）。この
ようにして提供される遊離アミン基を次にカプロン酸、
活性カプロン酸エステル、または６−アミノカプロン酸
のようなカプロン酸誘導体と任意に反応させ、ヌクレオ
チドとＲ1部につけられる検出可能標識物質との間に充
分なスペースを確保する。カプロン酸または関連化合物
は付着に先だち（実施例７参照）、またはその後に標識
化される。
【００８６】ヌクレオシドがシトシンまたは５−修飾シ
トシン、すなわち水素以外のＲ3で置換されている場合
には、環外のアミノ官能基は、アリールスルホニルクロ
ライドとの反応に続いてアルキルまたはアリールジアミ
ンとの反応によってＮ4−アミノアルキルまたはＮ4−ア
ミノアリールシトシンに変換される（反応経路図Ｉ）。
例えばMarkiewicz, W.T.およびR. Kierzek、7th Intl.
Round Table、pp.32および72(1986)を参照せよ。あるい
はまた、Ｎ4−置換シトシンはビスルファイト−触媒交
換反応を使って調製し得る（反応経路図ＩＩ）。Schulm
an, L.H.ら、Nuc. Acids Res. 9:1203-1217 (1981)およ
びDraper, D.E.、Nuc. Acids Res. 12:989-1002 (1984)
を参照せよ。
【００８７】あるいはまた、アルキルアミン基が炭素原
子約６個より長いときは、それらの遊離アミン基は適切
な検出可能標識物質と直接結合し得る。この合成法はさ
らに、酸を使ってジメトキシトリチル基または他の保護
基を取り除き、次にもし必要ならばヌクレオチドの連続
付加のために調製に際し3'位のホスホリル化またはホス
フィチル化を行うことを含み得る。
【００８８】
【化１２】
【００８９】
【化１３】
【００９０】本発明はその好ましい特別な実施例と関連
して記述されているが、次の記述ならびに次に揚げられ
る実施例は説明を目的とするもので、それは添付の特許
請求の範囲で規定される本発明の範囲を限定するもので
はない。本発明の範囲内での他の観点、利点および改変
は本発明に関連した当業者にとっては明白となり得る。
【００９１】
【化１４】
【００９２】
【化１５】
【００９３】
【化１６】
【００９４】分析物は上記のごとくHBV BglII断片であ
る。（Valenzuelaら、(1981)in Animal Virus Genetic
s、 Fields, B、Jaenisch, R.、Fox, C. F.編、 Academ
ic Press, Inc.、N.Y.、pp57〜70）標識プローブと捕獲
プローブのサブセットが示されている。ここではHBVに
存在する異なる配列に相補的な配列12種が用意されてい
る。HBV相補配列の６個は標識結合体(A')と複合体を形
成するための共通配列(A)に結合している。残り６個のH
BV相補配列はビオチン化配列(B')と複合体を形成するた
めの共通配列(B)、または支持体と結合するための第３
のDNA配列(B'C)と結合している。図１にHBV鎖と種々の
試薬を含む最終複合体を示した。
【００９５】（実施例１）カプロン酸誘導体の標識化
【００９６】
【化１７】
【００９７】DMF５mlにイソチオシアン酸フルオレセイ
ン１mmol加えたものに、6−アミノカプロン酸２mmolと
トリエチルアミン540μlを加える。室温で24時間おいた
のち生成物を予備的薄層クロマトグラフィーにより分離
する（WarnerおよびLegg、 Inorg. Chem.18 : 1839(197
9)）。乾燥生成物を１：１ DMF／THF(v/v) 10mlに懸濁
し、これにＮ−ヒドロキシサクシンイミド1.5mmolとジ
シクロヘキシルカルボジイミド１mmolを加える。室温で
18時間おいたのち溶液をガラスウールで濾過し、Ａを最
終濃度0.2MになるようにDMFで希釈する（反応段階１か
らの収量を100％と仮定して）。
【００９８】（実施例２）6−Ｎ 4−（２−アミノエチル）−デオキシシチジン
【００９９】
【化１８】
【０１００】デオキシシチジンのアルキル化誘導体、Ｎ
4−（２−アミノエチル）デオキシシチジン（Ｂ）は、R
eeseおよびUbasawa、 Tetrahedron Lett. 21 : 2265(19
84)によって記述されるように、適当に保護したデオキ
シウリジンから4−テトラゾイル誘導体を経由して調製
した。この後者の誘導体は、実質的にはSung、J. Org.C
hem. 47 : 3623(1982)およびMaggioら、 Tetrahedron L
ett. 25 : 3195(1984)によって記述されているように、
テトラゾイル部分をエチレンジアミンで置換して（Ｂ）
に変換した。対応する5'−DMT−3'−ホスホロアミダイ
ト Ｎ4−（２−Ｎ−トリフルオロアセチルアミノエチ
ル）デオキシシチジンは、アルキルアミンをトリフルオ
ロ無水酢酸でブロックし、次いで対応するＮ、Ｎ−ジイ
ソプロピルホスホロアミダイトを調製することにより製
造した（参照：BeaucageおよびCaruthers、 前出 ; McB
rideおよびCaruthers、Tetrahedron Lett. 24 : 245(19
83)）。
【０１０１】（実施例３）プローブ調製（フルオレセイン標識） 合成オリゴヌクレオチドはWarnerら、DNA ３:401 (198
4)記述の自動化ホスホロアミダイト法により調製した。
精製はSanchez - PescadorおよびUrdea、 DNA ３:339
(1984)に従って行った。
【０１０２】実施例２で調製されたデオキシシチジンの
アミノエチル誘導体を標準カップリング法によりオリゴ
ヌクレオチド合成中に導入し、精製された修飾オリゴヌ
クレオチドを下記のごとくフルオレセイン標識導入のた
めに使った。オリゴマーを含むアミノエチルデオキシシ
チジンの乾燥試料（３〜５ OD 260単位）にDMF50μｌ、
および上記（Ａ）の0.2M保存溶液25μｌを加える。室温
で18時間おいたのち溶液をSephadex G-10クロマトグラ
フィーにかけ水で溶出して部分的に精製し、乾燥し、さ
らに上記と同様ポリアクリルアミドゲルで精製した。
【０１０３】（実施例４）プローブ調製（ビオチン標識） 前実施例で調製したごとくアミノエチルシチジンを含有
するプローブを使用して、ビオチン標識化を下記のよう
にして行った。オリゴヌクレオチド（３〜５ OD260単
位）を0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.0、50μｌ、およびD
MF 50μｌ中にとり、これに“長鎖”Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミジルビオチン（Pierce Chemical)１mgを含有
するDMF溶液100μｌを加えた。室温で18時間おいたの
ち、ビオチン化プローブをフルオレセイン標識プローブ
について記述した方法で精製した。
【０１０４】（実施例５）固相支持DNAプローブの調製 断片B'C（合成50量体）を標準条件下、T4−ポリヌクレ
オチドキナーゼとATPにより5'−リン酸化した。上述の
ごとくゲル精製した後、オリゴヌクレオチドを排気乾燥
した。
【０１０５】水酸化したラテックス（10mg：0.8μ；Pan
dex Laboratories）をDMSO、次に３量部の40mM MES（モ
ルホリノエタンスルフォン酸）、pH6.0で、遠心分離を
用いて洗浄した。5'−リン酸化断片B'Cの1500pmolを40m
M MES 90mlにとり、これを洗浄された支持体に加えた。
MES 100mlにEDAC 100mgを含有する溶液を調製した。EDA
C溶液５μｌを添加して混合後、反応混合液を残りが計3
0μｌとなるまで蒸発させた。混合液を37℃で18時間放
置した後、12,000rpmで２分間遠心分離にかけた。上澄
液を捨てる。ラテックスをDMSO 30mlに懸濁し、渦巻撹
拌を行い、水100μｌを加え、混合液を２分間渦巻撹拌
し、遠心分離したのち上澄液を廃棄した。この洗浄過程
を２度繰り返した。次に支持体を４×SSC各回100mlで３
回、H2O、次に37℃のH2Oで15分間洗浄した（収量：20pm
ol断片B'C／mgラテックス）。
【０１０６】（実施例６）DNA固相支持体を使用したHBVDNAのアッセイ 全HBVゲノムを含有するpBR322クローン(Valenzuelaら、
Animal Virus Genetics、 R. Jaenisch、 B. Fieldsお
よびC. F. Fox編、(Academic Press : New York)pp. 57
〜70 (1980)）をBglIIで切断し、分析物核酸として使用
した。６pmolの標識および捕獲プローブセットを含有す
るホルムアミド10ml中の分析物を95℃で10分間加熱した
のち室温に下げた。この混合液に水60μｌ、20×SSC 20
μｌ、１％ NP40 10mlおよびポリＡ ２μｌ（10μg）を
加え、渦巻撹拌し、37℃で１時間インキュベートした。
【０１０７】固相支持されたDNAプローブ（８pmol 400
μg）を加え、さらに1.5時間インキュベートした。混合
液を12,000rpmで２分間遠心分離し、上澄液を廃棄し
た。支持体を、４×SSC 100mlの溶液中にペレットを渦
巻撹拌して１回洗浄し、つづいて遠心分離にかける。洗
浄したビーズに、20×SSC ４ml、１％ NP40 ２μｌ、ポ
リＡ １μｌ（５μg）、水13 μｌおよびフルオレセイ
ン標識プローブ６pmolの混合液を加える。37℃で30分間
インキュベートした後、ビーズをパンデックスフィルタ
ープレートに移し、プレートの0.2μ酢酸セルロース膜
上での真空濾過によって４×SSC 100mlで４回洗浄す
る。試料を真空乾燥し、パンデックス スクリーン機器
のフルオレセイン チャンネルＡ（λ（励起）-485;λ
（放射）-525）で読みとる。
【０１０８】
【表１】
【０１０９】（実施例７）アビジン支持体を用いたHBV DNAのアッセイ 実験７ａ ：分析物を上記と同様に標識プローブおよび捕
獲プローブと混合してともにインキュベートする。次に
ビオチン標識化プローブ（12pmol）を含む水５μｌを加
え、渦巻撹拌し、37℃で30分間インキュベートする。0.
25％ (w/v) 0.8μアビジンラテックス（Pandex Laborat
ories)を含む１×PBS 20mlを上記混合液に加え、37℃で
１時間インキュベートする。混合液を洗浄し、フルオレ
セインプローブと共にインキュベートし、洗浄し、上記
と同様にパンデックススクリーン機器上で読みとる。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】実験７ｂ：HBVプラスミドを超音波処理に
より平均サイズ500bpにする。30pmolの標識および捕獲
プローブを使用し、５時間のアニーリングを行うという
点を除いては、上記と同様の方法で変性およびハイブリ
ダイゼーションを行った。30pmolのビオチン化プローブ
とインキュベート（２時間）した後、0.25％アビジンビ
ーズ50μｌを加えインキュベートした（1.5時間）。フ
ルオレセインプローブを加え、１時間インキュベート
し、洗浄し、上記と同様にしてスクリーン機器上の数値
を読みとった。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】上記の結果から、特異核酸配列に関して非
常に特異的で感度の高いアッセイが提供されることが明
らかである。関心のある配列に対する試薬は容易に調製
することができ、また数段階の簡単な操作段階で試料中
の配列の有無が確かめられる。この方法は応用範囲が広
く、従来の装置で容易に測定することができる広範な標
識物質について使用することができる。プローブは所望
の長さに合成することができ、たやすく標識物質や支持
体に結合することができる。万国共通配列を標識や支持
体への結合のために調製することができる。アッセイの
必要条件に従って幾分厳密なバックグランド妨害の除去
がなされる場合には、種々のプロトコールを採用するこ
とができる。
【０１１４】（実施例８）5'−ジメトキシトリチル−2'−デオキシウリジン
【０１１５】
【化１９】
【０１１６】ピリジンの共蒸発により乾燥しピリジン
（100ml）に懸濁させた2−デオキシウリジン（10ｇ、44
mmol）に、4、4'−ジメトキシトリチルクロライド（DMT
-Cl）18.4ｇ（54mmol）を加える。反応を室温で18時間
進行させ、メタノール100mlを加えて過剰DMT-Clを不活
性化する。次に大部分のピリジンを真空除去し、残渣を
酢酸エチル500mlに溶解し、飽和NaHCO3水（３×500ml）
で洗浄する。有機相を固体Na2SO4を加えて乾燥し、蒸発
乾燥させる。残渣をシリカゲルを用いたフラッシュクロ
マトグラフィーで精製し、5'−ジメトキシトリチル−2'
−デオキシウリジン（Ｃ）18.0ｇ（77％）を得た。
【０１１７】（実施例９）5'−ｏ−（4、4'−ジメトキシトリチル）−3'−ｔ−ブ
チルジメチルシリル−2'−デオキシウリジン
【０１１８】
【化２０】
【０１１９】（Ｃ）18ｇ（34mmol）を含むDMF 200ml
に、完全に溶解させるため急速な撹拌を行いながらイミ
ダゾール（5.8ｇ、85mmol）を加えた。ｔ−ブチルジメ
チルシリルクロライド（7.65ｇ、51mmol）を少量のDMF
に溶解した溶液を撹拌下、滴下しながら加え、室温で18
時間、暗所で反応を進行させる。反応混合液を酢酸エチ
ル（250ml）で希釈し、NaHCO3（３×250ml）で抽出す
る。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、蒸発乾燥する。残渣
をシリカゲルを用いたフラッシュクロマトグラフィーで
精製し、15.0ｇ（収率68％）の5'−o−（4、4'−ジメト
キシトリチル−3'−ｔ−ブチルジメチルシリル−2'−デ
オキシウリジン（Ｄ）を得た。
【０１２０】（実施例10）４−（1,2,3,4−テトラゾル−１−イル）−〔5'−（4,
4'−ジメトキシトリチル ）−3'−ｔ−ブチルジメチルシ
リル−β−Ｄ−2'−デオキシリボシル〕ピリジン−２
（１Ｈ）−オン
【０１２１】
【化２１】
【０１２２】ピリジンを共蒸発させて乾燥した（Ｄ）1
5.0ｇ(23mmol）をピリジン（50ml）に溶解し、これに、
ジフェニルホスフェート（2.9ｇ、11.5mmol）をピリジ
ン（５ml）に溶解した溶液を加える。１−（メシチレン
−２−スルホニル）−テトラゾル(MS-tet)(15.5ｇ、61.
5mmol）をピリジン（45ml）に溶解した溶液を加え、反
応混合液を暗所で室温にて18時間おいて反応を進行させ
る。暗褐色反応混合液に水25mlを加える。30分後反応生
成物を減圧下濃縮する。残渣を塩化メチレン250mlに溶
解し、ＮａＨＣＯ3水溶液で洗い（３×250ml）、Ｎａ2
ＳＯ4で乾燥し、溶媒をトルエンの存在下、減圧除去す
る。残渣をシリカゲルを使用したフラッシュクロマトグ
ラフィーで精製し、４−（1,2,3,4,−テトラゾル−１−
イル）−〔5'−（4,4'−ジメトキシトリチル）−3'−ｔ
−ブチルジメチルシリル−β−Ｄ−2'−デオキシ−リボ
シル〕ピリジン−２（１Ｈ）−オン（Ｅ）10.0ｇ（62
％）を得た。
【０１２３】（実施例11）４−Ｎ−（２−アミノエチル）−5'−ジメトキシトリチ
ル−3'−ｔ−ブチルジメチルシリル−2'−デオキシシチ
ジン
【０１２４】
【化２２】
【０１２５】ジオキサン(100ml）にエチレンジアミン
(9.3ml、143mmol）を溶解した溶液を５℃に冷却し、こ
れに（Ｅ）（10.0ｇ、14.3mmol）を加えて１時間放置す
る。溶媒を減圧除去し、残渣をトルエンで共蒸発させて
過剰のエチレンジアミンを除去する。生成物をシリカゲ
ルカラムを用いたクロマトグラフィーにかけて精製し、
塩化メチレンにメタノールを12〜20％含有する溶液で溶
出して、４−Ｎ−（２−アミノエチル）−5'−ジメトキ
シトリチル−3'−ｔ−ブチルジメチルシリル−2'−デオ
キシシチジン（Ｆ）7.15ｇ（75％）を得た。生成物はニ
ンヒドリンに陽性に反応し、遊離アミン部分が存在する
ことを示した。
【０１２６】（実施例12）Ｎ 4−（Ｎ−FMOC−６−アミノカプロイル−２−アミノ
エチル）−5'−ジメチルトリチル−3'−ｔ−ブチルジメ
チルシリル−2'−デオキシシチジン
【０１２７】
【化２３】
【０１２８】
【化２４】
【０１２９】ピリジン（50ml）に（Ｆ）(6.5ｇ、9.6mmo
l）を加えた溶液に、N−FMOC−６−アミノカプロン酸
（4.26ｇ、12mmol)(FMOCは構造式（Ｈ）で表されてい
る）およびDCC（2.96ｇ、14.4mmol）を加える。３時間
後、反応はTLC（10％メタノール／塩化メチレンにシリ
カを加えたもの）で判定されるごとく完了している。ピ
リジンを減圧下、除去する。残渣を酢酸エチルで抽出
し、不溶のジシクロヘキシル尿素（DCHU）を濾去し、溶
媒を除去する。生成物をシリカゲルクロマトグラフィー
で単離しメタノール４％含有塩化メチレンで溶出して、
N4−（N−FMOC−６−アミノカプロイル−２−アミノエ
チル）−5'−ジメチルトリチル−3'−ｔ−ブチルジメチ
ルシリル−2'−デオキシシチジン（Ｇ）7.3ｇ（70％）
を得た。
【０１３０】（実施例13）
【０１３１】
【化２５】
【０１３２】フッ化テトラブチルアンモニウム溶液（15
mmol、THFに溶解した1M溶液15ml）とHF水溶液（50％水
溶液1.05ml）を混合し、ピリジンとの共蒸発によって乾
燥する。残渣をピリジン（15ml）に溶解し、（Ｇ）(7.2
ｇ、7.3mmol)に加え、超音波処理によって溶解する。４
℃に18時間放置したのち反応混合液を塩化メチレン200m
lで希釈する。NaHCO3の濃縮水溶液を注意深く加え、続
いてHF／ピリジンを中和するために固体NaHCO3を徐々に
加える。Na2SO4を加えて乾燥したのち有機相を油状まで
濃縮し、これをシリカゲルクロマトグラフィーにかけ
た。生成物N4−（Ｎ−FMOC−６−アミノカプロイル−２
−アミノエチル）−5'−ジメトキシトリチル−3'−ｔ−
ブチルジメチルシリル−2'−デオキシシチジン（Ｉ）を
メタノール５〜６％含有塩化メチレンで溶出し、収率は
86％(6.0ｇ）であった。
【０１３３】（実施例14）
【０１３４】
【化２６】
【０１３５】ジイソプロピルエチルアミン含有塩化メチ
レンに（Ｉ） 5.1ｇ(5.7mmol）を加えた溶液に、クロロ
−N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン、1.3
ml〔1.2当量〕、（Ｋ）をアルゴン気流下、０℃で添加
する。
【０１３６】
【化２７】
【０１３７】１時間後、酢酸エチル(200ml）を加え、80
％飽和塩化ナトリウム水溶液で洗う；有機相をNa2SO4で
乾燥したのち、生成物の塩化メチレン溶液をヘキサンに
−40℃で滴下し沈澱させ、（Ｊ）を4.43ｇ（75％）得
た。
【０１３８】（実施例15）西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP)の合成：DNA結合体 配列１（5'−〔LCA〕CTGAACGTTCAACCAGTTCA−3'）、こ
こでLCA＝N4（６−アミノカプロイル−２−アミノエチ
ル）−デオキシシチジン、は化学的に合成され、他所記
載の方法で精製された（Warnerら、(1984) DNA ３、40
1)。水50μｌに溶解した10 OD 260単位に、ホウ酸ナト
リウム1.0M溶液、pH9.3 10μｌ、およびｐ−フェニレン
ジイソチオシアネート20mgを含有する蒸留ジメチルホル
ムアミド 500μｌを加えた。溶液を渦巻撹拌し、暗所、
室温に２時間おく。次いで約３mlのｎ−ブタノールを加
えた。渦巻撹拌し、水３mlを添加しそして再び渦巻撹拌
した後、試験管を遠心分離にかけ、黄色上層液を廃棄し
た。続いてｎ−ブタノールを加えて抽出操作を繰り返し
最終量約50μｌを得た。ブタノール排気除去し、次いで
ホウ酸塩0.1M溶液pH 9.3 200μｌにHRP 10mgを含有する
溶液を加えた。混合液を渦巻撹拌し、暗所、室温に１晩
放置した。
【０１３９】遊離酵素とDNAからのHRP-DNA結合体の分離
は、７％ポリアクリルアミドゲルで行なった。反応混合
液250μｌを0.5％SDS、0.5％ブロモフェノールブルー、
2.5mMEDTA、 25％グリセロールの100μｌで消光させ
た。次に溶液を20×20 0.15cmゲル10レーンに配分し、
ブロモフェノールブルーがゲルを約2/3下がるまで、標
準条件下60mAmpで展開させた（Maxam, A、およびGilber
t, W、(1980） Methods inEnzymol 65、499-560)。ゲル
をサランラップ(Dow)でカバーされたベーカーF-254 シ
リカ60板上にセットし、上に設置した小型UV−短波長ラ
ンプで検査した。UVのバンドの画像をコダック製No.59
緑色フィルターをとりつけたポラロイドMP-4カメラシス
テムで撮り、その後レーザー刃で切断した。バンドを10
mlのBio-Redポリプロピレンエコノカラムに入れ、これ
に0.1Mリン酸ナトリウム（pH7.5)３mlを加え、１晩室温
においた。
【０１４０】カラムの内容物を、カラム底のフリットを
通して、蒸留水で２度洗浄済のAmicon Centriconマイク
ロコンセントレーターにとる。次に、HRP-DNA結合体を3
500rpmで遠心分離して濃縮し、１×PBSで２回また遠心
分離によって洗浄する。その後最終溶液を４℃で保存す
る。
【０１４１】（実施例16）HRP-DNAプローブとアビジンビーズに結合したビチオン
化プローブとを使用したHBV-DNAのアッセイ ビチオン標識プローブ(B':水66.7μｌ中に1000pmol)
を、0.8μアビジンビーズ(Pandex Laboratories)の0.25
％(w/v）溶液５ml、20×SSC １ml、１％NP40 0.5mlおよ
び１mg／mlポリＡ 0.6mlと一緒にする。37℃に１時間放
置後、ビーズを４×SSC、 0.1％NP40で遠心分離により
２度洗浄し、この溶液の2.5ml中で保存する。水３μｌ
にHBV分析物（前記）をとり、これを４×SSC、１％SD
S、0.5M NaOH、および標識と捕獲プローブセット1.5 pm
olの混合溶液10μｌ中に加えて希釈する。混合液を95℃
に10分間加熱し、氷上で冷却し、1M酢酸５μｌで中和
し、次にビチオンプローブビーズ10μｌを加え、溶液を
37℃で１時間インキュベートする。
【０１４２】ビーズを４×SSC、 0.1％NP40、で遠心分
離により２度洗浄した後、0.1％NP40、1mg／mlポリＡ、1
0mg／ml BSA、HRP-DNA結合体1pmolを含有する１×PBSの
混合溶液50μｌにとり、37℃で１時間置く。ビーズを0.
1％NP40、１×PBSで３回洗浄したのち、マイクロタイタ
ー皿へ50μｌで移した。各ウェルに新鮮OPD溶液（50mM
クエン酸ナトリウム溶液（pH5.0) 10mlに98mg OPD（o−
フェニレンジアミン）、30％ H2O2 20μｌを含む）50μ
ｌを加え、混合し、37℃で５分間おく。マイクロタイタ
ープレート読みとり器に吸光度が記録される。対照のハ
イブリダイゼーションはHBV分析物を含有していなかっ
た。
【０１４３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】固相支持体に結合している種々の成分の複合体
の解説図であり、1)は非共有結合にDNA橋を使った場
合、そして 2)は非共有結合にビチオン−アビジン橋を
使った場合である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/533 8310−2Ｊ (72)発明者 ブライアン ワーナー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94062 レッドウッド シティ，クレスト ドラ イブ 422 (72)発明者 トーマス ホーン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94708 バークレイ，アーチ ストリート 1583 エー

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の構造式１によって示される修飾ヌ
    クレオチド： 【化１】 ここでＲ1は検出可能な標識により誘導体を作りうる反
    応基であり；Ｒ2はアミド結合、チオエーテル結合もし
    くはジスルフィド結合、またはそれらの組み合わせを含
    む任意の結合部分であり；Ｒ3は水素、メチル、臭素、
    フッ素およびヨウ素から成る群から選ばれ；Ｒ4は水
    素、酸感受性で塩基安定性のブロッキング基およびアシ
    ルキャッピング基から成る群から選ばれ；Ｒ5は水素ま
    たはリン誘導体であり；Ｒ6はＨ、ＯＨ、またはＯＲ
    で、この場合のＲは酸感受性で塩基安定性の保護基であ
    り；そしてXは１から８を含む範囲の整数である。
  2. 【請求項２】 少なくとも２つのヌクレオチドを有する
    ポリヌクレオチドプローブであって、該ヌクレオチドの
    少なくとも一つが以下の構造式１３によって示される構
    造を有するポリヌクレオチドプローブ： 【化２】 ここでＲ1は検出可能な標識により誘導体を作りうる反
    応基であり；Ｒ2はアミド結合、チオエーテル結合もし
    くはジスルフィド結合、またはそれらの組み合わせを含
    む任意の結合部分であり；Ｒ3は水素、メチル、臭素、
    フッ素およびヨウ素から成る群から選ばれ；Ｒ6はＨ、
    ＯＨ、またはＯＲで、この場合のＲは保護基であり；そ
    してXは１から８を含む範囲の整数である。
  3. 【請求項３】 一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲ
    ＮＡを含む試料中のヌクレオチド配列を検出する方法で
    あって、以下の工程を包含する方法： (1)ヌクレオチド配列を有する分析物を提供する工程、
    および(2)該分析物配列に相補的なヌクレオチド配列を
    有する標識されたポリヌクレオチドプローブを提供する
    工程であって、該ポリヌクレオチドプローブが、以下の
    構造式１３によって示される構造を有する少なくとも一
    つのヌクレオチドを含む、工程： 【化３】 ここでＲ1は検出可能な標識により誘導体を作りうる反
    応基であり；Ｒ2はアミド結合、チオエーテル結合もし
    くはジスルフィド結合、またはそれらの組み合わせを含
    む任意の結合部分であり；Ｒ3は水素、メチル、臭素、
    フッ素およびヨウ素から成る群から選ばれ；Ｒ6はＨ、
    ＯＨ、またはＯＲで、この場合のＲは保護基であり；そ
    してXは１から８を含む範囲の整数である。
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