JPH06213887A - チログロブリン含有量決定方法およびこの方法用のキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明はチログロブリン含有量の決定方法お
よびこの方法で用いるキットに関するものである。 【構成】 本発明のチログロブリン含有量決定方法は吸
引によって採取した甲状腺細胞学的試料を使用するもの
であり、ｍｇ程度の量のチログロブリンの定量測定に有
用であり、かつまた非常には専門家されていない臨床実
験室においてさえも、容易に、そしてまた迅速に採用す
ることができる。この定量測定に好適な技術は免疫拡散
法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はチログロブリン含有量の
決定方法およびこの方法で使用するためのキットに関す
る。さらに特に、本発明は、甲状腺に存在するチログロ
ブリンレベルの測定に適しており、そして高度に専門的
ではない、臨床実験室においてさえも、安価に使用する
ことができ、迅速で簡単であり、かつまた正確であるチ
ログロブリン含有量の決定方法およびキットによる決定
方法に関するものである。

【０００２】本明細書中で引用されている刊行物の目録
番号は本明細書の最後に記載のリストの刊行物を表わ
す。

【０００３】

【従来の技術】ヒトチログロブリン（ｈＴｇ）は甲状腺
の器管特異タンパク質であり、このタンパク質は小胞細
胞によって分泌され、コロイド中に沈着する。その合
成、代謝、一次免疫化学構造およびホルモン形成におけ
る機能はいずれも広く研究されている（１−５）。

【０００４】新鮮な組織１ｇ当りのｈＴｇ濃度は２０〜
４０ｍｇである。この数値は、種々の甲状腺機能の変化
状態によって変わることがある。バセドー氏病、抗甲状
腺薬による処置、甲状腺温熱小結節、ホルモン形成にお
ける変性によって生じる甲状腺腫では、ｈＴｇの濃度は
減少し、これに対して、コロイド甲状腺腫およびヨウ素
により処置後の場合には増加する（６，７）。

【０００５】甲状腺腫瘍では、生じた腫瘍の差の程度に
応じて、このタンパク質の漸進的減少が生じる；このタ
ンパク質は、アデノーマ、地方病性甲状腺腫、散発性多
発結節性甲状腺腫において存在し、小胞癌および乳頭癌
の場合に、著しく減少し、そしてまた未分化腫瘍、甲状
腺リンパ腫および異常小胞腫瘍においては存在しない
（８）。

【０００６】甲状腺腫瘍疾患は、一般の人々に非常に多
発するが、正確に、１桁のパーセンテージまで推定する
ことはできない。これは、これらの病気の発現に広い地
域的変化および多様性があり、特に甲状腺腫疾患は地域
的に変化と多様性があるためである。しかしながら、一
般の人々の５〜１５％の割合が、甲状腺の腫瘍および
（または）小結節形成に被患しているものと大体、推定
することができる。

【０００７】したがって、針によって吸引した甲状腺試
料に対する細胞学的検査は、その種々の分化段階で、コ
ロイド甲状腺腫であるか、または腫瘍であるかを判断し
て、甲状腺小結節の適当な治療的処置（医薬による処置
または手術による処置）を選択するための指標として最
近に臨床的に広く普及してきている。

【０００８】しかしながら、針により吸引採取した小胞
細胞に対して行なわれる細胞学的検査では、甲状腺肥大
が悪性であるか、または良性であるかに関して疑いが生
じることがある。コロイドの主要特異構成成分であるタ
ンパク質ｈＴｇの定量測定は細胞学的診断の方法の開発
および完成に大きな助けとなることができ、これによっ
て細胞学的判断基準を細胞分化マーカーの定量測定によ
って支持することができる。

【０００９】針により吸引採取した甲状腺試料中のチロ
グロブリン含有量決定は現時点では行なわれていない。
これは、ヒト血清中のｈＴｇ濃度を定量的に測定するた
めに開発された、利用できる方法（ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、
ＥＬＩＳＡ）がｎｇ単位程度のｈＴｇの量を測定できる
ものであって、ｍｇ単位の甲状腺内ｈＴｇ濃度の定量測
定に使用するには適していないことによるものである。

【００１０】したがって、高度に専門家された実験室の
必要がなく、したがって臨床および診断の目的に使用す
ることができ、針により吸引採取された甲状腺細胞試料
内のｍｇ単位程度のチログロブリンを定量測定するため
の、簡単で正確で、かつまた迅速な方法が求められてい
ることは明らかである。

【００１１】

【発明の開示】本発明の発明者達は、免疫拡散法がこの
特徴を満足させるものであり、針により吸引採取された
甲状腺試料中のチログロブリンを、放射性同位元素を用
いる必要がない、迅速で正確な方法によって定量測定す
る方法を開発できることを見い出した。

【００１２】したがって、本発明の目的は針により吸引
採取した甲状腺試料中のチログロブリンの定量測定方法
を提供することにある。本発明のもう一つの目的は免疫
拡散技術によってチログロブリンを定量測定する方法を
提供することにある。

【００１３】好適態様において、この免疫拡散技術は免
疫電気拡散法であり、この方法は好ましくは、チログロ
ブリンに特異的に結合できるリガンドを含有する電気泳
動ゲルを調製する工程；試料を負荷する工程；上記電気
泳動を行なう工程；この試料反応に含まれるリガンド−
チログロブリンを測定する工程；からなる。

【００１４】別法として、この免疫拡散技術は単純放射
免疫拡散法であり、さらに好ましくは、この方法は次の
工程からなる：チログロブリンを結合できるリガンドを
含有する不活性ゲルを調製する工程；このゲルを試料と
接触させる工程；これをインキュベートする工程；この
試料反応に含まれるリガンド−チログロブリンを測定す
る工程。

【００１５】さらに、本発明において、上記リガンドは
抗チログロブリン血清または精製抗チログロブリン抗体
からなる。さらにまた、本発明において、上記不活性ゲ
ルは、好ましくはＮａＣｌおよびリン酸塩緩衝剤を含有
する溶液中に溶解した０．８％〜２．０％の濃度のアガ
ロースからなり、さらに好ましくは、この溶液は０．１
５％ＭのＮａＣｌ濃度および０．０５Ｍのリン酸塩緩衝
剤濃度を有し、そしてまたこの溶液はグルタミン酸ナト
リウムおよびクロルヘキシジンを含有する。

【００１６】本発明の特定の態様では、上記不活性ゲル
を適当にシールされる２枚のガラスプレートの間の空隙
中に液体状態で注入し、次いでこのゲルを固化させる。
さらにまた、好ましくは、この２枚のガラスプレートの
１枚を、プレートそれ自体に対する上記ゲルの接着を容
易にする物質により被覆する。

【００１７】さらにまた、本発明において、上記接触は
上記不活性ゲルの一部を針による吸引によって行ない、
生成された円形のくぼみに試料を導入する。上記インキ
ュベーションは湿った容器内で、１８℃〜３０℃、好ま
しくは２０℃〜２７℃の温度において、２〜６０時間、
好ましくは２４〜５０時間、行なう。

【００１８】さらにまた、本発明において、上記リガン
ドとチログロブリンとの間の反応は沈殿反応であり、上
記定量測定は環状沈殿の少なくとも一つの直径を測定す
ることによって行なう。別法として、上記環状沈殿は、
不活性ゲルの乾燥後に、タンパク質用染料によって着色
する、試料は０．５〜４．０ｍｇ／ｍｌの濃度でチログ
ロブリンを含有するか、またはこのような濃度が得られ
るまで稀釈する。

【００１９】本発明のもう一つの目的は、前記方法に使
用するためのキットにある。

【００２０】

【実施例】本発明を若干の実施例によって以下に説明す
るが、これらの例は説明のためのものであって、制限す
るものではない。

【００２１】例１単純放射免疫拡散法によるチログロブリンの定量測定方
法 免疫拡散技術は（１２）に記載されている。針による吸
引採取は２０ｍｌシリンジおよび２１Ｇ×１−１／２、
０．８×４０ｍｍ針を備えた、細胞学的試料の吸引採取
用の装置（Ｃａｍｅｃｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行な
う。

【００２２】吸引採取した試料は下記のものからなるこ
とができる：ａ）数滴のネマティック（ｎｅｍａｔｉ
ｃ）液；ｂ）褐色または黄色またはネマテイック色の種
々の量の（２０ｍｌ以上）のう胞液（ｃｙｓｔｉｃ ｌ
ｉｑｕｉｄ）。ａ）の場合には、一定量（３０μｌ）を
０．１５ＭＮａＣｌ中に１＋１で稀釈し、次いでこれを
ポリエチレン管（２９×６ｍｍ）内で１，０００×ｇで
２回、遠心分離する。上澄液を用いて、ｈＴｇを定量測
定する。沈降部分は注意深く懸濁し、次いで塗布して細
胞学的検査を行なう。

【００２３】ｂ）の場合には、のう胞液を遠心分離し、
（１５００×ｇ、１０回）、次いでａ）と同様に処理
し、上澄液はｈＴｇの定量測定に使用し、他方沈降部分
は細胞学的検査に使用する。

【００２４】アガロース１．５ｇを、０．２４Ｍグルタ
ミン酸ナトリウムおよび０．００５％クロルヘキシジン
含有０．０５Ｍリン酸塩緩衝剤により緩衝されている塩
類溶液（０．１５ＭＮａＣｌ）１００ｍｌ中に加熱によ
り溶解した。一定量を１０ｍｌ管に分配し、次いで＋４
℃で保存する。

【００２５】ｈＴｇ５ｍｇをフロインド完全アジュバン
ト１ｍｌ中で乳化し、このエマルジョンを動物の足の脂
性クッション中に注入することによって、ウサギヒト抗
チログロブリン血清を調製する。１ケ月後に、同一操作
にしたがい、ブースター注入を行なう。１５日後に、動
物から心臓穿刺により採血し、抗体を正常なヒト血清に
吸着させ、その濃度を、沈降曲線をグラフに描くことに
よって測定した。沈殿したｈＴｇ１０ｍｇの力価が血清
１ｍｌ当りの数値関係で沈降曲線から得られる。

【００２６】コロイド甲状腺腫の粗抽出物から、塩処理
および引続く超微細Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００カラム
（０．００５Ｍリン酸塩緩衝剤；ｐＨ７．４）における
クロマトグラフィにより、ｈＴｇを調製する。純度検査
はポリアクリルアミドゲル上のＳＤＳ電気泳動でシング
ルバンドを示す（８−１０）。

【００２７】寒天１０ｍｌを水浴上で８０℃において溶
解し、次いでこの溶液を冷却させる；この寒天が６６℃
である時点で、ウサギ抗ｈＴｇ１ｍｌを加え、次いでこ
の混合物を迅速に磁気攪拌に付し、完全に混合し、次い
でこの寒天−抗血清を溶融状態で、ピペットにより型中
に分配する。

【００２８】この型は、２枚のガラスプレート（７×１
６ｃｍ）を厳しく清浄にした後に、これらのガラス板を
相互に近接しておくことによって調製する。この２枚の
ガラスプレートはプラスティック材料からなるＵ形中間
部品によって分離させておき、金属製爪によって相互に
一体に保持する。これらの２枚のプレートのうちの１枚
は、Ｇｅｌ Ｂｏｎｄラミナ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
よる被覆により予め被覆しておく。

【００２９】上記ゲル−抗血清混合物は１時間の間、室
温に冷却させておき、次いでＧｅｌＢｏｎｄで処理され
ていない方のプレートを静かにスライドすることによっ
て取り除く。Ｕ形プラスティック製中間部品も取り除
く。このゲルに、眼鏡を備えた、２．５ｍｍの針による
吸引によって穴を作る。おだやかな吸引（水圧減圧）に
よって、一列５個のくぼみの列を２本得る。各くぼみの
直径は２．５ｍｍである。増加する量（０．００５〜
０．０４ｍｇ）でｈＴｇを含有する溶液０．０１ｍｌ
を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットまたは同様の手段によ
り５個のくぼみに装入する。各装入において、ピペット
の先端の変化に注意する。各種被検試料はそれぞれ別々
のくぼみに装入する。これらのプレートを次いで湿った
容器内で室温において４８時間放置する。このインキュ
ベーション時間の終了時点で、環状沈殿の直径を適当な
プレート読み取り基準にしたがい読み取る。直角で直径
を２回測定し、平均値をとる。この二つの直径は相互に
５％より多くは相違していない。

【００３０】この読み取りはまた、冷却した材料に対し
て行なう読み取りに加えて、環を着色することにより、
さらに正確に行なうことができる。この目的のために
は、プレートを数時間、水中で洗浄し、次いで１００℃
のオーブン中で３０分間乾燥させる。タンパク質は慣用
のタンパク質染料（プロモフェノールブルー、Ｃｏｍｍ
ａｓｓｉｅ、Ｐｏｎｃｅａｕ Ｒｅｄ）を用いて着色す
る。横軸としてｈＴｇ濃度を、そして縦軸としてｍｍ単
位で環径をとり、標準曲線を作成する。

【００３１】試料１ｍｌ当り０．５〜４ｍｇのｈＴｇの
量がこの方法によって測定できる。さらに濃厚な試料の
場合には、適当に稀釈して適当にする。

【００３２】

【表１】

【００３３】例２ チログロブリンの定量測定方法を用いて得られた結果 ７つの標準曲線の結果は第１表に示されている。異なる
実験間の変化は、この曲線の最低点でその最大値１３％
に達した。他方、濃度が高い方の試料においては試料中
の最大値は８％に達し、最小値は３％であった。限られ
た数の試料において、市販キットを用いて行なわれたＲ
ＩＡ法と単純放射免疫拡散法（ＲＩＤ）との間の比較評
価は最適の相互関係を示した（ｒ＝０．９３、ｐ０．０
２より少）。５４の肥大甲状腺から吸引採取した細胞学
的物質の試料において、ＲＩＤ法によって測定されたＴ
ｈＴｇの甲状腺内濃度を第２表に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】小結節増殖の場合には、ＴｈＴｇの平均濃
度は１．３０±０．５ｍｇ／ｍｌを示したが、８つの試
料のうちの３つにおいて（これらは平均値の計算には入
れない）ＴｈＴｇ濃度は明確に大きく、これを標準曲線
から読み取るためには試料の稀釈が必要であった。増殖
小結節の場合と同様の濃度が変質した偽のう胞で見られ
た（１．６８±０．６９ｍｇ／ｍｌ）。このような偽の
う胞は増殖小結節が壊死および流体化に進行したものと
考えることができる。この群ではまた、若干の非常に高
い数値が別々に得られる。このような場合には、コロイ
ドのう胞変性が生じていた。

【００３６】吸引によって採取した細胞学的試料のうち
の６試料においては典型的な甲状腺構成要素が見られな
かったが（卵形小のう細胞または甲状腺小胞の切端）、
これらの試料において、増殖小結節の場合に得られた濃
度に匹敵するＴｈＴｇ濃度が定量的に測定できたこと
は、極めて重大である。この結果は、典型的な細胞構成
員が存在していない場合でさえも、器管診断要素および
肥大の性質についての判断を提供することから、本発明
の方法のもう一つの利点を明白に示している。

【００３７】細胞学的臨界徴候（慢性リンパ性甲状腺
炎、小胞腫瘍）により、あるいは臨床実験室的臨界徴候
（温熱小結節、Ｇｒａｖｅｓ病）により分類される甲状
腺疾患のもう一つのグループにおいては、ＴｈＴｇ濃度
が０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するか、または存在し
ないかによって判断できる。この結果は、Ｇｒａｖｅｓ
病の場合、温熱小結節の場合、アデノーマおよびコロイ
ド甲状腺腫の場合（この場合には、ＴｈＴｇ沈殿は非常
に少ない）、およびまたリンパ性甲状腺炎の場合（この
場合には、小胞組織がリンパ球湿潤で置き換えられる）
に見られる組織学的研究および生化学的研究からすでに
知られている結果と良く一致する。

【００３８】したがって、「小胞増殖」または疑わしい
「リンパ性甲状腺炎」に係る細胞学的所見が存在する場
合に、ＴｈＴｇの定量測定は診断確定に有用な要素を提
供することができる。たとえば、「慢性リンパ性甲状腺
炎」と「小結節増殖に病因がある甲状腺炎」とが疑われ
ている場合に、このＴｈＴｇの定量測定は、慢性リンパ
性甲状腺炎の診断に対して（この場合には、ＴｈＴｇ濃
度は低いかまたはＴｈＴｇは存在しない）、あるいは小
結節増殖の診断に対して（この場合には、ＴｈＴｇの濃
度は高い）、指示を与えることができる。同様に、細胞
が豊富な吸引採取された細胞学的試料の場合に、増殖で
あるか、小結節腫瘍であるかが疑われている場合には、
ＴｈＴｇの測定は診断手段を提供することができ、Ｔｈ
Ｔｇ値が高いと、増殖の診断ができ、あるいはＴｈＴｇ
が存在していないか、または低濃度で存在する場合に
は、腫瘍の診断をくだすことができる。

【００３９】例３ 免疫電気拡散法（ＥＩＤ） ８０ｍＭトリスーホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８．６中の１％
アガロースゲル溶液を２％デキストリン７０ｋｄおよび
１％ウサギ抗Ｔｇ血清と、５６℃で混合することによっ
てゲルプレートを調製する。この溶液８ｍｌをゲルバン
ド（７×８ｃｍ）の親水性側に注ぎ入れる。これらのプ
レートを４℃で２時間放置する。眼鏡装置（Ｂｅｈｒｉ
ｎｇ）を備えた、２．５ｍｍの吸引用針によって、底部
から２ｃｍの地点まで１１個のくぼみを作る。直後に、
精密なＥＰＰｅｎｄｏｒｆピペット（非精度＜２．８
％）によって標準および試料（５μｌ）を装入する。こ
れらのゲルをトリス−ホウ酸塩緩衝液８０ｍＭ、ｐＨ
８．６中で１２ボルト定電圧において１４時間、処理す
る。ロケットの高さをＥＩＤリーダーにより測定する。

【００４０】下記の第３表は０ｇＴｇ量とロケットの高
さとの間の直線的関係を示している。ＥＩＤ法の感度は
ＲＩＤ法の感度よりも高い。

【００４１】

【表３】

【００４２】

【００４３】

【００４４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルガ ロッツ イタリア国ローマ，ビア パレンツオ，ナ ンバー ２

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 吸引採取した甲状腺試料からチログロブ
   リン含有量を決定する方法。
2. 【請求項２】 免疫拡散技術によるチログロブリン含有
   量の決定方法。
3. 【請求項３】 上記免疫拡散技術が免疫電気拡散法から
   なる、請求項２に記載のチログロブリン含有量の決定方
   法。
4. 【請求項４】 上記方法が、 チログロブリンに対して特異的に結合できるリガンドを
   含有する電気泳動ゲルを調製する工程；試料を負荷する
   工程；上記電気泳動を行なう工程；上記試料反応に含ま
   れるリガンド−チログロブリンを測定する工程；からな
   る、請求項３に記載のチログロブリン含有量の決定方
   法。
5. 【請求項５】 上記免疫拡散技術が、単純放射免疫拡散
   法からなる、請求項２に記載のチログロブリン含有量の
   決定方法。
6. 【請求項６】 上記方法が、 チログロブリンを結合できるリガンドを含有する不活性
   ゲルを調製する工程；このゲルを試料と接触させる工
   程；これをインキュベートする工程；試料反応に含まれ
   るリガンド−チログロブリンを定量測定する工程；から
   なる、請求項５に記載のチログロブリン含有量の決定方
   法。
7. 【請求項７】 上記リガンドが、抗チログロブリン導入
   血清または抗チログロブリン精製抗体からなる、請求項
   ４または６に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
8. 【請求項８】 上記不活性ゲルが、０．８％〜２．０％
   の範囲の濃度のアガロースからなる、請求項６または７
   に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
9. 【請求項９】 上記アガロースはＮａＣｌおよびリン酸
   塩緩衝剤を含有する溶液中に溶解されている、請求項８
   に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
10. 【請求項１０】 上記ＮａＣｌが０．０５Ｍ濃度であ
    り、そして上記溶液がグルタミン酸ナトリウムおよびク
    ロルヘキシジンを含有する、請求項９に記載のチログロ
    ブリン含有量の決定方法。
11. 【請求項１１】 上記不活性ゲルを溶液状態で、適当に
    シールされる２枚のガラスプレート間の空隙に注入し、
    次いで固化させる、請求項６〜１０のいずれか一項に記
    載のチログロブリン含有量の決定方法。
12. 【請求項１２】 上記２枚のガラスプレートの１枚を、
    上記ゲルの上記ガラスプレートに対する接着性を改善す
    る物質により被覆する、請求項１１に記載のチログロブ
    リン含有量の決定方法。
13. 【請求項１３】 上記接触を、上記不活性ゲルの一部を
    針により吸引し、生成されるくぼみに上記試料を導入す
    ることによって生じさせる、請求項６〜１２のいずれか
    一項に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
14. 【請求項１４】 上記インキュベーションを、湿った容
    器内で２〜６０時間の間、温度１８℃〜３０℃で行な
    う、請求項６〜１３のいずれか一項に記載のチログロブ
    リン含有量の決定方法。
15. 【請求項１５】 上記温度が２０℃〜２７℃の範囲であ
    り、そして上記時間が２４時間〜５０時間である、請求
    項１４に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
16. 【請求項１６】 上記リガンドとチログロブリンとの反
    応が沈殿反応であり、そして上記定量測定を環状沈殿の
    少なくとも一つの直径を測定することによって行なう、
    請求項６〜１５のいずれか一項に記載のチログロブリン
    含有量の決定方法。
17. 【請求項１７】 上記環状沈殿を、上記不活性ゲルの乾
    燥後に、タンパク質染料によって着色する、請求項１６
    に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
18. 【請求項１８】 上記試料が０．５〜４．０ｍｇ／ｍｌ
    の濃度でチログロブリンを含有するか、またはこの濃度
    が得られるまで稀釈されている、請求項１〜１７のいず
    れか一項に記載のチログロブリン含有量の決定方法。
19. 【請求項１９】 前記請求項のいずれか一項に記載のチ
    ログロブリン含有量の決定方法に使用するためのキッ
    ト。