JPS6411148B2 - - Google Patents

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JPS6411148B2
JPS6411148B2 JP56053073A JP5307381A JPS6411148B2 JP S6411148 B2 JPS6411148 B2 JP S6411148B2 JP 56053073 A JP56053073 A JP 56053073A JP 5307381 A JP5307381 A JP 5307381A JP S6411148 B2 JPS6411148 B2 JP S6411148B2
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JP
Japan
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antibody
animal species
creatine kinase
isozyme
produced
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JP56053073A
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Usategui Gometsu Magudarena
Uorutaa Uitsukusu Richaado
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Publication date
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Publication of JPS6411148B2 publication Critical patent/JPS6411148B2/ja
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液中のクレアチンキナーゼ−MBア
イソザイム量を迅速かつ正確に測定する免疫化学
的方法およびそのための組成物に関する。この方
法は測定可能な標識を有する免疫複合体を形成さ
せる三重抗体法を用いる。本方法および生成した
複合体は患者が心筋梗塞であるかどうかの判定に
有用である。
クレアチンキナーゼ（CK）は動物体液中また
は組織内に３種のアイソザイムの形で存在し、そ
れはCK−BB、CK−MMおよびCK−MBの記号
が呼ばれている。この３種のアイソザイムすなわ
ちCK−BB、CK−MMおよびCK−MBは、それ
ぞれＭまたはＢの符号が付されているサブユニツ
トの組み合わせが異なる点で区別される。CK−
BBはＢサブユニツト２個を有し、CK−MMは
Ｍサブユニツト２個を有し、CK−MBはＭ、Ｂ
各１個のサブユニツトを有する。クレアチンキナ
ーゼMBアイソザイム（CK−MB）が体液中と
くに患者の血清中に単に存在するかどうかを知る
だけで心筋梗塞の診断にきわめて有用である
（Galan、R.S.、Human path.６．No.２、145〜
147.Apr.1975）。
体液中のCK−MBを測定する免疫学的方法は、
CK−MMおよびCK−BBに干渉されて難しい。
CK−MM、CK−BBおよびCK−BBに対して産
生した抗体は、同一サブユニツトのために、CK
−MBとCK−MM、CK−MBとCK−BBまたは
３種の全アイソザイムとそれぞれ免疫学的に反応
する。CK−MBの含有が想定される体液の大部
分はCK−MMをかなりの量含み、CK−BBと
CK−MBの量ははるかに少ない。したがつて従
来技術では、CK−MBの測定にCK−BBおよび
CK−MMの干渉が問題であつた。
CK−MBの存在を知る免疫学的方法を含めた
最近の方法、またこの種の方法の欠点はCurrent
Problems in Cardiology、Vol.、No.12、
March、1979、７〜28に報告され、総説されて
いる。これらの方法は、CK−MBの測定におけ
るCK−MMおよびCK−BBの干渉による難点を
十分解決したとはいえない。既報の方法として
は、抗体が妨害物質の酵素活性を阻害するために
用いる酵素免疫定量法（U.S.4067775号）および
CK−アイソザイムを抗体によつて沈降させる酵
素免疫沈降法（たとえばU.S.4012285および
3932221）のような免疫定量法がある。
U.S.4012285および3932221に記載された方法は
CK−MBを間接的に測定する目的で各種アイソ
ザイムを分別沈殿するため、単一抗体の複合体を
使用する。これらの方法は沈殿前に総CK活性を、
沈殿後に残つたCK活性を測定し、活性の差から
CK−BBを測定する。活性は酵素法で定量する。
この方法は繁雑で、２量の差をとるため誤差が出
やすい。
本発明はCK−MBをCK−MMおよびCK−BB
とともに含有する体液サンプル中のCK−MB量
を選択的に直接測定する方法およびそのための組
成物に関する。
本発明の方法は、(a)第１動物種に産生し、サン
プル中のクレアチンキナーゼのＢまたはＭサブユ
ニツトの一方に選択的に免疫反応的結合が可能な
第１抗体、第２動物種に産生し第１抗体と免疫沈
降素として選択的に免疫反応的結合が可能な第２
抗体、および第１動物種以外の動物種に産生し測
定可能な標識でラベルされ第１抗体が結合が結合
可能なＢまたはＭサブユニツトの他方と選択的に
免疫反応的結合が可能な第３抗体をサンプルとイ
ンキユベートして、標識された第３抗体−クレア
チンキナーゼ−MBアイソザイム−第１抗体−第
２抗体およびクレアチンキナーゼアイソザイム−
第１抗体−第２抗体を含む免疫複合体の混合物を
沈降物として得、(b)沈降物を単離し、(c)免疫複合
体含有沈降物中の標識量を測定する方法である。
本発明の方法は、CK−MMまたはCK−BBに
対する抗体を、CK−MBの直接測定に使用でき
る沈降性免疫複合体の産生に有効に利用する三重
抗体法である。本発明の方法は放射定量が可能な
放射活性標識を用いることにより、通常用いられ
る他の検知法よりもCK−MB測定の感度および
効率を上げることができる。放射定量法を採用す
ることにより、従来検知不能であつたような量の
CK−MBの検知も可能となり、また従来法より
もより直接的なCK−MB量の定量を可能にした。
本発明の方法および免疫複合体は心筋梗塞の診断
に有用である。
本発明は体液中のCK−MB量を免疫化学的に
定量する方法である。本発明の方法には任意の体
液を使用できる。たとえば全血、血漿、血清、リ
ンパ液、胆汁、尿、脊髄液、痰、汗等、また糞の
ようなヒトまたは他動物の体液である。ヒトまた
は他動物の組織たとえば骨各筋、心臓、腎臓、肺
臓、脳、骨髄、皮膚等の液状プレパレーシヨンも
使用できる。本発明の本法に好ましい体液はヒト
血清である。本発明の方法に使用する場合、通
常、血清を稀釈する必要はないが、急性心筋梗塞
患者の血清のように異常にCK量が高い場合は稀
釈した方が良好な結果が得られる。血清は加熱動
物血清たとえば加熱正常ヤギもしくはヒト血清ま
たはウシ血清アルブミン溶液のような高タンパク
溶液で稀釈することもできる。
とくに本発明はCK−MBをCK−MMおよび
CK−BBとともに含有する体液中のCK−MB量
を直接、選択的に測定する方法に関する。本発明
の方法は、(a)第１動物種に産生し、サンプル中の
クレアチンキナーゼのＢまたはＭサブユニツトの
一方に選択的に免疫反応的結合が可能な第１抗
体、第２動物種に産生し第１抗体と免疫沈降素と
して選択的に免疫反応的結合が可能な第２抗体、
および第１動物種以外の動物種に産生し測定可能
な標識でラベルされ第１抗体が結合可能なＢまた
はＭサブユニツトの他方と選択的に免疫反応的結
合が可能な第３抗体をサンプルとインキユベート
して、標識された第３抗体−クレアチンキナーゼ
−MBアイソザイム−第１抗体−第２抗体および
クレアチンキナーゼアイソザイム−第１抗体−第
２抗体を含む免疫複合体の混合物を沈降物として
得、(b)沈降物を単離し、(c)免疫複合体の標識量を
測定する方法である。免疫複合体中の測定標識量
を標準曲線と比較し、生体サンプル中のCK−
MB存在量を決定する。
本発明はまた体液中のCK−MB量を測定する
ための組成物を提供する。この組成物は、第１動
物種に産生し、サンプル中のクレアチンキナーゼ
のサブユニツトＢまたはＭの一方に選択的に免疫
反応的結合が可能な第１抗体、第２動物種に産生
し、第１抗体と選択的に免疫反応的結合が可能な
第２抗体、および第１動物種以外の動物種に産生
し、測定可能な標識でラベルされ、上記Ｂまたは
Ｍサブユニツトの他方と選択的に免疫反応的結合
が可能な第３抗体よりなる。
本発明はさらに、体液サンプル中のCK−MB
量を測定するための診断試験キツトをも提供す
る。このキツトは試薬を組み合わせて包装したも
ので、(a)第１動物種に産生し、クレアチンキナー
ゼのサブユニツトＢまたはＭの一方に選択的に免
疫反応的結合が可能な第１抗体の容器、(b)第２動
物種に産生し第１抗体と選択的に免疫反応的結合
が可能な第２抗体の容器、および(c)第１動物種以
外の動物種に産生し測定可能な標識でラベルさ
れ、第１抗体が結合可能な上記ＭまたはＢユニツ
トの他方と選択的に免疫反応的結合が可能な第３
抗体の容器よりなる。上述の各抗体はキツト中で
別個の容器に入れてもよい。抗体のキツト中での
好ましい組み合わせは、第１抗体と第３抗体を１
個の容器に一緒に入れ、第２抗体は別の容器に入
れたものである。
キツト中の全抗体をサンプルとインキユベート
すると沈降性の免疫複合体が得られる。これを測
定して標準曲線と比較すればサンプル中のCK−
MB量が決定される。試験キツトには上述の全試
薬とともに、標準曲線作成に適当な標品を添付し
てもよい。たとえば本技分野でみられるように、
試験キツト用の適当な標品は一連の既知の違う量
のCK−MBを含む試薬としてもよい。一連の標
品について放射定量法を行い、既知CK−MB量
に対して放射活性測定値をプロツトすれば曲線が
得られ、これを未知サンプル中のCK−MB量を
測定に際し対照として使用する。試験キツトは体
液中のCK−MBを測定する必要がある診療所、
病院、検査室、医師に便利である。
さらに詳しくは、本発明はCK−MBの存在が
疑われる血清サンプルのような試験サンプルを、
CK−MBの免疫反応を生じる第１抗体で処理す
る方法である。本発明の好ましい態様によれば、
第１抗体は、第１動物種としてウサギを用い、こ
れを高純度CK−BBで免疫処理し、常法により
第１抗体としてのウサギ抗（CK−BB）を得る
方法で製造する。この方法で得られた第１抗体は
CK−MBおよびCK−BBのＢサブユニツトと結
合できる。第１抗体を試験サンプルと混合し、約
５分間インキユベートすると、サンプル中のCK
−MBおよびCK−BBと免疫学的に結合し、CK
−MB−第１抗体およびCK−BB−第１抗体複合
体を与える。使用した第１抗体の量が十分であれ
ば、試験サンプル中の全CK−MBと結合するが、
サンプル中にCK−BBがあれば第１抗体はこれ
とも結合する。サンプル中の全CK−MBおよび
CK−BBを結合させるのに必要な量以上の第１
抗体を加えることが、試験サンプル中のCK−
MBの定量に重要である。第１抗体の必要量の決
定は本技術分野において認められている方法で行
うことができる。
試験サンプルを次に、第１抗体と免疫沈降素と
して免疫学的反応を行う第２抗体で処理する。第
２動物種として、たとえば、ヤギをウサギγ−グ
ロブリン（IgG）で免疫処理すると、ヤギ抗−ウ
サギIgGが第２抗体として慣用の免疫技術により
得られる。この方法で得られた第２抗体はウサギ
抗−（CK−BB）を含めた任意のウサギIgGと結
合できる。第２抗体を試験サンプルと混合し、約
５分間室温でインキユベートすると第１抗体と免
疫学的に結合する。これがCK−MB−第１抗体
−第２抗体およびCK−BB−第１抗体−第２抗
体を含む免疫沈降素を沈殿させる。第２抗体の使
用量は第１抗体すべてを結合させるに十分な量で
ある。試験サンプル中のCK−MBの良好な定量
値を得るためには全第１抗体の結合に必要な量よ
り過剰の第２抗体を加えることが必要である。
試験サンプルに次に生理食塩水を加え、サンプ
ルを遠心分離し、上澄を傾瀉して除去する。この
傾瀉で、操作の妨害になるCK−MMは免疫沈降
素から除去される。
次に免疫沈降素を第３抗体の溶液で処理する。
この抗体は免疫沈降素のCK−MBとのみ免疫学
的に反応する。第３抗体は試験液中のCK−MB
以外のアイソザイムとも結合できる場合もあるが
免疫沈降素に関しては、それがCK−MB以外の
アイソザイムを含んでいてもCK−MBとのみ免
疫学的に反応する。本発明は、本発明の抗体と免
疫学的に反応するCK−MB以外のアイソザイム
を含むサンプルを用いても行うことができる利点
がある。
第３抗体は第１動物種以外の動物種、たとえば
ヒツジを高純度CK−MMで免疫処理し、常法に
より第３抗体としてヒツジ抗−（CK−MM）を得
ることにより製造できる。第３抗体は精製し、こ
れをヨウ素−125でヨウ素化して測定可能な標識
をもつ標識第３抗体を製造する。この方法で得ら
れた第３抗体はCK−MBおよびCK−MMのＭサ
ブユニツトに結合できる。第３抗体を溶液として
既知濃度で免疫沈降素に加える。第３抗体を免疫
沈降素と混合し約30分間室温でインキユベートす
ると、標識第３抗体−CK−MB−第１抗体−第
２抗体およびCK−BB−第１抗体−第２抗体を
含む免疫複合体混合物が沈殿として得られる。得
られた混合物を食塩水で希釈し、遠心分離し、傾
瀉する。遠心分離と傾瀉により免疫複合体が他の
干渉物質から単離される。免疫複合体は任意の方
法たとえば濾過によつて集め、単離してもよい
が、好ましい方法は遠心分離と傾瀉である。沈殿
中の免疫複合体がもつ放射活性をガンマシンチレ
ーシヨンカウンターで測定する。得られる放射活
性値は試験サンプル中のCK−MB量によく比例
する。
上述の方法の別法として各抗体を試験サンプル
を順次混合し、免疫複合体を含み放射活性をもつ
沈殿を分離し、複合体のもつ放射活性を測定して
もよい。
他の好ましい本発明の態様としては、第１抗体
を、高純度CK−MMでウサギを免疫処理し、ウ
サギ抗−（CK−MM）を得る方法で常法にしたが
い製造してもよい。この方法で得られた第１抗体
はCK−MBまたはCK−MMのＭサブユニツトと
結合できる。第３抗体は高純度CK−BBでヒツ
ジを免疫処理してヒツジ抗−（CK−BB）を得る
ことにより製造できる。これを精製し、ヨウ素−
125で標識すると測定可能な標識を有する第３抗
体が得られる。かくして得られた第３抗体はCK
−MBまたはCK−BBのＢサブユニツトと結合で
きる。第２抗体は前述したと同じでよい。第１抗
体と第３抗体を試験サンプルに加え、ついで混合
し、室温で１時間インキユベートする。次に第２
抗体を試験サンプルに加え、混合し、再び室温で
15分間インキユベートする。ついで試験サンプル
を食塩水で希釈し、遠心分離し、上澄を傾瀉す
る。生成した放射活性免疫複合体を含む沈殿の放
射活性を前述したと同様に測定する。
第１抗体および第２抗体の産生に抗原として用
いるアイソザイムすなわちCK−MMおよびCK−
BBは、適当な体液たとえば血清または臓器もし
くは組織たとえび心筋、骨格筋、骨髄、またその
他このアイソザイムの存在が知られている他の任
意の臓器組織から得ることができる。これらのア
イソザイムの好ましい原料は動物骨格筋および脳
である。
上述のアイソザイムを抗体産生に使用する前に
精製することは非特異的な抗体の存在を低下させ
るためにとくに重要である。アイソザイムの精製
は本技術分野においてこの目的によく用いられる
常法を利用できる。たとえばアルコール分別化、
陰イオン交換クロマトグラフイー等である。
抗体の産生に使用するアイソザイムの純度、な
らびに得られた抗体の特異性は本技術分野で近年
認められている方法たとえば免疫拡散または電気
泳動法で実施できる。アイソザイムの純度の測定
に好ましい方法はアクリルアミドゲル電気泳動で
ある。
純粋なCK−MMおよびCK−BBは各種動物に
第１抗体または第２抗体を産生させるのに使用で
きる。動物はとくに脊部動物で、たとえばブタ、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、サル、ウサ
ギ、鳥類、モルモツト、ラツト等である。とくに
ウサギ、ヒツジ、ヤギのような哺乳類が好まし
い。
第２抗体または沈殿抗血清は上述の動物種に抗
原として第１抗体を用いて得ることができる。し
かしながら第１抗体と第２抗体は別の動物種に産
生させることが重要である。これは第２抗体が試
験サンプル中で第１抗体に特異性を示すためであ
る。第２抗体は第１抗体を産生させた動物種のγ
−グロブリン（IgG）に対する抗体である。
本発明の実施態様として、第２抗体を不溶性支
持体に付着させて不溶化することもできる。適当
な支持体としては水不溶性の有機重合物質たとえ
ばセルロースまたは他のポリサツカライド、ビニ
ル付加重合体もしくは縮合重合体または重合性の
水溶性無機物質たとえばガラスもしくはシリコン
樹脂がある。一方、第２抗体は固体支持体たとえ
ばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリフルオル
エチレンまたはポリビニリデンフルオライドの表
面に吸着させてもよい。第２抗体を固体支持体に
付着させる方法にはとくに限定はなく、(1)可溶性
第２抗体の不溶性重合体への共重結合的カツプリ
ング、たとえば不溶化剤との反応、(3)第２抗体粒
子のゲルポリマーたとえば架橋ポリアクリルアミ
ドの細孔部への物理的捕集、または(4)不溶性ポリ
マー物質への物理的吸着などを挙げることができ
る。固体支持体を用いる場合、好ましい態様で
は、米国特許第3843443号に開示されているよう
な公知の一般方法を用いて活性化ポリビニリデン
フルオライド（Kynar）上に第２抗体を吸着させ
る。
第３抗体は第１抗体を得た動物種以外の上述の
任意の動物に産生させることができる。第１抗体
の好ましい起源はウサギであり、第２抗体はヤギ
であり、第３抗体はヒツジである。アイソザイム
CK−MMおよびCK−BBに対する抗体の産生は
任意の公知常法で実施できる。
第３抗体は定量のために、任意の本技術分野で
用いられる標識によつてラベルする。たとえば酵
素、化学ルミネツセンス、螢光、または放射同位
元素である。好ましい標識は放射性同位元素で放
射定量法が使用できる。本技術分野で認められて
いる任意の適当な放射同位元素を使用できる。好
ましい放射同位元素はヨウ素−125であり、第３
抗体の標識には本技術分野で認められている任意
の方法を用いることができる。
本発明の放射性免疫複合体がもつ放射活性を放
射定量法で測定し、適当な標準曲線で比較すると
試験サンプル中のCK−MB量に比例した値が得
られる。標準曲線は常法により、既知濃度の一連
の希釈系列でCK−MBを含むサンプルを放射定
量法で定量する、得られた各サンプルの放射活性
をCK−MBの濃度に対してプロツトすると曲線
が得られる。この曲線は未知サンプル中の濃度を
測定する時に対照となる。
次に本発明を実施例により説明するが、これは
本発明を単に例示するものであつて、本発明の範
囲、精神を限定するものではない。
例 CKアイソザイムの精製 CKアイソザイムはElaine Carlson、Robert
Roberts and Burton E.Sobel：J.Molecular
and Cellular Cardiology８、159−167（1976）の
方法にしたがつて精製した。
例 抗体産生 ウサギを１週0.5mgの純粋CK−MMまたは１mg
のCK−BBで免疫処置した。イムノゲンは完全
フロインドアジユバンドに乳化し、腋窩の２個所
に皮下注射した。ウサギは１月毎にブリーデイン
グした。
ヤギまたはヒツジは２mgの純粋CK−MMまた
はCK−BBにより１週のベースで免疫処置した。
イムノゲンは完全フロインドアジユバンドに乳化
し、腋窩に皮下注射した。ヤギまたはヒツジは２
週間毎にブリーデイングした。
例 抗体精製 抗体を親和性クロマトグラフイーで精製するた
めに、CK−MMまたはCK−BBをCNBr−活性
化Sepharose4Bゲルにカツプリングさせた。
Sepharose4Bへのカツプリングに用いた材料は
次のとおりである。
１ CNBr活性化Sepharose4B（Pharmacia） ２ 精製CK−BBまたはCK−MM、約５mg ３ 10-3M−HCl ４ 0.1M−NaHCO3緩衝液（0.5N−Nacl含有） ５ 0.1M−NaHCO3中1Mエタノールアミン緩衝
液（0.5M−NaCl含有、PH8.0） ６ 0.1M酢酸緩衝液（1M−NaCl含有、PH8.0） ７ 0.1Mホウ酸緩衝液（1M−NaCl含有、PH8.0） ８ 0.1M PBS（0.1％NaN3含有、PH7.2） ９ Fisherロトラツク 10 Sorval RC−３冷凍遠心機 11 比色計 12 Amicon限外濾過セル 13 Lowryタンパク定量試薬 Sepharose4Bゲルへのカツプリング操作 １ CNBr活性化Sepharose4Bゲル0.5ｇを10-3M
HCl200ml中に15分間置く。ゲルを焼成ガラス
濾斗に移し、約15分以上さらに200mlのHClで
洗浄した。
２ 精製酵素（５ml中約５mg）をNaHCO3緩衝
液に対して４℃で３時間透析する。緩衝液は数
回変える。
３ 試験管にゲルとアイソザイム溶液をとり、栓
をしてロトラツク上、４℃で一夜上下にゆつく
り転した。
４ 結合しなかつた物質を20mlのNaHCO3緩衝
液で３回洗い流した。各洗浄ごとに５分間、
1200×ｇで遠心分離した。上澄液のOD280nｍ
を測定した。OD280nｍ0.5以上の洗液を合し、
分析用に残した。
５ 1Mエタノールアミン溶液10mlをゲルととも
に試験管にとり、４℃で3.5時間上下に回転し
て残つた活性基を反応させた。
６ ３回洗浄サイクルを用いて非共有結合的に吸
着されたタンパクを除去した。各洗浄は酢酸緩
衝液（PH4.0）20mlにより行つた。各洗液を
1200×ｇで５分間遠心し、上澄を捨てた。つい
でホウ酸緩衝液（PH8.0）１回20mlで洗浄した。
７ ゲルをPBS20mlで２回洗浄し、得られた上
澄液を捨てた。アイソザイムがカツプリングし
たSepharose4BをPBS中４℃に保存した。
８ 工程２の上澄液をはじめの容量に濃縮し、カ
ツプリングの効率を調べるためLowry法でタ
ンパクを定量した。
親和性クロマトグラフイーによる抗血清精製用
材料 １ CK−BBまたはCK−MM Sepharose4Bゲ
ル ２ 抗−CK−BBまたはCK−MM血清 ３ Fisherロトラツク ４ Sorvall RC−３冷凍遠心機 ５ 3.0Mアンモニウムチオシアネート ６ 脱イオン水 ７ 0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.5） 親和性クロマトグラフイーによる抗血清精製操
作 １ 試験管中0.5ｇのCK−BBまたはCK−MM−
Sepharose4Bに抗血清２〜５mlを加えた。混合
物をロトラツク上、室温で１時間上下に回転し
た。
２ 試験管を1200×ｇで５分間遠心分離した。上
澄を除去して、未反応のタンパクの分析用に保
存した。試験管に残つたSepharose4Bペレツト
を傾瀉した上澄のOD280nｍが0.05以下になるま
でPBSで洗浄した。
３ Sepharoseを含む試験管にアンモニウムチオ
シアナートを最終濃度が2.5Mになるように加
えた。得られた混合物を室温で15分間上下に回
転した。試験管を1200×ｇで遠心分離した。上
澄を直ちにとり、1.5時間脱イオン水に対して
透析した。親和性精製した抗体を長時間（約48
時間）リン酸緩衝液に対して４℃で透析し、残
つたチオシアネートを除去した。
４ 透析後、親和性精製した抗体を限外濾過では
じめの容量に濃縮した。タンパク濃度を
Lowry法で定量し、抗体活性は精製CK−MM
またはCK−BBの一定量に対する結合能で測
定した。
例 親和性精製抗体のヨウ素化用材料 １ 抗−（CK−BB）または抗−（CK−MM）
（タンパク濃度約１mg／ml） ２ Na 125I（Amersham） ３ クロラミンＴ（0.05Mリン酸ナトリウム−PH
7.5−１ml中５mg） ４ メタ重亜硫酸ナトリウム（0.05Mリン酸ナト
リウム−PH7.5−１ml中10mg） ５ ５％ウシ血清アルブミン（BSA）溶液
（ｗ／ｖ脱イオン水） ６ 0.3ml反応バイアル ７ １×30cmカラムSephadex Ｇ−100（0.15M−
NaClおよび0.02％NaN3含有0.1M−Tris−
HCl、PH7.5で平衡化） 親和性精製抗体のヨウ素化操作 １ 反応バイアルに抗体50μｇ、 125I 5μ、お
よびクロラミン−T5μを順次加えた。バイア
ルを60秒間撹拌し、ついでメタ重亜硫酸ナトリ
ウム5μを加えた。バイアルをさらに30秒間
撹拌した。
２ ５％BSA125μを加え、バイアルを再び撹
拌した。
３ 反応混合物をSephadexカラムに適用した。
カラムをTris緩衝液により流速約20ml／時で
溶出した。計30個の1.5mlフラクシヨンを集め
た。各フラクシヨンから20μをとりγ−シン
チレーシヨンカウンターでカウントした。クロ
マトグラフの最初のピークに相当するフラクシ
ヨンをプールし、４℃で保存した。
例 CK−MB標品の製造 １ ヒト心臓組織からCarlsonらの方法にしたが
つてCK−MBを精製した。精製CK−MBは
0.05M Tris−HCl緩衝液、PH7.5中、４℃、濃
度30mg／ml以上で保存した。
２ 以下の濃度に正常ヤギ血清で希釈してCK−
MB標品を調整した。14nｇ／ml、25nｇ／ml、
70nｇ／ml、140nｇ／ml、280nｇ／ml、700n
ｇ／ml。CK−MB標品は凍結乾燥すると長期
間保存できる。
例 放射定量操作 Ａ 標識ヒツジ抗−（CK−MM）を用いる方法 １ 試験管にサンプル200μを加える（CK−
MB標品または臨床血清サンプル） ２ ウサギ抗−（CK−BB）血清50μを加え
る ３ 試験管を撹拌し、室温で５分間インキユベ
ートする ４ ヤギ抗−ウサギIgG200μを加える。試験
管を混合し、室温で５分間インキユベートす
る ５ 生理食塩水５mlを試験管に加える。
６ 試験管を遠心分離し、上澄を傾瀉する。
７ 125I−ヒツジ抗（CK−MM）（約
100000CPM）200μをペレツトに加える。
振盪しながら室温で30分間インキユベートす
る。
８ 試験管に生理食塩水５mlを加える。
９ 遠心分離してペレツトを得る。
10 上澄を傾瀉する。
11 ペレツトをガンマシンチレーシヨンカウン
ターでカウントする。
第１表はCK−MBを検知したCK放射定量によ
り得られた標準曲線の値を示した。例および
(A)に述べたようにして反応を行つたものであり、
試験サンプル中のCK−MBの定量に本発明の方
法が有用であることを示している。
第 １ 表 CK−MB ｎｇ／ml CPM 0 4740 28 5281 70 6239 140 8305 280 11592 700 21412 Ｂ 標識ヒツジ抗−（CK−BB）を用いる操作 １ 試験管にサンプル（CK−Ｍ標品または臨
床血清サンプル）500μを加える ２ ウサギ抗−（CK−MM）と 125I−ヒツジ
抗−（CK−BB）抗血清（200000CPM）より
なる抗体混合物を100μを加え、試験管を
撹拌する ３ 室温で１時間インキユベートする ４ ヤギ抗−ウサギIgG200μを加える ５ 試験管を撹拌し、室温で15分間インキユベ
ートする ６ 生理食塩水4.0mlを加える。
７ 遠心分離してペレツトを得る ８ 上澄を傾瀉する ９ ペレツトをガンマシンチレーシヨンカウン
ターでカウントする 第２表はCK−MBを検知するCK放射定量に
より得られた標準曲線の値を示した。データは
例および(B)に述べたようにして行つた反応
から得られたもので、試験サンプル中のCK−
MBの定量に本発明の方法が有用であることを
示している。
第 ２ 表 CK−MB ｎｇ／ml CPM 0 6912 28 11840 70 18580 140 26375 280 38840 700 58456

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a)(i)第１動物種に産生した第１抗体で、サン
    プル中のクレアチンキナーゼのサブユニツトＢま
    たはＭの一方に選択的に免疫反応的結合が可能な
    第１抗体、(ii)第２動物種に産生した第２抗体で、
    第１抗体と免疫沈降素として選択的に免疫反応的
    結合が可能な第２抗体、および(iii)第１動物種以外
    の動物種に産生し、測定可能な標識でラベルされ
    た第３抗体で、ＭまたはＢサブユニツトの他方と
    選択的に免疫反応的結合が可能な第３抗体、をサ
    ンプルとインキユベートして、ラベルされた第３
    抗体−クレアチンキナーゼ−MBアイソザイム−
    第１抗体−第２抗体およびクレアチンキナーゼア
    イソザイム−第１抗体−第２抗体を含む免疫複合
    体混合物を沈降物として得、(b)この免疫複合体を
    含む沈降物を単離し、(c)沈降物中の標識量を測定
    し、(d)標識量の測定値を標準曲線と比較して体液
    サンプル中のクレアチンキナーゼ−MBアイソザ
    イムの量を決定することを特徴とするサブユニツ
    トＢもしくはＭまたは両者を有するクレアチンキ
    ナーゼ含有体液サンプル中のクレアチンキナーゼ
    −MBアイソザイム量の定量方法。 ２ 第３抗体は放射活性標識を有する特許請求の
    範囲第１項記載の方法。 ３ 放射活性標識はヨウ素−125である特許請求
    の範囲第２項記載の方法。 ４ 体液サンプルは血清である特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 ５ 血清は心筋梗塞が疑われる患者から採取する
    特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 第１、第２および第３抗体はそれぞれ別の動
    物種から得る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７ 第１抗体はウサギ抗−（CK−MM）、第２抗
    体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−BB）である特許請求の範囲第６項記載の
    方法。 ８ 第１抗体はウサギ抗−（CK−BB）、第２抗
    体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−MM）である特許請求の範囲第６項記載の
    方法。 ９ 第２抗体は不溶性固体支持体に付着させる特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 １０ (a)(i)第１動物種に産生した第１抗体でサン
    プル中のクレアチンキナーゼのサブユニツトＢに
    選択的に免疫反応的結合が可能な第１抗体、およ
    び(ii)第２動物種に産生した第２抗体で第１抗体と
    免疫沈降素として選択的に免疫反応的結合が可能
    な第２抗体をサンプルとインキユベートして、ク
    レアチンキナーゼ−MBアイソザイム−第１抗体
    −第２抗体およびクレアチンキナーゼ−BBアイ
    ソザイム−第１抗体−第２抗体を含む混合物を免
    疫沈降素として得、(b)混合物から免疫沈降素を単
    離し、(c)単離された免疫沈降素を、第１動物種以
    外の動物種に産生し、測定可能な標識でラベルさ
    れた第３抗体でクレアチンキナーゼ−MBアイソ
    ザイムのＭサブユニツトと選択的に免疫反応的結
    合が可能な第３抗体とインキユベートして標識第
    ３抗体−クレアチンキナーゼ−MBアイソザイム
    −第１抗体−第２抗体およびクレアチンキナーゼ
    −BBアイソザイム−第１抗体−第２抗体を含む
    免疫複合体混合物を沈降物として得、(d)この免疫
    複合体を含む沈降物を単離し、(e)沈降物中の標識
    量を測定し、(f)標識量の測定値を標準曲線と比較
    して体液サンプル中のクレアチンキナーゼ−MB
    アイソザイムの量を決定することを特徴とするサ
    ブユニツトＢもしくはＭまたは両者を有するクレ
    アチンキナーゼ含有体液サンプル中のクレアチン
    キナーゼ−MBアイソザイム量の定量方法。 １１ 第３抗体は放射活性標識を有する特許請求
    の範囲第１０項記載の方法。 １２ 放射活性標識はヨウ素−125である特許請
    求の範囲第１１項記載の方法。 １３ 体液サンプルは血清である特許請求の範囲
    第１０項記載の方法。 １４ 血清は心筋梗塞が疑われる患者から採取す
    る特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５ 第１、第２および第３抗体はそれぞれ別の
    動物種から得る特許請求の範囲第１０項記載の方
    法。 １６ 第１抗体はウサギ抗−（CK−BB）、第２
    抗体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−MM）である特許請求の範囲第１５項記載
    の方法。 １７ 第２抗体は不溶性固体支持体に付着させる
    特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １８ (a)(i)第１動物種に産生した第１抗体で、サ
    ンプル中のクレアチンキナーゼのサブユニツトＭ
    と選択的に免疫反応的結合が可能な第１抗体、お
    よび(ii)第１種動物以外の動物種に産生し、測定可
    能な標識でラベルされた第３抗体でサンプル中の
    クレアチンキナーゼのサブユニツトＢと選択的に
    免疫反応的結合が可能な第３抗体をサンプルとイ
    ンキユベートして、標識第３抗体−クレアチンキ
    ナーゼ−MBアイソザイム−第１抗体、標識第３
    抗体−クレアチンキナーゼ−BBアイソザイムお
    よびクレアチンキナーゼ−MMアイソザイム−第
    １抗体を含む免疫複合体混合物を得、(b)この混合
    物を、第２動物種に産生した第２抗体で第１抗体
    と免疫沈降素として選択的に免疫反応的結合が可
    能な第２抗体とインキユベートして、標識第３抗
    体−クレアチンキナーゼ−MBアイソザイム−第
    １抗体−第２抗体およびクレアチンキナーゼ−
    MMアイソザイム−第１抗体−第２抗体を含む免
    疫複合体の混合物を沈降物として得、(c)免疫複合
    体を含む沈降物を単離し、(d)沈降物中の標識量を
    測定し、(e)標識量の測定値を標準曲線と比較して
    体液サンプル中のクレアチンキナーゼ−MBアイ
    ソザイムの量を決定することを特徴とするサブユ
    ニツトＢもしくはＭまたは両者を有するクレアチ
    ンキナーゼ含有体液サンプル中のクレアチンキナ
    ーゼ−MBアイソザイム量の定量方法。 １９ 第３抗体は放射活性標識を有する特許請求
    の範囲第１８項記載の方法。 ２０ 放射活性標識はヨウ素−125である特許請
    求の範囲第１９項記載の方法。 ２１ 体液サンプルは血清である特許請求の範囲
    第１８項記載の方法。 ２２ 血清は心筋梗塞が疑われる患者から採取す
    る特許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３ 第１抗体、第２抗体および第３抗体はそれ
    ぞれ別の動物種から得る特許請求の範囲第１８項
    記載の方法。 ２４ 第１抗体はウサギ抗−（CK−MM）、第２
    抗体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−BB）である特許請求の範囲第２３項記載
    の方法。 ２５ 第２抗体は不溶性固体支持体に付着させる
    特許請求の範囲第１８項記載の方法。 ２６ 第１動物種に産生した第１抗体でサンプル
    中のクレアチンキナーゼのサブユニツトＢまたは
    Ｍの一方に選択的に免疫反応的に結合が可能な第
    １抗体、第２動物種に産生した第２抗体で第１抗
    体と選択的に免疫反応的に結合が可能な第２抗
    体、第１動物種以外の動物種に産生し、測定可能
    な標識でラベルされた第３抗体でＭまたはＢサブ
    ユニツトの他方と選択的に免疫反応的結合が可能
    な第３抗体からなることを特徴とする組成物で、
    サブユニツトＢもしくはＭまたは両者を有するク
    レアチンキナーゼ含有体液中のクレアチンキナー
    ゼ−MBアイソザイム量測定用組成物。 ２７ 第３抗体は放射活性標識抗体である特許請
    求の範囲第２６項記載の組成物。 ２８ 放射活性標識はヨウ素−125である特許請
    求の範囲第２７項記載の組成物。 ２９ 体液サンプルは血清である特許請求の範囲
    第２６項記載の組成物。 ３０ 第１抗体、第２抗体、第３抗体はそれぞれ
    別の動物種から得る特許請求の範囲第２６項記載
    の組成物。 ３１ 第１抗体はウサギ抗−（CK−BB）、第２
    抗体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−MM）である特許請求の範囲第３０項記載
    の組成物。 ３２ 第１抗体はウサギ抗−（CK−MM）、第２
    抗体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−BB）である特許請求の範囲第３０項記載
    の組成物。 ３３ 第２抗体は不溶性支持体に付着されている
    特許請求の範囲第２６項記載の組成物。 ３４ (a)第１動物種に産生した第１抗体でクレア
    チンキナーゼのサブユニツトＢまたはＭの一方に
    選択的に免疫反応的結合が可能な第１抗体の容
    器、(b)第２動物種に産生した第２抗体で第１抗体
    と選択的に免疫反応的結合が可能な第２抗体の容
    器、および(c)第１動物種以外の動物種に産生し、
    測定可能な標識でラベルされた第３抗体で、第１
    抗体によつて結合されるＭまたはＢサブユニツト
    の他方と選択的に免疫反応的結合が可能な第３抗
    体の容器からなる試験キツトであつて、クレアチ
    ンキナーゼ−MBアイソザイム定量用診断試験キ
    ツト。 ３５ 第３抗体は放射活性標識を有する特許請求
    の範囲第３４項記載の試験キツト。 ３６ 放射活性標識はヨウ素−125である特許請
    求の範囲第３５項記載の試験キツト。 ３７ 第１抗体、第２抗体、第３抗体はそれぞれ
    別の動物種から得る特許請求の範囲第３４項記載
    の試験キツト。 ３８ 第１抗体はウサギ抗−（CK−MM）、第２
    抗体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−BB）である特許請求の範囲第３７項記載
    の試験キツト。 ３９ 第１抗体はウサギ抗−（CK−BB）、第２
    抗体はヤギ抗ウサギIgG、第３抗体はヒツジ抗−
    （CK−MM）である特許請求の範囲第３７項記載
    の試験キツト。 ４０ 第２抗体は不溶性固体支持体に付着させる
    特許請求の範囲第３４項記載の試験キツト。 ４１ 標準曲線作成用の標品が加わつた特許請求
    の範囲第３４項記載の試験キツト。 ４２ 第１動物種に産生した第１抗体でクレアチ
    ンキナーゼのサブユニツトＢまたはＭの一方に選
    択的に免疫反応的結合が可能な第１抗体、および
    第１動物種以外の動物種に産生し、測定可能な標
    識でラベルされた第３抗体で、第１抗体によつて
    結合されるＭまたはＢサブユニツトの他方と選択
    的に免疫反応的結合が可能な第３抗体の容器、な
    らびに第２動物種に産生した第２抗体で第１抗体
    と選択的に免疫反応的結合が可能な第２抗体の容
    器、からなる試験キツトであつて、クレアチンキ
    ナーゼ−MBアイソザイム定量用診断試験キツ
    ト。
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