JPH06217778A - ヒトｍｋ遺伝子及び蛋白質の配列 - Google Patents
ヒトｍｋ遺伝子及び蛋白質の配列Info
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- JPH06217778A JPH06217778A JP3228656A JP22865691A JPH06217778A JP H06217778 A JPH06217778 A JP H06217778A JP 3228656 A JP3228656 A JP 3228656A JP 22865691 A JP22865691 A JP 22865691A JP H06217778 A JPH06217778 A JP H06217778A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明はヒトＭＫ蛋白質のための新規ＤＮＡ
及びアミノ酸配列に関する。ＭＫ蛋白質の製造法におい
て有用な発現ベクタ−及び宿主細胞についても記載す
る。 【効果】 本発明における配列決定により神経細胞の成
長、維持及び修復に有用な細胞を構築することができ
る。
及びアミノ酸配列に関する。ＭＫ蛋白質の製造法におい
て有用な発現ベクタ−及び宿主細胞についても記載す
る。 【効果】 本発明における配列決定により神経細胞の成
長、維持及び修復に有用な細胞を構築することができ
る。
Description
【０００１】本発明はヒトヘパリン結合神経栄養因子
（ＨＢＮＦ）と実質的に相同な蛋白質のための新規ＤＮ
Ａ配列に関する。問題の配列は以前に記載されたＭＫ１
と表されるねずみ蛋白質とも高度の相同性を示す。これ
らの既知の蛋白質とのＭＫの相同性は、神経細胞成長及
び分化の誘導、ならびに神経細胞の維持及び修復におい
て類似の有用性かあることを示唆している。さらに奇形
がん腫細胞及び胚の発生においてＭＫ遺伝子が存在する
ことは分化誘導因子として、ならびに組織維持又は修復
因子としての広い有用性を示す。
（ＨＢＮＦ）と実質的に相同な蛋白質のための新規ＤＮ
Ａ配列に関する。問題の配列は以前に記載されたＭＫ１
と表されるねずみ蛋白質とも高度の相同性を示す。これ
らの既知の蛋白質とのＭＫの相同性は、神経細胞成長及
び分化の誘導、ならびに神経細胞の維持及び修復におい
て類似の有用性かあることを示唆している。さらに奇形
がん腫細胞及び胚の発生においてＭＫ遺伝子が存在する
ことは分化誘導因子として、ならびに組織維持又は修復
因子としての広い有用性を示す。
【０００２】本発明の蛋白質は通常ヒトの脳で製造され
るが、明らかにＨＢＮＦとは発生的に異なる時期に製造
される。ヒトのＭＫ蛋白質は発表されているマウスＭＫ
配列と約８５％の相同性を示す。現在ＭＫは、多数の異
なる種に存在する保存性の高い遺伝子ファミリ−の一員
であることが明らかになったが、ヒトにおいてそのよう
な蛋白質の存在は以前認められていなかった。
るが、明らかにＨＢＮＦとは発生的に異なる時期に製造
される。ヒトのＭＫ蛋白質は発表されているマウスＭＫ
配列と約８５％の相同性を示す。現在ＭＫは、多数の異
なる種に存在する保存性の高い遺伝子ファミリ−の一員
であることが明らかになったが、ヒトにおいてそのよう
な蛋白質の存在は以前認められていなかった。
【０００３】ヒトのＭＫ蛋白質をコ−ドする遺伝子はヒ
トの新生児脳幹ＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリから
単離される。遺伝子は配列を決定され、クロ−ニングさ
れている；これは３６６−ヌクレオチド配列であり、蛋
白質が１２１アミノ酸を有することを示している。
トの新生児脳幹ＲＮＡから得たｃＤＮＡライブラリから
単離される。遺伝子は配列を決定され、クロ−ニングさ
れている；これは３６６−ヌクレオチド配列であり、蛋
白質が１２１アミノ酸を有することを示している。
【０００４】
【発明の背景】Ｋａｄｏｍａｔｓｕ等（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５１：１３
１２−１３１８，１９８８）はマウス細胞からｃＤＮＡ
を単離し、配列を決定し、それをＭＫ１と呼んだ。対応
するｍＲＮＡはマウスの胚の発生の初期段階に存在する
が後期段階には存在しないと言われている。ＭＫ１蛋白
質は細胞の分化、特にＤＮＡ結合蛋白質調節遺伝子発現
の制御と関連していると示唆されている。他の既知の蛋
白質配列との関連性は見いだされていない。その後の文
献（Ｔｏｍｏｍｕｒａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）は胚性がん
腫細胞分化の初期段階におけるＭＫ遺伝子の発現を報告
しており、明確に異なる３種類のｃＤＮＡクロ−ンの存
在を示し、ＭＫ１，ＭＫ２及びＭＫ３と呼んだ。Ｋａｄ
ｏｍａｔｓｕ等（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６
０７−６１６，１９９０）はＭＫが多種類の細胞の分化
において基本的な役割を演じること、及び上皮組織の生
成及び中胚葉の改造に含まれ得ることを示唆した。
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５１：１３
１２−１３１８，１９８８）はマウス細胞からｃＤＮＡ
を単離し、配列を決定し、それをＭＫ１と呼んだ。対応
するｍＲＮＡはマウスの胚の発生の初期段階に存在する
が後期段階には存在しないと言われている。ＭＫ１蛋白
質は細胞の分化、特にＤＮＡ結合蛋白質調節遺伝子発現
の制御と関連していると示唆されている。他の既知の蛋
白質配列との関連性は見いだされていない。その後の文
献（Ｔｏｍｏｍｕｒａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６５：１０７６５−１０７７０，１９９０）は胚性がん
腫細胞分化の初期段階におけるＭＫ遺伝子の発現を報告
しており、明確に異なる３種類のｃＤＮＡクロ−ンの存
在を示し、ＭＫ１，ＭＫ２及びＭＫ３と呼んだ。Ｋａｄ
ｏｍａｔｓｕ等（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：６
０７−６１６，１９９０）はＭＫが多種類の細胞の分化
において基本的な役割を演じること、及び上皮組織の生
成及び中胚葉の改造に含まれ得ることを示唆した。
【０００５】ここでマウスＭＫ１配列はヘパリン結合神
経栄養因子（ＨＢＮＦｓ）として知られる蛋白質の群に
おいて高度の相同性を有することが見いだされた；後者
の蛋白質をコードするヌクレオチド配列は出願人等の同
時係属、及び同時出願の出願番号０７／５６８，５７４
に開示されている。ＨＢＮＦ蛋白質はＥＰ ３２５０７
６で最初にＨＢＢＭＳとして開示された。ここで予期に
反してマウスＭＫ配列に対応する遺伝子がヒトの脳でも
見いだされた。本発明はヒトの蛋白質をコードする遺伝
子の全配列、ならびに成熟蛋白質の予想アミノ酸配列、
クローニング及び発現ベクター、及び遺伝子を発現し、
純粋なＭＫ蛋白質を製造することができる宿主細胞を提
供する。ＭＫ蛋白質及びＨＢＮＦの間の強い相同性を考
慮すると、これらは発生的な意味を持つ、遺伝子及び蛋
白質のファミリーを構成するようである。
経栄養因子（ＨＢＮＦｓ）として知られる蛋白質の群に
おいて高度の相同性を有することが見いだされた；後者
の蛋白質をコードするヌクレオチド配列は出願人等の同
時係属、及び同時出願の出願番号０７／５６８，５７４
に開示されている。ＨＢＮＦ蛋白質はＥＰ ３２５０７
６で最初にＨＢＢＭＳとして開示された。ここで予期に
反してマウスＭＫ配列に対応する遺伝子がヒトの脳でも
見いだされた。本発明はヒトの蛋白質をコードする遺伝
子の全配列、ならびに成熟蛋白質の予想アミノ酸配列、
クローニング及び発現ベクター、及び遺伝子を発現し、
純粋なＭＫ蛋白質を製造することができる宿主細胞を提
供する。ＭＫ蛋白質及びＨＢＮＦの間の強い相同性を考
慮すると、これらは発生的な意味を持つ、遺伝子及び蛋
白質のファミリーを構成するようである。
【０００６】１連のポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の
分離、及びヒト新生児脳幹から誘導したｃＤＮＡライブ
ラリのスクリ−ニングにより、ヒトＭＫをコ−ドするＤ
ＮＡ配列をクロ−ニングする。ＰＣＲ増幅のためのオリ
ゴヌクレオチドの設計のための出発点としてヒトＨＢＮ
Ｆ配列を使用する；この配列を図２に示す。ＨＢＮＦ、
及び発表されたマウス ＭＫ１ ＤＮＡ配列間に最も保
存されている領域に特異的なヌクレオチドを設計する。
このオリゴヌクレオチドをマウスゲノムＤＮＡ上のポリ
メラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマ−として
使用する。予想された１５０の塩基対生成物を適したベ
クタ−にクロ−ニングし、配列を決定する。このクロ−
ンを、ヒトＭＫ同等遺伝子の同定のためのヒト脳ｃＤＮ
Ａライブラリのスクリ−ニングのプロ−ブとして使用す
る。単一のクロ−ンを単離し、サブクロ−ニングし、配
列を決定する。これらのクロ−ンのひとつの配列を図１
に示し、１１００と見積もられる成人ＭＫ ｍＲＮＡの
ヌクレオチドの７９０ヌクレオチドと説明する。続いて
ヌクレオチド配列をより短い別のＭＫクロ−ンで確認
し、最初のクロ−ンの異なる重複フラグメントを含むこ
とがわかる。ＭＫ ｃＤＮＡの配列は２個のポリアデニ
ル化シグナル、及び１個のポリＡ末端を含む（図１）。
最初の単離クロ−ンは読み取り枠を持ち、コ−ド領域は
ヌクレオチド２２で始まり１４３残基蛋白質を定義す
る。Ｎ−末端配列は非常に嫌水性で、シグナルペプチド
を特徴とする（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８５）。Ｖｏｎ
Ｈｅｉｊｎｅにより示されたシグナルペプチドの構造に
関する基準（同；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：
４６８３−４６９０，１９８６）、及びマウスＭＫとヒ
トＨＢＮＦ配列の比較を基にして、シグナルペプチドの
分裂はアミノ酸残基２２（Ａｌａ）及び２３（Ｌｙｓ）
の間で起こり、１２１残基の長さの成熟ＭＫポリペプチ
ドが生ずると仮定する。
分離、及びヒト新生児脳幹から誘導したｃＤＮＡライブ
ラリのスクリ−ニングにより、ヒトＭＫをコ−ドするＤ
ＮＡ配列をクロ−ニングする。ＰＣＲ増幅のためのオリ
ゴヌクレオチドの設計のための出発点としてヒトＨＢＮ
Ｆ配列を使用する；この配列を図２に示す。ＨＢＮＦ、
及び発表されたマウス ＭＫ１ ＤＮＡ配列間に最も保
存されている領域に特異的なヌクレオチドを設計する。
このオリゴヌクレオチドをマウスゲノムＤＮＡ上のポリ
メラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマ−として
使用する。予想された１５０の塩基対生成物を適したベ
クタ−にクロ−ニングし、配列を決定する。このクロ−
ンを、ヒトＭＫ同等遺伝子の同定のためのヒト脳ｃＤＮ
Ａライブラリのスクリ−ニングのプロ−ブとして使用す
る。単一のクロ−ンを単離し、サブクロ−ニングし、配
列を決定する。これらのクロ−ンのひとつの配列を図１
に示し、１１００と見積もられる成人ＭＫ ｍＲＮＡの
ヌクレオチドの７９０ヌクレオチドと説明する。続いて
ヌクレオチド配列をより短い別のＭＫクロ−ンで確認
し、最初のクロ−ンの異なる重複フラグメントを含むこ
とがわかる。ＭＫ ｃＤＮＡの配列は２個のポリアデニ
ル化シグナル、及び１個のポリＡ末端を含む（図１）。
最初の単離クロ−ンは読み取り枠を持ち、コ−ド領域は
ヌクレオチド２２で始まり１４３残基蛋白質を定義す
る。Ｎ−末端配列は非常に嫌水性で、シグナルペプチド
を特徴とする（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１８４：９９−１０５，１９８５）。Ｖｏｎ
Ｈｅｉｊｎｅにより示されたシグナルペプチドの構造に
関する基準（同；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：
４６８３−４６９０，１９８６）、及びマウスＭＫとヒ
トＨＢＮＦ配列の比較を基にして、シグナルペプチドの
分裂はアミノ酸残基２２（Ａｌａ）及び２３（Ｌｙｓ）
の間で起こり、１２１残基の長さの成熟ＭＫポリペプチ
ドが生ずると仮定する。
【０００７】図３に示す通り、ヒトＭＫ誘導アミノ酸配
列、及びマウスＭＫ蛋白質配列を比較するとその相違は
わずか約１５％である。これらの変化のほとんどは保存
的である。図２に示されたＭＫとＨＢＮＦの間の相同性
は、保存されたアミノ酸変化が含まれると５０％の相同
性が６３％に増加することを示す。両蛋白質に存在する
システインは完全に並んでおり、類似構造を示唆してい
る。
列、及びマウスＭＫ蛋白質配列を比較するとその相違は
わずか約１５％である。これらの変化のほとんどは保存
的である。図２に示されたＭＫとＨＢＮＦの間の相同性
は、保存されたアミノ酸変化が含まれると５０％の相同
性が６３％に増加することを示す。両蛋白質に存在する
システインは完全に並んでおり、類似構造を示唆してい
る。
【０００８】真核蛋白質に汚染されない成熟ＭＫ蛋白質
の供給源とするために、上記で単離したｃＤＮＡクロ−
ンをＰＣＲ増幅の鋳型として使用し、メチオニンコドン
を成熟蛋白質のＮ−末端リシン残基の５’に直接配置す
るようプライマ−を設計する。増幅生成物を発現ベクタ
−ｐＥＴ−３ａの修正型（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，１９９
０）にクロ−ニングし、得られたプラスミドｐＥＴＭＨ
２をＥ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２１ ＬｙｓＳに形質転換す
る。ＩＰＴＧ−誘導ｐＥＴＭＨ２を含む細菌の蛋白質抽
出物は約１６．５ｋＤａ移動した蛋白質主要バンドを示
す（図４，列２）。非誘導培養物（列１，ｐＥＴＭＨ２
−含有細菌）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの強度により
判断して、ずっと少量の蛋白質を含む。組み替えＭＫ蛋
白質を、ＩＰＴＧ−誘導細菌培養物からヘパリンアフィ
ニティ−クロマトグラフィ−（図４，列３）により精製
し、そのＮ−末端配列及びアミノ酸組成を確認する。
の供給源とするために、上記で単離したｃＤＮＡクロ−
ンをＰＣＲ増幅の鋳型として使用し、メチオニンコドン
を成熟蛋白質のＮ−末端リシン残基の５’に直接配置す
るようプライマ−を設計する。増幅生成物を発現ベクタ
−ｐＥＴ−３ａの修正型（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，１９９
０）にクロ−ニングし、得られたプラスミドｐＥＴＭＨ
２をＥ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２１ ＬｙｓＳに形質転換す
る。ＩＰＴＧ−誘導ｐＥＴＭＨ２を含む細菌の蛋白質抽
出物は約１６．５ｋＤａ移動した蛋白質主要バンドを示
す（図４，列２）。非誘導培養物（列１，ｐＥＴＭＨ２
−含有細菌）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドの強度により
判断して、ずっと少量の蛋白質を含む。組み替えＭＫ蛋
白質を、ＩＰＴＧ−誘導細菌培養物からヘパリンアフィ
ニティ−クロマトグラフィ−（図４，列３）により精製
し、そのＮ−末端配列及びアミノ酸組成を確認する。
【０００９】ヒト、及び発表されたマウスＭＫ ＤＮ
Ａ、ならびに誘導蛋白質配列の相同性は、ＨＢＮＦの類
似の進化的比較より保存性の程度が低い。ＨＢＮＦとの
相同性から推定した成熟ＭＫ蛋白質からの推定Ｎ−末端
を用いて、マウス配列中に３個のアミノ酸の欠失を含み
８６％のアミノ酸の同一性が観察される。ＨＢＮＦ及び
ＭＫは両方とも脳で発現するが、それらの時間的、及び
空間的調節は異なる。予備的に行ったｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリッド形成により、２つのメッセ−ジのための明確
に異なる発現のパタ−ンを示した。成体組織からのマウ
スＲＮＡのノザンハイブリッド形成分析は、脳が１６５
０−ヌクレオチドＨＢＮＦメッセ−ジを発現するだけで
あることを示す（図６）。これはＨＢＮＦ蛋白質が脳に
存在することを示したＨＢＮＦ蛋白質の発現の特徴に関
する以前の研究と一致する（ＥＰ３２６ ０７５，Ｒａ
ｕｖａｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．８：２９３３−２９４１，
１９８９）。最近、ＨＢＮＦ蛋白質が牛の子宮からも単
離された（Ｍｉｌｎｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６５：１０９６−１１０
３，１９８９）。これらの最初に実験によるとＭＫは試
験したどの成体組織中でも発現しない（図６）。しかし
その後の実験によると、ＭＫ ｍＲＮＡが成体の脳の二
領域、尾状核、及び脳幹で検出できる（図７）。胚のＲ
ＮＡの場合と比較して成体のＲＮＡにおいてこれらのバ
ンドを検出するのに非常に長時間の暴露が必要であるこ
とに基づき、ＭＫ ＲＮＡの成体における発現は最小で
あると思われる。
Ａ、ならびに誘導蛋白質配列の相同性は、ＨＢＮＦの類
似の進化的比較より保存性の程度が低い。ＨＢＮＦとの
相同性から推定した成熟ＭＫ蛋白質からの推定Ｎ−末端
を用いて、マウス配列中に３個のアミノ酸の欠失を含み
８６％のアミノ酸の同一性が観察される。ＨＢＮＦ及び
ＭＫは両方とも脳で発現するが、それらの時間的、及び
空間的調節は異なる。予備的に行ったｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリッド形成により、２つのメッセ−ジのための明確
に異なる発現のパタ−ンを示した。成体組織からのマウ
スＲＮＡのノザンハイブリッド形成分析は、脳が１６５
０−ヌクレオチドＨＢＮＦメッセ−ジを発現するだけで
あることを示す（図６）。これはＨＢＮＦ蛋白質が脳に
存在することを示したＨＢＮＦ蛋白質の発現の特徴に関
する以前の研究と一致する（ＥＰ３２６ ０７５，Ｒａ
ｕｖａｌａ，ＥＭＢＯ Ｊ．８：２９３３−２９４１，
１９８９）。最近、ＨＢＮＦ蛋白質が牛の子宮からも単
離された（Ｍｉｌｎｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６５：１０９６−１１０
３，１９８９）。これらの最初に実験によるとＭＫは試
験したどの成体組織中でも発現しない（図６）。しかし
その後の実験によると、ＭＫ ｍＲＮＡが成体の脳の二
領域、尾状核、及び脳幹で検出できる（図７）。胚のＲ
ＮＡの場合と比較して成体のＲＮＡにおいてこれらのバ
ンドを検出するのに非常に長時間の暴露が必要であるこ
とに基づき、ＭＫ ＲＮＡの成体における発現は最小で
あると思われる。
【００１０】両遺伝子の時間的発現を、種々の発生段階
のラットＲＮＡ全体を用いて、ノザンブロット分析によ
り評価する。ＨＢＮＦプロ−ブとのハイブリッド形成に
より、発生中を通じてメッセ−ジの量が徐々に増加し、
成体の脳で最高量となることが示された（図６ａ）。同
一ブロットのＭＫプロ−ブとのハイブリッド形成によ
り、１２−，１４−及び１６−日令の胚組織のみがメッ
セ−ジを含むことが示された。１２日令段階の胚におい
て、最も多くのＭＫメッセ−ジが存在すると思われる
（図６ｂ）。一般にこれらの結果はＫａｄｏｍａｔｓｕ
（同上）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成研究と一致
する。しかしＫａｄｏｍａｔｓｕの発見に反して我々は
腎臓組織でＭＫ ｍＲＮＡ発現を検出することはできな
かった。ラットの脳におけるＨＢＮＦ蛋白質の研究によ
り出生後７日の子供に最高量が生ずることが示された。
この量は５６日令の動物と比較すると１０倍である（Ｒ
ａｕｖａｌａ，同上）。
のラットＲＮＡ全体を用いて、ノザンブロット分析によ
り評価する。ＨＢＮＦプロ−ブとのハイブリッド形成に
より、発生中を通じてメッセ−ジの量が徐々に増加し、
成体の脳で最高量となることが示された（図６ａ）。同
一ブロットのＭＫプロ−ブとのハイブリッド形成によ
り、１２−，１４−及び１６−日令の胚組織のみがメッ
セ−ジを含むことが示された。１２日令段階の胚におい
て、最も多くのＭＫメッセ−ジが存在すると思われる
（図６ｂ）。一般にこれらの結果はＫａｄｏｍａｔｓｕ
（同上）のｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成研究と一致
する。しかしＫａｄｏｍａｔｓｕの発見に反して我々は
腎臓組織でＭＫ ｍＲＮＡ発現を検出することはできな
かった。ラットの脳におけるＨＢＮＦ蛋白質の研究によ
り出生後７日の子供に最高量が生ずることが示された。
この量は５６日令の動物と比較すると１０倍である（Ｒ
ａｕｖａｌａ，同上）。
【００１１】ヒトの胚性がん腫（ＥＣ）細胞系 ＮＴ２
／Ｄ１を、レチノイン酸（ＲＡ）濃度０．０１−１０μ
Ｍにて分化を誘導することができ、分化ＥＣ細胞の割合
は０．０１μＭのＲＡで５０％（Ｓｉｍｅｏｎｅ等，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４６：７６３−７６６，１９９０）か
ら、１及び１０μＭのＲＡで９９％以上（Ａｎｄｒｅｗ
ｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １０３：２８５−２９３，１
９８４）である。ＮＴ２／Ｄ１の分化の間のＭＫ及びＨ
ＢＮＦの発現を、０．０１−１０μＭの濃度で研究す
る。ＲＡへの暴露９日後、ＲＮＡ全体を細胞から抽出
し、ノザン分析により遺伝子発現に関して調べた。両遺
伝子の発現は類似パタ−ンに従った（図８）。ｍＲＮＡ
発現の程度は０．１−０．５μＭのＲＡ濃度の場合定常
基底量以内であり、０．１−０．５μＭのＲＡ濃度の間
に急速に増加し、１０μＭのＲＡ濃度まで及びこの濃度
でその量を維持した。ＲＮＡハイブリッド形成シグナル
を標準β−アクチンプロ−ブに規格化すると、最大増加
はＨＢＮＦの場合６倍、及びＭＫの場合１１倍と算出さ
れた（図８）。これらの結果は、マウスＥＣ細胞系、Ｈ
Ｍ−１のレチノイン酸誘導の間の観察結果に匹敵する
（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ等，同上）。この細胞系におい
て、ＭＫ遺伝子発現は上記基底量の８−１０倍と推定さ
れている。
／Ｄ１を、レチノイン酸（ＲＡ）濃度０．０１−１０μ
Ｍにて分化を誘導することができ、分化ＥＣ細胞の割合
は０．０１μＭのＲＡで５０％（Ｓｉｍｅｏｎｅ等，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４６：７６３−７６６，１９９０）か
ら、１及び１０μＭのＲＡで９９％以上（Ａｎｄｒｅｗ
ｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ． １０３：２８５−２９３，１
９８４）である。ＮＴ２／Ｄ１の分化の間のＭＫ及びＨ
ＢＮＦの発現を、０．０１−１０μＭの濃度で研究す
る。ＲＡへの暴露９日後、ＲＮＡ全体を細胞から抽出
し、ノザン分析により遺伝子発現に関して調べた。両遺
伝子の発現は類似パタ−ンに従った（図８）。ｍＲＮＡ
発現の程度は０．１−０．５μＭのＲＡ濃度の場合定常
基底量以内であり、０．１−０．５μＭのＲＡ濃度の間
に急速に増加し、１０μＭのＲＡ濃度まで及びこの濃度
でその量を維持した。ＲＮＡハイブリッド形成シグナル
を標準β−アクチンプロ−ブに規格化すると、最大増加
はＨＢＮＦの場合６倍、及びＭＫの場合１１倍と算出さ
れた（図８）。これらの結果は、マウスＥＣ細胞系、Ｈ
Ｍ−１のレチノイン酸誘導の間の観察結果に匹敵する
（Ｋａｄｏｍａｔｓｕ等，同上）。この細胞系におい
て、ＭＫ遺伝子発現は上記基底量の８−１０倍と推定さ
れている。
【００１２】組み替えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質を、１８
日令胎児ラットの脳ニュ−ロンのニュ−ライト自然成長
を刺激する能力に関して分析する。細菌誘導蛋白質は両
方とも、本来の牛ＨＢＮＦと類似のニュ−ライト自然成
長促進活性を示した（図５）。組み替えＭＫ蛋白質も、
牛成体の大動脈内皮細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞
に対するマイトジェン活性につき分析する。ＭＫ蛋白質
はこれらの細胞に対してマイトジェン活性を示さない。
しかしＭＫ−トランスフェクション Ｌ 細胞からのな
らし培地はＰＣ１２細胞からマイトジェン性であること
がＴｏｍｏｍｕｒａにより報告されている（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｃｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７１：６
０３，６０９，１９９０）。
日令胎児ラットの脳ニュ−ロンのニュ−ライト自然成長
を刺激する能力に関して分析する。細菌誘導蛋白質は両
方とも、本来の牛ＨＢＮＦと類似のニュ−ライト自然成
長促進活性を示した（図５）。組み替えＭＫ蛋白質も、
牛成体の大動脈内皮細胞及びＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞
に対するマイトジェン活性につき分析する。ＭＫ蛋白質
はこれらの細胞に対してマイトジェン活性を示さない。
しかしＭＫ−トランスフェクション Ｌ 細胞からのな
らし培地はＰＣ１２細胞からマイトジェン性であること
がＴｏｍｏｍｕｒａにより報告されている（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｃｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７１：６
０３，６０９，１９９０）。
【００１３】このように本発明の発見は、ＨＢＮＦ及び
ＭＫが高度に保存された遺伝子ファミリ−の一員である
ことを示している。さらに遺伝子の発現のデ−タは、こ
れらの遺伝子が組織、特に神経組織の増殖、維持、及び
／又は発生的分化において機能していることを意味して
いる。
ＭＫが高度に保存された遺伝子ファミリ−の一員である
ことを示している。さらに遺伝子の発現のデ−タは、こ
れらの遺伝子が組織、特に神経組織の増殖、維持、及び
／又は発生的分化において機能していることを意味して
いる。
【００１４】以下の実施例ではＭＫ遺伝子のクロ−ニン
グとＴ７ ＲＮＡポリメラ−ゼ発現系における発現を説
明する。しかし、このＴ７発現系は非常に有効である
が、これが組み替えによりＭＫを製造する唯一の手段で
はないことを理解するべきである。ＭＫの製造はＭＫ遺
伝子を適した発現ベクタ−に挿入し、その後ベクタ−を
用いて適した宿主細胞を形質転換することにより行うこ
とができる；又はベクタ−を用いずに裸のＤＮＡにより
直接宿主細胞の形質転換を行うこともできる。本発明に
より真核細胞、又は原核細胞のいずれかによるＭＫの製
造を試みる。適した真核細胞の例には、哺乳類細胞、植
物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞が含まれる。同様に、
適した原核細胞宿主としてはＥ．ｃｏｌｉの他に枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。
グとＴ７ ＲＮＡポリメラ−ゼ発現系における発現を説
明する。しかし、このＴ７発現系は非常に有効である
が、これが組み替えによりＭＫを製造する唯一の手段で
はないことを理解するべきである。ＭＫの製造はＭＫ遺
伝子を適した発現ベクタ−に挿入し、その後ベクタ−を
用いて適した宿主細胞を形質転換することにより行うこ
とができる；又はベクタ−を用いずに裸のＤＮＡにより
直接宿主細胞の形質転換を行うこともできる。本発明に
より真核細胞、又は原核細胞のいずれかによるＭＫの製
造を試みる。適した真核細胞の例には、哺乳類細胞、植
物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞が含まれる。同様に、
適した原核細胞宿主としてはＥ．ｃｏｌｉの他に枯草菌
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。
【００１５】他の適した発現ベクタ−も使用することが
でき、宿主細胞の選択に基づいて選ぶ。例えば細菌細胞
の形質転換に使用するのに適した多数のベクタ−が周知
である。例えばプラスミド、及びλ−ファ−ジなどのバ
クテリオファ−ジが細菌宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉに
最も良く使用されるベクタ−である。哺乳類及び昆虫細
胞の両方において、外因性ＤＮＡの発現を得るためにウ
ィルスベクタ−を使用することが多い。特に哺乳類細胞
は通常ＳＶ４０又はポリオ−マウィルスを用いて形質転
換され；培養昆虫細胞はバクロウィルス発現ベクタ−を
用いて形質転換することができる。酵母のベクタ−系に
は酵母セントロメアプラスミド、酵母エピソ−ムプラス
ミド、及び酵母組み込みプラスミドが含まれる。
でき、宿主細胞の選択に基づいて選ぶ。例えば細菌細胞
の形質転換に使用するのに適した多数のベクタ−が周知
である。例えばプラスミド、及びλ−ファ−ジなどのバ
クテリオファ−ジが細菌宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉに
最も良く使用されるベクタ−である。哺乳類及び昆虫細
胞の両方において、外因性ＤＮＡの発現を得るためにウ
ィルスベクタ−を使用することが多い。特に哺乳類細胞
は通常ＳＶ４０又はポリオ−マウィルスを用いて形質転
換され；培養昆虫細胞はバクロウィルス発現ベクタ−を
用いて形質転換することができる。酵母のベクタ−系に
は酵母セントロメアプラスミド、酵母エピソ−ムプラス
ミド、及び酵母組み込みプラスミドが含まれる。
【００１６】本発明の実行は図１で定義したＭＫ遺伝子
の正確な配列の使用に限られないことも理解しなければ
ならない。得られる蛋白質分子中に現れない変化を生ず
る、配列の欠失、挿入又は置換などの配列の修正も予期
している。例えばある部位における化学的に同等なアミ
ノ酸を製造する遺伝子配列の変化を予期する；このよう
にして嫌水性アミノ酸であるアラニンを示すコドンをグ
リシンなどの他の嫌水性残基をコ−ドするコドンと容易
に置換することができ、あるいはバリン、ロイシン、又
はイソロイシンなどのより嫌水性の強い残基と置換する
こともできる。同様にある負に帯電した残基から他への
置換を起こす変化、例えばアスパラギン酸からグルタミ
ン酸への変化、あるいはある正に帯電した残基から他へ
の置換を起こす変化、例えばリシンからアルギニンへの
変化も生物学的に同等な生成物を製造すると思われる。
蛋白質分子中のＮ−末端及びＣ−末端の割合を変えるヌ
クレオチドの変化は、通常これらの領域が生物活性に含
まれないので多くの場合蛋白質の活性を変化させない。
組み替えにより蛋白質を製造する場合、システインが存
在すると望ましくない多量体の形成が起こり、そのため
に精製及び結晶化過程が複雑になり得るので配列中に存
在する１個又はそれ以上のシステインを除去するのが望
ましい。提案される修正のそれぞれはコ−ドされた生成
物の生物活性の保持の決定と同様にこの分野における全
く日常的技術である。従って”ＭＫＤＮＡ配列”又は”
ＭＫ遺伝子”という言葉が明細書及び特許請求の範囲中
で使用される場合、それは生物学的に同等のＭＫ蛋白質
を製造するそのような修正及び変化のすべてを含むもの
とする。特に本発明は、図１の配列と十分に重複してお
り、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，１９８２）に記載されているような標準的高
緊縮サザンハイブリッド形成条件下でそれとハイブリッ
ド形成できるＤＮＡ配列を意図する。ＭＫ蛋白質はＨＢ
ＮＦ蛋白質と強い相同性を有し、ＨＢＮＦと同様にニュ
−ライト自然成長の誘導を刺激する。従ってＭＫを神経
栄養剤として提案する。そのままでＭＫ蛋白質は生体内
及び試験管内の両方において、末梢及び中枢神経系の神
経細胞の成長、維持、及び修復に有用である。試験管内
適用の例は、パ−キンソン氏病の治療における使用が現
在提出されている、胚脳移植の維持における利用であ
る。
の正確な配列の使用に限られないことも理解しなければ
ならない。得られる蛋白質分子中に現れない変化を生ず
る、配列の欠失、挿入又は置換などの配列の修正も予期
している。例えばある部位における化学的に同等なアミ
ノ酸を製造する遺伝子配列の変化を予期する；このよう
にして嫌水性アミノ酸であるアラニンを示すコドンをグ
リシンなどの他の嫌水性残基をコ−ドするコドンと容易
に置換することができ、あるいはバリン、ロイシン、又
はイソロイシンなどのより嫌水性の強い残基と置換する
こともできる。同様にある負に帯電した残基から他への
置換を起こす変化、例えばアスパラギン酸からグルタミ
ン酸への変化、あるいはある正に帯電した残基から他へ
の置換を起こす変化、例えばリシンからアルギニンへの
変化も生物学的に同等な生成物を製造すると思われる。
蛋白質分子中のＮ−末端及びＣ−末端の割合を変えるヌ
クレオチドの変化は、通常これらの領域が生物活性に含
まれないので多くの場合蛋白質の活性を変化させない。
組み替えにより蛋白質を製造する場合、システインが存
在すると望ましくない多量体の形成が起こり、そのため
に精製及び結晶化過程が複雑になり得るので配列中に存
在する１個又はそれ以上のシステインを除去するのが望
ましい。提案される修正のそれぞれはコ−ドされた生成
物の生物活性の保持の決定と同様にこの分野における全
く日常的技術である。従って”ＭＫＤＮＡ配列”又は”
ＭＫ遺伝子”という言葉が明細書及び特許請求の範囲中
で使用される場合、それは生物学的に同等のＭＫ蛋白質
を製造するそのような修正及び変化のすべてを含むもの
とする。特に本発明は、図１の配列と十分に重複してお
り、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，１９８２）に記載されているような標準的高
緊縮サザンハイブリッド形成条件下でそれとハイブリッ
ド形成できるＤＮＡ配列を意図する。ＭＫ蛋白質はＨＢ
ＮＦ蛋白質と強い相同性を有し、ＨＢＮＦと同様にニュ
−ライト自然成長の誘導を刺激する。従ってＭＫを神経
栄養剤として提案する。そのままでＭＫ蛋白質は生体内
及び試験管内の両方において、末梢及び中枢神経系の神
経細胞の成長、維持、及び修復に有用である。試験管内
適用の例は、パ−キンソン氏病の治療における使用が現
在提出されている、胚脳移植の維持における利用であ
る。
【００１７】分化における明らかな役割を考慮して、Ｍ
Ｋ蛋白質を一般組織の分化、維持、及び修復因子として
も提案する。特にＭＫは分化表現型への逆行を起こす腫
瘍細胞の治療に有用であることができる。
Ｋ蛋白質を一般組織の分化、維持、及び修復因子として
も提案する。特にＭＫは分化表現型への逆行を起こす腫
瘍細胞の治療に有用であることができる。
【００１８】中枢又は末梢神経系の損傷の治療における
ＭＫの生体内投与は遺伝子配列の発見により非常に単純
になる。遺伝子及びその配列の同定により、繊維芽細
胞、単球、又はマクロファ−ジなどのトランスジェニッ
ク細胞の構築ができるようになり、これらをＭＫ遺伝子
の発現を許すように設計し、神経破壊異常、手術に続く
末梢神経の修復、又は神経細胞の成長、及び／又は修復
の強化が望まれる状態のための移植組織として使用する
ことができる。
ＭＫの生体内投与は遺伝子配列の発見により非常に単純
になる。遺伝子及びその配列の同定により、繊維芽細
胞、単球、又はマクロファ−ジなどのトランスジェニッ
ク細胞の構築ができるようになり、これらをＭＫ遺伝子
の発現を許すように設計し、神経破壊異常、手術に続く
末梢神経の修復、又は神経細胞の成長、及び／又は修復
の強化が望まれる状態のための移植組織として使用する
ことができる。
【００１９】さらにＭＫの治療への利用はヒトのみに限
られてはいない。実際に関連性の薄い種の間でのこの蛋
白質の保存性を考慮すると、どのような形態におけるＭ
Ｋの投与も同様に獣医学的適用に有益である。治療配合
物は所望の生物活性を起こすのに有効な量のＭＫを製薬
上許容できる液体又は固体キャリヤ−と組み合わせて含
む。又は、配合物は試験管内でＭＫを発現できる適合性
トランスジェニック細胞の製薬上許容できる集合を、末
梢及び中枢神経系修復、又は分化治療のための移植組織
として含む。
られてはいない。実際に関連性の薄い種の間でのこの蛋
白質の保存性を考慮すると、どのような形態におけるＭ
Ｋの投与も同様に獣医学的適用に有益である。治療配合
物は所望の生物活性を起こすのに有効な量のＭＫを製薬
上許容できる液体又は固体キャリヤ−と組み合わせて含
む。又は、配合物は試験管内でＭＫを発現できる適合性
トランスジェニック細胞の製薬上許容できる集合を、末
梢及び中枢神経系修復、又は分化治療のための移植組織
として含む。
【００２０】
【実施例】ＭＫ遺伝子のクロ−ニング及び配列決定 発表されたマウスＭＫ蛋白質アミノ酸配列を用いてポリ
メラ−ゼ連鎖反応におけるプライマ−として使用する特
異的オリゴヌクレオチドを製造した。Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、同上、に記載の通り、Ｃ５７ Ｂｌａｃｋ／６Ｊ
マイスからマウスゲノムＤＮＡを単離した。
メラ−ゼ連鎖反応におけるプライマ−として使用する特
異的オリゴヌクレオチドを製造した。Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、同上、に記載の通り、Ｃ５７ Ｂｌａｃｋ／６Ｊ
マイスからマウスゲノムＤＮＡを単離した。
【００２１】ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位から出発してアミ
ノ酸配列：ＣＮＷＫＫＥＦＧ（図１）に対して認識プラ
イマ−を作り、それはＤＮＡ配列：５’ＧＧＡＡＴＴＣ
ＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴ−３’を
含んだ。
ノ酸配列：ＣＮＷＫＫＥＦＧ（図１）に対して認識プラ
イマ−を作り、それはＤＮＡ配列：５’ＧＧＡＡＴＴＣ
ＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴ−３’を
含んだ。
【００２２】相補的ＤＮＡ上でＴａｇポリメラ−ゼを用
い、５０℃における１分間のアニ−リング、７２℃にお
ける２分間の伸張、及び９４℃における１分間の変性を
３０サイクル行ってＰＣＲ反応を行った（ＵＳＢ Ｃｏ
ｒｐ．）。
い、５０℃における１分間のアニ−リング、７２℃にお
ける２分間の伸張、及び９４℃における１分間の変性を
３０サイクル行ってＰＣＲ反応を行った（ＵＳＢ Ｃｏ
ｒｐ．）。
【００２３】１５０塩基対のマウスＭＫ ＰＣＲ生成物
をブル−スクライブ（＋）ベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）にクロ−ニングし、新生脳幹及び大脳基底核 λ
ｇｔ １１ ｃＤＮＡライブラリにおけるスクリ−ニン
グに使用する（Ｋａｍｈｏｌｚ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
３：４９６２−５４９６６，１９８６）。ＭＫ配列を含
むと推定される単一のクロ−ンを単離し、ブル−スクラ
イブ（＋）のＥｃｏＲＩ部位にサブクロ−ニングし、ジ
デオキシヌクレオチド連鎖停止法により配列決定する
（Ｓａｎｇｅｒ等 ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４：５４６３
−５４６７，１９８８）。ＭＫ遺伝子の配列、並びに予
測アミノ酸配列を図１に示す。マウスＭＫ配列と比較す
ると、マウス配列における３個のコドンの欠失を含めて
４１のヌクレオチドの相違がある。
をブル−スクライブ（＋）ベクタ−（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）にクロ−ニングし、新生脳幹及び大脳基底核 λ
ｇｔ １１ ｃＤＮＡライブラリにおけるスクリ−ニン
グに使用する（Ｋａｍｈｏｌｚ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８
３：４９６２−５４９６６，１９８６）。ＭＫ配列を含
むと推定される単一のクロ−ンを単離し、ブル−スクラ
イブ（＋）のＥｃｏＲＩ部位にサブクロ−ニングし、ジ
デオキシヌクレオチド連鎖停止法により配列決定する
（Ｓａｎｇｅｒ等 ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７４：５４６３
−５４６７，１９８８）。ＭＫ遺伝子の配列、並びに予
測アミノ酸配列を図１に示す。マウスＭＫ配列と比較す
ると、マウス配列における３個のコドンの欠失を含めて
４１のヌクレオチドの相違がある。
【００２４】組み替えヒトＭＫの発現 ｐＭＫＨＣ２と呼ぶ上記の単離クロ−ンを、メチオニン
コドン及びＮｄｅ Ｉ制限部位をＮ−末端リシンの５’
に直接配置するよう設計したプライマ−を用いたＰＣＲ
増幅のための鋳型として使用する。精製ＰＣＲ生成物
を、１４００ｂｐＳａｌｌ／ＰｖｕＩＩフラグメントの
欠失、及びｆ１複製起点のＥｃｏＲＩ部位への挿入によ
り修正した発現ベクタ−ｐＥＴ−３ａの誘導体にクロ−
ニングする。ＰＣＲ増幅の正確性を確認するために挿入
物の配列を決定した後、プラスミド（ｐＥＴＭＨ２と名
付ける；以前ｐＥＴＭＫＨＣ２とも呼ばれた）を株 Ｂ
Ｌ２１ ｌｙｓＳに形質転換し、記載の通りＩＰＴＧを
用いて蛋白質製造を誘導する（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，同
上）。１ｍｌの培養物からの菌糸塊を１００μｌのＳＤ
Ｓ緩衝液中に再懸濁させ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２２７：６８０−６８５，１９７０）、２．５μｌ
を１５アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流す。
ゲルをク−マシ−ブル−を用いて染色する。組み替えＭ
ＫをｐＨ７．０のトリス１０ｍＭ中のヘパリン セファ
ロ−ス ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂上で細
菌抽出物から精製し、１−１．１３ＭのＮａＣｌにて溶
離する。さらに５０ｍＭのｐＨ６．８のリン酸ナトリウ
ム中のＭｏｎｏ Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で
ＮａＣｌを用い、０−１Ｍまで塩濃度を増加させて精製
する。精製蛋白質は０．６Ｍ ＮａＣｌにて溶離する。
コドン及びＮｄｅ Ｉ制限部位をＮ−末端リシンの５’
に直接配置するよう設計したプライマ−を用いたＰＣＲ
増幅のための鋳型として使用する。精製ＰＣＲ生成物
を、１４００ｂｐＳａｌｌ／ＰｖｕＩＩフラグメントの
欠失、及びｆ１複製起点のＥｃｏＲＩ部位への挿入によ
り修正した発現ベクタ−ｐＥＴ−３ａの誘導体にクロ−
ニングする。ＰＣＲ増幅の正確性を確認するために挿入
物の配列を決定した後、プラスミド（ｐＥＴＭＨ２と名
付ける；以前ｐＥＴＭＫＨＣ２とも呼ばれた）を株 Ｂ
Ｌ２１ ｌｙｓＳに形質転換し、記載の通りＩＰＴＧを
用いて蛋白質製造を誘導する（Ｓｔｕｄｉｅｒ等，同
上）。１ｍｌの培養物からの菌糸塊を１００μｌのＳＤ
Ｓ緩衝液中に再懸濁させ（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒ
ｅ ２２７：６８０−６８５，１９７０）、２．５μｌ
を１５アクリルアミドＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に流す。
ゲルをク−マシ−ブル−を用いて染色する。組み替えＭ
ＫをｐＨ７．０のトリス１０ｍＭ中のヘパリン セファ
ロ−ス ＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂上で細
菌抽出物から精製し、１−１．１３ＭのＮａＣｌにて溶
離する。さらに５０ｍＭのｐＨ６．８のリン酸ナトリウ
ム中のＭｏｎｏ Ｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上で
ＮａＣｌを用い、０−１Ｍまで塩濃度を増加させて精製
する。精製蛋白質は０．６Ｍ ＮａＣｌにて溶離する。
【００２５】ニュ−ライト自然成長分析 １８日令の胎児ラットから脳を無菌下で取り出し、無菌
の５ｍｌシリンジを用いて１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ
中に分散して単一細胞とする。細胞懸濁液を５ｘ１０5
細胞／ｍｌに調節し、室温で３０分間５０μｇ／ｍｌの
ポリ−Ｌ−リシンを予備被覆した組織培養皿にひろげる
（Ｒａｕｖａｌａ ａｎｄ Ｐｉｈｌａｓｋａｒｉ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６６２５−１６６
３５，１９８７）。培養物を１０％ＣＯ2中、３７℃に
て２４時間インキュベ−トし、その後培地を１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含むＤＭＥＭに変え、ＨＢＮＦ又はＭＫ蛋
白質を指示された濃度で加える。さらに１日インキュベ
−トした後、細胞の視覚試験により標準と比較した拡大
自然成長／プロセスに関してニュ−ライト自然成長活性
を決定する。図５Ｄに示す通り、精製組み替えＭＫは、
組み替えＨＢＮＦ及び牛の脳から誘導したＨＢＮＦと実
質的に同程度にニュ−ライト自然成長を刺激することが
できる。
の５ｍｌシリンジを用いて１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ
中に分散して単一細胞とする。細胞懸濁液を５ｘ１０5
細胞／ｍｌに調節し、室温で３０分間５０μｇ／ｍｌの
ポリ−Ｌ−リシンを予備被覆した組織培養皿にひろげる
（Ｒａｕｖａｌａ ａｎｄ Ｐｉｈｌａｓｋａｒｉ，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６６２５−１６６
３５，１９８７）。培養物を１０％ＣＯ2中、３７℃に
て２４時間インキュベ−トし、その後培地を１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡを含むＤＭＥＭに変え、ＨＢＮＦ又はＭＫ蛋
白質を指示された濃度で加える。さらに１日インキュベ
−トした後、細胞の視覚試験により標準と比較した拡大
自然成長／プロセスに関してニュ−ライト自然成長活性
を決定する。図５Ｄに示す通り、精製組み替えＭＫは、
組み替えＨＢＮＦ及び牛の脳から誘導したＨＢＮＦと実
質的に同程度にニュ−ライト自然成長を刺激することが
できる。
【００２６】ヒトＮＴ２／Ｄ１細胞の成長とレチノイン酸誘導 ヒトの胚性がん腫細胞系ＮＴ２／Ｄ１を前記のようにし
て成育する（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０
３：２８５−２９３，１９８４）。レチノイン酸誘導の
ために細胞を成育し、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培
地に１００ｍｍの皿当たり５ｘ１０5細胞の密度で再分
散する（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）。ジメチルスルホキシド（１０μｌ）中の種
々の濃度の全−トランスレチノイン酸を加え、細胞を９
日間インキュベ−トする。第４日及び８日目に新しい培
地及びＲＡを加える。皿をリン酸塩緩衝生理食塩水で１
度洗浄し、ＲＮＡを上記の通りに抽出する。図８はレチ
ノイン酸の濃度の変化量に対応する、製造ＨＢＮＦ及び
ＭＫの量をグラフで示したものである。ＲＡを用いて誘
導したＮＴ２／Ｄ１細胞はニュ−ロン分化の研究のモデ
ル系となることが示されているので（Ｌｅｅ 及び Ａ
ｎｄｒｅｗ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：５１４−５２
１，１９８６）、この系におけるＨＢＮＦ及びＭＫ遺伝
子の誘導の増加はニュ−ロン細胞発生における可能な役
割を示している。
て成育する（Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１０
３：２８５−２９３，１９８４）。レチノイン酸誘導の
ために細胞を成育し、１０％子牛血清を含むＤＭＥＭ培
地に１００ｍｍの皿当たり５ｘ１０5細胞の密度で再分
散する（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）。ジメチルスルホキシド（１０μｌ）中の種
々の濃度の全−トランスレチノイン酸を加え、細胞を９
日間インキュベ−トする。第４日及び８日目に新しい培
地及びＲＡを加える。皿をリン酸塩緩衝生理食塩水で１
度洗浄し、ＲＮＡを上記の通りに抽出する。図８はレチ
ノイン酸の濃度の変化量に対応する、製造ＨＢＮＦ及び
ＭＫの量をグラフで示したものである。ＲＡを用いて誘
導したＮＴ２／Ｄ１細胞はニュ−ロン分化の研究のモデ
ル系となることが示されているので（Ｌｅｅ 及び Ａ
ｎｄｒｅｗ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：５１４−５２
１，１９８６）、この系におけるＨＢＮＦ及びＭＫ遺伝
子の誘導の増加はニュ−ロン細胞発生における可能な役
割を示している。
【００２７】生物学的素材の貯蔵 ｐＭＫＨＣ２を含むＥ．ｃｏｌｉ株 Ｍ １０６１、及
びｐＥＴＭＨ２を含むＥ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２Ｔ Ｌｙ
ｓＳを、Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍｐ
ａｎｙ，Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＰｅａｒｌＲｉｖｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋのカルチャ−
コレクション、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ
に、それぞれ１９９０年８月１３日受け入れ番号ＡＴＣ
Ｃ ６８３８４、及び１９９０年９月１７日受け入れ番
号６８４０１として貯蔵した。
びｐＥＴＭＨ２を含むＥ．ｃｏｌｉ株 ＢＬ２Ｔ Ｌｙ
ｓＳを、Ａｍｅｒｉｃａｎ ＣｙａｎａｍｉｄＣｏｍｐ
ａｎｙ，Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
ＰｅａｒｌＲｉｖｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋのカルチャ−
コレクション、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ
に、それぞれ１９９０年８月１３日受け入れ番号ＡＴＣ
Ｃ ６８３８４、及び１９９０年９月１７日受け入れ番
号６８４０１として貯蔵した。
【００２８】配列ＩＤ番号：１ 配列の種類：核酸、及びアミノ酸 配列の長さ：７９９塩基対 １４３アミノ酸 らせん：一重 トポロジ−：直線 供給生物：ヒト 特性：ヒトＭＫ遺伝子及び蛋白質配列
【００２９】
【表１】 配列ＩＤ番号：２ 配列の種類：核酸、及びアミノ酸 配列の長さ：３５４塩基対 １１８アミノ酸 らせん：一重 トポロジ−：直線 供給生物：マウス 特性：マウスＭＫ遺伝子及び蛋白質配列
【００３０】
【表２】 配列ＩＤ番号：３ 配列の種類：核酸、及びアミノ酸 配列の長さ：４１１塩基対 １３６アミノ酸 らせん：一重 トポロジ−：直線 供給生物：ヒト 特性：ヒトＨＢＮＦ遺伝子及び蛋白質配列
【００３１】
【表３】 本発明の主たる特徴及び態様は以下の通りである。
【００３２】１．精製及び単離されたヒトＭＫ蛋白質を
コードする遺伝子。
コードする遺伝子。
【００３３】２．第１項に記載の遺伝子において、生物
活性ＭＫ蛋白質をコ−ドする、図１に描いたＭＫ配列又
はその一部を有することを特徴とする遺伝子。
活性ＭＫ蛋白質をコ−ドする、図１に描いたＭＫ配列又
はその一部を有することを特徴とする遺伝子。
【００３４】３．第１項に記載の遺伝子において、標準
高緊縮条件下で図１に描いたＭＫ配列とハイブリッド形
成することができることを特徴とする遺伝子。
高緊縮条件下で図１に描いたＭＫ配列とハイブリッド形
成することができることを特徴とする遺伝子。
【００３５】４．実質的に純粋なＭＫ蛋白質の製造法に
おいて、第１項に記載の遺伝子を有する宿主細胞を形質
転換し、宿主細胞による遺伝子の発現を許す条件下で宿
主細胞を培養することから成ることを特徴とする方法。
おいて、第１項に記載の遺伝子を有する宿主細胞を形質
転換し、宿主細胞による遺伝子の発現を許す条件下で宿
主細胞を培養することから成ることを特徴とする方法。
【００３６】５．第１項に記載の遺伝子を含む発現ベク
タ−。
タ−。
【００３７】６．第１項に記載の遺伝子を含む宿主細
胞。
胞。
【００３８】７．第６項に記載の細胞において、Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎにＡＴＣＣ ６８３８４として貯蔵された細
胞。
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎにＡＴＣＣ ６８３８４として貯蔵された細
胞。
【００３９】８．精製単離された図１に描いた配列を有
するＭＫ蛋白質、及びＭＫ生物活性を保持しているその
相同体又はフラグメント。
するＭＫ蛋白質、及びＭＫ生物活性を保持しているその
相同体又はフラグメント。
【００４０】９．有効量のＭＫ蛋白質を、製薬上許容で
きるキャリヤ−と組み合わせて含む治療配合物。
きるキャリヤ−と組み合わせて含む治療配合物。
【００４１】１０．第９項に記載の配合物において、蛋
白質が図１に描いた配列を有する、又はＭＫ生物活性を
保持しているその相同体又はフラグメントであることを
特徴とする配合物。
白質が図１に描いた配列を有する、又はＭＫ生物活性を
保持しているその相同体又はフラグメントであることを
特徴とする配合物。
【００４２】１１．試験管内の神経細胞の成長を保持、
又は促進する方法において、有効量の第８項に記載の蛋
白質の存在下で細胞を培養することから成ることを特徴
とする方法。
又は促進する方法において、有効量の第８項に記載の蛋
白質の存在下で細胞を培養することから成ることを特徴
とする方法。
【００４３】１２．損傷神経細胞を生体内で修復又は治
療する方法において、そのような治療の必要な個人にＭ
Ｋ蛋白質を発現することができる適合性トランスジェニ
ック細胞を投与することから成ることを特徴とする方
法。
療する方法において、そのような治療の必要な個人にＭ
Ｋ蛋白質を発現することができる適合性トランスジェニ
ック細胞を投与することから成ることを特徴とする方
法。
【００４４】１３．未分化細胞の分化を起こす方法にお
いて、有効量のＭＫ蛋白質を細胞に適用することを含む
方法。
いて、有効量のＭＫ蛋白質を細胞に適用することを含む
方法。
【図１】図１（配列表１も参照）。ヒトＭＫ遺伝子のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列。太字のアミノ酸は予想蛋
白質配列を示し、矢印は成熟蛋白質の予想Ｎ−末端を示
し、マウスゲノムＤＮＡプロ−ブを増幅するために使用
したプライマ−１及び２に対応する２箇所のペプチド配
列に下線を引く。遺伝子の３’末端近辺の２カ所のポリ
アデニル化配列に下線を引く。
クレオチド及びアミノ酸配列。太字のアミノ酸は予想蛋
白質配列を示し、矢印は成熟蛋白質の予想Ｎ−末端を示
し、マウスゲノムＤＮＡプロ−ブを増幅するために使用
したプライマ−１及び２に対応する２箇所のペプチド配
列に下線を引く。遺伝子の３’末端近辺の２カ所のポリ
アデニル化配列に下線を引く。
【図２】図２はヒトＨＢＮＦの成熟蛋白質領域（配列表
３も参照）、及びＭＫヌクレオチドの比較を示し、アミ
ノ酸配列を推定する。同一のアミノ酸を太字で示す。二
ヌクレオチド配列の一致を星（＊）で示す。
３も参照）、及びＭＫヌクレオチドの比較を示し、アミ
ノ酸配列を推定する。同一のアミノ酸を太字で示す。二
ヌクレオチド配列の一致を星（＊）で示す。
【図３】図３はヒト及びマウスＭＫのヌクレオチド配列
及び推定アミノ酸配列を示す（配列表２も参照）。二ヌ
クレオチド配列における相違を星（＊）で示す。アミノ
酸における相違を太字で示す。マウスゲノムＰＣＲプラ
イマ−設計に使用したアミノ酸に下線を引く。
及び推定アミノ酸配列を示す（配列表２も参照）。二ヌ
クレオチド配列における相違を星（＊）で示す。アミノ
酸における相違を太字で示す。マウスゲノムＰＣＲプラ
イマ−設計に使用したアミノ酸に下線を引く。
【図４】図４はヒト組み替えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質の
細菌における発現。細胞溶解物は発現プラスミドｐＥＴ
ＨＨ８又はｐＥＴＭＨ２を含む培養細菌から得る。列１
及び２はｐＥＴＭＨ２を含む非誘導、及びＩＰＴＧ誘導
培養物。列３は精製組み替えＭＫ蛋白質。列４及び５は
ｐＥＴＨＨ８を含む非誘導、及び誘導培養物。列６は精
製組み替えＨＢＮＦ蛋白質。蛋白質標準はＢＲＬからの
ものである。
細菌における発現。細胞溶解物は発現プラスミドｐＥＴ
ＨＨ８又はｐＥＴＭＨ２を含む培養細菌から得る。列１
及び２はｐＥＴＭＨ２を含む非誘導、及びＩＰＴＧ誘導
培養物。列３は精製組み替えＭＫ蛋白質。列４及び５は
ｐＥＴＨＨ８を含む非誘導、及び誘導培養物。列６は精
製組み替えＨＢＮＦ蛋白質。蛋白質標準はＢＲＬからの
ものである。
【図５】図５は精製組み替えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質の
ニュ−ライト自然成長分析。精製蛋白質は１８日令ラッ
ト胎児ニュ−ロン上で、示した濃度にて分析した。
（Ａ）蛋白質を加えない神経細胞。（Ｂ）牛の脳からの
ＨＢＮＦ蛋白質（１６０μｇ／ｍｌ）。（Ｃ）精製組み
替えヒトＨＢＮＦ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）。（Ｄ）
精製組み替えヒトＭＫ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）。
ニュ−ライト自然成長分析。精製蛋白質は１８日令ラッ
ト胎児ニュ−ロン上で、示した濃度にて分析した。
（Ａ）蛋白質を加えない神経細胞。（Ｂ）牛の脳からの
ＨＢＮＦ蛋白質（１６０μｇ／ｍｌ）。（Ｃ）精製組み
替えヒトＨＢＮＦ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）。（Ｄ）
精製組み替えヒトＭＫ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）。
【図６】図６は（ａ）ラットの胚形成の間のＨＢＮＦ遺
伝子の発現を示す。各組織から１列当たり２０μｇの全
ＲＮＡを適用し、32Ｐ−標識ヒトＨＢＮＦ ｃＤＮＡプ
ロ−ブとハイブリッド形成した。ＲＮＡの単離に使用し
た組織は、Ｅ８及びＥ１０の場合は胚プロパ−全体、Ｅ
１２及びＥ１４の場合は頭、Ｅ１６，Ｅ１８，Ｅ２０，
Ｐ２及び成体（Ａｄｕｌｔ）の場合は脳全体であった；
（ｂ）ラットの胚形成の間のＭＫ遺伝子の発現。（ａ）
と同様に32Ｐ−標識ヒトＭＫ ｃＤＮＡプロ−ブとハイ
ブリッド形成した（ａ）と同様のノザンブロット。
伝子の発現を示す。各組織から１列当たり２０μｇの全
ＲＮＡを適用し、32Ｐ−標識ヒトＨＢＮＦ ｃＤＮＡプ
ロ−ブとハイブリッド形成した。ＲＮＡの単離に使用し
た組織は、Ｅ８及びＥ１０の場合は胚プロパ−全体、Ｅ
１２及びＥ１４の場合は頭、Ｅ１６，Ｅ１８，Ｅ２０，
Ｐ２及び成体（Ａｄｕｌｔ）の場合は脳全体であった；
（ｂ）ラットの胚形成の間のＭＫ遺伝子の発現。（ａ）
と同様に32Ｐ−標識ヒトＭＫ ｃＤＮＡプロ−ブとハイ
ブリッド形成した（ａ）と同様のノザンブロット。
【図７】図７は成体ラット脳におけるＨＢＮＦ及びＭＫ
の遺伝子発現。２月令のラットの脳の種々の領域から抽
出したＲＮＡに関してノザン分析を行った（１列当たり
１０μｇのＲＮＡ；列１−脳全体、２−皮質、３−海
馬、４−小脳、５−尾状核、６−中脳＋視床下部，７−
脳幹）。得られたブロットを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及
びβ−アクチンのプロ−ブとハイブリッド形成した。
の遺伝子発現。２月令のラットの脳の種々の領域から抽
出したＲＮＡに関してノザン分析を行った（１列当たり
１０μｇのＲＮＡ；列１−脳全体、２−皮質、３−海
馬、４−小脳、５−尾状核、６−中脳＋視床下部，７−
脳幹）。得られたブロットを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及
びβ−アクチンのプロ−ブとハイブリッド形成した。
【図８】図８はＮＴ２／Ｄ１細胞におけるＨＢＮＦ及び
ＭＫ遺伝子のレチノイン酸−誘導による発現。ＮＴ２／
Ｄ１細胞を種々の濃度のＲＡで処理し、９日成育し、Ｒ
ＮＡを抽出した。（Ａ）ノザン分析では各ＲＡ濃度につ
き１０μｇのＲＮＡを使用した。得られたブロットを連
続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンとハイブリッド
形成した。（Ｂ）（Ａ）ＨＢＮＦ（黒）、及びＭＫ（斜
線）で得たハイブリッドシグナルをデンシトメトリ−に
より測定し、β−アクチンのシグナルに対して規格化し
た。
ＭＫ遺伝子のレチノイン酸−誘導による発現。ＮＴ２／
Ｄ１細胞を種々の濃度のＲＡで処理し、９日成育し、Ｒ
ＮＡを抽出した。（Ａ）ノザン分析では各ＲＡ濃度につ
き１０μｇのＲＮＡを使用した。得られたブロットを連
続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンとハイブリッド
形成した。（Ｂ）（Ａ）ＨＢＮＦ（黒）、及びＭＫ（斜
線）で得たハイブリッドシグナルをデンシトメトリ−に
より測定し、β−アクチンのシグナルに対して規格化し
た。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＭＫ遣伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配
列。太字のアミノ酸は予想蛋白質配列を示し、矢印は成
熟蛋白質の予想Ｎ−末端を示し、マウスゲノムＤＮＡプ
ローブを増幅するために使用したプライマー１及び２に
対応する２箇所のペプチド配列に下線を引く。遣伝子の
３′末端近辺の２カ所のポリアデニル化配列に下線を引
く。
列。太字のアミノ酸は予想蛋白質配列を示し、矢印は成
熟蛋白質の予想Ｎ−末端を示し、マウスゲノムＤＮＡプ
ローブを増幅するために使用したプライマー１及び２に
対応する２箇所のペプチド配列に下線を引く。遣伝子の
３′末端近辺の２カ所のポリアデニル化配列に下線を引
く。
【図２】 ヒトＨＢＮＦ及びＭＫヌクレオチド配列とそれ
らの推定アミノ酸（一文字標記）配列の一部を示す。こ
の配列に
らの推定アミノ酸（一文字標記）配列の一部を示す。こ
の配列に
【図３】に示される配列が連続して、ヒトＨＢＮＦ及び
ＭＫ配列の全体を構成する。星印（＊）は両ヌクレオチ
ド配列の一致する部分を示す。
ＭＫ配列の全体を構成する。星印（＊）は両ヌクレオチ
ド配列の一致する部分を示す。
【図３】
【図２】の配列に連続するヒトＨＢＮＦ及びＭＫヌクレ
オチド配列とその推定アミノ酸配列の一部を示す。
オチド配列とその推定アミノ酸配列の一部を示す。
【図４】 ヒトＭＫのヌクレオチド及び推定アミノ酸配列
並びにマウスＭＫのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示
す。両ヌクレオチド配列の相違する部分を星印（＊）で
示す。
並びにマウスＭＫのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示
す。両ヌクレオチド配列の相違する部分を星印（＊）で
示す。
【図５】 ヒト組み換えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質の発現を
表わす、各培養細菌の細胞溶解物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真で
ある。列１及び２はｐＥＴＭＨ２を含む非誘導、及びＩ
ＰＴＧ誘導培養物。列３は精製組み替えＭＫ蛋白質。列
４及び５はｐＥＴＭＨ８を含む非誘導、及び誘導培養
物。列６は精製組み替えＨＢＮＦ蛋白質。蛋白質標準は
ＢＲＬからのものである。
表わす、各培養細菌の細胞溶解物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真で
ある。列１及び２はｐＥＴＭＨ２を含む非誘導、及びＩ
ＰＴＧ誘導培養物。列３は精製組み替えＭＫ蛋白質。列
４及び５はｐＥＴＭＨ８を含む非誘導、及び誘導培養
物。列６は精製組み替えＨＢＮＦ蛋白質。蛋白質標準は
ＢＲＬからのものである。
【図６】 組み換えＨＢＮＦ及びＭＫ蛋白質刺激による脳
ニユーロンのニユーライト（神経細胞突起）の成長の様
子（生物の形態）を示す図面に代わる写真である。な
お、（Ａ）は蛋白質を加えない神経細胞であり、（Ｂ）
は牛の脳からのＨＢＮＦ蛋白質（１６０μｇ／ｍｌ）を
加えた神経細胞である。
ニユーロンのニユーライト（神経細胞突起）の成長の様
子（生物の形態）を示す図面に代わる写真である。な
お、（Ａ）は蛋白質を加えない神経細胞であり、（Ｂ）
は牛の脳からのＨＢＮＦ蛋白質（１６０μｇ／ｍｌ）を
加えた神経細胞である。
【図７】 図６に準ずる写真である。なお、（Ｃ）は、精
製組み替えヒトＨＢＮＦ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）を
加えた神経細胞であり、（Ｄ）は精製組み替えヒトＭＫ
蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）を加えた神経細胞である。
製組み替えヒトＨＢＮＦ蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）を
加えた神経細胞であり、（Ｄ）は精製組み替えヒトＭＫ
蛋白質（１５０μｇ／ｍｌ）を加えた神経細胞である。
【図８】 ラットの胚形成の間のＨＢＮＦ遺伝子の発現を
表わし（ａ）、そしてラットの胚形成の間のＭＫ遺伝子
の発現を表わす（ｂ）ための各ＲＮＡのゲル電気泳動
（ノーザンハイブリッド形成処理済み）の結果を示す図
面に代わる写真である。（ａ）は、各組織から１列当た
り２０μｇの全ＲＮＡを適用し、３２Ｐ−標識ヒトＨＢ
ＮＦ ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。ＲＮ
Ａの単離に使用した組織は、Ｅ８及びＥ１０の場合は胚
プロパー全体、Ｅ１２及びＥ１４の場合は頭、Ｅ１６，
Ｅ１８，Ｅ２０，Ｐ２及び成体（Ａｄｕｌｔ）の場合は
脳全体であった；（ｂ）は、（ａ）と同様に３２Ｐ−標
識ヒトＭＫ ｃＮＡプローブとハイブリッド形成した
（Ａ）と同様のノーザンブロット。
表わし（ａ）、そしてラットの胚形成の間のＭＫ遺伝子
の発現を表わす（ｂ）ための各ＲＮＡのゲル電気泳動
（ノーザンハイブリッド形成処理済み）の結果を示す図
面に代わる写真である。（ａ）は、各組織から１列当た
り２０μｇの全ＲＮＡを適用し、３２Ｐ−標識ヒトＨＢ
ＮＦ ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。ＲＮ
Ａの単離に使用した組織は、Ｅ８及びＥ１０の場合は胚
プロパー全体、Ｅ１２及びＥ１４の場合は頭、Ｅ１６，
Ｅ１８，Ｅ２０，Ｐ２及び成体（Ａｄｕｌｔ）の場合は
脳全体であった；（ｂ）は、（ａ）と同様に３２Ｐ−標
識ヒトＭＫ ｃＮＡプローブとハイブリッド形成した
（Ａ）と同様のノーザンブロット。
【図９】 成体ラット脳におけるＨＢＮＦ及びＭＫの遺伝
子を表わすゲル電気泳動（ノーザンハイブリッド形成処
理済み）の結果を示す図面に代わる写真である。２月令
のラットの脳の種々の領域から抽出したＲＮＡに関して
ノザン分析を行った（１列当たり１０μｇのＲＮＡ；列
１−脳全体、２−皮質、３−海馬、４−小脳、５−尾状
核、６−中脳＋視床下部，７−脳幹）。得られたブロッ
トを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンのプロー
ブとハイブリッド形成した。
子を表わすゲル電気泳動（ノーザンハイブリッド形成処
理済み）の結果を示す図面に代わる写真である。２月令
のラットの脳の種々の領域から抽出したＲＮＡに関して
ノザン分析を行った（１列当たり１０μｇのＲＮＡ；列
１−脳全体、２−皮質、３−海馬、４−小脳、５−尾状
核、６−中脳＋視床下部，７−脳幹）。得られたブロッ
トを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンのプロー
ブとハイブリッド形成した。
【図１０】 上段の図は、ＮＴ２／Ｄ１細胞におけるＨＢ
ＮＦ及びＭＫ遺伝子のレチノイン酸誘導による発現を表
わすための各ＲＮＡのゲル電気泳動（ノーザンハイブリ
ッド形成処理済み）の結果を示す図面に代わる写真であ
る。ＮＴ２／Ｄ１細胞を種々の濃度のＲＡで処理し、９
日成育し、ＲＮＡを抽出した。ノーザン分析では各ＲＡ
濃度につき１０μｇのＲＮＡを使用した。得られたブロ
ットを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンとハイ
ブリッド形成した。下段の図は、上記のＨＢＮＦ
（黒）、及びＭＫ（斜線）で得たハイブリッドシグナル
をデンシトメトリーにより測定し、β−アクチンのシグ
ナルに対して規格化したグラフである。
ＮＦ及びＭＫ遺伝子のレチノイン酸誘導による発現を表
わすための各ＲＮＡのゲル電気泳動（ノーザンハイブリ
ッド形成処理済み）の結果を示す図面に代わる写真であ
る。ＮＴ２／Ｄ１細胞を種々の濃度のＲＡで処理し、９
日成育し、ＲＮＡを抽出した。ノーザン分析では各ＲＡ
濃度につき１０μｇのＲＮＡを使用した。得られたブロ
ットを連続してＨＢＮＦ，ＭＫ及びβ−アクチンとハイ
ブリッド形成した。下段の図は、上記のＨＢＮＦ
（黒）、及びＭＫ（斜線）で得たハイブリッドシグナル
をデンシトメトリーにより測定し、β−アクチンのシグ
ナルに対して規格化したグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【図３】
【図１】
【図４】
【図６】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (10)
- 【請求項１】 精製及び分離されたヒトＭＫ蛋白質をコ
−ドする遺伝子。 - 【請求項２】 実質的に純粋なＭＫ蛋白質の製造法にお
いて、請求項１に記載の遺伝子を有する宿主細胞を形質
転換し、宿主細胞による遺伝子の発現を許す条件下で宿
主細胞を培養することから成ることを特徴とする方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の遺伝子を含む発現ベク
タ−。 - 【請求項４】 請求項１に記載の遺伝子を含む宿主細
胞。 - 【請求項５】 精製単離された図１に描いた配列を有す
るＭＫ蛋白質、及びＭＫ生物活性を保持しているその相
同体又はフラグメント。 - 【請求項６】 有効量のＭＫ蛋白質を、製薬上許容でき
るキャリヤ−と組み合わせて含む治療配合物。 - 【請求項７】 請求項６に記載の配合物において、蛋白
質が図１に描いた配列を有する、又はＭＫ生物活性を保
持しているその相同体又はフラグメントであることを特
徴とする配合物。 - 【請求項８】 試験管内の神経細胞の成長を保持、又は
促進する方法において、有効量の請求項５に記載の蛋白
質の存在下で細胞を培養することから成ることを特徴と
する方法。 - 【請求項９】 損傷神経細胞を生体内で修復又は治療す
る方法において、そのような治療の必要な個人にＭＫ蛋
白質を発現することができる適合性トランスジェニック
細胞を投与することから成ることを特徴とする方法。 - 【請求項１０】 未分化細胞の分化を起こす方法におい
て、有効量のＭＫ蛋白質を細胞に適用することを含む方
法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56857390A | 1990-08-20 | 1990-08-20 | |
| US568573 | 1990-08-20 | ||
| US650795 | 1991-02-05 | ||
| US07/650,795 US5210026A (en) | 1990-08-20 | 1991-02-05 | Human mk gene and method of expression |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06217778A true JPH06217778A (ja) | 1994-08-09 |
Family
ID=27074824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3228656A Pending JPH06217778A (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-14 | ヒトｍｋ遺伝子及び蛋白質の配列 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5210026A (ja) |
| EP (1) | EP0476233B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06217778A (ja) |
| KR (1) | KR920004570A (ja) |
| AT (1) | ATE134219T1 (ja) |
| AU (1) | AU636789B2 (ja) |
| CA (1) | CA2049370A1 (ja) |
| DE (1) | DE69117123T2 (ja) |
| DK (1) | DK0476233T3 (ja) |
| ES (1) | ES2085928T3 (ja) |
| GR (1) | GR3019059T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ239357A (ja) |
| PT (1) | PT98694A (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5461029A (en) * | 1992-04-24 | 1995-10-24 | American Cyanamid Company | Method of treating herpes viral infections using HBNF and MK proteins |
| GB9225928D0 (en) * | 1992-12-11 | 1993-02-03 | Cancer Res Campaign Tech | Growth factor |
| US5534615A (en) * | 1994-04-25 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Cardiac hypertrophy factor and uses therefor |
| US6472585B1 (en) | 1994-04-25 | 2002-10-29 | Genentech, Inc. | Cardiotrophin-1 defective mouse |
| US7258983B2 (en) * | 1994-04-25 | 2007-08-21 | Genentech, Inc. | Cardiotrophin-1 compositions and methods for the treatment of tumor |
| DK0755446T3 (da) * | 1994-04-25 | 2007-01-29 | Genentech Inc | Cardiotrophin og anvendelser deraf |
| JPH0995454A (ja) * | 1995-10-02 | 1997-04-08 | Meiji Milk Prod Co Ltd | 抗潰瘍組成物 |
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