JPH06225762A - 新規生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、その発現ベクターおよび形質転換体 - Google Patents
新規生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、その発現ベクターおよび形質転換体Info
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- JPH06225762A JPH06225762A JP5113601A JP11360193A JPH06225762A JP H06225762 A JPH06225762 A JP H06225762A JP 5113601 A JP5113601 A JP 5113601A JP 11360193 A JP11360193 A JP 11360193A JP H06225762 A JPH06225762 A JP H06225762A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 天然のヒト・ガンマインターフエロンよりも
活性の強いポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、その
発現ベクターおよび形質転換体を提供する。 【構成】 １４６個のアミノ酸からなるヒト・ガンマイ
ンターフエロンの第１番目から１３５番目までのアミノ
酸よりなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、その
配列を発現させうるＤＮＡ配列が上記配列に有効に連結
された発現ベクターおよびそのベクターによって形質転
換された転換体。 【効果】 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、その発現ベクターおよび形質転換体を用いて天然型
のヒト・ガンマインターフエロンよりも生理活性の強い
ポリペプチドを製造することができる。
活性の強いポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、その
発現ベクターおよび形質転換体を提供する。 【構成】 １４６個のアミノ酸からなるヒト・ガンマイ
ンターフエロンの第１番目から１３５番目までのアミノ
酸よりなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、その
配列を発現させうるＤＮＡ配列が上記配列に有効に連結
された発現ベクターおよびそのベクターによって形質転
換された転換体。 【効果】 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列、その発現ベクターおよび形質転換体を用いて天然型
のヒト・ガンマインターフエロンよりも生理活性の強い
ポリペプチドを製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な生理活性ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、その発現ベクターおよ
びその形質転換体に関する。
プチドをコードするＤＮＡ配列、その発現ベクターおよ
びその形質転換体に関する。
【０００２】本発明のＤＮＡ配列がコードする生理活性
ポリペプチドは、成熟ヒト・ガンマインターフエロン
（免疫インターフエロンとも呼ばれる）に含まれるアミ
ノ酸配列を有するが、それとは物理化学的な性質を異に
し且つそれに比べ非常に高い抗ウイルス並びに抗細胞増
殖活性を有する新規なポリペプチドである。また、本発
明は、組換えＤＮＡ技術を用いた該新規ポリペプチドの
製造に有用な発現ベクター並びにそれによって形質転換
された単細胞微生物転換体に関するものである。
ポリペプチドは、成熟ヒト・ガンマインターフエロン
（免疫インターフエロンとも呼ばれる）に含まれるアミ
ノ酸配列を有するが、それとは物理化学的な性質を異に
し且つそれに比べ非常に高い抗ウイルス並びに抗細胞増
殖活性を有する新規なポリペプチドである。また、本発
明は、組換えＤＮＡ技術を用いた該新規ポリペプチドの
製造に有用な発現ベクター並びにそれによって形質転換
された単細胞微生物転換体に関するものである。
【０００３】インターフエロンは、その物理化学的並び
に免疫学的性質などからα，β，γ型の３種に分けられ
ている。いずれも抗ウイルス活性を有するポリペプチド
からなる物質であるが、特にγ型インターフエロン（免
疫インターフエロンとも呼ばれる）は、α，β型インタ
ーフエロンに比べ、細胞増殖抑制効果が強いことから、
抗ウイルス製剤の他に抗腫瘍剤や免疫調節剤としての利
用が注目されている。ヒト・ガンマインターフエロン
（以下ｈＩＦＮ−γと略す）については、１９８１年１
０月米国サンフランシスコで開かれた第２回インターフ
エロン研究国際会議（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕ
ａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ
ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
において、そのアミノ酸配列が示され、その後該アミノ
酸配列をコードしているヒト遺伝子のＤＮＡ配列も明ら
かにされている（Ｒ．Ｄｅｖｏｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄ．Ｒｅｓ．，１０：２４８７，１９８２およびＰ．
Ｗ．Ｇｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０３，１９８
２）。さらに、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡを用いたプレｈＧＩＦ−γおよび成熟ｈＩＦ
Ｎ−γの製造法に関する特許も公開されている（特開昭
５８−９０５１４）。
に免疫学的性質などからα，β，γ型の３種に分けられ
ている。いずれも抗ウイルス活性を有するポリペプチド
からなる物質であるが、特にγ型インターフエロン（免
疫インターフエロンとも呼ばれる）は、α，β型インタ
ーフエロンに比べ、細胞増殖抑制効果が強いことから、
抗ウイルス製剤の他に抗腫瘍剤や免疫調節剤としての利
用が注目されている。ヒト・ガンマインターフエロン
（以下ｈＩＦＮ−γと略す）については、１９８１年１
０月米国サンフランシスコで開かれた第２回インターフ
エロン研究国際会議（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕ
ａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ
ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
において、そのアミノ酸配列が示され、その後該アミノ
酸配列をコードしているヒト遺伝子のＤＮＡ配列も明ら
かにされている（Ｒ．Ｄｅｖｏｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄ．Ｒｅｓ．，１０：２４８７，１９８２およびＰ．
Ｗ．Ｇｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０３，１９８
２）。さらに、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡを用いたプレｈＧＩＦ−γおよび成熟ｈＩＦ
Ｎ−γの製造法に関する特許も公開されている（特開昭
５８−９０５１４）。
【０００４】ヒト・リンパ球又は膵臓細胞から得られる
天然のｈＩＦＮ−γは、糖蛋白であるが、その物理化学
的性状についてはまだ不明瞭なところが多い。成熟ｈＩ
ＦＮ−γの蛋白の部分については、組換えＤＮＡ技術に
より１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドであるこ
とが示されているが、その活性部位やＣ末端部位の真の
構造（例えば、Ｃ末端アミノ酸がフリーであるか何らか
の修飾を受けているか）については不明である。
天然のｈＩＦＮ−γは、糖蛋白であるが、その物理化学
的性状についてはまだ不明瞭なところが多い。成熟ｈＩ
ＦＮ−γの蛋白の部分については、組換えＤＮＡ技術に
より１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドであるこ
とが示されているが、その活性部位やＣ末端部位の真の
構造（例えば、Ｃ末端アミノ酸がフリーであるか何らか
の修飾を受けているか）については不明である。
【０００５】本発明者らは、１４６個のアミノ酸からな
るｈＩＦＮ−γ（以下ＧＩＦ１４６と略す）の活性部位
およびＣ末端部位の生理活性に及ぼす効果について鋭意
研究の結果、特に、１番目から１３５番目までのポリペ
プチド（以下ＧＩＦ１３５と略す）が、驚くべきことに
ＧＩＦ１４６に比べ極めて高い生理活性を有すること、
また物理化学的性質も異なること、さらには該ＧＩＦ１
３５ポリペプチドを化学的に合成した遺伝子を用いた組
換えＤＮＡ技術で製造できることを見出し、本発明を完
成するに至った。また、ＧＩＦ１３５で代表される本発
明のポリペプチドは、ＧＩＦ１４６に比べ形質転換株培
養菌体からの抽出が容易であり、且つ安定性も高いとい
う特徴を有しており、従来のＧＩＦ１４６とは異なる新
規な生理活性物質と言える。
るｈＩＦＮ−γ（以下ＧＩＦ１４６と略す）の活性部位
およびＣ末端部位の生理活性に及ぼす効果について鋭意
研究の結果、特に、１番目から１３５番目までのポリペ
プチド（以下ＧＩＦ１３５と略す）が、驚くべきことに
ＧＩＦ１４６に比べ極めて高い生理活性を有すること、
また物理化学的性質も異なること、さらには該ＧＩＦ１
３５ポリペプチドを化学的に合成した遺伝子を用いた組
換えＤＮＡ技術で製造できることを見出し、本発明を完
成するに至った。また、ＧＩＦ１３５で代表される本発
明のポリペプチドは、ＧＩＦ１４６に比べ形質転換株培
養菌体からの抽出が容易であり、且つ安定性も高いとい
う特徴を有しており、従来のＧＩＦ１４６とは異なる新
規な生理活性物質と言える。
【０００６】本発明は、次のアミノ酸配列：
【化６】 で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただし、Ｘは
水素原子又はメチオニル基を表わす）をコードするＤＮ
Ａ配列、その配列が前記ポリペプチドを発現させうるＤ
ＮＡ配列に有効に連結している発現ベクター、およびそ
のベクターによって形質転換された単細胞微生物形質転
換株である。
水素原子又はメチオニル基を表わす）をコードするＤＮ
Ａ配列、その配列が前記ポリペプチドを発現させうるＤ
ＮＡ配列に有効に連結している発現ベクター、およびそ
のベクターによって形質転換された単細胞微生物形質転
換株である。
【０００７】上記のポリペプチド（ＧＩＦ１３５）をコ
ードするＤＮＡの好ましい配列は次のとおりである。
ードするＤＮＡの好ましい配列は次のとおりである。
【化７】
【０００８】以下、ＧＩＦ１３５を例として詳しく本発
明を説明する。ＧＩＦ１３５生産株の１つ（ＷＡ８０２
／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５）は、プラスミドｐｔａｃＧ
ＩＦ５４ｃｉq （特願昭５８−１６２３３７に開示）に
組みこまれている化学的に合成したＧＩＦ１４６をコー
ドする遺伝子の下流領域に、化学的に合成したＤＮＡ断
片を挿入し、さらにランナウエイプラスミドＤＮＡを挿
入して得たプラスミドによって、大腸菌を形質転換する
ことにより得た（図１参照）。
明を説明する。ＧＩＦ１３５生産株の１つ（ＷＡ８０２
／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５）は、プラスミドｐｔａｃＧ
ＩＦ５４ｃｉq （特願昭５８−１６２３３７に開示）に
組みこまれている化学的に合成したＧＩＦ１４６をコー
ドする遺伝子の下流領域に、化学的に合成したＤＮＡ断
片を挿入し、さらにランナウエイプラスミドＤＮＡを挿
入して得たプラスミドによって、大腸菌を形質転換する
ことにより得た（図１参照）。
【０００９】他のＧＩＦ１３５生産株（ＷＡ８０２／ｐ
ＩＮＧＩＦ１３５もしくはＷ３１１０／ｐＩＮＧＩＦ１
３５）は、上記（図１）で得たｐｔａｃＧＩＦ１３５の
ＢａｌIIとＰａｔＩによるＤＮＡ断片（ｉq 遺伝子を含
む側の断片）と、ｐＩＮ５ＧＩＦ５４Ｃ（特願昭５８−
１３２５２４図４に開示）のＢａｌIIとＰｓｔＩによる
ＤＮＡ断片（ｌｐｐプロモーター，ＧＩＦ遺伝子を含
む）とをライゲーシヨンして得られるプラスミドｐＩＮ
ＧＩＦ１３５（図２参照）を、大腸菌ＷＡ８０２もしく
はＷ３１１０株に形質転換することによって得ることが
できる。
ＩＮＧＩＦ１３５もしくはＷ３１１０／ｐＩＮＧＩＦ１
３５）は、上記（図１）で得たｐｔａｃＧＩＦ１３５の
ＢａｌIIとＰａｔＩによるＤＮＡ断片（ｉq 遺伝子を含
む側の断片）と、ｐＩＮ５ＧＩＦ５４Ｃ（特願昭５８−
１３２５２４図４に開示）のＢａｌIIとＰｓｔＩによる
ＤＮＡ断片（ｌｐｐプロモーター，ＧＩＦ遺伝子を含
む）とをライゲーシヨンして得られるプラスミドｐＩＮ
ＧＩＦ１３５（図２参照）を、大腸菌ＷＡ８０２もしく
はＷ３１１０株に形質転換することによって得ることが
できる。
【００１０】ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５につ
いてさらに詳しく述べると、まず、プラスミドｐｔａｃ
ＧＩＦ５４ｃｉq を制限酵素ＢａｌIIとＳａｌＩで処理
することにより、ＧＩＦ１４６をコードする遺伝子の下
流のＤＮＡ断片（１３４番目のＡｒｇをコードする部位
から翻訳終止コドンのすぐ下流のＳａｌＩ断点までのＤ
ＮＡ断片）を除き、その代りに、ＢａｌIIとＳａｌＩ粘
着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）および２つの翻訳
終止コドン（ＴＡＡとＴＡＧ）をもつ化学的に合成した
ＤＮＡ断片
いてさらに詳しく述べると、まず、プラスミドｐｔａｃ
ＧＩＦ５４ｃｉq を制限酵素ＢａｌIIとＳａｌＩで処理
することにより、ＧＩＦ１４６をコードする遺伝子の下
流のＤＮＡ断片（１３４番目のＡｒｇをコードする部位
から翻訳終止コドンのすぐ下流のＳａｌＩ断点までのＤ
ＮＡ断片）を除き、その代りに、ＢａｌIIとＳａｌＩ粘
着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）および２つの翻訳
終止コドン（ＴＡＡとＴＡＧ）をもつ化学的に合成した
ＤＮＡ断片
【化８】 を挿入することにより、ＧＩＦ１３５をコードする遺伝
子を有するプラスミドｐｔａｃＧＩＦ１３５を造成した
（図２参照）。次に、これにランナウエイＤＮＡをｐＹ
Ｈ３０７より導入し、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５を造成
し、該プラスミドを大腸菌ＷＡ８０２に形質転換した。
そして、該形質転換株（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３５）の抗ウイルス活性を、ＧＩＦ１４６遺伝子をも
つプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦによる形質転換株（ＷＡ
８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ）と比較した結果、ＷＡ８０
２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５はおどろくべき高い抗ウイ
ルス活性を示した（表１参照）。
子を有するプラスミドｐｔａｃＧＩＦ１３５を造成した
（図２参照）。次に、これにランナウエイＤＮＡをｐＹ
Ｈ３０７より導入し、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５を造成
し、該プラスミドを大腸菌ＷＡ８０２に形質転換した。
そして、該形質転換株（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３５）の抗ウイルス活性を、ＧＩＦ１４６遺伝子をも
つプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦによる形質転換株（ＷＡ
８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ）と比較した結果、ＷＡ８０
２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５はおどろくべき高い抗ウイ
ルス活性を示した（表１参照）。
【００１１】ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５は、ｈＩＦＮ−γ
遺伝子の下流領域を除き、プラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ
と同じＤＮＡ配列を有するプラスミドであり、また、用
いた宿主細胞も同じである。然るに、本発明におけるＧ
ＩＦ１３５遺伝子をもつプラスミドによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５は、表
１に示した如く、ｐＹｔａｃＧＩＦによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦに比べ、驚く
べく高い抗ウイルス活性を示した。即ち、アンピシリン
およびカナマイシンを含むＬ−ｂｒｏｔｈで培養（ＩＰ
ＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラフトシドによる誘
導培養）で得られる形質転換株細胞を、凍結・融解によ
って破砕した後の遠沈上清液（ｓｕｐ）では約３５倍、
遠心残基を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出した画分
（ｐｐｔ）では約９６倍という高い抗ウイルス活性を示
した（総活性量でみると約７３倍）。両形質転換株のも
つプラスミドは、ｈＩＦＮ−γ遺伝子の部分だけが異な
り各々のポリペプチド（ＧＩＦ１４６とＧＩＦ１３５）
の生産量は理論的に同じと考えられることから、表１に
示す結果は、本発明のＧＩＦ１３５が従来のＧＩＦ１４
６に比べ、極めて強い生理活性を有するポリペプチドで
あることを強く示唆している。
遺伝子の下流領域を除き、プラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ
と同じＤＮＡ配列を有するプラスミドであり、また、用
いた宿主細胞も同じである。然るに、本発明におけるＧ
ＩＦ１３５遺伝子をもつプラスミドによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５は、表
１に示した如く、ｐＹｔａｃＧＩＦによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦに比べ、驚く
べく高い抗ウイルス活性を示した。即ち、アンピシリン
およびカナマイシンを含むＬ−ｂｒｏｔｈで培養（ＩＰ
ＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラフトシドによる誘
導培養）で得られる形質転換株細胞を、凍結・融解によ
って破砕した後の遠沈上清液（ｓｕｐ）では約３５倍、
遠心残基を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出した画分
（ｐｐｔ）では約９６倍という高い抗ウイルス活性を示
した（総活性量でみると約７３倍）。両形質転換株のも
つプラスミドは、ｈＩＦＮ−γ遺伝子の部分だけが異な
り各々のポリペプチド（ＧＩＦ１４６とＧＩＦ１３５）
の生産量は理論的に同じと考えられることから、表１に
示す結果は、本発明のＧＩＦ１３５が従来のＧＩＦ１４
６に比べ、極めて強い生理活性を有するポリペプチドで
あることを強く示唆している。
【００１２】また、細胞破砕遠沈上清部（ｓｕｐ）と沈
澱部を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出された画分
（ｐｐｔ）の抗ウイルス活性の比（ｓｕｐ／ｐｐｔ）
は、ｐＹｔａｃＧＩＦでは０．６２、ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３５では０．２３であり、ＧＩＦ１３５はＧＩＦ１４
６とは物理化学的性質（例えば細胞膜又は細胞壁への吸
着性）においても異なると考えられる（表１参照）。さ
らに、ＧＩＦ１３５は尿素溶液によく溶解するが、ＧＩ
Ｆ１４６は尿素にさらに塩類（たとえば食塩）を加えた
溶液でないとよく溶解しないなど、各々の溶解度に明ら
かな差異が認められた。
澱部を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出された画分
（ｐｐｔ）の抗ウイルス活性の比（ｓｕｐ／ｐｐｔ）
は、ｐＹｔａｃＧＩＦでは０．６２、ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３５では０．２３であり、ＧＩＦ１３５はＧＩＦ１４
６とは物理化学的性質（例えば細胞膜又は細胞壁への吸
着性）においても異なると考えられる（表１参照）。さ
らに、ＧＩＦ１３５は尿素溶液によく溶解するが、ＧＩ
Ｆ１４６は尿素にさらに塩類（たとえば食塩）を加えた
溶液でないとよく溶解しないなど、各々の溶解度に明ら
かな差異が認められた。
【００１３】
【表１】 註１：凍結・融解による細胞破砕後の遠沈上清区分 註２：同上遠沈沈澱物を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで
抽出した区分
抽出した区分
【００１４】これらの事実は、本発明のポリペプチド
は、生理的活性の面で秀れているばかりか、物理化学的
にもＧＩＦ１４６とは明らかに異なるすぐれた性質を有
していることを示している。本発明のポリペプチドはＧ
ＩＦ１４６のポリペプチド構造に含まれてはいるが、本
発明のポリペプチドが上記のような秀れた性質を有する
ことは、ＧＩＦ１４６の構造からは容易に考えつくもの
ではないことは明らかである。
は、生理的活性の面で秀れているばかりか、物理化学的
にもＧＩＦ１４６とは明らかに異なるすぐれた性質を有
していることを示している。本発明のポリペプチドはＧ
ＩＦ１４６のポリペプチド構造に含まれてはいるが、本
発明のポリペプチドが上記のような秀れた性質を有する
ことは、ＧＩＦ１４６の構造からは容易に考えつくもの
ではないことは明らかである。
【００１５】かくして、本発明のポリペプチドは、新規
な抗ウイルス剤，抗腫瘍剤又免疫調節剤として非常に興
味のあるものである。
な抗ウイルス剤，抗腫瘍剤又免疫調節剤として非常に興
味のあるものである。
【００１６】尚、本発明におけるＧＩＦ１３５生産株
が、期待通りの１３５個のアミノ酸残基からなるポリペ
プチドであることを、電気泳動による解析並びにアミノ
酸分析から明らかにすることができた。即ち、アミノ酸
分析では、アミノ酸組成値が期待値とよく一致し、さら
にカルボキシペプチダーゼを用いたカルボキシル末端分
析より、ＧＩＦ１３５のカルボキシル末端部分が期待通
りであることを示唆するデータを得ることができた。以
下、具体的実施例をもって本発明を説明する。尚、以下
の実施例ではＧＩＦ１３５およびｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５に関する例を示すが、本発明の範囲はこれらに限るも
のではない。
が、期待通りの１３５個のアミノ酸残基からなるポリペ
プチドであることを、電気泳動による解析並びにアミノ
酸分析から明らかにすることができた。即ち、アミノ酸
分析では、アミノ酸組成値が期待値とよく一致し、さら
にカルボキシペプチダーゼを用いたカルボキシル末端分
析より、ＧＩＦ１３５のカルボキシル末端部分が期待通
りであることを示唆するデータを得ることができた。以
下、具体的実施例をもって本発明を説明する。尚、以下
の実施例ではＧＩＦ１３５およびｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５に関する例を示すが、本発明の範囲はこれらに限るも
のではない。
【００１７】実施例 １．ＧＩＦ１３５の作製 １）ｐｔａｃＧＩＦ１３５の作製 プラスミドｐｔａｃＧＩＦ５４ｃｉq （特願昭５８−１
６２３３７図３に開示）のＤＮＡ２μｇを１０ｍＭ塩化
マグネシウム，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）５０μｌに溶解し、ＢｇｌII１０単
位，ＳａｌＩ１０単位を加え、３７℃で１時間反応させ
て、アガロースゲル電気泳動にかけ、目的とする約７ｋ
ｂのＢｇｌII−ＳａｌＩ断片を電気泳動的に抽出し、フ
ェノール処理後、アルコールを加え、目的とする約７ｋ
ｂのＤＮＡ断片を沈澱物として得た。次に固相法（特願
昭５７−８６１８０参照）により合成した１１ｍｅｒの
２つのオリゴヌクレオチド（図１ならびに図３に塩基配
列を示す）は各々２０ｐｍｏｌｅを１０μｌの６．６ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、４ｍＭＡＴＰ１μｌとポリヌ
クレオチドキナーゼ２単位を加え、３７℃３０分反応さ
せ、５′−ＯＨをリン酸化した。先に調整した約７ｋｂ
のＢｇｌII−ＳａｌＩＤＮＡ断片を１０μｌの６．６ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）（以下ライゲーション溶液と略す）に溶かし、
そこに化学合成したＤＮＡ断片１０μｌを加え、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃一夜反応を行なっ
た。このＤＮＡを用いて、大腸菌ＷＡ８０２を常法に従
い形質転換した。形質転換株の選択はアンピシリン４０
μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行ない、アンピシリン
耐性の多数の形質転換株より１８株についてプラスミド
ＤＮＡを分離し制限酵素による解折を行なったところ、
すべてのプラスミドが目的のｐｔａｃＧＩＦ１３５であ
った。
６２３３７図３に開示）のＤＮＡ２μｇを１０ｍＭ塩化
マグネシウム，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）５０μｌに溶解し、ＢｇｌII１０単
位，ＳａｌＩ１０単位を加え、３７℃で１時間反応させ
て、アガロースゲル電気泳動にかけ、目的とする約７ｋ
ｂのＢｇｌII−ＳａｌＩ断片を電気泳動的に抽出し、フ
ェノール処理後、アルコールを加え、目的とする約７ｋ
ｂのＤＮＡ断片を沈澱物として得た。次に固相法（特願
昭５７−８６１８０参照）により合成した１１ｍｅｒの
２つのオリゴヌクレオチド（図１ならびに図３に塩基配
列を示す）は各々２０ｐｍｏｌｅを１０μｌの６．６ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、４ｍＭＡＴＰ１μｌとポリヌ
クレオチドキナーゼ２単位を加え、３７℃３０分反応さ
せ、５′−ＯＨをリン酸化した。先に調整した約７ｋｂ
のＢｇｌII−ＳａｌＩＤＮＡ断片を１０μｌの６．６ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．６）（以下ライゲーション溶液と略す）に溶かし、
そこに化学合成したＤＮＡ断片１０μｌを加え、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃一夜反応を行なっ
た。このＤＮＡを用いて、大腸菌ＷＡ８０２を常法に従
い形質転換した。形質転換株の選択はアンピシリン４０
μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行ない、アンピシリン
耐性の多数の形質転換株より１８株についてプラスミド
ＤＮＡを分離し制限酵素による解折を行なったところ、
すべてのプラスミドが目的のｐｔａｃＧＩＦ１３５であ
った。
【００１８】２）ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５の作製 ＧＩＦ１３５の発現をコピー数増加により上げる目的で
ｐｔａｃＧＩＦ１３５のＥｃｏＲＩ断点にランナウエイ
プラスミドｐＹＭ３０７の長い方のＥｃｏＲＩＤＮＡ断
片を挿入した。尚、ｐＹＭ３０７をもつ大腸菌はＷ６２
０ｒｅｃＡ／ｐＹＭ３０７と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている（微工研菌条第３４５
号，ＦＥＲＭ ＢＰ−３４５）。
ｐｔａｃＧＩＦ１３５のＥｃｏＲＩ断点にランナウエイ
プラスミドｐＹＭ３０７の長い方のＥｃｏＲＩＤＮＡ断
片を挿入した。尚、ｐＹＭ３０７をもつ大腸菌はＷ６２
０ｒｅｃＡ／ｐＹＭ３０７と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている（微工研菌条第３４５
号，ＦＥＲＭ ＢＰ−３４５）。
【００１９】まずｐｔａｃＧＩＦ１３５ＤＮＡ２μｇ，
ｐＹＭ３０７ＤＮＡ２μｇを各々５０μｌの６６ｍＭ酢
酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭ
ジチオスレイトールを含む３３ｍＭトリス酢酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、ＥｃｏＲＩ５単位を加え、３
７℃１時間反応させ、その後６５℃で１５分加熱するこ
とにより、制限酵素を不活化した後、エタノールを加
え、ＤＮＡを沈澱物として得た。これを真空乾燥後、２
０μｌのライゲーション溶液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡライ
ゲース１単位を加え、１６℃一夜ライゲーションを行な
った。このＤＮＡを用いて大腸菌ＷＡ８０２を形質転換
した。形質転換時の温度は２８℃で行なった。形質転換
株の選択は、アンピシリン４０μｇ／ｍｌカナマイシン
２０μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行なった。こうし
て得られた多数のアンピシリン，カナマイシン両耐性を
示す形質転換株より適当に１２株選んでプラスミドを分
離し、制限酵素による解析を行った。その結果、すべて
の株において目的とするプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ１
３５を有していることを確認することができた。
ｐＹＭ３０７ＤＮＡ２μｇを各々５０μｌの６６ｍＭ酢
酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭ
ジチオスレイトールを含む３３ｍＭトリス酢酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、ＥｃｏＲＩ５単位を加え、３
７℃１時間反応させ、その後６５℃で１５分加熱するこ
とにより、制限酵素を不活化した後、エタノールを加
え、ＤＮＡを沈澱物として得た。これを真空乾燥後、２
０μｌのライゲーション溶液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡライ
ゲース１単位を加え、１６℃一夜ライゲーションを行な
った。このＤＮＡを用いて大腸菌ＷＡ８０２を形質転換
した。形質転換時の温度は２８℃で行なった。形質転換
株の選択は、アンピシリン４０μｇ／ｍｌカナマイシン
２０μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行なった。こうし
て得られた多数のアンピシリン，カナマイシン両耐性を
示す形質転換株より適当に１２株選んでプラスミドを分
離し、制限酵素による解析を行った。その結果、すべて
の株において目的とするプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ１
３５を有していることを確認することができた。
【００２０】２．抗ウイルス活性の測定 ガンマ・インターフエロンの活性量を調べるため、ＷＡ
８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦとＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧ
ＩＦ１３５をＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む）２ｍｌで２８℃一夜培養し、この菌体０．２
ｍｌを４ｍｌのＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む）に接種し、３２℃でＯＤ６６０でおよそ
０．７まで培養し、１００ｍＭＩＰＴＧ溶液を０．２ｍ
ｌ添加後、３７℃で３時間培養した。この培養液１ｍｌ
を１０，０００ｒｐｍ５分遠心し、得られた菌体に１ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチーム、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、５００
μｌを加え氷中１０分放置し、浴菌を行なった。その後
ドライアイス−エタノール中で急速に凍結、３７℃恒温
槽で急速融解を３回くり返し菌体を破壊後、１０，００
０ｒｐｍ１０分遠心し、その上清を抗ウイルス活性の測
定に用いた。抗ウイルス活性は特願昭５７−８６１８０
に開示した方法に準じて測定した。さらに沈澱分画より
目的とするポリペプチドをさらに回収するため、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む８Ｍ尿素溶液５００μｌを沈
澱に加え、超音波処理を行ない、１０，０００ｒｐｍ１
０分遠心後の上清を集めたところ、この上清部に非常に
高い抗ウイルス活性を認めた。これらの抗ウイルス活性
について調べた結果は表１に示した。上記実施例におい
て、本発明者らは同じ発現系のベクターを用いたにもか
かわらず、表１に示すように、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
によって形質転換された大腸菌が、ｐＹｔａｃＧＩＦに
よって形質転換された大腸菌に比べ非常に高い抗ウイル
ス活性（総活性量で約７３倍）を与えたことは、本発明
におけるＧＩＦ１３５が、従来のＧＩＦ１４６にはない
秀れた抗ウイルス活性を有するポリペプチドであること
を強く示唆している。
８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦとＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧ
ＩＦ１３５をＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む）２ｍｌで２８℃一夜培養し、この菌体０．２
ｍｌを４ｍｌのＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む）に接種し、３２℃でＯＤ６６０でおよそ
０．７まで培養し、１００ｍＭＩＰＴＧ溶液を０．２ｍ
ｌ添加後、３７℃で３時間培養した。この培養液１ｍｌ
を１０，０００ｒｐｍ５分遠心し、得られた菌体に１ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチーム、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、５００
μｌを加え氷中１０分放置し、浴菌を行なった。その後
ドライアイス−エタノール中で急速に凍結、３７℃恒温
槽で急速融解を３回くり返し菌体を破壊後、１０，００
０ｒｐｍ１０分遠心し、その上清を抗ウイルス活性の測
定に用いた。抗ウイルス活性は特願昭５７−８６１８０
に開示した方法に準じて測定した。さらに沈澱分画より
目的とするポリペプチドをさらに回収するため、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む８Ｍ尿素溶液５００μｌを沈
澱に加え、超音波処理を行ない、１０，０００ｒｐｍ１
０分遠心後の上清を集めたところ、この上清部に非常に
高い抗ウイルス活性を認めた。これらの抗ウイルス活性
について調べた結果は表１に示した。上記実施例におい
て、本発明者らは同じ発現系のベクターを用いたにもか
かわらず、表１に示すように、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
によって形質転換された大腸菌が、ｐＹｔａｃＧＩＦに
よって形質転換された大腸菌に比べ非常に高い抗ウイル
ス活性（総活性量で約７３倍）を与えたことは、本発明
におけるＧＩＦ１３５が、従来のＧＩＦ１４６にはない
秀れた抗ウイルス活性を有するポリペプチドであること
を強く示唆している。
【００２１】３．アミノ酸分析 ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５およびＷＡ８０２
／ｐＹｔａｃＧＩＦの培養菌体から、実施例２に記した
方法に準じて各々のポリペプチドを抽出し、部分精製物
をＳＤＳゲル電気泳動にかけた。次に、ＧＩＦ１３５な
らびにＧＩＦ１４６の分子量に相当する位置のゲル断片
を切り出し、各々のポリペプチドを抽出し充分に水に対
し透析した後アミノ酸分析を行った。
／ｐＹｔａｃＧＩＦの培養菌体から、実施例２に記した
方法に準じて各々のポリペプチドを抽出し、部分精製物
をＳＤＳゲル電気泳動にかけた。次に、ＧＩＦ１３５な
らびにＧＩＦ１４６の分子量に相当する位置のゲル断片
を切り出し、各々のポリペプチドを抽出し充分に水に対
し透析した後アミノ酸分析を行った。
【００２２】尚、ＳＤＳゲル上のＧＩＦ１３５に相当す
るバンドは、明らかにＧＩＦ１４６に相当するバンドよ
り低分子側にシフトしており、各々のバンドは期待され
る分子量に相当する位置にみることができた。
るバンドは、明らかにＧＩＦ１４６に相当するバンドよ
り低分子側にシフトしており、各々のバンドは期待され
る分子量に相当する位置にみることができた。
【００２３】（１）アミノ酸組成の分析 約１ｎｍｏｌの該ポリペプチド抽出物を減圧乾固後、
０．１％フェノールを含む１００μｌの６ＭＨＣｌを加
え、１１０℃で２４，４８，７２時間減圧下に加水分解
を行った。又、別に過ギ酸酸化後のサンプルを６ＮＨＣ
ｌで１１０℃，２４時間加水分解した。加水分解物は、
アミノ酸分析機（日立８３５−５０型）を用い、常法に
従いアミノ酸分析を行った。その結果を表２に示した。
０．１％フェノールを含む１００μｌの６ＭＨＣｌを加
え、１１０℃で２４，４８，７２時間減圧下に加水分解
を行った。又、別に過ギ酸酸化後のサンプルを６ＮＨＣ
ｌで１１０℃，２４時間加水分解した。加水分解物は、
アミノ酸分析機（日立８３５−５０型）を用い、常法に
従いアミノ酸分析を行った。その結果を表２に示した。
【００２４】尚、表２のＭｅｔ（メチオニン）値から、
翻訳開始点のアミノ酸であるメチオニンは、両ポリペプ
チドともそのアミノ末端に付加されていたとしても多く
はないと考えられる。
翻訳開始点のアミノ酸であるメチオニンは、両ポリペプ
チドともそのアミノ末端に付加されていたとしても多く
はないと考えられる。
【００２５】
【表２】 Ａ：ＣｙＳＯ3 ＨとしてＣｙｓを計算した。 Ｂ：Ｏタイムに外挿して計算した。 Ｃ：７２時間加水分解の値を示した。 Ｄ：Ｌｅｕの組成値を基準に他のアミノ酸値を算出し
た。 Ｅ：Ｔｒｐは本実験の条件では、分解してしまうため測
定できない。 Ｆ：ＧＩＦ１４６は２４時間の値を示した。
た。 Ｅ：Ｔｒｐは本実験の条件では、分解してしまうため測
定できない。 Ｆ：ＧＩＦ１４６は２４時間の値を示した。
【００２６】（２）カルボキシル末端の分析 上記ＳＤＳゲル電気泳動のバンドから抽出されたサンプ
ルを適当に前処理（ｐＨや容量などの調整）後、適当な
濃度のカルボキシペプチダーゼＡ溶液あるいはＡとＢの
混合酵素溶液を加え、３７℃で４時間反応させた。反応
後、０．０２ＭＨＣｌを加えさらに７０％ギ酸でｐＨ，
容量を調整し、常法に従いアミノ酸分析を行った。
ルを適当に前処理（ｐＨや容量などの調整）後、適当な
濃度のカルボキシペプチダーゼＡ溶液あるいはＡとＢの
混合酵素溶液を加え、３７℃で４時間反応させた。反応
後、０．０２ＭＨＣｌを加えさらに７０％ギ酸でｐＨ，
容量を調整し、常法に従いアミノ酸分析を行った。
【００２７】その結果、ＧＩＦ１３５をカルボキシペプ
チダーゼＡとＢで処理したサンプルでは、Ｓｅｒ（１．
０），Ａｒｇ（１．８），Ｌｙｓ（２．７），Ｇｌｙ
（０．９），Ｔｈｒ（１．１），Ａｌａ（１．０）の各
アミノ酸のみが検出され* 、またカルボキシペプチダー
ゼＡの場合は、Ｓｅｒ（０．７），Ａｒｇ（０．２），
Ｌｙｓ（０．１）が検出された。これらの結果は、ＧＩ
Ｆ１３５のカルボキシル末端部分が期待されるアミノ酸
配列を有していることを強く示唆するものである。
チダーゼＡとＢで処理したサンプルでは、Ｓｅｒ（１．
０），Ａｒｇ（１．８），Ｌｙｓ（２．７），Ｇｌｙ
（０．９），Ｔｈｒ（１．１），Ａｌａ（１．０）の各
アミノ酸のみが検出され* 、またカルボキシペプチダー
ゼＡの場合は、Ｓｅｒ（０．７），Ａｒｇ（０．２），
Ｌｙｓ（０．１）が検出された。これらの結果は、ＧＩ
Ｆ１３５のカルボキシル末端部分が期待されるアミノ酸
配列を有していることを強く示唆するものである。
【００２８】＊註：カッコ内の数値は、同ＧＩＦ１３５
サンプルを酸加水分解して得られた各アミノ酸のモル比
を基準に計算した。
サンプルを酸加水分解して得られた各アミノ酸のモル比
を基準に計算した。
【図１】ＧＩＦ１３５ポリペプチド発現ベクターｐＹｔ
ａｃＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
ａｃＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
【図２】ＧＩＦ１３５ポリペプチド発現ベクターｐＩＮ
ＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
ＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
【図３】ＧＩＦ１３５生産用ベクターを造成するための
ＧＩＦ１４６のＣ末端付近の塩基配列の改変方法を示
す。
ＧＩＦ１４６のＣ末端付近の塩基配列の改変方法を示
す。
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月１１日
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 新規生理活性ポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列、その発現ベクターおよび形質転換体
るＤＮＡ配列、その発現ベクターおよび形質転換体
【特許請求の範囲】
【化１】で表わされる生理活性ポリペプチド（ただし、
Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコードす
るＤＮＡ配列。
Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコードす
るＤＮＡ配列。
【化２】を含むことを特徴とする請求項１または２記載
のＤＮＡ配列。
のＤＮＡ配列。
【化３】で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただ
し、Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコー
ドするＤＮＡ配列が、該ポリペプチドを発現させうるＤ
ＮＡ配列に有効に連結していることを特徴とする発現ベ
クター。
し、Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコー
ドするＤＮＡ配列が、該ポリペプチドを発現させうるＤ
ＮＡ配列に有効に連結していることを特徴とする発現ベ
クター。
【化４】で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただ
し、Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコー
ドする遺伝子が発現されうるように組み込まれた発現ベ
クターによって形質転換された単細胞微生物形質転換
体。
し、Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコー
ドする遺伝子が発現されうるように組み込まれた発現ベ
クターによって形質転換された単細胞微生物形質転換
体。
【化５】で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただ
し、Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコー
ドするＤＮＡ配列が、該ポリペプチドを発現させうるＤ
ＮＡ配列に有効に連結しているものである請求項１０記
載の形質転換体。
し、Ｘは水素原子またはメチオニル基を表わす）をコー
ドするＤＮＡ配列が、該ポリペプチドを発現させうるＤ
ＮＡ配列に有効に連結しているものである請求項１０記
載の形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な生理活性ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列、その発現ベクターおよ
びその形質転換体に関する。
プチドをコードするＤＮＡ配列、その発現ベクターおよ
びその形質転換体に関する。
【０００２】本発明のＤＮＡ配列がコードする生理活性
ポリペプチドは、成熟ヒト・ガンマインターフエロン
（免疫インターフエロンとも呼ばれる）に含まれるアミ
ノ酸配列を有するが、それとは物理化学的な性質を異に
し且つそれに比べ非常に高い抗ウイルス並びに抗細胞増
殖活性を有する新規なポリペプチドである。また、本発
明は、組換えＤＮＡ技術を用いた該新規ポリペプチドの
製造に有用な発現ベクター並びにそれによって形質転換
された単細胞微生物転換体に関するものである。
ポリペプチドは、成熟ヒト・ガンマインターフエロン
（免疫インターフエロンとも呼ばれる）に含まれるアミ
ノ酸配列を有するが、それとは物理化学的な性質を異に
し且つそれに比べ非常に高い抗ウイルス並びに抗細胞増
殖活性を有する新規なポリペプチドである。また、本発
明は、組換えＤＮＡ技術を用いた該新規ポリペプチドの
製造に有用な発現ベクター並びにそれによって形質転換
された単細胞微生物転換体に関するものである。
【０００３】インターフエロンは、その物理化学的並び
に免疫学的性質などからα，β，γ型の３種に分けられ
ている。いずれも抗ウイルス活性を有するポリペプチド
からなる物質であるが、特にγ型インターフエロン（免
疫インターフエロンとも呼ばれる）は、α，β型インタ
ーフエロンに比べ、細胞増殖抑制効果が強いことから、
抗ウイルス製剤の他に抗腫瘍剤や免疫調節剤としての利
用が注目されている。ヒト・ガンマインターフエロン
（以下ｈＩＦＮ−γと略す）については、１９８１年１
０月米国サンフランシスコで開かれた第２回インターフ
エロン研究国際会議（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕ
ａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ
ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
において、そのアミノ酸配列が示され、その後該アミノ
酸配列をコードしているヒト遺伝子のＤＮＡ配列も明ら
かにされている（Ｒ．Ｄｅｖｏｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄ．Ｒｅｓ．，１０：２４８７，１９８２およびＰ．
Ｗ，Ｇｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０３，１９８
２）。さらに、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡを用いたプレｈＩＦＮ−γおよび成熟ｈＩＦ
Ｎ−γの製造法に関する特許も公開されている（特開昭
５８−９０５１４）。
に免疫学的性質などからα，β，γ型の３種に分けられ
ている。いずれも抗ウイルス活性を有するポリペプチド
からなる物質であるが、特にγ型インターフエロン（免
疫インターフエロンとも呼ばれる）は、α，β型インタ
ーフエロンに比べ、細胞増殖抑制効果が強いことから、
抗ウイルス製剤の他に抗腫瘍剤や免疫調節剤としての利
用が注目されている。ヒト・ガンマインターフエロン
（以下ｈＩＦＮ−γと略す）については、１９８１年１
０月米国サンフランシスコで開かれた第２回インターフ
エロン研究国際会議（Ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｎｎｕ
ａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ
ｆｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）
において、そのアミノ酸配列が示され、その後該アミノ
酸配列をコードしているヒト遺伝子のＤＮＡ配列も明ら
かにされている（Ｒ．Ｄｅｖｏｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄ．Ｒｅｓ．，１０：２４８７，１９８２およびＰ．
Ｗ，Ｇｒａｙら，Ｎａｔｕｒｅ２９５：５０３，１９８
２）。さらに、ヒトリンパ球由来のｍＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡを用いたプレｈＩＦＮ−γおよび成熟ｈＩＦ
Ｎ−γの製造法に関する特許も公開されている（特開昭
５８−９０５１４）。
【０００４】ヒト・リンパ球又は脾臓細胞から得られる
天然のｈＩＦＮ−γは、糖蛋白であるが、その物理化学
的性状についてはまだ不明瞭なところが多い。成熟ｈＩ
ＦＮ−γの蛋白の部分については、組換えＤＮＡ技術に
より１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドであるこ
とが示されているが、その活性部位やＣ末端部位の真の
構造（例えば、Ｃ末端アミノ酸がフリーであるか何らか
の修飾を受けているか）については不明である。
天然のｈＩＦＮ−γは、糖蛋白であるが、その物理化学
的性状についてはまだ不明瞭なところが多い。成熟ｈＩ
ＦＮ−γの蛋白の部分については、組換えＤＮＡ技術に
より１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドであるこ
とが示されているが、その活性部位やＣ末端部位の真の
構造（例えば、Ｃ末端アミノ酸がフリーであるか何らか
の修飾を受けているか）については不明である。
【０００５】本発明者らは、１４６個のアミノ酸からな
るｈＩＦＮ−γ（以下ＧＩＦ１４６と略す）の活性部位
およびＣ末端部位の生理活性に及ぼす効果について鋭意
研究の結果、特に、１番目から１３５番目までのポリペ
プチド（以下ＧＩＦ１３５と略す）が、驚くべきことに
ＧＩＦ１４６に比べ極めて高い生理活性を有すること、
また物理化学的性質も異なること、さらには該ＧＩＦ１
３５ポリペプチドを化学的に合成した遺伝子を用いた組
換えＤＮＡ技術で製造できることを見出し、本発明を完
成するに至った。また、ＧＩＦ１３５で代表される本発
明のポリペプチドは、ＧＩＦ１４６に比べ形質転換株培
養菌体からの抽出が容易であり、且つ安定性も高いとい
う特徴を有しており、従来のＧＩＦ１４６とは異なる新
規な生理活性物質と言える。
るｈＩＦＮ−γ（以下ＧＩＦ１４６と略す）の活性部位
およびＣ末端部位の生理活性に及ぼす効果について鋭意
研究の結果、特に、１番目から１３５番目までのポリペ
プチド（以下ＧＩＦ１３５と略す）が、驚くべきことに
ＧＩＦ１４６に比べ極めて高い生理活性を有すること、
また物理化学的性質も異なること、さらには該ＧＩＦ１
３５ポリペプチドを化学的に合成した遺伝子を用いた組
換えＤＮＡ技術で製造できることを見出し、本発明を完
成するに至った。また、ＧＩＦ１３５で代表される本発
明のポリペプチドは、ＧＩＦ１４６に比べ形質転換株培
養菌体からの抽出が容易であり、且つ安定性も高いとい
う特徴を有しており、従来のＧＩＦ１４６とは異なる新
規な生理活性物質と言える。
【０００６】本発明は、次のアミノ酸配列：
【化６】で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただ
し、Ｘは水素原子又はメチオニル基を表わす）をコード
するＤＮＡ配列、その配列が前記ポリペプチドを発現さ
せうるＤＮＡ配列に有効に連結している発現ベクター、
およびそのベクターによって形質転換された単細胞微生
物形質転換株である。
し、Ｘは水素原子又はメチオニル基を表わす）をコード
するＤＮＡ配列、その配列が前記ポリペプチドを発現さ
せうるＤＮＡ配列に有効に連結している発現ベクター、
およびそのベクターによって形質転換された単細胞微生
物形質転換株である。
【０００７】上記のポリペプチド（ＧＩＦ１３５）をコ
ードするＤＮＡの好ましい配列は次のとおりである。
ードするＤＮＡの好ましい配列は次のとおりである。
【化７】
【０００８】以下、詳しく本発明を説明する。ＧＩＦ１
３５生産株の１つ（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５）は、プラスミドｐｔａｃＧＩＦ５４ｃｉｑ（特願昭
５８−１６２３３７に開示）に組みこまれている化学的
に合成したＧＩＦ１４６をコードする遺伝子の下流領域
に、化学的に合成したＤＮＡ断片を挿入し、さらにラン
ナウエイプラスミドＤＮＡを挿入して得たプラスミドに
よって、大腸菌を形質転換することにより得た（図１参
照）。
３５生産株の１つ（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５）は、プラスミドｐｔａｃＧＩＦ５４ｃｉｑ（特願昭
５８−１６２３３７に開示）に組みこまれている化学的
に合成したＧＩＦ１４６をコードする遺伝子の下流領域
に、化学的に合成したＤＮＡ断片を挿入し、さらにラン
ナウエイプラスミドＤＮＡを挿入して得たプラスミドに
よって、大腸菌を形質転換することにより得た（図１参
照）。
【０００９】他のＧＩＦ１３５生産株（ＷＡ８０２／ｐ
ＩＮＧＩＦ１３５もしくはＷ３１１０／ｐＩＮＧＩＦ１
３５）は、上記（図１）で得たｐｔａｃＧＩＦ１３５の
ＢｇｌＩＩとＰｓｔＩによるＤＮＡ断片（ｉｑ遺伝子を
含む側の断片）と、ｐＩＮ５ＧＩＦ５４Ｃ（特願昭５８
−１３２５２４図４に開示）のＢｇｌＩＩとＰｓｔＩに
よるＤＮＡ断片（ｌｐｐプロモーター，ＧＩＦ遺伝子を
含む）とをライゲーションして得られるプラスミドｐＩ
ＮＧＩＦ１３５（図２参照）を、大腸菌ＷＡ８０２もし
くはＷ３１１０株に形質転換することによって得ること
ができる。
ＩＮＧＩＦ１３５もしくはＷ３１１０／ｐＩＮＧＩＦ１
３５）は、上記（図１）で得たｐｔａｃＧＩＦ１３５の
ＢｇｌＩＩとＰｓｔＩによるＤＮＡ断片（ｉｑ遺伝子を
含む側の断片）と、ｐＩＮ５ＧＩＦ５４Ｃ（特願昭５８
−１３２５２４図４に開示）のＢｇｌＩＩとＰｓｔＩに
よるＤＮＡ断片（ｌｐｐプロモーター，ＧＩＦ遺伝子を
含む）とをライゲーションして得られるプラスミドｐＩ
ＮＧＩＦ１３５（図２参照）を、大腸菌ＷＡ８０２もし
くはＷ３１１０株に形質転換することによって得ること
ができる。
【００１０】ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５につ
いてさらに詳しく述べると、まず、プラスミドｐｔａｃ
ＧＩＦ５４ｃｉｑを制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩで処
理することにより、ＧＩＦ１４６をコードする遺伝子の
下流のＤＮＡ断片（１３４番目のＡｒｇをコードする部
位から翻訳終止コドンのすぐ下流のＳａｌＩ断点までの
ＤＮＡ断片）を除き、その代りに、ＢｇｌＩＩとＳａｌ
Ｉ粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）および２つの
翻訳終止コドン（ＴＡＡとＴＡＧ）をもつ化学的に合成
したＤＮＡ断片
いてさらに詳しく述べると、まず、プラスミドｐｔａｃ
ＧＩＦ５４ｃｉｑを制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩで処
理することにより、ＧＩＦ１４６をコードする遺伝子の
下流のＤＮＡ断片（１３４番目のＡｒｇをコードする部
位から翻訳終止コドンのすぐ下流のＳａｌＩ断点までの
ＤＮＡ断片）を除き、その代りに、ＢｇｌＩＩとＳａｌ
Ｉ粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）および２つの
翻訳終止コドン（ＴＡＡとＴＡＧ）をもつ化学的に合成
したＤＮＡ断片
【化８】を挿入することにより、ＧＩＦ１３５をコード
する遺伝子を有するプラスミドｐｔａｃＧＩＦ１３５を
造成した（図２参照）。次に、これにランナウエイＤＮ
ＡをｐＹＭ３０７より導入し、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
を造成し、該プラスミドを大腸菌ＷＡ８０２に形質転換
した。そして、該形質転換株（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃ
ＧＩＦ１３５）の抗ウイルス活性を、ＧＩＦ１４６遺伝
子をもつプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦによる形質転換株
（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ）と比較した結果、Ｗ
Ａ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５はおどろくべき高い
抗ウイルス活性を示した（表１参照）。
する遺伝子を有するプラスミドｐｔａｃＧＩＦ１３５を
造成した（図２参照）。次に、これにランナウエイＤＮ
ＡをｐＹＭ３０７より導入し、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
を造成し、該プラスミドを大腸菌ＷＡ８０２に形質転換
した。そして、該形質転換株（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃ
ＧＩＦ１３５）の抗ウイルス活性を、ＧＩＦ１４６遺伝
子をもつプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦによる形質転換株
（ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ）と比較した結果、Ｗ
Ａ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５はおどろくべき高い
抗ウイルス活性を示した（表１参照）。
【００１１】ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５は、ｈＩＦＮ−γ
遺伝子の下流領域を除き、プラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ
と同じＤＮＡ配列を有するプラスミドであり、また、用
いた宿主細胞も同じである。然るに、本発明におけるＧ
ＩＦ１３５遺伝子をもつプラスミドによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５は、表
１に示した如く、ｐＹｔａｃＧＩＦによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦに比べ、驚く
べき高い抗ウイルス活性を示した。即ち、アンピシリン
およびカナマイシンを含むＬ−ｂｒｏｔｈで培養（ＩＰ
ＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドによる誘
導培養）で得られる形質転換株細胞を、凍結・融解によ
って破砕した後の遠沈上清液（ｓｕｐ）では約３５倍、
遠心残渣を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出した画分
（ｐｐｔ）では約９６倍という高い抗ウイルス活性を示
した（総活性量でみると約７３倍）。両形質転換株のも
つプラスミドは、ｈＩＦＮ−γ遺伝子の部分だけが異な
り各々のポリペプチド（ＧＩＦ１４６とＧＩＦ１３５）
の生産量は理論的に同じと考えられることから、表１に
示す結果は、本発明のＧＩＦ１３５が従来のＧＩＦ１４
６に比べ、極めて強い生理活性を有するポリペプチドで
あることを強く示唆している。
遺伝子の下流領域を除き、プラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ
と同じＤＮＡ配列を有するプラスミドであり、また、用
いた宿主細胞も同じである。然るに、本発明におけるＧ
ＩＦ１３５遺伝子をもつプラスミドによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５は、表
１に示した如く、ｐＹｔａｃＧＩＦによって形質転換さ
れた大腸菌ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦに比べ、驚く
べき高い抗ウイルス活性を示した。即ち、アンピシリン
およびカナマイシンを含むＬ−ｂｒｏｔｈで培養（ＩＰ
ＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシドによる誘
導培養）で得られる形質転換株細胞を、凍結・融解によ
って破砕した後の遠沈上清液（ｓｕｐ）では約３５倍、
遠心残渣を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出した画分
（ｐｐｔ）では約９６倍という高い抗ウイルス活性を示
した（総活性量でみると約７３倍）。両形質転換株のも
つプラスミドは、ｈＩＦＮ−γ遺伝子の部分だけが異な
り各々のポリペプチド（ＧＩＦ１４６とＧＩＦ１３５）
の生産量は理論的に同じと考えられることから、表１に
示す結果は、本発明のＧＩＦ１３５が従来のＧＩＦ１４
６に比べ、極めて強い生理活性を有するポリペプチドで
あることを強く示唆している。
【００１２】また、細胞破砕遠沈上清部（ｓｕｐ）と沈
澱部を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出された画分
（ｐｐｔ）の抗ウイルス活性の比（ｓｕｐ／ｐｐｔ）
は、ｐＹｔａｃＧＩＦでは０．６２、ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３５では０．２３であり、ＧＩＦ１３５はＧＩＦ１４
６とは物理化学的性質（例えば細胞膜又は細胞壁への吸
着性）においても異なると考えられる（表１参照）。さ
らに、ＧＩＦ１３５は尿素溶液によく溶解するが、ＧＩ
Ｆ１４６は尿素にさらに塩類（たとえば食塩）を加えた
溶液でないとよく溶解しないなど、各々の溶解度に明ら
かな差異が認められた。
澱部を８Ｍ尿素と０．５ＭＮａＣｌで抽出された画分
（ｐｐｔ）の抗ウイルス活性の比（ｓｕｐ／ｐｐｔ）
は、ｐＹｔａｃＧＩＦでは０．６２、ｐＹｔａｃＧＩＦ
１３５では０．２３であり、ＧＩＦ１３５はＧＩＦ１４
６とは物理化学的性質（例えば細胞膜又は細胞壁への吸
着性）においても異なると考えられる（表１参照）。さ
らに、ＧＩＦ１３５は尿素溶液によく溶解するが、ＧＩ
Ｆ１４６は尿素にさらに塩類（たとえば食塩）を加えた
溶液でないとよく溶解しないなど、各々の溶解度に明ら
かな差異が認められた。
【００１３】
【表１】
【００１４】これらの事実は、本発明のポリペプチド
は、生理的活性の面で秀れているばかりか、物理化学的
にもＧＩＦ１４６とは明らかに異なるすぐれた性質を有
していることを示している。本発明のポリペプチドはＧ
ＩＦ１４６のポリペプチド構造に含まれてはいるが、本
発明のポリペプチドが上記のような秀れた性質を有する
ことは、ＧＩＦ１４６の構造からは容易に考えつくもの
ではないことは明らかである。
は、生理的活性の面で秀れているばかりか、物理化学的
にもＧＩＦ１４６とは明らかに異なるすぐれた性質を有
していることを示している。本発明のポリペプチドはＧ
ＩＦ１４６のポリペプチド構造に含まれてはいるが、本
発明のポリペプチドが上記のような秀れた性質を有する
ことは、ＧＩＦ１４６の構造からは容易に考えつくもの
ではないことは明らかである。
【００１５】かくして、本発明のポリペプチドは、新規
な抗ウイルス剤，抗腫瘍剤又免疫調節剤として非常に興
味のあるものである。
な抗ウイルス剤，抗腫瘍剤又免疫調節剤として非常に興
味のあるものである。
【００１６】尚、本発明におけるＧＩＦ１３５生産株
が、期待通りの１３５個のアミノ酸残基からなるポリペ
プチドであることを、電気泳動による解析並びにアミノ
酸分析から明らかにすることができた。即ち、アミノ酸
分析では、アミノ酸組成値が期待値とよく一致し、さら
にカルボキシペプチダーゼを用いたカルボキシル末端分
析より、ＧＩＦ１３５のカルボキシル末端部分が期待通
りであることを示唆するデータを得ることができた。以
下、具体的実施例をもって本発明を説明する。尚、以下
の実施例ではＧＩＦ１３５およびｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５に関する例を示すが、本発明の範囲はこれらに限るも
のではない。
が、期待通りの１３５個のアミノ酸残基からなるポリペ
プチドであることを、電気泳動による解析並びにアミノ
酸分析から明らかにすることができた。即ち、アミノ酸
分析では、アミノ酸組成値が期待値とよく一致し、さら
にカルボキシペプチダーゼを用いたカルボキシル末端分
析より、ＧＩＦ１３５のカルボキシル末端部分が期待通
りであることを示唆するデータを得ることができた。以
下、具体的実施例をもって本発明を説明する。尚、以下
の実施例ではＧＩＦ１３５およびｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５に関する例を示すが、本発明の範囲はこれらに限るも
のではない。
【００１７】実施例 １．ＧＩＦ１３５の作製 １）ｐｔａｃＧＩＦ１３５の作製 プラスミドｐｔａｃＧＩＦ５４Ｃｉｑ（特願昭５８−１
６２３３７図３に開示）のＤＮＡ２μｇを１０ｍＭ塩化
マグネシウム，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）５０μｌに溶解し、ＢｇｌＩＩ１０単
位，ＳａｌＩ１０単位を加え、３７℃で１時間反応させ
て、アガロースゲル電気泳動にかけ、目的とする約７ｋ
ｂのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片を電気泳動的に抽出し、
フェノール処理後、アルコールを加え、目的とする約７
ｋｂのＤＮＡ断片を沈澱物として得た。次に固相法（特
願昭５７−８６１８０参照）により合成した１１ｍｅｒ
の２つのオリゴヌクレオチド（図１ならびに図３に塩基
配列を示す）は各々２０ｐｍｏｌｅを１０μｌの６．６
ｍＭ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、４ｍＭＡＴＰ１μｌとポリヌ
クレオチドキナーゼ２単位を加え、３７℃３０分反応さ
せ、５′−ＯＨをリン酸化した。先に調製した約７ｋｂ
のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片を１０μｌの６．６
ｍＭ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）（以下ライゲーション溶液と略す）に溶か
し、そこに化学合成したＤＮＡ断片１０μｌを加え、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃一夜反応を行な
った。このＤＮＡを用いて、大腸菌ＷＡ８０２を常法に
従い形質転換した。形質転換株の選択はアンピシリン４
０μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行ない、アンピシリ
ン耐性の多数の形質転換株より１８株についてプラスミ
ドＤＮＡを分離し制限酵素による解折を行なったとこ
ろ、すべてのプラスミドが目的のｐｔａｃＧＩＦ１３５
であった。
６２３３７図３に開示）のＤＮＡ２μｇを１０ｍＭ塩化
マグネシウム，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１０ｍＭ２
−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）５０μｌに溶解し、ＢｇｌＩＩ１０単
位，ＳａｌＩ１０単位を加え、３７℃で１時間反応させ
て、アガロースゲル電気泳動にかけ、目的とする約７ｋ
ｂのＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ断片を電気泳動的に抽出し、
フェノール処理後、アルコールを加え、目的とする約７
ｋｂのＤＮＡ断片を沈澱物として得た。次に固相法（特
願昭５７−８６１８０参照）により合成した１１ｍｅｒ
の２つのオリゴヌクレオチド（図１ならびに図３に塩基
配列を示す）は各々２０ｐｍｏｌｅを１０μｌの６．６
ｍＭ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、４ｍＭＡＴＰ１μｌとポリヌ
クレオチドキナーゼ２単位を加え、３７℃３０分反応さ
せ、５′−ＯＨをリン酸化した。先に調製した約７ｋｂ
のＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片を１０μｌの６．６
ｍＭ塩化マグネシウムを含む６６ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．６）（以下ライゲーション溶液と略す）に溶か
し、そこに化学合成したＤＮＡ断片１０μｌを加え、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃一夜反応を行な
った。このＤＮＡを用いて、大腸菌ＷＡ８０２を常法に
従い形質転換した。形質転換株の選択はアンピシリン４
０μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行ない、アンピシリ
ン耐性の多数の形質転換株より１８株についてプラスミ
ドＤＮＡを分離し制限酵素による解折を行なったとこ
ろ、すべてのプラスミドが目的のｐｔａｃＧＩＦ１３５
であった。
【００１８】２）ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５の作製 ＧＩＦ１３５の発現をコピー数増加により上げる目的で
ｐｔａｃＧＩＦ１３５のＥｃｏＲＩ断点にランナウエイ
プラスミドｐＹＭ３０７の長い方のＥｃｏＲＩＤＮＡ断
片を挿入した。尚、ｐＹＭ３０７をもつ大腸菌はＷ６２
０ｒｅｃＡ／ｐＹＭ３０７と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている（微工研菌条第３４５
号，ＦＥＲＭ ＢＰ−３４５）。
ｐｔａｃＧＩＦ１３５のＥｃｏＲＩ断点にランナウエイ
プラスミドｐＹＭ３０７の長い方のＥｃｏＲＩＤＮＡ断
片を挿入した。尚、ｐＹＭ３０７をもつ大腸菌はＷ６２
０ｒｅｃＡ／ｐＹＭ３０７と命名し、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている（微工研菌条第３４５
号，ＦＥＲＭ ＢＰ−３４５）。
【００１９】まずｐｔａｃＧＩＦ１３５ＤＮＡ２μｇ，
ｐＹＭ３０７ＤＮＡ２μｇを各々５０μｌの６６ｍＭ酢
酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭ
ジチオスレイトールを含む３３ｍＭトリス酢酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、ＥｃｏＲＩ５単位を加え、３
７℃１時間反応させ、その後６５℃で１５分加熱するこ
とにより、制限酵素を不活化した後、エタノールを加
え、ＤＮＡを沈澱物として得た。これを真空乾燥後、２
０μｌのライゲーション溶液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡライ
ゲース１単位を加え、１６℃一夜ライゲーションを行な
った。このＤＮＡを用いて大腸菌ＷＡ８０２を形質転換
した。形質転換時の温度は２８℃で行なった。形質転換
株の選択は、アンピシリン４０μｇ／ｍｌカナマイシン
２０μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行なった。こうし
て得られた多数のアンピシリン，カナマイシン両耐性を
示す形質転換株より適当に１２株選んでプラスミドを分
離し、制限酵素による解析を行った。その結果、すべて
の株において目的とするプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ１
３５を有していることを確認することができた。
ｐＹＭ３０７ＤＮＡ２μｇを各々５０μｌの６６ｍＭ酢
酸カリウム，１０ｍＭ酢酸マグネシウム及び０．５ｍＭ
ジチオスレイトールを含む３３ｍＭトリス酢酸緩衝液
（ｐＨ７．６）に溶かし、ＥｃｏＲＩ５単位を加え、３
７℃１時間反応させ、その後６５℃で１５分加熱するこ
とにより、制限酵素を不活化した後、エタノールを加
え、ＤＮＡを沈澱物として得た。これを真空乾燥後、２
０μｌのライゲーション溶液に溶解し、Ｔ４ＤＮＡライ
ゲース１単位を加え、１６℃一夜ライゲーションを行な
った。このＤＮＡを用いて大腸菌ＷＡ８０２を形質転換
した。形質転換時の温度は２８℃で行なった。形質転換
株の選択は、アンピシリン４０μｇ／ｍｌカナマイシン
２０μｇ／ｍｌを含む栄養寒天培地で行なった。こうし
て得られた多数のアンピシリン，カナマイシン両耐性を
示す形質転換株より適当に１２株選んでプラスミドを分
離し、制限酵素による解析を行った。その結果、すべて
の株において目的とするプラスミドｐＹｔａｃＧＩＦ１
３５を有していることを確認することができた。
【００２０】２．抗ウイルス活性の測定 ガンマ・インターフエロンの活性量を調べるため、ＷＡ
８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦとＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧ
ＩＦ１３５をＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む）２ｍｌで２８℃一夜培養し、この菌体０．２
ｍｌを４ｍｌのＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む）に接種し、３２℃でＯＤ６６０でおよそ
０．７まで培養し、１００ｍＭＩＰＴＧ溶液を０．２ｍ
ｌ添加後、３７℃で３時間培養した。この培養液１ｍｌ
を１０，０００ｒｐｍ５分遠心し、得られた菌体に１ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチーム、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、５００
μｌを加え氷中１０分放置し、溶菌を行なった。その後
ドライアイス−エタノール中で急速に凍結、３７℃恒温
槽で急速融解を３回くり返し菌体を破壊後、１０，００
０ｒｐｍ１０分遠心し、その上清を抗ウイルス活性の測
定に用いた。抗ウイルス活性は特願昭５７−８６１８０
に開示した方法に準じて測定した。さらに沈澱分画より
目的とするポリペプチドをさらに回収するため、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む８Ｍ尿素溶液５００μｌを沈
澱に加え、超音波処理を行ない、１０，０００ｒｐｍ１
０分遠心後の上清を集めたところ、この上清部に非常に
高い抗ウイルス活性を認めた。これらの抗ウイルス活性
について調べた結果は表１に示した。上記実施例におい
て、本発明者らは同じ発現系のベクターを用いたにもか
かわらず、表１に示すように、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
によって形質転換された大腸菌が、ｐＹｔａｃＧＩＦに
よって形質転換された大腸菌に比べ非常に高い抗ウイル
ス活性（総活性量で約７３倍）を与えたことは、本発明
におけるＧＩＦ１３５が、従来のＧＩＦ１４６にはない
秀れた抗ウイルス活性を有するポリペプチドであること
を強く示唆している。
８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦとＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧ
ＩＦ１３５をＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシリ
ンを含む）２ｍｌで２８℃一夜培養し、この菌体０．２
ｍｌを４ｍｌのＬ−ブロス（４０μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含む）に接種し、３２℃でＯＤ６６０でおよそ
０．７まで培養し、１００ｍＭＩＰＴＧ溶液を０．２ｍ
ｌ添加後、３７℃で３時間培養した。この培養液１ｍｌ
を１０，０００ｒｐｍ５分遠心し、得られた菌体に１ｍ
ｇ／ｍｌのリゾチーム、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
０．１５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２、５００
μｌを加え氷中１０分放置し、溶菌を行なった。その後
ドライアイス−エタノール中で急速に凍結、３７℃恒温
槽で急速融解を３回くり返し菌体を破壊後、１０，００
０ｒｐｍ１０分遠心し、その上清を抗ウイルス活性の測
定に用いた。抗ウイルス活性は特願昭５７−８６１８０
に開示した方法に準じて測定した。さらに沈澱分画より
目的とするポリペプチドをさらに回収するため、０．１
５Ｍ塩化ナトリウムを含む８Ｍ尿素溶液５００μｌを沈
澱に加え、超音波処理を行ない、１０，０００ｒｐｍ１
０分遠心後の上清を集めたところ、この上清部に非常に
高い抗ウイルス活性を認めた。これらの抗ウイルス活性
について調べた結果は表１に示した。上記実施例におい
て、本発明者らは同じ発現系のベクターを用いたにもか
かわらず、表１に示すように、ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
によって形質転換された大腸菌が、ｐＹｔａｃＧＩＦに
よって形質転換された大腸菌に比べ非常に高い抗ウイル
ス活性（総活性量で約７３倍）を与えたことは、本発明
におけるＧＩＦ１３５が、従来のＧＩＦ１４６にはない
秀れた抗ウイルス活性を有するポリペプチドであること
を強く示唆している。
【００２１】３．アミノ酸分析 ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５およびＷＡ８０２
／ｐＹｔａｃＧＩＦの培養菌体から、実施例２に記した
方法に準じて各々のポリペプチドを抽出し、部分精製物
をＳＤＳゲル電気泳動にかけた。次に、ＧＩＦ１３５な
らびにＧＩＦ１４６の分子量に相当する位置のゲル断片
を切り出し、各々のポリペプチドを抽出し充分に水に対
し透析した後アミノ酸分析を行った。
／ｐＹｔａｃＧＩＦの培養菌体から、実施例２に記した
方法に準じて各々のポリペプチドを抽出し、部分精製物
をＳＤＳゲル電気泳動にかけた。次に、ＧＩＦ１３５な
らびにＧＩＦ１４６の分子量に相当する位置のゲル断片
を切り出し、各々のポリペプチドを抽出し充分に水に対
し透析した後アミノ酸分析を行った。
【００２２】尚、ＳＤＳゲル上のＧＩＦ１３５に相当す
るバンドは、明らかにＧＩＦ１４６に相当するバンドよ
り低分子側にシフトしており、各々のバンドは期待され
る分子量に相当する位置にみることができた。
るバンドは、明らかにＧＩＦ１４６に相当するバンドよ
り低分子側にシフトしており、各々のバンドは期待され
る分子量に相当する位置にみることができた。
【００２３】（１）アミノ酸組成の分析 約１ｎｍｏｌの該ポリペプチド抽出物を減圧乾固後、
０．１％フェノールを含む１００μｌの６ＮＨＣｌを加
え、１１０℃で２４，４８，７２時間減圧下に加水分解
を行った。又、別に過ギ酸酸化後のサンプルを６ＮＨＣ
ｌで１１０℃，２４時間加水分解した。加水分解物は、
アミノ酸分析機（日立８３５−５０型）を用い、常法に
従いアミノ酸分析を行った。その結果を表２に示した。
０．１％フェノールを含む１００μｌの６ＮＨＣｌを加
え、１１０℃で２４，４８，７２時間減圧下に加水分解
を行った。又、別に過ギ酸酸化後のサンプルを６ＮＨＣ
ｌで１１０℃，２４時間加水分解した。加水分解物は、
アミノ酸分析機（日立８３５−５０型）を用い、常法に
従いアミノ酸分析を行った。その結果を表２に示した。
【００２４】尚、表２のＭｅｔ（メチオニン）値から、
翻訳開始点のアミノ酸であるメチオニンは、両ポリペプ
チドともそのアミノ末端に付加されていたとしても多く
はないと考えられる。
翻訳開始点のアミノ酸であるメチオニンは、両ポリペプ
チドともそのアミノ末端に付加されていたとしても多く
はないと考えられる。
【００２５】
【表２】 Ｃ：７２時間加水分解の値を示した。 Ｄ：Ｌｅｕの組成値を基準に他のアミノ酸値を算出し
た。 Ｅ：Ｔｒｐは本実験の条件では、分解してしまうため測
定できない。 Ｆ：ＧＩＦ１４６は２４時間加水分解の値を示した。
た。 Ｅ：Ｔｒｐは本実験の条件では、分解してしまうため測
定できない。 Ｆ：ＧＩＦ１４６は２４時間加水分解の値を示した。
【００２６】（２）カルボキシル末端の分析 上記ＳＤＳゲル電気泳動のバンドから抽出されたサンプ
ルを適当に前処理（ｐＨや容量などの調整）後、適当な
濃度のカルボキシペプチダーゼＡ溶液あるいはＡとＢの
混合酵素溶液を加え、３７℃で４時間反応させた。反応
後、０．０２ＮＨＣｌを加えさらに７０％ギ酸でｐＨ，
容量を調整し、常法に従いアミノ酸分析を行った。
ルを適当に前処理（ｐＨや容量などの調整）後、適当な
濃度のカルボキシペプチダーゼＡ溶液あるいはＡとＢの
混合酵素溶液を加え、３７℃で４時間反応させた。反応
後、０．０２ＮＨＣｌを加えさらに７０％ギ酸でｐＨ，
容量を調整し、常法に従いアミノ酸分析を行った。
【００２７】その結果、ＧＩＦ１３５をカルボキシペプ
チダーゼＡとＢで処理したサンプルでは、Ｓｅｒ（１．
０），Ａｒｇ（１．８），Ｌｙｓ（２．７），Ｇｌｙ
（０．９），Ｔｈｒ（１．１），Ａｌａ（１．０）の各
アミノ酸のみが検出され＊、またカルボキシペプチダー
ゼＡの場合は、Ｓｅｒ（０．７），Ａｒｇ（０．２），
Ｌｙｓ（０．１）が検出された。これらの結果は、ＧＩ
Ｆ１３５のカルボキシル末端部分が期待されるアミノ酸
配列を有していることを強く示唆するものである。
チダーゼＡとＢで処理したサンプルでは、Ｓｅｒ（１．
０），Ａｒｇ（１．８），Ｌｙｓ（２．７），Ｇｌｙ
（０．９），Ｔｈｒ（１．１），Ａｌａ（１．０）の各
アミノ酸のみが検出され＊、またカルボキシペプチダー
ゼＡの場合は、Ｓｅｒ（０．７），Ａｒｇ（０．２），
Ｌｙｓ（０．１）が検出された。これらの結果は、ＧＩ
Ｆ１３５のカルボキシル末端部分が期待されるアミノ酸
配列を有していることを強く示唆するものである。
【００２８】＊註：カッコ内の数値は、同ＧＩＦ１３５
サンプルを酸加水分解して得られた各アミノ酸のモル比
を基準に計算した。
サンプルを酸加水分解して得られた各アミノ酸のモル比
を基準に計算した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＩＦ１３５ポリペプチド発現ベクターｐＹｔ
ａｃＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
ａｃＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
【図２】ＧＩＦ１３５ポリペプチド発現ベクターＰＩＮ
ＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
ＧＩＦ１３５の造成過程を示す。
【図３】ＧＩＦ１３５生産用ベクターを造成するための
ＧＩＦ１４６のカルボキシル末端付近の塩基配列の改変
方法を示す。
ＧＩＦ１４６のカルボキシル末端付近の塩基配列の改変
方法を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ 8314−4Ｃ 45/02 8415−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 13/00 ＺＮＡ 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (18)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列 【化１】 で表わされる生理活性ポリペプチド（ただし、Ｘは水素
原子またはメチオニル基を表わす）をコードするＤＮＡ
配列。 - 【請求項２】 化学的に合成されたことを特徴とする請
求項１記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】 次のＤＮＡ配列： 【化２】 を含むことを特徴とする請求項１または２記載のＤＮＡ
配列。 - 【請求項４】 ＤＮＡ配列が、その上流にはＥｃｏＲＩ
切断点を有するＤＮＡ断片を、下流には１及至２個の終
止コドン（ＴＡＡ又はＴＡＧ）とＳａｌＩ切断点を有す
るＤＮＡ断片を付加したことを特徴とする請求項１，２
または３記載のＤＮＡ配列。 - 【請求項５】 次のアミノ酸配列： 【化３】 で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただし、Ｘは
水素原子またはメチオニル基を表わす）をコードするＤ
ＮＡ配列が、該ポリペプチドを発現させうるＤＮＡ配列
に有効に連結していることを特徴とする発現ベクター。 - 【請求項６】 大腸菌のｔｒｐとｌａｃプロモーターの
ハイブリッドプロモーターであるｔａｃプロモーター，
ラクトース・レプレッサー遺伝子ｌａｃｉqおよびプラ
スミドコピー数の増加をもたらす機能を有するプラスミ
ドＤＮＡを含むことを特徴とする請求項５記載の発現ベ
クター。 - 【請求項７】 大腸菌リポ蛋白質支配構造遺伝子の改変
された５′末非翻訳領域を有していることを特徴とする
請求項５記載の発現ベクター。 - 【請求項８】 ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５もしくはｐｔａ
ｃＧＩＦ１３５からなるグループから選択されることを
特徴とする請求項６記載の発現ベクター。 - 【請求項９】 ｐＩＮＧＩＦ１３５からなるグループか
ら選択されることを特徴とする請求項７記載の発現ベク
ター。 - 【請求項１０】 次のアミノ酸配列： 【化４】 で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただし、Ｘは
水素原子またはメチオニル基を表わす）をコードする遺
伝子が発現されうるように組み込まれた発現ベクターに
よって形質転換された単細胞微生物形質転換体。 - 【請求項１１】 発現ベクターが、次のアミノ酸配列： 【化５】 で表わされる新規生理活性ポリペプチド（ただし、Ｘは
水素原子またはメチオニル基を表わす）をコードするＤ
ＮＡ配列が、該ポリペプチドを発現させうるＤＮＡ配列
に有効に連結しているものである請求項１０記載の形質
転換体。 - 【請求項１２】 発現ベクターが大腸菌のｔｒｐとｌａ
ｃプロモーターのハイブリッドプロモーターであるｔａ
ｃプロモーター，ラクトース・レプレッサー遺伝子ｌａ
ｃｉq およびプラスミドコピー数の増加をもたらす機能
を有するプラスミドＤＮＡを含むものである請求項１１
記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 発現ベクターが大腸菌リポ蛋白質支配
構造遺伝子の改変された５′末非翻訳領域を有している
ものである請求項１１記載の形質転換体。 - 【請求項１４】 発現ベクターがｐＹｔａｃＧＩＦ１３
５もしくはｐｔａｃＧＩＦ１３５からなるグループから
選択されるものである請求項１２記載の形質転換体。 - 【請求項１５】 発現ベクターがｐＩＮＧＩＦ１３５か
らなるグループから選択されるものである請求項１３記
載の形質転換体。 - 【請求項１６】 形質転換される微生物が大腸菌である
ことを特徴とする請求項１０記載の形質転換株。 - 【請求項１７】 ＷＡ８０２／ｐＹｔａｃＧＩＦ１３５
もしくはＷＡ８０２／ｐｔａｃＧＩＦ１３５からなるグ
ループから選択されることを特徴とする請求項１６記載
の形質転換株。 - 【請求項１８】 ＷＡ８０２／ｐＩＮＧＩＦ１３５もし
くはＷ３１１０／ｐＩＮＧＩＦ１３５からなるグループ
から選択されることを特徴とする請求項１６記載の形質
転換株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5113601A JP2612809B2 (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | 新規生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、その発現ベクターおよび形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5113601A JP2612809B2 (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | 新規生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、その発現ベクターおよび形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06225762A true JPH06225762A (ja) | 1994-08-16 |
| JP2612809B2 JP2612809B2 (ja) | 1997-05-21 |
Family
ID=14616353
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5113601A Expired - Lifetime JP2612809B2 (ja) | 1993-04-16 | 1993-04-16 | 新規生理活性ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、その発現ベクターおよび形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2612809B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210129443A (ko) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 엘지전자 주식회사 | 터보 압축기 |
-
1993
- 1993-04-16 JP JP5113601A patent/JP2612809B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210129443A (ko) * | 2020-04-20 | 2021-10-28 | 엘지전자 주식회사 | 터보 압축기 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2612809B2 (ja) | 1997-05-21 |
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