JPH0622748A - β−カロチンを生産する酵母及び酵母によるβ−カロチンの製造法 - Google Patents
β−カロチンを生産する酵母及び酵母によるβ−カロチンの製造法Info
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- JPH0622748A JPH0622748A JP20316792A JP20316792A JPH0622748A JP H0622748 A JPH0622748 A JP H0622748A JP 20316792 A JP20316792 A JP 20316792A JP 20316792 A JP20316792 A JP 20316792A JP H0622748 A JPH0622748 A JP H0622748A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 優れたβ−カロチン産生能酵母を取得し、こ
れらを利用して安全性の高い品質的に安定で且つ生産性
の安定したβ−カロチンの製造法を確立する。 【構成】 変異誘発処理により創製されたβ−カロチン
高産生能酵母、ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−１
株及びロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−２株。これ
ら変異誘発処理により創製されたβ−カロチン高産生能
酵母を培養して、β−カロチンを製造する。 【効果】 本発明の微生物を培養することにより、安全
性の高い、品質的に安定したβ−カロチンの生産ができ
る。
れらを利用して安全性の高い品質的に安定で且つ生産性
の安定したβ−カロチンの製造法を確立する。 【構成】 変異誘発処理により創製されたβ−カロチン
高産生能酵母、ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−１
株及びロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−２株。これ
ら変異誘発処理により創製されたβ−カロチン高産生能
酵母を培養して、β−カロチンを製造する。 【効果】 本発明の微生物を培養することにより、安全
性の高い、品質的に安定したβ−カロチンの生産ができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有用性の高いβ−カロ
チンの製造法に関し、さらに詳しくは、β−カロチンを
生産する変異誘発された酵母、及び変異誘発された酵母
によるβ−カロチンの製造法に関する。
チンの製造法に関し、さらに詳しくは、β−カロチンを
生産する変異誘発された酵母、及び変異誘発された酵母
によるβ−カロチンの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】β−カロチン（β−Carotene, Ｃ
40Ｈ56）は、カロチノイドの一種で、主に食品添加物と
して着色料に使われており、ビタミンＡの前駆体として
栄養的に重要な物質である。又、栄養素としてや、その
発色性から飼料添加物としても多く利用されている。更
に、抗酸化作用等生理活性も着目され、機能性食品とし
ての他、医薬品、化粧品への利用も年々増加する傾向に
ある。
40Ｈ56）は、カロチノイドの一種で、主に食品添加物と
して着色料に使われており、ビタミンＡの前駆体として
栄養的に重要な物質である。又、栄養素としてや、その
発色性から飼料添加物としても多く利用されている。更
に、抗酸化作用等生理活性も着目され、機能性食品とし
ての他、医薬品、化粧品への利用も年々増加する傾向に
ある。
【０００３】β−カロチンの原料には、大別して合成品
と天然品とがあり、合成品ではβ−イオノン（Ｃ30Ｈ20
Ｏ）を２量化して得られたもの（特開昭５１−１０１９
６２号）が主であり、天然品では、微細藻類ドナリエラ
（Dunaliella）由来のもの（A.Ben-Amotz.et.al,J.Phyc
ol,23,176 （1987））が主で、植物由来としてパーム
油、ニンジン油等からも抽出されている。また、一方で
は糸状菌や酵母等の微生物によるβ−カロチンの生産も
試みられている。例えば、（１）微生物利用学概論，
（1974）p224記載のBlakeslea trispora，Nocardia sp
，Rhodotorula sp，等の培養による生産、（２）Ｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．２，（1988）
P623〜P624記載のBlakeslea trispora，Rhodotorula gl
utinis，の培養による生産がある。
と天然品とがあり、合成品ではβ−イオノン（Ｃ30Ｈ20
Ｏ）を２量化して得られたもの（特開昭５１−１０１９
６２号）が主であり、天然品では、微細藻類ドナリエラ
（Dunaliella）由来のもの（A.Ben-Amotz.et.al,J.Phyc
ol,23,176 （1987））が主で、植物由来としてパーム
油、ニンジン油等からも抽出されている。また、一方で
は糸状菌や酵母等の微生物によるβ−カロチンの生産も
試みられている。例えば、（１）微生物利用学概論，
（1974）p224記載のBlakeslea trispora，Nocardia sp
，Rhodotorula sp，等の培養による生産、（２）Ｍｉ
ｃｒｏｂｉａｌ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖｏｌ．２，（1988）
P623〜P624記載のBlakeslea trispora，Rhodotorula gl
utinis，の培養による生産がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】最近では、合成β−カ
ロチンの安全性への不安から天然品志向が強まってい
る。しかし、その主たる天然品原料であるドナリエラ
（Dunaliella）はイスラエル、米国の西南部、オースト
ラリアなど、太陽光が強い乾燥地帯で自然培養に近い形
で生産が行われており、従って、海外に依存する比率が
極めて高い上、天然品であるがゆえに現地の天候にも左
右されるため、価格や品質変動の不安は常に随伴してい
る。又、ニンジン等β−カロチン含有植物からの原料を
用いた場合では、残留農薬（殺虫剤，殺菌剤，除草剤
等）の懸念もある。
ロチンの安全性への不安から天然品志向が強まってい
る。しかし、その主たる天然品原料であるドナリエラ
（Dunaliella）はイスラエル、米国の西南部、オースト
ラリアなど、太陽光が強い乾燥地帯で自然培養に近い形
で生産が行われており、従って、海外に依存する比率が
極めて高い上、天然品であるがゆえに現地の天候にも左
右されるため、価格や品質変動の不安は常に随伴してい
る。又、ニンジン等β−カロチン含有植物からの原料を
用いた場合では、残留農薬（殺虫剤，殺菌剤，除草剤
等）の懸念もある。
【０００５】糸状菌や酵母等の微生物によるβ−カロチ
ンの生産では、多量のβ−カロチンを微生物菌体内に蓄
積するものは大変少なく、前記（１），（２）に記載さ
れるBlakeslea trisporaが著量の産生能を有しているも
のの、炭素源にKeroseneを用いることや、不純物を多く
含む等、安全性の面から好ましくない。今日では、天然
品を原料とし、しかも安全性の高い、品質的、生産的に
安定したβ−カロチンの製造が望まれている。
ンの生産では、多量のβ−カロチンを微生物菌体内に蓄
積するものは大変少なく、前記（１），（２）に記載さ
れるBlakeslea trisporaが著量の産生能を有しているも
のの、炭素源にKeroseneを用いることや、不純物を多く
含む等、安全性の面から好ましくない。今日では、天然
品を原料とし、しかも安全性の高い、品質的、生産的に
安定したβ−カロチンの製造が望まれている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような現
状に鑑み、優れたβ−カロチン産生能酵母を取得し、こ
れらを利用して安全性の高い、品質的に安定で、且つ生
産性の安定した製造法を確立する目的で成されたもので
ある。本発明者らが種々検討を重ねた結果、自然界に広
く分布している通常赤色酵母と称される、ロドトルラ属
（Rhodotorula ）に属する変異酵母を用いたβ−カロチ
ンの製造法が最適である結論に到達した。
状に鑑み、優れたβ−カロチン産生能酵母を取得し、こ
れらを利用して安全性の高い、品質的に安定で、且つ生
産性の安定した製造法を確立する目的で成されたもので
ある。本発明者らが種々検討を重ねた結果、自然界に広
く分布している通常赤色酵母と称される、ロドトルラ属
（Rhodotorula ）に属する変異酵母を用いたβ−カロチ
ンの製造法が最適である結論に到達した。
【０００７】本発明者らは、ＩＦＯ（INSTITUTE FOR FE
RMENTATION,OSAKA）から分与を受けた酵母、ロドトルラ
・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＩＦＯ−１０９
９株を原株とし、これについて種々変異誘発処理を行な
い、更に抗真菌剤を用いたスクリーニング法で選別し、
これらを分離培養した結果、β−カロチン産生能におい
て原株とは判然と区別し得る、高産生能を有した菌株、
ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−１（微工研菌寄第
１２９９７号）株、ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２
−２（微工研菌寄第１２９９６号）株を分離取得し、こ
れらを培養することによるβ−カロチンの製造法を確立
した。
RMENTATION,OSAKA）から分与を受けた酵母、ロドトルラ
・グルチニス（Rhodotorula glutinis）ＩＦＯ−１０９
９株を原株とし、これについて種々変異誘発処理を行な
い、更に抗真菌剤を用いたスクリーニング法で選別し、
これらを分離培養した結果、β−カロチン産生能におい
て原株とは判然と区別し得る、高産生能を有した菌株、
ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−１（微工研菌寄第
１２９９７号）株、ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２
−２（微工研菌寄第１２９９６号）株を分離取得し、こ
れらを培養することによるβ−カロチンの製造法を確立
した。
【０００８】以下に本発明を詳述する。カビ、酵母の様
な真核生物の菌体中では、アセチル−ＣｏＡを基点とし
てメバロン酸を経由し、ファルネシルピロリン酸で分岐
してカロチノイドとステロールとが生合成される。従っ
て、ファルネシルピロリン酸から分岐してステロールに
至る代謝経路を遮断、もしくは抑制させることによっ
て、カロチノイドつまりはβ−カロチン生合成量が増加
することになる。
な真核生物の菌体中では、アセチル−ＣｏＡを基点とし
てメバロン酸を経由し、ファルネシルピロリン酸で分岐
してカロチノイドとステロールとが生合成される。従っ
て、ファルネシルピロリン酸から分岐してステロールに
至る代謝経路を遮断、もしくは抑制させることによっ
て、カロチノイドつまりはβ−カロチン生合成量が増加
することになる。
【０００９】本発明は酵母に変異誘発処理を施し、カロ
チノイドの生合成経路において、ファルネシルピロリン
酸から分岐するステロール生合成経路が、遮断又は抑制
された酵母を取得して利用するものである。これら酵母
を得るための変異誘発処理としては、様々な公知の方法
を用いることができる。例えば、紫外線、Ｘ線、γ線等
を照射する物理的変異源を用いる方法。ナイトロジェン
マスタード等のクロルエチルアミン系化合物、プリン系
化合物等、アルキル化剤、その他の薬剤を用いる化学的
方法を適宜使用して突然変異を誘発できる。
チノイドの生合成経路において、ファルネシルピロリン
酸から分岐するステロール生合成経路が、遮断又は抑制
された酵母を取得して利用するものである。これら酵母
を得るための変異誘発処理としては、様々な公知の方法
を用いることができる。例えば、紫外線、Ｘ線、γ線等
を照射する物理的変異源を用いる方法。ナイトロジェン
マスタード等のクロルエチルアミン系化合物、プリン系
化合物等、アルキル化剤、その他の薬剤を用いる化学的
方法を適宜使用して突然変異を誘発できる。
【００１０】変異誘発処理に用いる酵母としては、β−
カロチン産生能を有するロドトルラ属（Rhodotorula ）
酵母が好ましく、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorul
a glutinis）がより好ましい。
カロチン産生能を有するロドトルラ属（Rhodotorula ）
酵母が好ましく、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorul
a glutinis）がより好ましい。
【００１１】そして、これら変異誘発処理した酵母から
目的とする変異酵母をスクリーニングするには、これら
酵母をイミダゾール系抗真菌剤、例えば硝酸ミコナゾー
ル、硝酸サルコナゾール、ビフォナゾール等を添加して
ある、ＹＰＤ平板培地等へ塗布して培養を行ない、培地
上に生育したコロニー、即ち、薬剤耐性株を選択し釣菌
して、通常の培養法で継体培養すれば良い。
目的とする変異酵母をスクリーニングするには、これら
酵母をイミダゾール系抗真菌剤、例えば硝酸ミコナゾー
ル、硝酸サルコナゾール、ビフォナゾール等を添加して
ある、ＹＰＤ平板培地等へ塗布して培養を行ない、培地
上に生育したコロニー、即ち、薬剤耐性株を選択し釣菌
して、通常の培養法で継体培養すれば良い。
【００１２】スクリーニングに使用するイミダゾール系
抗真菌剤は、ステロール生合成経路の中間体である、24
−メチレンジヒドロラノステロールの代謝阻害剤として
知られており（山口、BIOINDUSTRY,18,328）、これら抗
真菌剤を用いることで、通常、ステロールを必要とする
酵母は形態異常となるか、又は死滅する。しかし、変異
誘発により、ファルネシルピロリン酸からステロール生
合成経路へ分岐する機能が遮断又は抑制され、カロチノ
イド生合成経路からより多くのカロチノイドが産生され
る酵母も取得される。この多量のカロチノイドを蓄積す
る能力を有した酵母は薬剤耐性であり、薬剤耐性を獲得
した理由の一つとして、カロチノイドが生体膜構造強化
の役割を果たすためであるとも考えられる。更にカロチ
ノイドはその分子中における共役二重結合の数により、
その色と密接な係わりを持ち、結合数が増加すると黄色
から赤色へと変化し、β−カロチンは橙色を示す。従っ
て、多量のβ−カロチンを蓄積した酵母は濃橙色を呈す
るので選別を容易に行なうことができる。
抗真菌剤は、ステロール生合成経路の中間体である、24
−メチレンジヒドロラノステロールの代謝阻害剤として
知られており（山口、BIOINDUSTRY,18,328）、これら抗
真菌剤を用いることで、通常、ステロールを必要とする
酵母は形態異常となるか、又は死滅する。しかし、変異
誘発により、ファルネシルピロリン酸からステロール生
合成経路へ分岐する機能が遮断又は抑制され、カロチノ
イド生合成経路からより多くのカロチノイドが産生され
る酵母も取得される。この多量のカロチノイドを蓄積す
る能力を有した酵母は薬剤耐性であり、薬剤耐性を獲得
した理由の一つとして、カロチノイドが生体膜構造強化
の役割を果たすためであるとも考えられる。更にカロチ
ノイドはその分子中における共役二重結合の数により、
その色と密接な係わりを持ち、結合数が増加すると黄色
から赤色へと変化し、β−カロチンは橙色を示す。従っ
て、多量のβ−カロチンを蓄積した酵母は濃橙色を呈す
るので選別を容易に行なうことができる。
【００１３】選別した酵母をＹＰＤ培地等に接種し、通
常の発酵生産法と同様の方法で培養を行ない、培養物よ
りβ−カロチンを抽出採取した後、生産されたβ−カロ
チンをＨＰＬＣ法による定量、薄層クロマトグラフィー
法、吸光光度法等で定量すればβ−カロチン産生能に優
れた酵母を特定できる。
常の発酵生産法と同様の方法で培養を行ない、培養物よ
りβ−カロチンを抽出採取した後、生産されたβ−カロ
チンをＨＰＬＣ法による定量、薄層クロマトグラフィー
法、吸光光度法等で定量すればβ−カロチン産生能に優
れた酵母を特定できる。
【００１４】以上のようにして得られた酵母をβ−カロ
チンの製造に供する。本発明の、β−カロチンを製造す
る際の培養法は公知の方法を利用すれば良く、特別な培
地や条件を必要としない。一例としては、ＹＰＤ培地に
酵母を接種し、１７０回転／分，３０℃で１２０時間程
度振盪培養を行なえば良い。そして、酵母の増殖が定常
期に到達したとき菌体を分離する。分離方法も公知の濾
過法、遠心分離法等の固液分離法で分離できる。そし
て、常法に従い溶剤等で抽出しβ−カロチンを採取す
る。
チンの製造に供する。本発明の、β−カロチンを製造す
る際の培養法は公知の方法を利用すれば良く、特別な培
地や条件を必要としない。一例としては、ＹＰＤ培地に
酵母を接種し、１７０回転／分，３０℃で１２０時間程
度振盪培養を行なえば良い。そして、酵母の増殖が定常
期に到達したとき菌体を分離する。分離方法も公知の濾
過法、遠心分離法等の固液分離法で分離できる。そし
て、常法に従い溶剤等で抽出しβ−カロチンを採取す
る。
【００１５】更に、抽出に先立ち分離した菌体を破砕処
理してもよい。この破砕処理は菌体よりβ−カロチンを
抽出する際に一層の効果が望め、ガラスビーズ法、酵素
溶解法、圧力破砕法、超音波破砕法等がある。又、培養
液より分離した菌体もしくは破砕処理した菌体を、抽出
する際の水分の影響を低減するため、少量のメタノール
等の極性溶媒を加え遠心分離して用いても良い。この時
メタノール等の極性溶媒中に食品の添加剤に使われてい
る、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の酸化防
止剤を添加して用いるとβ−カロチンの変成を抑制でき
る。そして集めた菌体に、常用される溶媒等を加えβ−
カロチンを抽出すれば良い。
理してもよい。この破砕処理は菌体よりβ−カロチンを
抽出する際に一層の効果が望め、ガラスビーズ法、酵素
溶解法、圧力破砕法、超音波破砕法等がある。又、培養
液より分離した菌体もしくは破砕処理した菌体を、抽出
する際の水分の影響を低減するため、少量のメタノール
等の極性溶媒を加え遠心分離して用いても良い。この時
メタノール等の極性溶媒中に食品の添加剤に使われてい
る、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の酸化防
止剤を添加して用いるとβ−カロチンの変成を抑制でき
る。そして集めた菌体に、常用される溶媒等を加えβ−
カロチンを抽出すれば良い。
【００１６】集めた菌体に、塩化メチレン／メタノー
ル，クロロホルム／メタノール等の極性溶媒と極性の低
い溶媒との混合溶媒を用いて抽出すれば、より抽出効果
を上げることができる。そして、これらの抽出溶媒中に
前記同様ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の安
定化剤を添加して用いても良い。これは、後の工程など
でβ−カロチンの変成を抑制できる。そして、抽出液を
集め溶媒を除去すればβ−カロチンを採取できる。
ル，クロロホルム／メタノール等の極性溶媒と極性の低
い溶媒との混合溶媒を用いて抽出すれば、より抽出効果
を上げることができる。そして、これらの抽出溶媒中に
前記同様ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）等の安
定化剤を添加して用いても良い。これは、後の工程など
でβ−カロチンの変成を抑制できる。そして、抽出液を
集め溶媒を除去すればβ−カロチンを採取できる。
【００１７】β−カロチンの定量は薄層クロマトグラフ
ィー法、ＨＰＬＣ法により測定することができる。
ィー法、ＨＰＬＣ法により測定することができる。
【００１８】
【実施例】次に実施例により本発明を示すが、これは一
例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
又、培地及び試薬は下記のものを使用した。
例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
又、培地及び試薬は下記のものを使用した。
【００１９】［ＹＰＤ培地］酵母エキス（ディフコ社
製）１０ｇ，ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ，ブ
ドウ糖（和光純薬社製）２０ｇを蒸留水１０００ｍｌに
溶解し、ｐＨ５．５に調製した。
製）１０ｇ，ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇ，ブ
ドウ糖（和光純薬社製）２０ｇを蒸留水１０００ｍｌに
溶解し、ｐＨ５．５に調製した。
【００２０】［０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）］ Ａ液：リン酸２ナトリウム，無水（試薬特級，和光純薬
社製）７．１ｇを蒸留水に溶解し１０００ｍｌに調整。 Ｂ液：リン酸２水素ナトリウム，無水（試薬特級，和光
純薬社製）６．０ｇを蒸留水に溶解し１０００ｍｌに調
整。 Ａ液を５７．７ｍｌとＢ液４２．３ｍｌを混合して調製
した。
０）］ Ａ液：リン酸２ナトリウム，無水（試薬特級，和光純薬
社製）７．１ｇを蒸留水に溶解し１０００ｍｌに調整。 Ｂ液：リン酸２水素ナトリウム，無水（試薬特級，和光
純薬社製）６．０ｇを蒸留水に溶解し１０００ｍｌに調
整。 Ａ液を５７．７ｍｌとＢ液４２．３ｍｌを混合して調製
した。
【００２１】［エチルメタンスルフォネート（ＥＭ
Ｓ）］ エチルメタンスルフォネート（Aldrich chemical社製）
Ｓ）］ エチルメタンスルフォネート（Aldrich chemical社製）
【００２２】［１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液］チオ
硫酸ナトリウム（試薬特級，国産化学社製）１００ｇを
蒸留水１０００ｍｌに溶解して調製した。
硫酸ナトリウム（試薬特級，国産化学社製）１００ｇを
蒸留水１０００ｍｌに溶解して調製した。
【００２３】［硝酸ミコナゾール添加ＹＰＤ平板培地］
酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ，ポリペプトン（日
本製薬社製）１０ｇ，ブドウ糖（和光純薬社製）２０
ｇ，寒天（日本製薬社製）２ｇを蒸留水１０００ｍｌに
溶解し、これに硝酸ミコナゾール（Ｃ18Ｈ14Ｃｌ4 Ｎ2
Ｏ−ＨＮＯ3 ，シグマ社製）１００ｍｇをジメチルスル
ホキシド（和光純薬社製）１０ｍｌに溶解した液を添加
して調製した。
酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ，ポリペプトン（日
本製薬社製）１０ｇ，ブドウ糖（和光純薬社製）２０
ｇ，寒天（日本製薬社製）２ｇを蒸留水１０００ｍｌに
溶解し、これに硝酸ミコナゾール（Ｃ18Ｈ14Ｃｌ4 Ｎ2
Ｏ−ＨＮＯ3 ，シグマ社製）１００ｍｇをジメチルスル
ホキシド（和光純薬社製）１０ｍｌに溶解した液を添加
して調製した。
【００２４】［硝酸サルコナゾール添加ＹＰＤ平板培
地］酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ，ポリペプトン
（日本製薬社製）１０ｇ，ブドウ糖（和光純薬社製）２
０ｇ，寒天（日本製薬社製）２ｇを蒸留水１０００ｍｌ
に溶解し、これに硝酸サルコナゾール（Ｃ18Ｈ15Ｃ3 Ｎ
2 Ｓ−ＨＮＯ3 ，シグマ社製）３０ｍｇをジメチルスル
ホキシド（和光純薬社製）１０ｍｌに溶解した液を添加
して調製した。
地］酵母エキス（ディフコ社製）１０ｇ，ポリペプトン
（日本製薬社製）１０ｇ，ブドウ糖（和光純薬社製）２
０ｇ，寒天（日本製薬社製）２ｇを蒸留水１０００ｍｌ
に溶解し、これに硝酸サルコナゾール（Ｃ18Ｈ15Ｃ3 Ｎ
2 Ｓ−ＨＮＯ3 ，シグマ社製）３０ｍｇをジメチルスル
ホキシド（和光純薬社製）１０ｍｌに溶解した液を添加
して調製した。
【００２５】［０．００５％ＢＨＴ含有メタノール溶
液］ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（東京化成
工業社製）５０ｍｇをメタノール（試薬特級，和光純薬
社製）に溶解し全量１０００ｍｌに調製した。
液］ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）（東京化成
工業社製）５０ｍｇをメタノール（試薬特級，和光純薬
社製）に溶解し全量１０００ｍｌに調製した。
【００２６】［塩化メチレン−メタノール混合溶媒］塩
化メチレン（試薬特級，和光純薬社製）とメタノール
（試薬特級，和光純薬社製）を５０ｖｏｌ％づつ混合し
て調製した。
化メチレン（試薬特級，和光純薬社製）とメタノール
（試薬特級，和光純薬社製）を５０ｖｏｌ％づつ混合し
て調製した。
【００２７】［０．００５％ＢＨＴ含有塩化メチレン−
メタノール混合溶媒］塩化メチレン−メタノール混合溶
媒１０００ｍｌにジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨ
Ｔ）（東京化成工業社製）５０ｍｇを添加、溶解して調
製した。
メタノール混合溶媒］塩化メチレン−メタノール混合溶
媒１０００ｍｌにジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨ
Ｔ）（東京化成工業社製）５０ｍｇを添加、溶解して調
製した。
【００２８】
【実施例１】ＹＰＤ培地１０ｍｌを２１ｍｍ径の試験管
に分注し、１２１℃で２０分間加圧滅菌後、ロトドトル
ラ・グルチニス（ＩＦＯ−１０９９株）を１白金耳接種
し、３０℃，４８時間，３００回転／分で振盪培養を行
った。
に分注し、１２１℃で２０分間加圧滅菌後、ロトドトル
ラ・グルチニス（ＩＦＯ−１０９９株）を１白金耳接種
し、３０℃，４８時間，３００回転／分で振盪培養を行
った。
【００２９】培養後、培養液を３０００ｒｐｍ（１７０
０Ｇ），１０分間遠心分離して菌体を集菌し、これに
０．０５Ｍリン酸緩衝液を菌体数×１０7 ／mlとなるよ
うに加え懸濁する。この内の１０ｍｌを別の２１ｍｍ径
の試験管に分取し、エチルメタンスルフォネート（ＥＭ
Ｓ）を３００μｌ添加して、３０℃で９０分間変異誘発
処理をした。
０Ｇ），１０分間遠心分離して菌体を集菌し、これに
０．０５Ｍリン酸緩衝液を菌体数×１０7 ／mlとなるよ
うに加え懸濁する。この内の１０ｍｌを別の２１ｍｍ径
の試験管に分取し、エチルメタンスルフォネート（ＥＭ
Ｓ）を３００μｌ添加して、３０℃で９０分間変異誘発
処理をした。
【００３０】変異誘発処理後、１０％チオ硫酸ナトリウ
ム水溶液を１０ｍｌ加えて、ＥＭＳを不活性化させ、３
０００ｒｐｍ（１７００Ｇ），１０分間遠心分離した。
分離後上澄を除去し、分離した菌体に０．０５Ｍリン酸
緩衝液１０ｍｌを加えて懸濁し、再び３０００ｒｐｍ
（１７００Ｇ），１０分間遠心分離した。分離後上澄を
除去し、分離した菌体にＹＰＤ培地１０ｍｌを加え、変
異固定をするため３０℃，１５時間，３００ｒｐｍで振
盪培養を行った。
ム水溶液を１０ｍｌ加えて、ＥＭＳを不活性化させ、３
０００ｒｐｍ（１７００Ｇ），１０分間遠心分離した。
分離後上澄を除去し、分離した菌体に０．０５Ｍリン酸
緩衝液１０ｍｌを加えて懸濁し、再び３０００ｒｐｍ
（１７００Ｇ），１０分間遠心分離した。分離後上澄を
除去し、分離した菌体にＹＰＤ培地１０ｍｌを加え、変
異固定をするため３０℃，１５時間，３００ｒｐｍで振
盪培養を行った。
【００３１】培養後、硝酸ミコナゾール添加ＹＰＤ平板
培地に培養液を塗布し、３０℃で７２〜１２０時間培養
してコロニーを形成させ、イミダゾール系薬剤耐性の有
無を調べた。
培地に培養液を塗布し、３０℃で７２〜１２０時間培養
してコロニーを形成させ、イミダゾール系薬剤耐性の有
無を調べた。
【００３２】目的とする変異株は薬剤耐性で、且つ濃橙
色のコロニーを形成するので、これらの性質を有する株
を選び、更に常法による培養及び抽出操作を行なった
後、β−カロチン含有量を薄層クロマトグラフィー法で
下記に示す条件で定量し、β−カロチン産生に優れた菌
株を特定し、変異株ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２
−１（微工研菌寄第１２９９７号）株を取得した。
色のコロニーを形成するので、これらの性質を有する株
を選び、更に常法による培養及び抽出操作を行なった
後、β−カロチン含有量を薄層クロマトグラフィー法で
下記に示す条件で定量し、β−カロチン産生に優れた菌
株を特定し、変異株ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２
−１（微工研菌寄第１２９９７号）株を取得した。
【００３３】［薄層クロマトグラフィー法による定量条
件］ 展開溶媒：石油エーテル／イソプロピルアルコール（９
９／１vol ％）含水分０．０２vol ％，ジブチルヒドロ
キシトルエン（ＢＨＴ）０．０５wt% 、プレート；ＨＰ
ＴＬＣ（メルク社製），１０×２０ｃｍ，２．５ｃｍ濃
縮ゾーン付、試料注入量；１μｌ、間隔：２ｃｍ、展開
距離；９ｃｍ、検出；ＴＬＣスキャナーＣＳ−９３０
（島津製作所製），４７０ｎｍ、標準にβ−カロチン
（シグマ社製）を用いて定量した。
件］ 展開溶媒：石油エーテル／イソプロピルアルコール（９
９／１vol ％）含水分０．０２vol ％，ジブチルヒドロ
キシトルエン（ＢＨＴ）０．０５wt% 、プレート；ＨＰ
ＴＬＣ（メルク社製），１０×２０ｃｍ，２．５ｃｍ濃
縮ゾーン付、試料注入量；１μｌ、間隔：２ｃｍ、展開
距離；９ｃｍ、検出；ＴＬＣスキャナーＣＳ−９３０
（島津製作所製），４７０ｎｍ、標準にβ−カロチン
（シグマ社製）を用いて定量した。
【００３４】
【実施例２】ＹＰＤ培地１０ｍｌを２１ｍｍ径の試験管
に分注し、１２１℃で２０分間加圧滅菌後、ロトドトル
ラ・グルチニス（ＩＦＯ−１０９９株）を１白金耳接種
し、３０℃，４８時間，３００回転／分で振盪培養を行
った。
に分注し、１２１℃で２０分間加圧滅菌後、ロトドトル
ラ・グルチニス（ＩＦＯ−１０９９株）を１白金耳接種
し、３０℃，４８時間，３００回転／分で振盪培養を行
った。
【００３５】培養後、培養液を３０００ｒｐｍ（１７０
０Ｇ），１０分間遠心分離して菌体を集菌し、これに
０．０５Ｍリン酸緩衝液を菌体数×１０7 ／mlとなるよ
うに加え懸濁する。この内の１０ｍｌを別の２１ｍｍ径
の試験管に分取し、コバルト６０（γ線）照射（線源と
の距離１０ｃｍ，照射線量１２０K ｒａｄ）により変異
誘発処理を行なった。
０Ｇ），１０分間遠心分離して菌体を集菌し、これに
０．０５Ｍリン酸緩衝液を菌体数×１０7 ／mlとなるよ
うに加え懸濁する。この内の１０ｍｌを別の２１ｍｍ径
の試験管に分取し、コバルト６０（γ線）照射（線源と
の距離１０ｃｍ，照射線量１２０K ｒａｄ）により変異
誘発処理を行なった。
【００３６】変異誘発処理後、３０００ｒｐｍ（１７０
０Ｇ），１０分間遠心分離した。分離後上澄を除去し、
分離した菌体にＹＰＤ培地１０ｍｌを加え、変異固定を
するため３０℃，１５時間，３００回転／分で振盪培養
を行った。
０Ｇ），１０分間遠心分離した。分離後上澄を除去し、
分離した菌体にＹＰＤ培地１０ｍｌを加え、変異固定を
するため３０℃，１５時間，３００回転／分で振盪培養
を行った。
【００３７】培養後、硝酸サルコナゾール添加ＹＰＤ平
板培地に培養液を塗布し、３０℃で７２〜１２０時間培
養してコロニーを形成させ、イミダゾール系薬剤耐性の
有無を調べた。
板培地に培養液を塗布し、３０℃で７２〜１２０時間培
養してコロニーを形成させ、イミダゾール系薬剤耐性の
有無を調べた。
【００３８】目的とする変異株は薬剤耐性で、且つ濃橙
色のコロニーを形成するので、これらの性質を有する株
を選び、更に常法による培養及び抽出操作を行なった
後、β−カロチン含有量を実施例１と同様に薄層クロマ
トグラフィー法で定量し、β−カロチン産生に優れた菌
株を特定し、変異株ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２
−２（微工研菌寄第１２９９６号）株を取得した。
色のコロニーを形成するので、これらの性質を有する株
を選び、更に常法による培養及び抽出操作を行なった
後、β−カロチン含有量を実施例１と同様に薄層クロマ
トグラフィー法で定量し、β−カロチン産生に優れた菌
株を特定し、変異株ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２
−２（微工研菌寄第１２９９６号）株を取得した。
【００３９】
【実施例３】実施例１、実施例２で取得した変異株ロド
トルラ・グルチニスＭＯＹ−２−１、ロドトルラ・グル
チニスＭＯＹ−２−２及びロドトルラ・グルチニスＩＦ
Ｏ−１０９９株を用い前培養の後、本培養を行なった。
トルラ・グルチニスＭＯＹ−２−１、ロドトルラ・グル
チニスＭＯＹ−２−２及びロドトルラ・グルチニスＩＦ
Ｏ−１０９９株を用い前培養の後、本培養を行なった。
【００４０】前培養として、ＹＰＤ培地１０ｍｌを２１
ｍｍ径の試験管に分注し、１２１℃で２０分間加圧滅菌
後、上記菌株各々を、滅菌後の各ＹＰＤ培地へ１白金耳
接種し、振盪培養器で３０℃，２４時間，３００回転／
分で振盪培養を行った。
ｍｍ径の試験管に分注し、１２１℃で２０分間加圧滅菌
後、上記菌株各々を、滅菌後の各ＹＰＤ培地へ１白金耳
接種し、振盪培養器で３０℃，２４時間，３００回転／
分で振盪培養を行った。
【００４１】次に本培養として、ＹＰＤ培地１００ｍｌ
の入った５００ｍｌフラスコをそれぞれ滅菌した後、各
菌株の前培養液１０ｍｌを接種して、３０℃，１２０時
間，１７０ｒｐｍで振盪培養を行った。本培養終了後、
各菌株本培養液から５ｍｌを分取し、これをヌクレポア
フィルター（０．８μｍ）で菌体を減圧濾過した。１０
５℃，３時間加熱乾燥して各菌株の乾燥菌体重量（ｇ／
ｌ）を求めた。
の入った５００ｍｌフラスコをそれぞれ滅菌した後、各
菌株の前培養液１０ｍｌを接種して、３０℃，１２０時
間，１７０ｒｐｍで振盪培養を行った。本培養終了後、
各菌株本培養液から５ｍｌを分取し、これをヌクレポア
フィルター（０．８μｍ）で菌体を減圧濾過した。１０
５℃，３時間加熱乾燥して各菌株の乾燥菌体重量（ｇ／
ｌ）を求めた。
【００４２】各菌株本培養液から２０ｍｌを遠沈管に分
取し、３０００ｒｐｍ（１７００Ｇ），１０分間遠心分
離した。遠心分離後、上澄を除去して得た各菌体に、
０．５ｍｌの水を加え懸濁させ、粒径０．５ｍｍのガラ
スビーズが入った容量２ｍｌの各チューブに全量を移し
た。ガラスビーズセルホモジナイザーで菌体を破砕（２
６００ｒｐｍ，５分間）後、各チューブ内の菌体を０．
００５％ＢＨＴ含有メタノール溶液で洗い流しながら、
それぞれを遠沈管に移し全量１０ｍｌとなるように調整
した後、３０００ｒｐｍ（１７００Ｇ），１０分間遠心
分離して各破砕菌体を集めた。
取し、３０００ｒｐｍ（１７００Ｇ），１０分間遠心分
離した。遠心分離後、上澄を除去して得た各菌体に、
０．５ｍｌの水を加え懸濁させ、粒径０．５ｍｍのガラ
スビーズが入った容量２ｍｌの各チューブに全量を移し
た。ガラスビーズセルホモジナイザーで菌体を破砕（２
６００ｒｐｍ，５分間）後、各チューブ内の菌体を０．
００５％ＢＨＴ含有メタノール溶液で洗い流しながら、
それぞれを遠沈管に移し全量１０ｍｌとなるように調整
した後、３０００ｒｐｍ（１７００Ｇ），１０分間遠心
分離して各破砕菌体を集めた。
【００４３】上澄を除去後、各破砕菌体に０．００５％
ＢＨＴ含有塩化メチレン−メタノール混合溶媒６ｍｌづ
つを加え、２５０回／分，振幅４０ｍｍの水平振盪器で
２０分間振盪抽出した。これらを、３０００ｒｐｍ（１
７００Ｇ），１０分間遠心分離して、上澄を回収し抽出
液とした。更に各菌体残渣について抽出操作を繰り返
し、各菌体ごとに、ここで得た抽出液と先に得た抽出液
とを合わせて、２５ｍｌのチューブに移し４０℃の湯浴
中で抽出液に窒素ブローをしながら溶媒を除去して抽出
液残渣物を得た。
ＢＨＴ含有塩化メチレン−メタノール混合溶媒６ｍｌづ
つを加え、２５０回／分，振幅４０ｍｍの水平振盪器で
２０分間振盪抽出した。これらを、３０００ｒｐｍ（１
７００Ｇ），１０分間遠心分離して、上澄を回収し抽出
液とした。更に各菌体残渣について抽出操作を繰り返
し、各菌体ごとに、ここで得た抽出液と先に得た抽出液
とを合わせて、２５ｍｌのチューブに移し４０℃の湯浴
中で抽出液に窒素ブローをしながら溶媒を除去して抽出
液残渣物を得た。
【００４４】この抽出液残渣物中のβ−カロチン含有量
の定量は、少量の塩化メチレンで溶解した後、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析法によって下記の
条件で行なった。
の定量は、少量の塩化メチレンで溶解した後、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析法によって下記の
条件で行なった。
【００４５】カラムはＴＳＫ ｇｅｌ ＯＤＳ １２０
Ａ（東ソー社製４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用い、試料
１０μｌを注入し、移動相；メタノール，流速；１．０
ｍｌ／分，検出；４７０ｎｍ，で標準にβ−カロチン
（シグマ社製）を用いて含有量を求めた。結果を表１に
示す。
Ａ（東ソー社製４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用い、試料
１０μｌを注入し、移動相；メタノール，流速；１．０
ｍｌ／分，検出；４７０ｎｍ，で標準にβ−カロチン
（シグマ社製）を用いて含有量を求めた。結果を表１に
示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
【発明の効果】変異誘発処理により創製した、β−カロ
チン高産生能酵母ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−
１及びロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−２を発酵生
産に用いることで、β−カロチンを品質的に安全で且つ
安定した生産を行なうことができる。
チン高産生能酵母ロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−
１及びロドトルラ・グルチニスＭＯＹ−２−２を発酵生
産に用いることで、β−カロチンを品質的に安全で且つ
安定した生産を行なうことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (4)
- 【請求項１】β−カロチンを菌体内に蓄積するように変
異誘発した、ロドトルラ属（Rhodotorula ）に属するβ
−カロチンを生産する酵母。 - 【請求項２】請求項１に記載の酵母が、イミダゾール系
抗真菌剤を含有する培地で生育することを特徴とする、
β−カロチンを生産する酵母。 - 【請求項３】請求項２に記載の酵母が、ロドトルラ・グ
ルチニスＭＯＹ−２−１株及びロドトルラ・グルチニス
ＭＯＹ−２−２株であることを特徴とする、β−カロチ
ンを生産する酵母。 - 【請求項４】請求項１から請求項３に記載の酵母いずれ
かを用いて培養し、その培養物からβ−カロチンを採取
することを特徴とする、β−カロチンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20316792A JP2810990B2 (ja) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | β−カロチンを生産する酵母及び酵母によるβ−カロチンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20316792A JP2810990B2 (ja) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | β−カロチンを生産する酵母及び酵母によるβ−カロチンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622748A true JPH0622748A (ja) | 1994-02-01 |
| JP2810990B2 JP2810990B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=16469563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20316792A Expired - Lifetime JP2810990B2 (ja) | 1992-07-08 | 1992-07-08 | β−カロチンを生産する酵母及び酵母によるβ−カロチンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2810990B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100900828B1 (ko) * | 2007-07-19 | 2009-06-04 | 함평군 | 로도토룰라 스피시스 에이치피 |
| EP3124597A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-01 | Fundacíon Tecnalia Research & Innovation | A sporobolomyces roseus strain for the production of compositions with colorant and antioxidant properties |
| WO2023039922A1 (zh) * | 2021-09-16 | 2023-03-23 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一株经航天育种技术选育的变异菌株 |
-
1992
- 1992-07-08 JP JP20316792A patent/JP2810990B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100900828B1 (ko) * | 2007-07-19 | 2009-06-04 | 함평군 | 로도토룰라 스피시스 에이치피 |
| EP3124597A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-01 | Fundacíon Tecnalia Research & Innovation | A sporobolomyces roseus strain for the production of compositions with colorant and antioxidant properties |
| WO2017017188A1 (en) | 2015-07-29 | 2017-02-02 | Fundacion Tecnalia Research & Innovation | A sporobolomyces roseus strain for the production of compositions with colorant and antioxidant properties |
| WO2023039922A1 (zh) * | 2021-09-16 | 2023-03-23 | 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) | 一株经航天育种技术选育的变异菌株 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2810990B2 (ja) | 1998-10-15 |
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