JPH0622765A - Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ
をコードし、かつＳ．セレビシエ中でのこのシンテター
ゼの発現を制御するのに必要な転写および翻訳の活性化
配列、ならびにリボフラビンシンテターゼをコードする
遺伝子の制御配列を含有するＤＮＡ化合物を提供する。 【構成】 Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ
の遺伝子は、本発明によるプラスミドｐＪＲ２３５から
単離することができる。 【効果】 得られるＤＮＡ化合物は、組換え宿主細胞中
でリボフラビンシンテターゼの発現を制御する発現ベク
ターの構成のために使用することができ、かつビタミン
Ｂ２を生産する生物体中でのビタミンＢ２収率を改善す
るのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組換え宿主細胞におけ
るサッカロミセス・セレビシエのリボフラビンシンテタ
ーゼ活性の発現をコードしかつ制御し、ならびにビタミ
ンＢ２を生産する生物体中のこのビタミン収率を改善す
ることのできるＤＮＡ化合物および組換えＤＮＡ発現ベ
クターに関する。

【０００２】

【従来の技術】リボフラビンまたはビタミンＢ２は、た
とえばフラビン・アデニン・ジヌクレオチド（ＦＡＤ）
またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のような、
炭水化物の酵素的酸化に必要な補酵素の前生成物であ
る。従って、リボフラビンはすべての生物体における根
本的物質代謝にとり不可欠である。植物および多数の微
生物はリボフラビンを合成する。しかし、高等動物はリ
ボフラビンを生産しない。不十分なリボフラビン量は、
高等動物において脱毛、皮膚炎、視力障害および発育障
害を生じうる。

【０００３】さらに、リボフラビンは、牛乳、卵、脂肪
分の少ない肉、肝臓、腎臓、野菜、穀物、殊に酵母中に
含まれている栄養物であり、その際酵母は最も豊富なリ
ボフラビン源である（Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ”，第９版
（１９７６年），Ｗｉｎｄｈｏｌｇ等，Ｍｅｒｃｋ ＆
Ｃｏ．，第１０６４頁）。

【０００４】リボフラビンは、工業的には、米国特許第
２８０７６１１号（Ｍｅｒｃｋ；１９５７年）に記載さ
れているようにリボースから化学合成によるか、または
糸状菌エレモテシウム・アッシュビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈ
ｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｙｉｉ）またはアッシュビヤ・ゴ
ッシピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（Ｔｈｅ
Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ，ｓｕｐｒａ）の発酵によっ
て製造することができる。さらに、ニワトリおよびウシ
類の飼育用のリボフラビン濃縮物は、米国特許第２８７
６１６９号（Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏ
ｒｐ．，１９５９年）に記載されているように、発酵法
によって製造することができる。

【０００５】バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）の突然変異体からの大量のリボ
フラビンの製造は下記の特許に記載された：−米国特許
第３９００３８６号（Ｅｎｅｉ等，１９７５年）。ここ
には、アザグアニンおよびアザキサンチンとの接触によ
って選択される、バチルス・スブチリスの突然変異体が
記載されている。

【０００６】−フランス国特許第２５４６９０７号（Ｓ
ｔｅｐａｎｏｖ等，１９８４年）。ここには、Ｒｉｂ−
オペロンのコピーを含有するプラスミド（Ｒｉｂｏｆｌ
ａｖｉｎ−Ｏｐｅｒｏｎ）で形質転換された、バチルス
・スブチリスの突然変異体が記載されている。このオペ
ロンの性質の根本的な改善は、モロゾフ（Ｍｏｒｏｚｏ
ｖ等）（Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｉｋ．Ｖｉｒｕｓｏ
ｌ．，ｎｏ １２：１４（１９８５年））およびチキウ
ダス（Ｃｈｉｋｉｕｄａｓ等）（Ｄｉｋｌ．Ａｋａｄ．
Ｎａｕｋ．，第５版，ソ連邦 ２９８：９９７（１９８
８年））により記載されている。これらは本明細書に引
用される。

【０００７】ヨーロッパ特許出願ＥＰ０４０５３７０号
（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧ，１
９９１年）には、その染色体ＤＮＡ中にＳ．セレビシエ
（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｒｉｂ−オペロンの組込
まれかつ拡張されたコピーを含有する、Ｅ．コリ（Ｅ．
ｃｏｌｉ）およびＢ．スブチリスのリボフラビン過剰生
産菌株が記載されている。

【０００８】これらの方法を用いて良好な結果を得るこ
とができるが、若干の研究者は、細菌中のタンパク質を
発現する際の低い正確さ、ならびに細菌は、タンパク質
のグリコシル化を達成することができないという事実に
基づき、大量のリボフラビンを表現する酵母突然変異体
を見出すことを試みた。それで、米国特許第４７９４０
８１号（Ｋａｗａｉ等，１９８８年）には、プリンをベ
ースとする、リボフラビン生産性Ｓ．セレビシエ突然変
異体が記載されている。この特許も、同様に本明細書に
引用される。

【０００９】

【発明の構成】本発明は、なかんずく、Ｓ．セレビシエ
のリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化
合物に関する。この酵素（Ｅ．Ｃ．２．５．１．９）
は、６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジンからの
リボフラビンの製造反応を触媒する。この反応は、ビタ
ミンＢ２およびたとえばＦＭＮまたはＦＡＤのような他
のフラビン誘導体化合物の生合成の際の臨界過程であ
る。

【００１０】これらのＤＮＡ化合物には、Ｓ．セレビシ
エから単離され、リボフラビンシンテターゼ活性を制御
する、組換えＤＮＡ発現ベクターの製造に適当である、
リボフラビンシンテターゼ活性をコードする新規ＤＮＡ
配列が属する。これらのベクターは、Ｓ．セレビシエ中
のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を高度に制御
し、これは本発明による発現ベクターで変換されたＳ．
セレビシエの粗製細胞抽出物が、何らかの活性化前処理
なしに、高いリボフラビンシンテターゼ活性を示すとい
う事情から認められる。従って、本発明による発現ベク
ターは、高いリボフラビンシンテターゼ活性を得るため
の有効な手段である。さらに、本発明による高いリボフ
ラビンシンテターゼ活性は、６，７−ジメチル−８−リ
ビチル−ルマジン以外のルマジンの縮合のためならびに
新規フラビンの生成のために適当である。

【００１１】本発明による、リボフラビンシンテターゼ
活性をコードするＤＮＡ化合物は、酵母、細菌および糸
状菌（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ，
Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉｉ，Ｅｒｅｍｏｔｈｅ
ｃｉｕｍ ａｓｈｂｉｉおよびＡｓｈｂｙａ ｇｏｓｓ
ｙｐｉｉ等）のような他の生物体中でのリボフラビンの
生産の際の効率および収率を増加する他の発現ベクター
製造のため容易に変更することができる。

【００１２】リボフラビンシンテターゼ活性をコードす
る、Ｓ．セレビシエからの本発明によるＤＮＡ化合物は
単離されたが、このＤＮＡは、多数の宿主細胞中でのリ
ボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御するベクター
の製造のために使用することができる。すべてのリボフ
ラビン生産性生物体は同じ前駆物質、即ち６，６−ジメ
チル−８−リビチル−ルマジンを使用するので、リボフ
ラビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮ
Ａ化合物は、すべてのリボフラビン生産性生物体におけ
るリボフラビン発酵の効率および収率を改善する他のベ
クターの製造のために使用することができる。

【００１３】本発明によるリボフラビンシンテターゼ活
性をコードするＤＮＡ化合物は、Ｓ．セレビシエのゲノ
ムＤＮＡから誘導され、リボフラビンシンテターゼ活性
をコードするゲノムＤＮＡの発現を調節する、転写およ
び翻訳の活性化配列と一緒に単離された。本発明は、
Ｓ．セレビシエおよび近縁の生物体中の遺伝子の発現を
制御するのに使用することのできる、これらの転写およ
び翻訳の新規活性化配列を包含する。

【００１４】次に、本発明の対象を要約する。

【００１５】本発明の第１の対象は、Ｓ．セレビシエの
リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合
物である。これらのＤＮＡ化合物は、（ｉ）専らコーデ
ィング領域を包含し、ならびに（ｉｉ）このコーディン
グ領域を、遺伝子のコーディング領域内のコーディング
鎖の３′末端に存在するリボフラビンシンテターゼ遺伝
子の配列または調節シグナルと一緒に包含する。これら
の調節性３′−配列が、Ｓ．セレビシエのリボフラビン
シンテターゼ遺伝子の転写およびポリアデニル化および
ＲＮＡプロセシングの終端を決定する。発現ベクター
（表現すべき遺伝子のコーディング鎖の３′−末端にお
ける）中の適当な位置にこれらシグナルの存在は、ベク
ターによってコードされた生成物の発現を高める。これ
らすべての配列は新規であって、本発明の重要な成分で
ある。これらの配列は遺伝コードの縮退に基づき、リボ
フラビンシンテターゼ活性のアミノ酸配列をコードする
ことのできるすべてのヌクレオチド配列、ならびに本発
明によるリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤ
ＮＡの遺伝的変異型であるすべての配列を包含し、その
際これらの変異型は、同じかまたは類似の活性を有する
ことができかつ本発明による化合物との相同性に基づい
て得ることのできる、本発明によるＤＮＡの等価物であ
ってもよい。

【００１６】本発明の第２の対象は、リボフラビンシン
テターゼ活性をコードするアミノ酸を有する本発明によ
るＤＮＡ化合物、ならびに幾つかのアミノ酸が他の官能
的に等しいアミノ酸によって置換されている、同様にこ
のリボフラビンシンテターゼ活性を有するか、または重
要でない配列が欠けているが、自然の配列と類似の活性
を有するアミノ酸配列である。

【００１７】本発明の第３の対象は、リボフラビンシン
テターゼ活性の発現を制御する組換えＤＮＡ発現ベクタ
ー、ならびにその製造方法である。これらの発現ベクタ
ーは、リボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮ
Ａ化合物を適当なベクター中へ組込むことによって製造
することができる。これらの発現ベクターは、発現を制
御しかつ酵母、糸状菌および細菌におけるリボフラビン
製造を有効に高めるように構成されていてもよい。

【００１８】本発明の第４の対象は、発現ベクターで形
質転換された組換え微生物であり、その際この発現ベク
ターはリボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発
明によるＤＮＡ化合物を含有する。このベクターで形質
転換することのできる微生物としては、それぞれの種類
のすべてのリボフラビン生産性ならびに非生産性微生物
が適当である。これらの組換え微生物の製造方法は本発
明の別の対象である。本発明の第５の対象は、リボフラ
ビンシンテターゼ活性をコードする本発明によるＤＮＡ
化合物を含有する発現ベクターで形質転換された微生物
の培養によるリボフラビンシンテターゼ活性の生産方法
であり、その際この培養は、遺伝子の発現を可能にする
条件下で実施される。リボフラビンシンテターゼ活性
は、精製するかまたは精製せずに、直接に粗製細胞抽出
物から使用することができる。

【００１９】本発明の第６の対象は、このビタミンを製
造する微生物のリボフラビン生産を増加する方法であ
る。このためには、リボフラビン生産性微生物中へ、リ
ボフラビンシンテターゼ活性をコードする本発明による
ＤＮＡ化合物が組込まれる。これらの微生物はとくに種
々の種類の酵母、糸状菌および細菌である。

【００２０】本発明の第７の対象は、６，７−ジメチル
−リビチルルマジンから、本発明によるＤＮＡ化合物に
よってコードされたリボフラビンシンテターゼ活性の使
用下にリボフラビンを製造する方法である。この方法
は、単離された純合成酵素の使用下またはこの酵素を含
有する粗製細胞抽出物の使用下に、溶液中ならびに酵素
または細胞を適当な担体に固定することによって実施す
ることができる。

【００２１】最後に、本発明のもう１つの対象は、基質
として本発明によるリボフラビンシンテターゼから識別
しうる、６，７−ジメチル−リビチルルマジン以外のル
マジンを使用する、新規フラビンまたはフラビン誘導体
（天然のフラビンまたはフラビン誘導体は含まない）の
製造方法である。

【００２２】下記に、これらすべての対象を詳述する。

【００２３】図１および２は、プラスミドＹＥｐ３５２
の機能および制限地図（１Ａ）ならびに遺伝子ＲＩＢ５
のサブクローニング（１Ｂ）を示す。図３は、プラスミ
ドｐＪＲ２３５の機能および制限地図を示す。

【００２４】図４〜６は、プラスミドｐＪＲ２９８の構
成（図４）、遺伝子置換による遺伝子ＲＩＢ５の破壊
（図５）および野生菌株ＪＣ２ａのＫｐｎｌ（ＭＡＴα
ｈｉｓ−Δ１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｕｒ
ａ３−５２）（系列１）および２つの置換菌株ＡＪ５２
およびＡＪ５３（ＭＡＴαｈｉｓ−Δ１ ｌｅｕ２−３
ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２ ｒｉｂ５−１１）
（ＲＩＢ５：：ＵＲＡ）（系列２および３）で発酵させ
たゲノムＤＮＡのサザンブロッティング（図６）を示
す。フィルターは、α−³²Ｐで標識し、フラグメントＫ
ｐｎＩ−ＫｐｎＩ３ｂから誘導されたゾンデでハイブリ
ッド形成した。

【００２５】図７および８は、組換えＰＣＲによる融合
遺伝子ＰＧＫ−ＲＩＢ５の構造（図７）ならびにプラス
ミドｐＪＲ３７６の機能および制限地図（図８）を示
す。

【００２６】図９は、菌株ＪＭ１０１／ｐＴｒｃ９９−
Ａ（系列１，２，３および４）ならびにＪＭ１０１／ｐ
ＪＲ３８０の、ＩＰＴＧで誘導された細胞抽出物（系列
３，４，７および８）または誘導されなかった細胞抽出
物（系列１，２，５および６）の可溶性画分（系列１，
３，５および７）ならびに不溶性画分（系列２，４，６
および８）が分析された、クーマシー・ブルー（Ｃｏｏ
ｍａｓｉｅ Ｂｌａｕ）で染色された１４％のポリアク
リルアミド・ＳＤＳゲル中での、Ｅ．コリ中のリボフラ
ビンシンテターゼ、Ｒｉｂ５−タンパク質の発現を示す
（図Ａ）。図Ｂは、Ｒｉｂ５に対する特異的抗体の使用
下に、プレートＡ上に置かれたゲル中で分析された抽出
物の可溶性および不溶性画分のウエスタンブロッティン
グを示す。図１０は、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビン
シンテターゼの精製および特性表示を示す。図Ａは、イ
オン交換カラム（Ｍｏｎｏ Ｑ ＨＲ５／５）中の総タ
ンパク抽出物からのＦＰＬＣによる精製を示す。線形Ｎ
ａＣｌ勾配（不連続系列）を使用し、かつ種々の１ｍｌ
画分を、Ｒｉｂ５タンパク質の存在に関し、ウエスタン
ブロッティング（上部）および特異的リボフラビンシン
テターゼ活性（連続系列）により分析した。図Ｂは、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動を示す：
系列１、Ｓ．セレビシエの総タンパク抽出物；系列２、
ＦＰＬＣによって精製したリボフラビンシンテターゼ、
系列３、精製したリボフラビンシンテターゼのウエスタ
ンブロッティング。

【００２７】図１１は、自然条件下でのリボフラビンシ
ンテターゼの分子量決定を示す。

【００２８】添付図面の図１〜８に示した機能および制
限地図は、ここで扱われる組換えＤＮＡのベクターの概
略図である。地図の制限フラグメントの広がりはベクタ
ーの制限フラグメントの広がりに比例するが、フラグメ
ント間の距離は地図において算出される距離とは若干相
違する。制限フラグメントに対する指示は完全ではない
ので、特定のベクター中には、地図に示されているより
も多くのフラグメントが存在しうる。

【００２９】Ａ． 定義 本発明を明確にしかつ良好な理解のために、下記に若干
の概念を定義する： ＤＮＡ化合物：ＤＮＡ分子およびＤＮＡ配列、ならびに
その遺伝産物をコードするために必要なすべての情報を
保持するフラグメント（転写および翻訳を活性化するそ
の配列を含む）、ならびにこのＤＮＡ中に含有されてい
る情報の発現の調節シグナル。本発明においては、とこ
ろどころ表現“本発明によるＤＮＡ化合物”は、本発明
によるリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮ
Ａ配列が考えられている意味で使用する。

【００３０】ＲＩＢ５：サッカロミセス セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）のリボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮ
Ａ。

【００３１】ＵＲＡ３：サッカロミセス セレビシエの
オロチジン−５′−ホスフェート−デカルボキシラーゼ
をコードするＤＮＡ。

【００３２】生合成のリボフラビン遺伝子：一次物質代
謝産物のリボフラビンへの変換法における反応に必要な
活性をコードするＤＮＡセグメント。

【００３３】リボフラビン生産性生物体：専らではない
が、サッカロミセス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、バ
チルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エレモテシウム（Ｅｒｅ
ｍｏｔｈｅｃｉｕｍ）およびアッシュビヤ（Ａｓｈｂｙ
ａ）を含めリボフラビンを生産するかまたは発現の際に
リボフラビンを生産する遺伝子を含有する生物体。

【００３４】ＡｐＲ：アンピシリンに対する抵抗を伝達
する遺伝子。

【００３５】Ｓａｃ ＤＮＡ：サッカロミセス セレビ
シエのＤＮＡ。

【００３６】クローニング：組換えＤＮＡのクローニン
グベクター中へのＤＮＡセグメントの組込みゲノム ゲ
ノテク（Ｇｅｎｏｍｉｓｃｈｅ Ｇｅｎｏｔｈｅｋ）：
大体において当該生物体の全ゲノムを表わすＤＮＡセグ
メントがクローニングされている、組換えＤＮＡのクロ
ーニングベクターの束。

【００３７】ハイブリッド形成：完全または部分的な塩
基対であってもよい、２つの相補性１本鎖ＤＮＡ分子の
２本鎖ＤＮＡ分子への対合法。

【００３８】リボフラビンシンテターゼ：６，７−ジメ
チル−８−リビチル−ルマジンからのリボフラビン生成
を触媒する酵素。

【００３９】組換えＤＮＡ−発現ベクター：科学的また
は工業的に重要なポリペプチドをコードするＤＮＡセグ
メントの発現を制御するための、転写および／または翻
訳を活性化する配列を包含する、（専らではないが）プ
ラスミドを含む自律性複製または組込み手段。

【００４０】制限フラグメント：１つまたは幾つかの制
限酵素の作用によって得られる直鎖ＤＮＡ分子。

【００４１】形質転換細胞：形質転換を受けた受容宿主
細胞。

【００４２】形質転換：エルブ型を変えて受容細胞への
変換を生じる、受容宿主細胞中へのＤＮＡの組込み。

【００４３】転写の活性化配列：ＤＮＡ転写を促進する
ＤＮＡ配列。

【００４４】翻訳の活性化配列：ＡＲＮｍへの転写の際
ＡＲＮｍのタンパク質への翻訳を惹起するＤＮＡ配列。

【００４５】Ｂ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシン
テターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物 本発明の第１の対象は、Ｓ．セレビシエのリボフラビン
シンテターゼをコードするＤＮＡ化合物である。その製
造のためには、動原体ベクターＹＣｐ５０中のＳ．セレ
ビシエＧＲＦ８８のゲノムＤＮＡのゲノム・ゲノテク
（ＡＴＣＣにＮｏ．３７４１５で寄託された）を使用
し、これをＳ．セレビシエの菌株ＡＪ１０のｒｉｂ５−
１０の突然変異を例２による形質転換によって相補する
ことのできる配列の立証するために試験した。非機能性
リボフラビンシンテターゼ活性をコードする配列に影響
を与えるｒｉｂ５−１０突然変異が非機能性リボフラビ
ンシンテターゼの合成を決定し、この突然変異の担体菌
株中の６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン媒地
中でのリボフラビン栄養素要求性および蓄積を生じる。
ゲノムゲノテク中の一連のベクターは、ｒｉｂ５−１０
突然変異を相補し、リボフラビン不含最小培地中でのこ
れらベクターの担体菌株ＡＪ１０の形質転換細胞の成長
を可能にすることのできた、Ｓ．セレビシエの組込まれ
たＤＮＡ−フラグメントを含有していた。例２による遺
伝的破壊および配列決定は、ベクターの少なくとも１つ
は、遺伝子ＲＩＢ５を担持しかつＳ．セレビシエ中のリ
ボフラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡフラグ
メントを組込んで含有していたことを示す。次いで、
Ｓ．セレビシエのＲＩＢ５遺伝子を、Ｃ．コリのＪＭ１
０１菌株の形質転換のために使用されたプラスミドｐＪ
Ｒ２３５（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等，１９８５
年，Ｇｅｎｅ ３３：１０３）の形成下にクローニング
した。Ｅ．コリの形質転換細胞ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３
５は、ＮＣＩＭＢにおいてＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０４８
０で寄託された。図３は、プラスミドｐＪＲ２３５の機
能および制限地図を示す。

【００４６】Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテター
ゼ遺伝子のコーディング配列は、プラスミドｐＪＲ２３
５の制限フラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ ２．２ｋｂ
から単離することができる。この制限フラグメントおよ
びコーディング配列はヌクレオチドの配列決定によって
特性表示された。引き続き、リボフラビンシンテターゼ
活性をコードするＤＮＡ配列が、Ｓ．セレビシエの遺伝
子中のコーディング領域の３′−末端をフランキングす
るＤＮＡ部分（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１）と一緒に示され
る。２本鎖ＤＮＡ分子のコーディング鎖または“セン
ス”鎖の配列のみが示される。これは、左から右へ５′
→３′方向に記入されている。ヌクレオチド配列を番号
付けする場合、番号はＤＮＡ配列に沿って出現する。各
ＤＮＡ配列の列の直接下方には、アミノ末端方向で左か
ら右へ→末端カルボキシル、ＤＮＡによりコードされる
リボフラビンシンテターゼのアミノ酸基配列が示され
る。各アミノ酸基はそれをコードするヌクレオチドトリ
プレットの下方に出現する。アミノ酸基の配列を番号付
けする場合、番号はアミノ酸基の配列（ＳＥＱ ＩＤＮ
Ｏ２）の下方に出現する。

【００４７】ここで、記号は次のものを表わす：Ａ デ
オキシアデニル、Ｇ デオキシグアニル、Ｃ デオキシ
シチジル、Ｔ チミジル、ＡＬＡ アデニン基、ＡＲＧ
アルギニン基、ＡＳＮ アルパラギン基、ＡＳＰ ア
ルパラギン酸基、ＣＹＳ システイン基、ＧＬＮ グル
タミン基、ＧＬＵ グルタミン酸基、ＧＬＹ グリシン
基、ＨＩＳ ヒスチジン基、ＩＬＥ イソロイシン基、
ＬＥＵ ロイシン基、ＬＹＳ リジン基、ＭＥＴ メチ
オニン基、ＰＨＥ フェニルアラニン基、ＰＲＯ プロ
リン基、ＳＥＲ セリン基、ＴＨＲ スレオニン基、Ｔ
ＲＰ トリプトファン基、ＴＹＲ チロシン基およびＶ
ＡＬ バリン基。

【００４８】専門家は、ここで示したＤＮＡ配列は本発
明の重要な部分であることを知っている。遺伝コードの
縮退（これにより停止シグナルおよびアミノ酸基の大多
数は１以上のコドンによってコードされている）に基づ
き、上記に示したリボフラビンシンテターゼのアミノ酸
配列は、多数のＤＮＡ配列によってコードすることがで
きる。これらのいずれか一方のＤＮＡ配列が本発明によ
るアミノ酸配列をコードするので、本発明は同様にこれ
らいずれか一方の配列をも包含する。

【００４９】リボフラビンシンテターゼのコーディング
配列は、慣例の方法でまたは完全に保護されたデオキシ
リボヌクレオシドを使用してホスホルアミデート法によ
って合成することができる。これらの合成法は良く知ら
れており、ボーケージュ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）等（１９
８１年，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ２
２：１８５９）の方法に従って実施することができる。
ＤＮＡ配列は、たとえばアプライド・バイオシステムズ
社のモデル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｍｏｄｅｌ）３８０Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）の自動的ＤＮＡ合成装置を用いて製造する
ことができる。

【００５０】上記の、リボフラビンシンテターゼのＤＮ
Ａコーディング配列のほかに、本発明によるリボフラビ
ンシンテターゼをコードするＤＮＡ配列の遺伝的変異型
が出現しうる。これらの遺伝的変異型は、天然に出現す
る型の遺伝的多様性を表わし、ヌクレオチドおよびアミ
ノ酸基の配列の、本発明による化合物との本質的相同性
を示すことができる。これらは完全に同じ活性を有しな
いとしても、何らかの方法で、本発明において示した類
似のヌクレオチド配列とは識別しうる。これらの遺伝的
変異型は本発明による化合物の等価物であり、本発明に
よるリボフラビンシンテターゼのコーディングＤＮＡ配
列との相同性に基づき得ることができる。

【００５１】Ｂ．１ 転写および翻訳の活性化配列 本発明は、リボフラビンシンテターゼのアミノ酸配列を
コードするだけではなく、Ｓ．セレビシエ中でのリボフ
ラビンシンテターゼの発現の調節に必要な、転写および
翻訳の活性化配列をもコードする、完全な機能的ＤＮＡ
配列のクローニングに基づく。同時に、本発明によるリ
ボフラビンシンテターゼ遺伝子は、コーディング領域に
続く、転写の終結に責任がありかつＤＮＡのプロセシン
グ−およびポリアデニル化シグナルを提供する配列を含
有する。これらの制御要素５′および３′は本発明の重
要なアスペクトである。ｐＪＲ２３５遺伝子≒０．２０
ｋｂは、Ｓ．セレビシエのゲノム中で、リボフラビンシ
ンテターゼをコードするＤＮＡに先行するゲノムＤＮＡ
に含有されているので、ｐＪＲ２３５プラスミドは必然
的に、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝
子の転写および翻訳の活性化配列を含有する。

【００５２】転写および翻訳の、多数の活性化配列は、
リボソームＲＮＡをコードする若干の配列は、コーディ
ング領域に先行しない活性化配列によって活性化される
が、活性化すべきＤＮＡの前でコードされている。この
点で、コーディング領域に“先行する”というのは、リ
ボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡのコーディ
ング鎖の５′−末端の５′方向のＤＮＡに関する。ｐＪ
Ｒ２３５プラスミド中にコードされている、Ｓ．セレビ
シエの転写および翻訳の活性化配列は、リボフラビンシ
ンテターゼをコードするＤＮＡの発現を制御するため
に、正しい位置に存在する。ｐＪＲ２３５の構成におい
て、リボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡのコ
ーディング鎖の５′−末端には、プラスミドｐＪＲ２３
５中のリボフラビンシンテターゼ遺伝子の転写および翻
訳の活性化配列に影響しうる欠失も挿入も組込まれてお
らず、その際この活性化配列は、ｐＪＲ２３５プラスミ
ド中のリボフラビンシンテターゼをコードするＤＮＡの
傍に存在する、直接に先行する制限フラグメントＫｐｎ
Ｉ−ＮｄｅＩ中に単離することができる。位置ＮｄｅＩ
は、リボフラビンシンテターゼタンパク質のアミノ酸１
８および１９をコードするので、リボフラビンシンテタ
ーゼのアミノ末端端部のコーディング領域も同様にこの
フラグメントＫｐｎＩ−ＮｄｅＩ中に含有されている。
上記の≒０．２０ｋｂのフラグメントＫｐｎＩ−Ｎｄｅ
Ｉを含有する各制限フラグメントは、必然的に、本発明
による転写および翻訳の活性化配列をも含有する。次
に、ｐＪＲ２３５中のコードされた、Ｓ．セレビシエの
転写および翻訳の活性化配列のＤＮＡ配列を記載する。
この配列は、化学的に合成し、ｐＪＲ２３５プラスミド
から単離するか、またはｐＪＲ２３５プラスミドまたは
Ｓ．セレビシエのゲノム総ＤＮＡから、ポリメラーゼ連
鎖反応によって増幅することができる。ｐＪＲ２３５プ
ラスミド中の活性化配列の配向を明らかにするため、制
限フラグメントを、制限酵素ＫｐｎＩに典型的でありか
つ翻訳の開始コドンをも包含する、１本鎖の重複ＤＮＡ
配列として表わす。

【００５３】サッカロミセス・セレビシエのＤＮＡ配列 ｐＪＲ２３５プラスミド中にコードされた、転写および
翻訳の活性化配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３）

【００５４】

【表１】

【００５５】“ＴＡＣ”は、リボフラビンシンテターゼ
のアミノ末端メチオニン基をコードする５′−ＡＴＧ−
３′に対して相補的である。

【００５６】転写および翻訳の活性化配列は、Ｓ．セレ
ビシエまたは類似の生物体中のそれぞれ任意のＤＮＡ配
列中で発現の制御のために使用することができる。Ｓ．
セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ遺伝子の転写
プロモーターは、種々のタンパク質形のコーディング領
域に融合することができる。転写および翻訳５′−ＡＴ
Ｇの開始コドンの前にある５′−配列は、たとえば制限
に適当な部位、たとえばＮｄｅｌまたはＮｃｏｌをつく
るためにＳ．セレビシエのプロモーターを重要なタンパ
ク質のコーディング領域と融合するためポリメラーゼ連
鎖反応によって拡張および変更することができる。

【００５７】タンパク質のコーディング領域は、同様
に、結合を可能にする２つの和合性末端を含有するよう
に適合することができる。このために、タンパク質のコ
ーディング領域により、異なる戦略が適用される。Ｓ．
セレビシエ プロモーターと重要なタンパク質のコーデ
ィング領域との融合は、例３に示した方法に従いポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なうこともでき
る。例３には、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテタ
ーゼのコーディング領域と、Ｓ．セレビシエのＰＧＫ遺
伝子の転写プロモーターおよび翻訳の活性化配列との融
合記録を記載する。類似の方法によって、Ｓ．セレビシ
エのリボフラビンシンテターゼのコーディング領域を各
任意の生物体の転写プロモーターおよび翻訳の活性化配
列と結合することができる。

【００５８】本発明は、リボフラビンシンテターゼ活性
をコードするＤＮＡの発現を制御する際の転写および翻
訳の特定の活性化配列に制限されていない。本発明は、
Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性の発
現のために転写および翻訳の任意の活性化配列を使用す
ることを包含する。Ｓ．セレビシエ中の転写および翻訳
の多数の活性化配列は公知でありかつＳ．セレビシエ中
のリボフラビンシンテターゼ活性を制御するために使用
することができる。これら転写および翻訳の活性化配列
は、たとえば、全部ではないが、ＰＧＫ、ＴＰＩ、ＡＤ
Ｃｌ、ＥＮＯｌ、ＧＡＬｌおよびＧＡＰの転写および翻
訳の活性化配列を包含する。種々の自律性複製配列およ
び上記に例示した、転写および翻訳の活性化配列のほか
に、他の生物体の転写および翻訳の自律性複製配列およ
び活性化配列を、リボフラビンシンテターゼ活性をコー
ドする本発明のＤＮＡ化合物と結合して、自律性複製配
列および活性化配列が活動することのできる宿主細胞中
のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を制御する発現
ベクターを形成することができる。Ｓ．セレビシエは試
験管内での使用のための、リボフラビンシンテターゼ製
造のための適当な宿主であるが、Ｓ．セレビシエ以外の
宿主細胞中のリボフラビンシンテターゼ活性の発現を制
御する発現ベクターも、殊に他の生物体中のリボフラビ
ンの効力および生産能力を増加したい場合には使用する
ことができる。若干のリボフラビン生産性生物体は、ビ
タミンＢ２製造工業において使用される。この生物体の
ビタミンＢ２生産能力は、発酵の間生合成制限酵素の濃
度を高めることにより高め、有効にすることができる。

【００５９】Ｂ．２ Ｓ．セレビシエのリボフラビンシ
ンテターゼ遺伝子の制御配列 ｐＪＲ２３５プラスミドも同様に、Ｓ．セレビシエのリ
ボフラビンシンテターゼ遺伝子の３′−制御配列を包含
する。一般に、ｍＲＮＡの転写、ポリアデニル化および
プロセシングの終結に責任のある、遺伝子のコーディン
グ領域の停止コドンに続く配列は、≒５００ｂｐの領域
内でコードされている。従って、リボフラビンシンテタ
ーゼのカルボキシ末端端部をコードするＤＮＡを包含す
る≒１．４ｋｂのＳｃａｌ−ＰｓｔＩフラグメントは、
Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ遺伝子のｍ
ＲＮＡの転写、ポリアデニル化およびプロセシングの終
結シグナルをも含有する。ｐＪＲ２３５プラスミド中の
転写の終結配列はこれら遺伝的構造中の転写終結を可能
にするため、他の組換え遺伝子構造に接合することがで
きる。

【００６０】組換えＤＮＡ発現ベクター中の与えられた
ＤＮＡ配列の発現は、表現すべきコーディング領域のコ
ーディング鎖の３′−末端に、転写、ポリアデニル化お
よびＲＮＡｍ−プロセシングの終結シグナルを挿入する
ことによって高めることができる。本発明は、Ｓ．セレ
ビシエおよび近縁の宿主生物体中の組換えＤＮＡベクタ
ーの任意の遺伝生成物中での発現を高めるために使用す
ることのできる、転写、ポリアデニル化およびｍＲＮＡ
プロセシングの終結シグナルを提供する。

【００６１】本発明によるＤＮＡ化合物は、発現ベクタ
ーが複製または組込まれ、かつリボフラビンシンテター
ゼ活性の発現のため転写および翻訳の活性化配列が使用
される各任意の宿主細胞中でのリボフラビンシンテター
ゼの発現を制御する発現ベクターの構成に使用すること
ができる。付加的に、本発明によるＤＮＡ化合物は、
Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコー
ドするため、および本発明によるリボフラビンシンテタ
ーゼの遺伝的変異型をコードする、Ｓ．セレビシエ以外
の菌株の相同ＤＮＡ化合物の単離のために使用すること
ができる。従って本発明は、リボフラビンシンテターゼ
活性をコードする、プラスミドｐＪＲ２３５およびｐＪ
Ｒ３７６（下記に記載する）中のリボフラビンシンテタ
ーゼをコードする相同のＤＮＡ化合物をも包含する。

【００６２】Ｃ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシン
テターゼ活性の発現を制御する組換えＤＮＡ発現ベクタ
ー Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコー
ドする本発明によるＤＮＡ化合物は、この発現を制御す
る発現ベクターの構成のために使用することができる。
それでたとえばｐＪＲ２３５−プラスミドは、Ｅ．コリ
Ｋ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５から例１に記載した方
法に従って単離することができる。このｐＪＲ２３５−
プラスミドからは、非常に有用な制限フラグメント、た
とえば全ＲＩＢ５−遺伝子を含有する２．２ｋｂのＫｐ
ｎＩ−ＰｓｔＩ、またはアミノ末端端部を除く全遺伝子
を含有する１．４ｋｂのＮｄｅＩ−ＳｔｕＩ−フラグメ
ントを得ることができる。ｐＪＲ２３５−プラスミド
は、Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ活性
の発現を広範に制御するｐＪＲ３７６の符号を有するプ
ラスミドの構成のための基礎として使用された。ｐＪＲ
３７６−プラスミドは、リボフラビンシンテターゼのコ
ーディング配列からなる２．２ｋｂの合成ＤＮＡ−フラ
グメントを、Ｓ．セレビシエのグリコール性酵素３−ホ
スホグリコール酸キナーゼ（ＰＧＫ）（Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎ等，１９８２年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１０：７７９１頁）の遺伝子プロモーターの発現
下に、Ｅ．コリおよびＳ．セレビシエ中での該プラスミ
ドの自律的複製を可能にする配列を含有する、ＹＥｐ３
５２−プラスミドに類似のマルチコピープラスミド、な
らびにＥ．コリ中のアンピシリン抵抗を伝達するβ−ラ
クタマーゼ遺伝子、およびオロチジン−５′ホスフェー
トのデカルボキシラーゼをコードしかつＥ．コリおよび
Ｓ．セレビシエ中のこの栄養要求性遺伝標識の選択を可
能にするＳ．セレビシエのＵＲＡ３−遺伝子中へ接合す
ることによって得られる。添付図面の図１および２は、
ＹＥｐ３５２−プラスミドの機能および制限地図を示
す。大体において、ＰＧＫ−遺伝子はＳ．セレビシエ中
に発現する最も有効な遺伝子の１つであるので、その転
写物ならびにコードしたタンパク質は、全転写物および
細胞タンパク質の５％にまでに達する。ＰＧＫ−プロモ
ーターは、種々の真核タンパク質の高度に有効な発現ベ
クターを生産するように操作することができる（Ｔｕｉ
ｔｅ等，１９８２年，ＥＭＢＯ Ｊ． １：６３；Ｄｅ
ｒｙｎｃｋ等，１９８３年，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．， １１：１８１９；Ｍｅｌｌｏｒ等，１９
８３年，Ｇｅｎｅ ２４：１；Ｗｏｏｄ等，１９８５
年，Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３１４：４４６；Ｒｏｔ
ｈｓｔｅｉｅｎ等，１９８４年，Ｎａｔｕｒｅ（ロンド
ン）３０８：６６２およびＡｄａｍｓ等，１９８７年，
Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３２９：６８）。

【００６３】ｐＪＲ３７６−プラスミドは、塩基対の位
置−５８０〜−１のＰＧＫ−プロモーターを包含し、そ
の際番号付けは位置１として翻訳の開始コドン５′−Ａ
ＴＧ−３′のデソキンアデノシルヌクレオチドではじま
り、該プロモーターはｐＪＲ２３５−プラスミドのリボ
フラビンシンテターゼ遺伝子のコーディング配列の発現
を制御する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に
よる遺伝的融合の構成は、ヨン（Ｙｏｎ）等（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：４８９５，１９
８９年）により記載されている。プラスミドｐＪＲ３７
６の構成記録は、例３に詳細に記載されている。

【００６４】ＳＤ−Ｕｒａ培地中でリボフラビンシンテ
ターゼは、菌株Ｓ．セレビシエのプラスミドｐＪＲ３６
６担持細胞によって、高度に全細胞タンパク質の２％ま
での大きさに発現される。Ｓ．セレビシエ形質転換菌株
ＡＪ５３／ｐＪＲ３７６の細胞抽出物は、６，７−ジメ
チル−８−リビチル−ルマジンのリボフラビンへの形質
転換を触媒することができるが、菌株Ｓ．セレビシエＡ
Ｊ５３の細胞抽出物はこの形質転換を触媒することはで
きない。この転換反応の試験法は、例４Ｃに記載されて
いる。プラスミドｐＪＲ３７６は、Ｓ．セレビシエ中で
大量のリボフラビンシンテターゼを生産するための有効
な機構を、しかも全細胞タンパク質の約１％程度に利用
しうる。この理由からおよびＳ．セレビシエの培養は、
リボフラビンを天然に生産する他の生物体の培養よりも
費用がかからないので、Ｓ．セレビシエ／ｐＪＲ３７６
形質転換細胞は、リボフラビンシンテターゼの製造のた
めに、他の組換えないかまたは“天然”のリボフラビン
シンテターゼ生産細胞よりも経済的かつ有効に使用する
ことができる。本発明によるＳ．セレビシエ／ｐＪＲ３
７６形質転換細胞は高度にリボフラビンシンテターゼを
生産するので、Ｓ．セレビシエのゲノムによりコードさ
れたリボフラビンシンテターゼをほぼ純粋な形で単離す
ることができる。例示したリボフラビンシンテターゼの
精製記録は、例４Ｃに記載されている。

【００６５】上記に既述したように、リボフラビンシン
テターゼをコードする本発明によるＤＮＡ化合物は、発
現ベクターの構成のために使用することができる。これ
らのリボフラビンシンテターゼ発現ベクターを用いて、
リボフラビンをリボフラビンシンテターゼにより触媒さ
れる反応により製造する宿主細胞を形質転換する場合、
細胞内のリボフラビンシンテターゼの濃度が増加する。

【００６６】非形質転換宿主細胞中でのリボフラビン生
合成の制限因子がリボフラビンシンテターゼ活性である
限り、このリボフラビンシンテターゼ発現ベクターを含
有する宿主細胞は、非形質転換細胞よりも多量のリボフ
ラビンを生産する。

【００６７】形質転換された宿主細胞の細胞内部でのリ
ボフラビンシンテターゼの濃度を高めるベクターは、次
の要素を含有していなければならない：１）リボフラビ
ンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物；２）形
質転換すべき細胞中で活動しうるだけでなく、リボフラ
ビンシンテターゼをコードするＤＮＡを制御するための
正しい位置および定位を有する、転写および翻訳の活性
化配列；３）宿主細胞中のベクターを保持する複製およ
び組込み機能。ベクターまたはＤＮＡフラグメントの組
込み頻度は、宿主細胞によりコードされる活性に依存す
る。しかし、ベクターまたはＤＮＡフラグメント中の特
定のＤＮＡ配列（たとえば組込みを促進するファージお
よびウィルスの配列ならびに宿主細胞のゲノムＤＮＡの
相同配列）の存在は組込みを容易にすることがしばしば
確認される。

【００６８】リボフラビンシンテターゼ発現ベクターは
もちろん、このベクターを含有する宿主細胞の選択を可
能にする選択可能な要素をも含有しうる。しかし、これ
らの選択可能な要素は、ベクターまたはＤＮＡフラグメ
ントを宿主細胞の染色体ＤＮＡ中へ組込む場合には、不
要であるかまたは望ましくない。

【００６９】本発明によるリボフラビンシンテターゼ発
現ベクターは、特定の選択可能な遺伝標識に制限されて
いない。専門家は、リボフラビンシンテターゼ発現ベク
ターを使用する場合には多くの選択可能な標識が適当で
あることを承知している。これらの選択可能な標識は、
栄養要求性選択遺伝子、たとえばｌｅｕ２−菌株中の選
択可能なＬＥＵ２−遺伝子（Ｈｉｎｎｅｎ等，１９７８
年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，米国７
５：１９２９）、ｈｉｓ２−菌株中の選択可能なＨＩＳ
３−遺伝子（Ｓｔｒｕｈｌ １９８２年，Ｎａｔｕｒｅ
３００：２８４）ならびにｔｒｐｌ−菌株中の選択可
能なＴＲＰｌ遺伝子（Ｈｉｔｚｅｍａｎｎ等，１９８０
年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：１２０７
３）；優位選択を可能にする遺伝子、たとえば銅抵抗を
与えるＣＵＰｌ−遺伝子（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ等，１９
８５年，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，９：１３３）ならび
に抗生物質抵抗を与える遺伝子、たとえばＧ４１８、Ｔ
ｎ６０１中の選択可能な遺伝標識（Ｔｉｍｅｎｅｚおよ
びＤａｖｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ、２８７：８６９，１９
８０頁）、ヒグロマイシン、プラスミドｐＩＴ１２３中
の選択可能な遺伝標識（Ｋａｓｔｅｒ等，Ｃｕｒｒ．Ｇ
ｅｎｅｔ．，８：３５３，１９８３年）を包含する。

【００７０】若干の本発明によるプラスミドは、リボフ
ラビン生産細胞中のリボフラビンシンテターゼ活性濃度
を高めるのに適当である。プラスミドｐＪＲ２３５は、
Ｓ．セレビシエの完全なリボフラビンシンテターゼ遺伝
子を含有するので、プラスミドｐＪＲ２３５でのＳ．セ
レビシエの形質転換はリボフラビンシンテターゼ遺伝子
のコピー数の増加を形成し、これが細胞内部の酵素濃度
の増加をもたらす。

【００７１】Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテター
ゼ遺伝子は、アッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ
ｇｏｓｓｙｐｉｉ）およびエレモテシウム・アッシュ
ビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓｈｂｉｉ）中で
機能することから出発する。従って、プラスミドｐＪＲ
２３５の組込みによるＡ．ゴッシピィおよびＥ．アッシ
ュビィの形質転換はリボフラビンシンテターゼ遺伝子の
コピー数の増加、ひいては細胞内部における酵素濃度の
増加を生じる。しかし、Ｓ．セレビシエのリボフラビン
シンテターゼをコードする本発明による配列は、エレモ
テシウムおよびアッシュビヤから誘導される転写および
翻訳の活性化配列を、とくにこれら生物体に定められた
組換え遺伝子の構成のために制御することもできる。

【００７２】Ｓ．セレビシエの本発明による発現ベクタ
ーは、ここに記載した特殊なベクターに制限されていな
い。本発明は、Ｓ．セレビシエの各任意の発現プラスミ
ドまたはＳ．セレビシエ中のリボフラビンシンテターゼ
の発現を制御する各ベクターを包含する。従って、本発
明は、Ｓ．セレビシエ中の機能性複製単位、たとえばプ
ラスミド２μの複製原単位および他の自律性複製配列を
使用するリボフラビンシンテターゼ発現ベクターを包含
する。また、本発明はプラスミドベクターに制限されて
おらず、本発明は、リボフラビンシンテターゼ活性を表
現しかつゲノム中でのウィルスによる複製または組込み
を使用し、例３に記載したように、宿主細胞中に維持す
る発現ベクターまたはＤＮＡ化合物をも包含する。

【００７３】Ｄ． リボフラビンシンテターゼ活性をコ
ードするＤＮＡ化合物を含有する発現ベクターで変換さ
れた組換え微生物 本発明の別の対象は、リボフラビンシンテターゼ活性を
コードする本発明によるＤＮＡ化合物を含有する発現ベ
クターで変換された組換え微生物である。これらの形質
転換細胞は、適当な宿主細胞中へ本発明による発現ベク
ターを接合し、引き続きこの細胞を、宿主細胞の染色体
ＤＮＡ中への組込みまたはこの細胞中での複製に適当で
ある条件下で培養し、ならびに形質転換細胞を選択する
ことによって得られる。適当な宿主細胞は、酵母、細菌
または糸状菌のような各リボフラビン生産性または非生
産性微生物である。とくに、これらの微生物は、サッカ
ロミセス、エシェリキア、カンジダ、エルモテシウムお
よびアッシュビヤ属に属するが、他の属の微生物も本発
明による発現ベクターで変換することができる。これら
宿主細胞の形質転換に適当な条件は、形質転換すべき細
胞の種類に依存しかつ専門家に良く知られている。この
点で、次の文献を引用する：Ｍａｎｉａｔｉｓ等，１９
８２年，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニュー
ヨークおよびＹｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｅｄｓ：
Ｊ．Ｆ．Ｔ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄｏｒｏｔｈｙ Ｍ．Ｓ
ｐｅｎｃｅｒおよびＡ．Ｒ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｐｒｉ
ｎｇｅｒ出版（１９８３年）、これには微生物用の通常
の形質転換技術が記載されている。

【００７４】本発明の望ましい実施形ではＥ．コリＪＭ
１０１／ｐＪＲ２３５の形質転換細胞が製造され、これ
は、ＮＣＩＭＢにおいてＮｏ．ＮＣＩＭＢ４０４８０で
寄託された。

【００７５】Ｅ． Ｓ．セレビシエのリボフラビンシン
テターゼ活性の製造 本発明のもう１つの重要な対象は、Ｓ．セレビシエ リ
ボフラビンシンテターゼ活性の製造方法である。この方
法は大体において、本発明による発現ベクターで形質転
換された、Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ
をコードするＤＮＡ化合物を含有する生物体の培養を実
施することを要旨とし、その際この培養は、組込まれる
遺伝子の発現に適当な条件下に行なわれる。これらの条
件は、形質転換される微生物の種類に依存し、既に従前
に挙げた条件の範囲内に存在しうる。

【００７６】リボフラビンシンテターゼ活性は、精製す
ることができるか、または精製せずに直接、この酵素を
含有する粗製細胞抽出物から使用することができる（例
４）。

【００７７】既述したように、本発明はＳ．セレビシエ
リボフラビンシンテターゼ遺伝子のコーディング配列
ならびにＳ．セレビシエ中のこの遺伝子の発現を制御す
る一連の発現ベクターを利用する。Ｓ．セレビシエ中で
のリボフラビンシンテターゼの生産は高い発現速度およ
び酵素の簡単な単離を可能にするので、これは新規フラ
ビン化合物を製造するための新規ルマジン誘導体の試験
管内縮合を触媒するのに使用することができる。Ｓ．セ
レビシエ、カンジダ・グリエルモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・フラレ
リ（Ｃａｎｄｉｄａ ｆｌａｒｅｒｉｉ）、エレモセシ
ウム・アッシュビィ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ａｓ
ｈｂｙｉｉ）、アッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙ
ａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）および他のリボフラビン生産性
生物体を、重要な宿主細胞中でのリボフラビンシンテタ
ーゼの発現を制御する本発明による発現ベクターで形質
転換すると、形質転換された細胞中に高いビタミン含量
が生じる。

【００７８】リボフラビンシンテターゼは、例４に記載
したように、細胞不含系中で６，７−ジメチル−８−リ
ビチル−ルマジンからリボフラビンを製造するために使
用することができる。リボフラビンは天然のビタミンで
あるだけではなく、たとえばＦＭＮおよびＦＡＤのよう
な他の重要な補助因子の製造用出発物質である。リボフ
ラビンシンテターゼの別の重要な使用分野は、本発明に
よるリボフラビンシンテターゼに関し新規フラビン誘導
体の製造のために認めることのできる種々の６，７−ジ
メチル−８−リビチル−ルマジン化合物の縮合である。

【００７９】Ｆ． ６，７−ジメチル−８−リビチル−
ルマジンからのリボフラビンの製造 本発明のもう１つの重要な対象は、６，７−ジメチル−
８−リビチルルマジンからのリボフラビンの製造方法で
ある。この方法は、大体において、６，７−ジメチル−
８−リビチル−ルマジン含有溶液を、本発明によるＳ．
セレビシエ リボフラビンシンテターゼと一緒にするこ
とを要旨とする。このシンテターゼは、精製された形
で、ならびに既述したように、このシンテターゼを含有
する粗製細胞抽出物の使用により精製せずに使用するこ
とができる。この方法は、溶液中でまたは酵素またはシ
ンテターゼ含有細胞を適当な担体に固定することにより
実施することができる。

【００８０】この方法は、 −ｐＨ ６．５〜７．５ −温度 ３０℃〜４０℃で −はじめに１０μｇ／溶液１ｍｌの酵素の最低濃度を用
いて実施することができる。

【００８１】精製された酵素または粗製細胞抽出物から
の酵素を結合することのできる固体担体材料としては、
この種の方法に常用のもの、たとえばカラゲナン、セフ
ァロース（ＳＩＧＭＡ）または他の適当な担体が挙げら
れる。

【００８２】本発明の望ましい実施形においては、リボ
フラビンは６，７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン
から細胞不含の系中で製造される（例４）。

【００８３】Ｇ． 新規フラビンの製造 本発明のもう１つの重要な対象は、本発明によるリボフ
ラビンシンテターゼの使用下に、この酵素により基質と
認識することのできる、６，７−ジメチル−８−リビチ
ル−ルマジン以外のルマジン誘導体から新規フラビンま
たはフラビン誘導体を製造する方法である。

【００８４】リボフラビンシンテターゼは、単離した純
粋な形でまたは粗製細胞抽出物で使用することができ、
この方法は溶液で、ならびに純粋な酵素またはこの酵素
を含有する細胞抽出物の細胞を、適当な固体担体に固定
することにより、上述した形で実施することができる。

【００８５】細胞抽出物リボフラビン生産性生物体は、
天然物でない（天然に産出されない）フラビンを合成す
るために使用することができる。本発明による発現ベク
ターは、新規フラビンまたはフラビン誘導体製造のため
天然に出現しないルマジンの試験管内縮合のために使用
することができ、粗製細胞抽出物中のリボフラビンシン
テターゼを製造する有効かつ廉価な方法を提供する。リ
ボフラビンシンテターゼの担体として適当である天然物
でないルマジン誘導体の探索は、基質として天然物でな
いルマジン誘導体を受容するリボフラビンシンテターゼ
突然変異体の探索によって完成することができる。本発
明は、これらのリボフラビンシンテターゼ突然変異体を
探索するための出発物質を提供する。

【００８６】本発明を次の実施例につき説明するが、該
例は本発明を明らかにするだけで、制限するものではな
い。

【００８７】

【実施例】

例１ Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の培養および
プラスミドｐＪＲ２３５の製造 １．Ａ． Ｅ．コリＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の
培養 ＮＣＩＭＢにＮｏ．４０４８０で寄託されているＥ．コ
リＫ１２ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５凍結乾燥物は、下記
方法において接種培地として使用することができる。

【００８８】ＬＢ培地（１ｌあたりトリプトン１０ｇ、
ＮａＣｌ １０ｇおよび酵母エキス５ｇ）１ｌ（アンピ
シリン１００μｍ／ｌを含有する）に、Ｅ．コリＫ１２
ＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５接種培養物を接種し、３７℃
で通気下に、５９０ｍｎ（Ｏ．Ｄ．₅₉₀）における光学
密度が≒１になるまでインキュベートした。次いで、培
養物にクロラムフェニコール１５０ｍｇを加え、インキ
ュベーションを１６時間続けた。クロラムフェニコール
の添加はタンパク合成、それと共にあとでの細胞分裂を
阻止するが、プラスミドの複製は妨げない。

【００８９】１．Ｂ． プラスミドｐＪＲ２３５の製造 例１Ａにより製造した培養物を、４℃で５分間、ソルバ
ル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＧＳＡロータ（Ｄｕ Ｐｏｎｔ
Ｃｏ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ
ｓ，ウィルミントン在、ＤＥ１９８８０−００２４）中
で６０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心分離した。生じた上澄み
は捨て、細胞沈殿物をＴＥＳ緩衝液（トリス−ＨＣｌ
１０ｍＭ，ｐＨ＝７．５；ＮａＣｌ １０ｍＭおよびＡ
ＤＴＡ １ｍＭ）４０ｍｌ中で洗浄し、沈殿させた。上
澄みを再び捨て、細胞沈殿物をドライアイスおよびエタ
ノール含有浴中で凍結し、引き続き再び解凍した。解凍
した細胞沈殿物を改めて、サッカロース２５％およびＥ
ＤＴＡ５０ｍＭからなる溶液１０ｍｌに懸濁させた。引
き続き、この溶液に、リゾチーム５ｍｇ／ｍｌ、ＥＤＴ
Ａ０．２５Ｍ ３ｍｌ、ｐＨ＝８．０、ならびにリボヌ
クレアーゼＡ１００μｌからなる溶液を混合し、次いで
これを１５分間氷中でインキュベートとした。リゾチー
ムで処理した細胞に、溶解液（１０％のＴｒｉｔｏｎ−
Ｘ １００ ３ｍｌ、ＥＤＴＡ ０．２５Ｍ ７５ｍ
ｌ、ｐＨ＝８．０、トリス−ＨＣｌ １Ｍ１５ｍｌ、ｐ
Ｈ＝８．０および水７ｍｌを混合することにより製造）
３ｍｌを添加し、混合した後、生じた溶液を１５分間氷
中でインキュベートした。凍結乾燥した細胞を、ドライ
アイス・エタノール浴中で凍結し、引き続き再び解凍し
た。

【００９０】細胞廃棄物は、ＳＷ２７−ロータ（Ｂｅｃ
ｋｍａｎ，７３６０ Ｌｉｎｃｏｌｎ．Ａｖｅ．，Ｌｉ
ｎｃｏｌｎｗｏｏｄ，ＩＬ６０６４６）中で２５０００
ｒ．ｐ．ｍ．で４０分遠心分離し、緩衝したフェノール
で抽出することにより溶液から除去した。

【００９１】ＣｓＣｌ約３０．４４ｇおよび臭化エチジ
ウム５０ｍｇ／ｍｌからなる溶液約１ｍｌを上記溶液に
加え、引き続き溶液を４０ｍｌにし、超遠心機Ｖｔｉ５
０（Ｂｅｃｋｍａｎ）の管に入れた。管を密封し、溶液
をロータＶＴｉ５０中、４２０００ｒ．ｐ．ｍ．で遠心
分離した。生成したプラスミドの、紫外線で可視性にし
た横盤を単離し、管およびロータＴｉ５７に入れ（容積
適合は、ＣｓＣｌ ０．７６１ｇ／ｍｌを含有するＴＥ
Ｓを用いて実施した）、５００００ｒ．ｐ．ｍ．で１６
時間遠心分離した。プラスミド横盤（Ｐｌａｓｍｉｄｑ
ｕｅｒｓｃｈｅｉｂｅ）を改めて単離し、臭化エチジウ
ムを除去するため、食塩で飽和したイソプロパノールで
抽出し、ＴＥＳ緩衝液で１：３に希釈した。引き続き、
溶液に２容のエタノールを加え、次にこれを夜どおし−
２０℃でインキュベートした。プラスミドＤＮＡを、ロ
ータＳＳ３４（Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｃｏ．， Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｉｌｍｉｎｇ
ｔｏｎ，ＤＥ １９８８０−００２４）中で１００００
ｒ．ｐ．ｍ．で溶液を１５分間遠心分離することにより
沈殿させた。

【００９２】こうして得られたプラスミドＤＮＡ ｐＪ
Ｒ２３５（≒１ｍｇ）を、ＴＥ緩衝液（トリス−ＨＣｌ
１０ｍＭ，ｐＨ＝８．０およびＥＤＴＡ １ｍＭ）１
ｍｌに再懸濁させ、−２０℃で保存した。

【００９３】添付図面の図３にはプラスミドｐＪＲ２３
５の機能および制限地図が示されている。

【００９４】例２ Ｓ．セレビシエの遺伝子ＲＩＢ５のクローニングおよび
分析 リボフラビンシンテターゼをコードする、Ｓ．セレビシ
エのＲＩＢ５−遺伝子を含有するＤＮＡ−フラグメント
の一般的製造方法は、劣性のｒｉｂ５−１０突然変異体
を機能的に相補することのできる、Ｓ．セレビシエのゲ
ノムライブラリーからクローンを単離することを要旨と
する。ｒｉｂ５−突然変異体が、Ｓ．セレビシエ中のリ
ボフラビンシンテターゼをコードするＲＩＢ５−遺伝子
に影響を及ぼし、この突然変異を含有する菌株は、リボ
フラビン不含培地中で成長不能になる。

【００９５】２． リボフラビンシンテターゼをコード
する遺伝子中の影響されたｒｉｂ５−突然変異体 ｒｉｂ５突然変異の頻度を上げるために、突然変異原エ
チルメタンスルホネート（３０μｌ／ｍｌ）（ＥＭＳ；
Ｓｉｇｍａ）を使用した。突然変異誘発をＳ．セレビシ
エの菌株ＳＩ５０２（ＭＡＴａ ｈｉｓ−３−Δ１ ｌ
ｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｕｒａ３−５２）の細
胞中で常法に従って実施した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．
Ｗ．Ｇｕｉｄｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎ
ｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 所属、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：２７３，１９
９１年）。リボフラビンを補足（２０μｇ／ｍｌ）した
ＹＰＤ培地中に突然変異誘発した細胞２×１０⁵を接種
し、引き続きリボフラビンなしの完全な合成培地（ＳＣ
−ｒｉｂ）中で複製した後、リボフラビン不含培地中で
成長できない栄養要求性突然変異体を検出し、選択した
（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．Ｇｕｉｄｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ 所属、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９
４：１，１９９１年）。ｒｉｂ５−突然変異体を、リボ
フラビンに対し栄養要求性の突然変異体のうち、６，７
−ジメチル−８−リビチル−ルマジンを培地中で蓄積す
る能力につき確認した。ＲＩＢ５−遺伝子のクローニン
グのために、突然変異体ＡＪ１０（ＭＡＴａ ｈｉｓ−
３−Δ１ ｌｅｕ２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｒｉｂ５
−１０ ｕｒａ３−５２）を選択した。

【００９６】２．Ｂ． ＲＩＢ５−を含有するプラスミ
ドｐＪＲ２１１の単離 ＲＩＢ５−遺伝子を有しかつＳ．セレビシエの菌株ＡＪ
１０のｒｉｂ５−１０突然変異を完成することのできる
プラスミドの単離のために、動原体プラスミドＹＣｐ５
０中でＳ．セレビシエＧＲＦ８８（ＡＴＣＣからＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．３７４１５で得られた）からのＤＮＡを使用
した。実際に、酢酸リチウムで処理することによって得
た、Ｓ．セレビシエの菌株ＡＪ１０の能力細胞を、例１
Ｂに記載した方法と類似に、ＹＣｐ５０中の遺伝子のＤ
ＮＡ６５μｇと共にインキュベートした。反応混合物
を、ベクターＹＣｐ５０中に含有されている遺伝標識Ｕ
ＲＡ３および遺伝子ライブラリーのプラスミド中に含有
されている単離すべきＲＩＢ５−遺伝標識の二重選択を
実施するため、リボフラビンもウラシルも含有していな
かった完全な合成培地中へ接種した。合計１３０００と
評価された形質転換細胞（Ｐｈｅｎｏｔｙｐ Ｕｒ
ａ⁺）から、ウラシルおよびリボフラビン不含培地（Ｐ
ｈｅｎｏｔｙｐ Ｕｒａ⁺，Ｒｉｂ⁺）中で成長しうる３
つのクローンを得た。その担体がこの３つの形質転換細
胞であったプラスミドを、細菌中での形質転換により回
収し、制限酵素を用いて特性決定した（Ｓｔｒａｔｈｅ
ｒｎおよびＧｕｉｄｅ，Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：３１９，１９
９１年）。この３つのプラスミドは同じ制限モデルを有
し、そのうちの１つｐＪＲ２１１を別の分析のために選
択した。ベクターＹＣｐ５０および組込まれた≒１３ｋ
ｂのＤＮＡフラグメントからなるプラスミドｐＪＲ２１
１は、菌株ＡＪ１０中へ組込む場合、同じ効率でｒｉｂ
５−１０およびｕｒａ３−５２突然変異を完成すること
ができる。

【００９７】２．Ｃ． ＲＩＢ５−遺伝子のサブクロー
ニングおよびプラスミドｐＪＲ２３５の構成 ＲＩＢ５−遺伝子を含有する最小のＤＮＡ−フラグメン
トを限定するために、プラスミドｐＪＲ２１１のフラグ
メント≒１３ｋｂの一連の制限酵素の地図を作製し、種
々の低位フラグメントを単離し、エピソームベクターＹ
Ｅｐ３５２に結合した。生じたプラスミドを、ｒｉｂ５
−突然変異を完成する能力を調べ、それから、ＲＩＢ５
−遺伝子がフラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ≒２．２ｋ
ｂ中に含まれていたことが明らかになった。ベクターＹ
Ｅｐ３５２およびサブクローニングに使用されたフラグ
メントの機能および制限地図は、添付図面の図１に示さ
れている。フラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩをプラスミ
ドｐＪＲ２３５の生成下にベクターＹＥｐ３５２中にク
ローニングし、該プラスミドの制限および機能地図は添
付図面の図３に示されている。

【００９８】２．Ｄ． 遺伝子ＲＩＢ５の完全な欠失を
有する菌株の構成 ＲＩＢ５−遺伝子のコーディング領域の大部分の安定な
遺伝的欠失を有するＳ．セレビシエ菌株を構成するため
に、１工程の遺伝的破壊法（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐａｒｔ Ｃ，Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：２０２，１９
８３年）を使用した。この方法は、酵母の反応の間ゲノ
ム中の相同配列と直接に相互作用することにより組換え
を刺戟する自由端を有するＤＮＡ分子の組換え能力を基
礎としている。こうして、重要な遺伝子中で破壊が試験
管内で形成されるので、遺伝子の配列は選択可能な標識
の１つによって置換される（たとえばＵＲＡ３）。試験
管内で形成される破壊は、図４および５に示したよう
に、あとで反応の間ゲノム配列の置換のために使用され
る。この構成の１例を次に記載する。

【００９９】図４が示すように、プラスミドｐＪＲ２１
４は差当りＮｃｏｌで消化して末端をポリメラーゼＩの
クレノウフラグメントで処理することにより平滑にし、
引き続きＢａｍＨＩおよびフラグメントＢａｍＨＩ−Ｎ
ｃｏｌ≒２ｋｂで消化し、ＲＩＢ５−遺伝子の５′−末
端をフランキングし、アガロースゲル中で精製し、ブル
ースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳ⁺ベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，Ｕ
ＳＡ）に結合し、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化し、
Ｅ．コリＪＭ１０１に形質転換した。組換えプラスミド
を選択し、ｐＪＲ２７８と命名した。同様にして、ＲＩ
Ｂ５−遺伝子の３′末端をフランキングするプラスミド
ｐＪＲの１４のフラグメントＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ≒０．
８ｋｂを差当りＰＵＣｌ ９にサブクローニングし（Ｙ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ等，Ｇｅｎｅ ３３：１０
３，１９８５年；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ，ボストン，ＭＡ 米国およびＢｅｔｈｅｓｄａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ，米国で入手）、これからフラグメントとし
てＨｉｎｄＩＩＩ−ＫｐｎＩ≒０．８ｋｂを除去し、あ
らかじめＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したｐＪ
Ｒ２７８に結合し、Ｅ．コリＪＭ１０１に形質転換し
た。

【０１００】組換えプラスミドを選別し、ｐＪＲ２９７
と命名した。最後に、Ｓ．セレビシエの機能ＵＲＡ３−
遺伝子（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等，Ｇｅｎｅ ８：１７，１
９７９年）を含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメント≒１．１ｋｂを、ｐＪＲ２９８プラスミド
の生成下に、ｐＪＲ２９７にクローニングした。Ｋｐｎ
ＩでのｐＪＲ２９８の消化は、ＲＩＢ５遺伝子の５′お
よび３′末端をフランキングする配列からフランキング
されるＵＲＡ３−遺伝子からなる≒１．９のフラグメン
トを遊離する。このフラグメントを精製し、ＤＮＡ７μ
ｇをリボフラビンに対し原栄養体菌株Ｓ．セレビシエＪ
Ｃ２ａ（ＭＡＴαｈｉｓ ３Δｌ ｌｅｕ２−１１２
ｕｒａ３−５２）の転換のために使用した。形質転換
は、形質転換細胞の選択のために、転換の際に使用した
ＤＮＡフラグメントが構成されていたウラシル不含培地
ＳＣ−ｕｒａにクリーム状に固まった。

【０１０１】さらに、得られたＵｒａ⁺形質転換細胞１
７のうち２つはＲｉｂ表現型であり、これはここでは天
然のＲＩＢ５遺伝子が試験管内欠失によって置換されて
いたことを示す。引き続き、この菌株に溶解した、ＲＩ
Ｂ５遺伝子ＡＪ５３（ＭＡＴαｈｉｓ ３Δｌ ｌｅｕ
２−３ ｌｅｕ２−１１２ ｒｉｂ５−Δ１１：ＵＲＡ
３ ｕｒａ３−５２）の分裂を、サザンハイブリッド形
成（図３）およびｒｉｂ５突然変異体による完成によっ
て確認した。

【０１０２】例３ ＲＩＢ５遺伝子の転写変更因子でのプラスミドおよび
Ｓ．セレビシエ菌株の構成 既述したように、ＲＩＢ５−遺伝子のプロモーターを、
この生合成遺伝子の構成のための大きい発現を可能にす
るプロモーターによって代えることは非常に有益であり
うる。この形質転換体を含有するプラスミドは、大量の
リボフラビンを生産する酵母株の製造のために使用する
ことができる。

【０１０３】ＲＩＢ５−遺伝子のヌクレオチド配列なら
びに酵母中へ強く表現可能で、３−ホスホグリセレート
キナーゼＰＧＫをコードする構成遺伝子のプロモーター
を知ったことによって、ＰＧＫ遺伝子プロモーターによ
るＲＩＢ５−遺伝子のコーディング領域を、ヤン（Ｙｏ
ｎ）等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１
７：４８９５，１９８９年）により記載された方法に従
いポリメラーゼ連鎖反応によって調節する調節が計画さ
れた。

【０１０４】融合ＰＧＫ−ＲＩＢ５を含有するＤＮＡフ
ラグメントの製造のため、４つのヌクレオチドをアプラ
イドバイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）社のＭｏｄｅｌ３８０Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃ
ｉｔｙ，ＣＡ，米国）の自動ＤＮＡ合成装置中で合成
し、引き続きメーカーにより記載されたようにゲル電気
泳動によって精製した。このプライマーのヌクレオチド
配列およびその明細は次のとおりである：

【０１０５】

【表２】

【０１０６】プライマーＡは、ＰＧＫ−遺伝子のコーデ
ィング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド−５８０〜
−６２０，Ｈｉｔｚｅｍａｎ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１０：７７９１，１９８２年）によ
る番号付けした）に相同である（ヌクレオチド８〜２
８）。さらに、このプライマーは、その５′末端に、制
限酵素Ｎｃｏｌ（ヌクレオチド１〜６）およびＢａｍＨ
Ｉ（ヌクレオチド５〜１０）の認識塩基の配列を有す
る。プライマーＢはＰＧＫ−遺伝子のコーディング鎖の
ヌクレオチド配列（ヌクレオチド−１７〜＋１３）に対
して相補的である。プライマーＣは、そのヌクレオチド
１〜１５が、ＰＧＫ−遺伝子コーディング鎖のヌクレオ
チド配列（ヌクレオチド−１２〜＋３）およびＲＩＢ５
遺伝子のコーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオ
チド＋１〜＋１５、上記に記載したように番号付けし
た）に相同である。プライマーＤは、ＲＩＢ５−遺伝子
のコーディング鎖のヌクレオチド配列（ヌクレオチド＋
７３８〜＋７５５）に対して相補的である。

【０１０７】トリス−ＨＣｌ，ｐＨ＝７．３ １０ｍ
Ｍ；ＫＣｌ ５０ｍＭ，ＭｇＣｌ₂２ｍＭ、各デソキシ
ヌクレオチド三リン酸８０ｎＭ、各プライマー［Ａと
Ｂ、ＣとＤまたはＡとＤ］５０ｐｍｏｌ、下記に記載し
たようなＤＮＡ型５０ｎｇおよびＴａｑポリメラーゼ
０．５単位からなる反応混合物１００μｌを製造した。
反応は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮＡ Ｔｈｅｒ
ｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）中で３０
サイクル宛実施した。各サイクルは、９４℃で１分の熱
作用による変性工程を包含し、これに５５℃で２．５分
間のＤＮＡに対するプライマーのリアニーリングおよび
７２℃で２．５分間のＴａｑポリメラーゼによる連鎖延
長工程が続く。反応混合物に対し、制限酵素反応前にク
ロロホルムで１回抽出した１滴の鉱油を加えた。

【０１０８】プライマーＡおよびＢならびにＳ．セレビ
シエＸ２１８０−１Ａの野生型菌株（この菌株はＹｅａ
ｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ，カ
リフォルニア大学、Ｂｅｒｋｅｌｙ，ＣＡ，米国で入手
することができる）のゲノムＤＮＡを含有しかつＰｈｉ
ｌｉｐｓｅｎ等（Ｇｕｉｄｅ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
所属、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４：
１６９，１９９１年）により記載された方法に従って製
造した第１の反応混合物中に、ＰＧＫ−遺伝子プロモー
ター（ｎｔ−５８０〜＋３）を含有しかつさらに遠位の
５′−末端にＮｃｏｌおよびＢａｍＨＩの認識配列を有
しているＤＮＡフラグメントを複製した。

【０１０９】プライマーＣおよびＤならびにプラスミド
ｐＪＲ２３５のＤＮＡを含有する第２の反応生成物にお
いては、ＲＩＢ５−遺伝子（ｎｔ＋１〜＋７５５）のコ
ーディング領域が複製されていて、さらにヌクレオチド
＋１に相当する末端にＰＧＫ遺伝子に相当する配列（ｎ
ｔ−１２〜＋３）を有していた。

【０１１０】プライマーＡおよびＤ、ならびにさきの２
つの反応において複製された２つのフラグメントに相当
する精製されたＤＮＡ（各フラグメントの２５０ｎｇ）
を含有する第３の反応混合物においては、ＲＩＢ５−遺
伝子のコーディング領域（ｎｔ＋１〜＋７５５）を有す
るＰＧＫ−遺伝子プロモーターの配列（ｎｔ−５８０〜
＋３）が、図４Ａに示したように存在するＤＮＡ−フラ
グメントが複製されていた。

【０１１１】この反応生成物をアガロースゲル中で精製
し、ＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで
消化したＹＥｐ３５２−ベクターをクローニングし、こ
れによってプラスミドｐＪＲ３７６が生成した（図
８）。引き続き、複製反応後は欠陥のない遺伝的融合Ｐ
ＧＫ−ＲＩＢ５の正しいヌクレオチド配列を順列決定に
よって確認した。

【０１１２】例４ リボフラビンシンテターゼの特性表示 ４．Ａ． Ｅ．コリ中でのＲＩＢ５タンパク質の発現 Ｅ．コリ中でのリボフラビンシンテターゼの発現のため
に、合成ｔｒｃプロモーターを有するベクターｐＴｒｃ
９９Ａを使用した（Ａｍａｎｎ等，Ｇｅｎｅ６９：３０
１，１９８８年。このベクターは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｕｐｐｓａｌ
ａ，Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）で入手できる）。ｔｒｃプロモ
ーターの制御下にＲＩＢ５遺伝子のコーディング配列を
調節するために、あらかじめカドワキ等（Ｇｅｎｅ ７
６：１６１，１９８９年）により記載された方法による
突然変異誘導によって、ＲＩＢ５遺伝子のコーディング
配列の開始コドン５′−ＡＴＧ−３′のまわりに制限部
位Ｎｃｏｌを形成した。このために、プライマーとして
２つのオリゴヌクレオチドを使用した：Ｅ，制限部位Ｎ
ｃｏｌの形成のためおよびＤ，さきに例３Ａに記載した
ものに一致する。これらのオリゴヌクレオチドを、アプ
ライド・バイオシステムス社のモデル３８０Ａ（Ｆｏｓ
ｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，米国）のＤＮＡ合成装置中で
製造した。その配列は次のとおりである：

【０１１３】

【表３】

【０１１４】１００μｌの容積を有するポリメラーゼ連
鎖反応(ＰＣＲ)（トリスＨＣｌ １０ｍＭ，ｐＨ７．
３；ＫＣｌ ５０ｍＭ，ＭｇＣｌ₂ ２ｍＭ、個々のデ
ソキシヌクレオチド三リン酸それぞれ８０ｎＭ，プライ
マーＤおよびＥそれぞれ５０ｐｍｏｌ，プラスミドｐＪ
Ｒ２３５のＤＮＡ５０ｎｇおよびＴａｑポリメラーゼ
(Ｋｉｔ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ Ｃｅｔｕｓ）０．５単位含有）において、開始コド
ン５′−ＡＴＧ−３′中に制限部位Ｎｃｏｌを有するＲ
ＩＢ５遺伝子の変更配列を含有するＤＮＡ−フラグメン
トを複製した。このフラグメントをアガロースゲル中で
精製し、ＮｃｏＩで消化し、あらかじめＮｃｏＩ−Ｓａ
ｍＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−ベクターに結合し、
Ｅ．コリＪＭ１０１に形質転換した。組換えプラスミド
を選択し、ｐＪＲ３８０と命名した。

【０１１５】Ｅ．コリ中のＳ．セレビシエのＲＩＢ５−
遺伝子の発現のために、プラスミドｐＪＲ３８０で形質
転換したＥ．コリＪＭ１０１細胞を１６時間ＮＺＹＡｍ
Ｐ^{10 0}−培地中で成長させ（カゼイン加水分解物１％、
ＮａＣｌ ０．５％、酵母エキス０．５％、ＭｇＳＯ₄
０．２％およびアンピシリン１００μｇ／ｍｌ）、そ
れをイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）１ｍＭで２時間誘発した。発現プラスミド
ｐＪＲ３８０で形質転換した細胞は、ｐＴｒｃ９９Ａ−
ベクターで形質転換したものよりも緩慢に成長した。Ｉ
ＰＴＧで誘発後、発現プラスミドｐＪＲ３８０を含有す
る細胞は停止するまで成長した。この形質転換細胞の検
鏡は、光屈折性細粒（封入体と呼ばれる）を細胞極中に
含有しておりかつ大量の不溶性異物タンパク質を含有す
る形態学に典型的である伸長細胞の出現を示した（Ｓｈ
ａｒｍａ，Ｓ．Ｋ．，１９８６年，Ｓｅｐａｒａｔｉｏ
ｎＳｃｉ． Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：７０１〜７２
６，１９８６年）。

【０１１６】引き続き、細胞を遠心分離することによっ
て取得し、溶菌緩衝液中に改めて懸濁させ、超音波によ
り分解し、細胞抽出物を、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ）等により記載された方法（１９８９年，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に
従い、４℃および１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分遠心
分離することによって可溶性画分と不溶性画分に分け
た。

【０１１７】これらの画分を変性条件下での電気泳動に
よって分析し、ゲルをクーマシーブルーで染色した。可
溶性画分では正常バンドに対し付加的バンドは出現しな
かったが、発現プラスミドｐＪＲ３８０で変換された細
胞の不溶性画分は、クローニングＲＩＢ５−遺伝子のコ
ーディング領域の誘導重量に一致する約２４ｋＤａの分
子量の強いバンドを示した（図５）。この結果は、Ｅ．
コリ中のＲＩＢ５−タンパク質は、タンパク質の大部分
が不溶性の酵素不活性の形で存在しかつその抽出のため
にデタージェントまたは変性剤の使用が必要であるとき
でも、高度に表現することができる。

【０１１８】４．Ｂ． ポリクローナル抗体ａｎｔｉ
Ｒｉｂ５の製造および精製 Ｅ．コリＪＭ１０１中に表現される不活性Ｒｉｂ５−タ
ンパク質は、下記に記載するように、ポリクローナル抗
体製造の際免疫原として使用するために好適である。発
現プラスミドｐＪＲ３８０で形質転換し、ＩｐＴＧで誘
導した、例４Ａに記載したように製造した細胞２５０ｍ
ｌからの、Ｒｉｂ５−タンパク質を含有する不溶性沈殿
物を、蒸留水２０ｍｌで洗浄し、０．１Ｍトリス・ＨＣ
ｌ（ｐＨ＝８．５）４ｍｌおよび尿素３Ｍに溶解した。
混合物を４℃、１２０００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分遠心分
離し、尿素を０．１Ｍトリス・ＨＣｌへの透析により除
去した。タンパク質９９％の純粋なＲｉｂ５−タンパク
質（測光により決定）（図９−Ａ）合計５ｍｇが得られ
た。

【０１１９】前免疫血清（Ｐｒａｅｉｍｍｕ−Ｓｅｒｕ
ｍ）を得るためあらかじめ採血したニュージーランドウ
サギを、１００ｍＭのトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
０．５ｍｌおよび１００℃で３分変性し、完全なフロイ
ントアジュバント（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）
で乳化したＳＤＳ２％中のＲｉｂ５−タンパク質１００
μｇを皮下注射した。引き続き、ウサギを全部２週間更
新用量で接種し、初期免疫化から６週間後に、免疫血清
を得るために採血した。

【０１２０】抗体を、Ｅ．コリＪＭ１０１中に表現され
るＲｉｂ５−タンパク質をＡｆｆｉ−ゲル １０−Ｍａ
ｔｒｉｘ（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）
に結合して含有していたカラム中でのアフィニティー・
クロマトグラフィーにより、メーカーの指示に従って精
製した。カラムを、Ｓｔａｐｈ緩衝液（ＮａＨ₂ＰＯ
₄１．６μＭ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．１μＭ，Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ１００１％，ＳＤＳ ０．１％，ＮａＮ
₃ ０．１％，ＮａＣｌ ０．１Ｍ，デソキシナトリウ
ムコレート ０．５％）で徹底的に洗浄し、引き続き
０．２Ｍグリセリン（ｐＨ２．２）２０容量で溶離し、
溶離液を直ちに１Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ＝８．８）１
／９容量で中和し、０．１％アジドの存在で４℃で保存
した。これらの抗体がＥ．コリの総タンパク質のウエス
タンブロッティングで検出された場合、適当な大きさの
ポリペプチドとの反応が観察された。クーマシーブルー
で染色されたゲルにおけるように、ウエスタンブロッテ
ィングにより検出されたＲｉｂ５−タンパク質の大部分
は不溶の形で存在していた（図９−Ｂ）。

【０１２１】４．Ｃ． Ｓ．セレビシエのリボフラビン
シンテターゼの精製 リボフラビンシンテターゼは、２分子の６，７−ジメチ
ル−８−リビチル−ルマジンからのリボフラビン−およ
び５−アミノ−６−リビチル−アミノ−２，４（１Ｈ，
３Ｈ）−ピリミジンジオン分子の生成を触媒する。この
酵素は、幾つかの微生物および植物中に見出され、アッ
シュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉ
ｉ）、エシェリキア・コリおよびホウレンソウの半精製
製剤が製造された。酵母からのリボフラビンシンテター
ゼは、精製法が非常に費用がかかりかつ面倒であるにも
拘らず、既に約５０００回精製された（Ｐｌａｕｔ，
Ｇ．Ｗ．Ｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９：７７１
〜７８５，１９７０年）。

【０１２２】低級微生物（高フラビン生産性子のう菌を
含む）の細胞抽出物中のリボフラビンシンテターゼ含量
は僅かであり、これがその精製および特性表示を困難に
する。従って、酵素の簡単で再現可能な精製法ならびに
酵素活量によらない別の検出法を使用することが望まし
い。

【０１２３】Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテター
ゼの精製のために、ＹＰＤ培地中のＯＤ₆₀₀＝１．５〜
２．０を有する野生型菌株Ｘ２１８０−１ａの細胞の培
養液２５０ｍｌからの、ミカエリ（Ｍｉｃｈａｅｌｉ）
等（ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３０４５，１９８９年）の
方法による細胞抽出物を製造した。得られた細胞抽出物
１ｍｌ（タンパク質≒５ｍｇ／ｍｌ）を、あらかじめト
リス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．５）２０ｍＭで平衡に
したイオン交換カラムＭｏｎｏＱ ＨＲ−５／５（ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）を使用してＦＰＬＣクロマトグラフィ
ーによって分別した。保持されたタンパク質を、ＮａＣ
ｌ ０〜０．５Ｍの連続的勾配法で溶離し、画分１ｍｌ
を、例４Ｂからの方法によって得られたａｎｔｉ−Ｒｉ
ｂ５−抗体を用いるウエスタンブロッティングによって
分析した。ａｎｔｉ−Ｒｉｂ５−抗体は画分２２（２５
０ｍＭのＮａＣｌ濃度に一致）中に溶離した約２４ｋＤ
ａのポリペプチドと特異的に反応した。このポリペプチ
ドの分子量は、クローニング遺伝子のコーディング領域
のヌクレオチド配列の誘導重量と一致する。

【０１２４】同様に、イオン交換クロマトグラフィー前
の画分を、バッシャー（Ｂａｃｈｅｒ）等により記載さ
れた方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２２：
１９２，１９８６年）によりリボフラビンシンテターゼ
活性を調べた。試験混合物は実際に、リン酸カリウム
（ｐＨ＝７）５０ｍＭ、ＮａＨＳＯ₄ １０ｍＭ、６，
７−ジメチル−８−リビチル−ルマジン（Ｐｌａｕｔお
よびＨａｒｖｅｙにより記載された方法（Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１８Ｂ：５１５〜５３８，１９７
１年）により合成）０．６ｍＭおよび試験すべき画分１
５０μｌ（全容量１ｍｌ中）を含有していた。反応混合
物を暗所中で１時間３７℃でインキュベートした。イン
キュベーション時間の初めと終りに、試料を採取し、タ
ンパク質をトリクロル酢酸１５％の添加により沈殿させ
た。

【０１２５】合成リボフラビンの量は、４７０ｎｍにお
ける光学密度の増加（４７０ｎｍにおけるリボフラビン
のモル吸光＝９３００）から計算し、比活性は毎時タン
パク質１ｍｇあたり生成したリボフラビンｎｍｏｌで表
わした。結果は、リボフラビンシンテターゼ活性はＮａ
Ｃｌ濃度２５０ｍＭで溶離した画分２２において最大を
示し、その際これはａｎｔｉ−Ｒｉｂ５−抗体と反応し
たポリペプチド中に確認されたと同じ画分である。

【０１２６】画分２２中に存在するタンパク質を変性条
件下で電気泳動により分析し、ゲルを銀で染色する（Ｍ
ｏｒｒｉｓｅｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１
７：５０７，１９８１年）場合、抽出物の総タンパク質
の９９％以上に達しかつ約２４ｋＤａの分子量を有する
単１つの大きいバンドが出現し、これはクローニング遺
伝子のコーディング領域のヌクレオチド配列の誘導され
た分子量と一致する（図１０−Ｂ）。

【０１２７】４．Ｄ． Ｓ．セレビシエのリボフラビン
シンテターゼの特性表示 ４．Ｄ．１ リボフラビンシンテターゼのアミノ末端端
部の配列決定 真核生物の生物体中では、ポリペプチドへのｍＲＮＡの
有効な翻訳の後、しばしば成熟ポリペプチド製造のため
あとでの修飾が必要である。Ｒｉｂ５−タンパク質がそ
のアミノ末端端部に何らかの変化を有するか否かを確認
するためおよび本発明により提案された出発コドン（Ｏ
ＲＦ中の相中の最初のＡＴＧ）が実際にＲｉｂ５−タン
パク質に使用された出発コドン（ＯＲＦ中の相中の最初
のＡＴＧ）と一致することを立証するために、Ｒｉｂ５
−タンパク質のアミノ末端端部を配列決定した。例４Ｃ
による方法に従いイオン交換クロマトグラフィーによっ
て精製したＲｉｂ５−タンパク質５μｇを、アクリルア
ミド１４％を含有するゲル中で変性条件下での電気泳動
にかけ、マツダイラの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６２：１００３５，１９８７年）に従いジフル
オロポリビニリデン膜ＰＶＤＦ（Ｉｎｍｏｂｉｌｏｎ−
Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上へ移した。

【０１２８】移した後、膜を２０％エタノールで濡ら
し、Ｒｉｂ５−タンパク質に一致する、照射により可視
的になったバンドを切取り、アプライド・バイオシステ
ムズ社のＭｏｄｅｌ ４７０のタンパク質シークエンサ
ー（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（ガス相シ
ークエンサー）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａ，米
国）中で配列決定した。最初の８つの分析したアミノ酸
基の配列：ＮＨ₂−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−・・・・・−ＣＯＯ
Ｈは、クローニング遺伝子のヌクレオチド配列から誘導
されたアミノ酸配列と同じであり、これは本発明の範囲
内で提案された出発コドン（ＯＲＦ中の相中の最初のＡ
ＴＧ）は適正なものであることおよびＲｉｂ５−タンパ
ク質、リボフラビンシンテターゼはそのアミノ末端端部
に変化を有しないことを指摘する。

【０１２９】４．Ｄ．２ 自然条件下でのリボフラビン
シンテターゼの分子量測定 リボフラビンシンテターゼが自然条件下でモノマーの形
またはマルチマーの形で存在するか否かを確認するため
に、Ｒｉｂ５−タンパク質の分子量を自然条件下で測定
した。例４Ｃにより精製したＲｉｂ５−タンパク質
（０．５μｇ）を４％〜２０％のポリアクリルアミド勾
配のゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）
中でトリス−グリシン緩衝液（トリス２５ｍＭ，グリシ
ン１５０ｍＭ）中、４℃、２５ｍＡで１２時間、チログ
ロブリン（Ｔｉｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）（６６９ｋＤ
ａ）、フェリチン（Ｆｅｒｒｉｔｉｎ）（４４０ｋＤ
ａ）、カタラーゼ（２３２ｋＤａ）、ラクテートデヒド
ロゲナーゼ（１４０ｋＤａ）およびウシ血清アルブミン
（６７ｋＤａ）からの自然の遺伝標識と一緒に分析し
た。

【０１３０】電気泳動の終結後、ゲルを銀で染色し、自
然条件下のＲｉｂ５−タンパク質の分子量をアンデルセ
ン（Ａｎｄｅｒｓｅｎ）等（ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２
０：１９９，１９７１年）により記載された方法に従っ
て評価した。結果（図１１）は、Ｒｉｂ５−タンパク質
は非変性条件下では約７２ｋＤａの分子量を有すること
を示し、これはリボフラビンシンテターゼは自然の状態
では３つの同じＲｉｂ５−ポリペプチド−サブユニット
からなるマルチマーであることを意味する。この結果
は、デービス（Ｄａｖｉｅｓ）およびスターク（Ｓｔａ
ｒｋ）により記載された方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，米国 ６６：６５１，１９７０年）
に従いジメチルスベルイミデートの存在における架橋実
験によって確認された。

【０１３１】例５ リボフラビンシンテターゼの製造速度 リボフラビンシンテターゼの製造は、Ｓ．セレビシエの
野生型菌株およびリボフラビンシンテターゼに対しコー
ドするＲＩＢ５−遺伝子の種々の修飾体の担体菌株にお
いて測定された。野生型菌株Ｘ２１８０−１Ａの定常相
における培養のタンパク質抽出物、ＲＩＢ５−遺伝子の
完全な欠失の担体、ＡＪ１１３、形質転換細胞ＡＪ５
３、ＲＩＢ５−遺伝子を含有するマルチコピープラスミ
ドｐＪＲ２３５の担体、ならびにＡＪ１１２、形質転換
細胞ＡＪ５３、遺伝的融合ＰＧＫ−ＲＩＢ５を含有する
マルチコピープラスミドｐＪＲ３７６の担体を、例４Ｃ
による方法に従ってそのリボフラビンシンテターゼ活量
につき分析した。下記に第Ｉ表に記載した結果が得られ
た。

【０１３２】 第Ｉ表 菌 株 リボフラビンシンテターゼ比活性 （リボフラビンｎモル／タンパク質ｍｇ） Ｘ２１８０−１Ａ ５．５９ ＡＪ ５３ ----- ＡＪ１１３ ７１．６ ＡＪ１１２ ２４８．０１ 第Ｉ表につき、マルチコピープラスミド中のＲＩＢ５−
遺伝子の存在は野生型菌株中のリボフラビンシンテター
ゼ活性の少なくとも２０倍上昇を前提とすると約言する
ことができる。この活性は、強表現プロモーター、たと
えばＰＧＫ−遺伝子のプロモーターの使用によってなお
付加的に高めることができ、これは菌株ＡＪ１１２が野
生型菌株よりも８０倍高いリボフラビンシンテターゼ活
性を有することとなる。

【０１３３】微生物の寄託 Ｅ．コリＪＭ１０１／ｐＪＲ２３５の形質転換細胞は、
１９９２年３月１７日にナショナル・コレクションズ・
オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア
・リミテッド（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉ
ｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ａｂｅｒｄ
ｅｅｎ （Ｓｃｈｏｔｔｌａｎｄ，Ｇｒｏｓｓｂｒｉｔ
ａｎｉｅｎ）のＮＣＩＭＢ）にＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４０
４８０で寄託された。

【０１３４】配列記録 （１） 一般的情報： （ｉ） 出願人 （Ａ） 名称 ：ＢＡＳＦ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌ
ｓｃｈａｆｔ （Ｂ） 町名 ：Ｃａｒｌ−Ｂｏｓｃｈ−Ｓｔｒａｓｓ
ｅ ３８ （Ｃ） 都市名：Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ （Ｅ） 国名 ：Ｂｕｎｄｅｓｒｅｐｕｂｌｉｋ Ｄｅ
ｎｔｓｃｈｌａｎｄ （Ｆ） 郵便番号：Ｄ−６７００ （Ｇ） 電話 ：０６２１／６０４８５２６ （Ｈ） テレファックス：０６２１／６０４３１２３ （Ｉ） テレックス：１７６２１７５１７０ （ｉｉ） 本願表題：ＤＮＡ化合物およびＳ．セレビシ
エのリボフラビンシンテターゼ活性をコーディングする
組換えＤＮＡ−発現ベクター （ｉｉｉ） 配列の数：８ （ｉｖ） コンピュータ読取り可能な形： （Ａ） データ担体：フロッピィ・ディスク （Ｂ） コンピュータ：ＩＭＢ ＰＣ Ｃｏｍｐａｔｉ
ｂｌｅ （Ｃ） オープンシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ
Ｓ （Ｄ） ソフトウェア： （２） ＳＥＱに対する情報ＩＤ ＮＯ：１： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ ：１４３９塩基対 （Ｂ） 種類 ：核酸 （Ｃ） 鎖の形：２本 （Ｄ） トポロジー：線形 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｉｉｉ） 仮定：なし （ｉｉｉ） アンチセンス：なし （ｖｉ） 原出所： （Ａ） 生物体：サッカロミセス・セレビシエ （ｉｘ） 特徴： （Ａ） 名称／符号：ＣＤＳ （Ｂ） 位置：１． ．７１７ （ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１：

【０１３５】

【表４】

【０１３６】

【表５】

【０１３７】

【表６】 ＧＴＣＡＡＡＣＣＡＡ ＴＴＧＧＴＧＡＧＴＡ ＣＧＴ
ＡＡＣＣＡＴＡ ＧＣＡＣＡ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対する情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ ：塩基対２８ （Ｂ） 種類 ：核酸 （Ｃ） 鎖の形：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｖｉｉ） 直接の出所： （Ｂ） クローン：プライマーＡ （ｘｉ） 配列記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： ＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣ ＣＴＣＣＴＴＣＴＴＧ ＡＡＴ
ＴＧＡＴＧ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に対する情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ ：塩基対２０ （Ｂ） 種類 ：核酸 （Ｃ） 鎖の形：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｖｉｉ） 直接の出所： （Ｂ） クローン：プライマーＢ （ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： ＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴ ＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対する情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ ：塩基対２７ （Ｂ） 種類 ：核酸 （Ｃ） 鎖の形：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｖｉｉ） 直接の出所： （Ｂ） クローン：プライマーＣ （ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： ＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡ ＣＡＡＴＧＴＴＴＡＣ ＴＧＧ
ＴＡＴＴ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対する情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ ：塩基対１８ （Ｂ） 種類 ：核酸 （Ｃ） 鎖の形：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｖｉｉ） 直接の出所： （Ｂ） クローン：プライマーＤ （ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： ＧＡＡＡＣＣＴＡＴＴ ＴＡＴＧＡＣＧＡ （２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に対する情報： （ｉ） 配列特性： （Ａ） 長さ ：塩基対２０ （Ｂ） 種類 ：核酸 （Ｃ） 鎖の形：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線形 （ｉｉ） 分子の種類：ＤＮＳ（ゲノム） （ｖｉｉ） 直接の出所： （Ｂ） クローン：プライマーＥ （ｘｉ） 配列の記述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： ＡＴＡＧＣＡＣＣＡＴ ＧＧＣＴＡＣＴＧＧＴ

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドＹＥｐ３５２の機能および制限地
図。

【図２】遺伝子ＲＩＢ５のサブクローニングを示す図。

【図３】プラスミドｐＪＲ２３５の機能および制限地
図。

【図４】プラスミドｐＪＲ２９８の構成を示す図。

【図５】遺伝子置換による遺伝子の破壊を示す図。

【図６】野生菌株および置換菌株で発酵したゲノムＤＮ
Ａのサザンブロッティング図。

【図７】組換えＰＣＲによる遺伝子融合ＰＧＫ−ＲＩＢ
５の構成を示す図。

【図８】プラスミドｐＪＲ３７６の機能および制限地
図。

【図９】Ｅ．コリ中でのリボフラビンシンテターゼの発
現を示すもので、Ａは染色したポリアクリルアミド・Ｓ
ＤＳゲル中で誘導または非誘導細胞抽出物の可溶性また
は不溶性画分の分析を示す図、Ｂは上記抽出物の可溶性
または不溶性画分のウエスタンブロッティング図。

【図１０】Ｓ．セレビシエ中のリボフラビンシンテター
ゼの精製および特性表示を示し、Ａは全タンパク抽出物
からのＦＰＬＣによる分析図、ＢはそのＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル中での電子泳動による分析図。

【図１１】天然条件下でのリボフラビンシンテターゼの
分子量決定を示す図。

【符号の説明】

図２： （ａ） プラスミド （ｂ） ｒｉｂ５−１０−突然変異の相補 図４： （ａ） Ｎｃｏｌによる消化 （ｂ） クレノウフラグメントでの処理 （ｃ） ＢａｍＨＩによる消化 （ｄ） フラグメントＢａｍＨＩ−ＮｃｏｌＩＫ １．
６ｋｂの精製 （ｅ） ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩによる消化 （ｆ） 結合 （ｇ） ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化 （ｈ） ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩによる消化 （ｉ） ＨｉｎｄＩＩＩによる消化 図１０Ａ： （ａ） 比活性（Ｂ２ ｎモル／ｍｇ） （ｂ） 画分数 （ｃ） ＮａＣｌ（Ｍ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 25/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ホセ ハビエル ガルシア ラミレス スペイン国 ラ リオハ ナルダ カルカ バ 13 (72)発明者 ホセ ルイス レブエルタ ダバル スペイン国 サラマンカ プラサ ラ パ ラ ４

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 適当な発現ベクター中に、（ａ）リボフ
   ラビンシンテターゼ活性をコードするＤＮＡ化合物、ま
   たは（ｂ）上記化合物に対し相同で、この活性を表現し
   かつその遺伝的変異型である配列、または（ｃ）そのリ
   ボフラビンシンテターゼ活性をコードするフラグメント
   をクローニングすることを特徴とするＳ．セレビシエの
   リボフラビンシンテターゼ活性を発現しうる発現ベクタ
   ーの製法。
2. 【請求項２】 得られる発現ベクターが、 （ａ）Ｓ．セレビシエから由来しかつヌクレオチド配列
   ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ３を有し、リボフラビンシンテター
   ゼ活性をコードするＤＮＡ化合物に作動的に結合してい
   て、このＤＮＡ化合物の発現を制御することのできる、
   転写および翻訳の活性化配列； （ｂ）転写の終結シグナル、ポリアデニル化およびｍＲ
   ＮＡプロセシング、ならびに場合により （ｃ）微生物から選択された１種または数種の標識遺伝
   子を含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 リボフラビン生産菌株を、Ｓ．セレビシ
   エのリボフラビンシンテターゼ活性を発現しうる請求項
   １または２記載の発現ベクターと反応させることを特徴
   とするリボフラビン生産菌株からリボフラビンを製造す
   る場合の収率を高める方法。