ES2216010T3 - Biosintesis de riboflavina en hongos. - Google Patents

Biosintesis de riboflavina en hongos.

Info

Publication number
ES2216010T3
ES2216010T3 ES95913119T ES95913119T ES2216010T3 ES 2216010 T3 ES2216010 T3 ES 2216010T3 ES 95913119 T ES95913119 T ES 95913119T ES 95913119 T ES95913119 T ES 95913119T ES 2216010 T3 ES2216010 T3 ES 2216010T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
seq
polypeptide
dna sequences
amino acids
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95913119T
Other languages
English (en)
Inventor
Jose Luis Revuelta Doval
Maria Jose Buitrago Serna
Maria Angeles Santos Garcia
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE4420785A external-priority patent/DE4420785A1/de
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Application granted granted Critical
Publication of ES2216010T3 publication Critical patent/ES2216010T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE LOS GENES PARA LA BIOSINTESIS DE LA RIBOFLAVINA EN EL HONGO ASHBYA GOSSYPII ASI COMO DEL PROCEDIMIETNO DE INGENIERIA GENETICA PARA LA OBTENCION DE RIBOFLAVINA UTILIZANDO ESTOS GENES Y PRODUCTOS GENETICOS.

Description

Biosíntesis de riboflavina en hongos.
La presente invención se refiere a los genes para la biosíntesis de riboflavina en hongos, a las proteínas codificadas por ellos, así como a los procedimientos genético-técnicos para la producción de riboflavina utilizando estos genes y productos genéticos.
Se conoce la producción de riboflavina por medio de la fermentación de hongos, tales como Eremothecium ashbyii o Ashbya gossypii (The Merck Index, Windholz et al., editoriales Merck & Co., página 1183, 1983).
En el documento EP 405370 se describen cepas de bacterias superproductoras de riboflavina, que se obtuvieron por transformación de los genes de biosíntesis de riboflavina de Bacillus subtilis
Puesto que la genética de la biosíntesis de riboflavina es diferente en bacterias y eucariotas, los genes mencionados anteriormente de Bacillus subtilis no son adecuados para un procedimiento recombinante de producción de riboflavina con organismos de producción eucariotas, tales como Ashbya gossypii.
En una solicitud de patente presentada el 19.11.1992 en la Oficina Alemana de Patentes, se describe la clonación de los genes de biosíntesis de riboflavina de la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Sin embargo, no se logró la clonación de los genes de biosíntesis de riboflavina de Ashbya gossypii utilizando los genes RIB de S. cerevisiae, con métodos habituales de hibridación; evidentemente, la homología de los genes RIB de S. cerevisiae y A. gossypii no era lo suficientemente grande para una hibridación.
Por tanto se planteó la tarea de aislar los genes de biosíntesis de riboflavina de un eucariota, para proporcionar un procedimiento recombinante de producción de riboflavina en un organismo eucariota de producción.
De manera correspondiente, se encontraron y aislaron en el ascomiceto Ashbya gossypii seis genes (genes rib), que codifican para las enzimas de la biosíntesis de riboflavina partiendo de GTP.
La invención se refiere a las siguientes secuencias de ADN:
Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2, o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 2, con lo que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 1.
Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 4, o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 4, con lo que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 3.
Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 6, o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 6, con lo que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 5.
Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8, o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 8, con lo que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 7.
Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 10, o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 10, con lo que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 9.
Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 12, o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 12, con lo que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 11.
Los genes y sus productos genéticos (polipéptidos) están representados en el protocolo de secuencias con su estructura primaria y tienen las siguientes asignaciones:
SEQ ID NO: 1 : gen rib1
SEQ ID NO: 2 : producto del gen rib1 (GTP ciclohidrolasa II)
SEQ ID NO: 3 : gen rib2
SEQ ID NO: 4 : producto del gen rib2 (DRAP desaminasa)
SEQ ID NO: 5 : gen rib3
SEQ ID NO: 6 : producto del gen rib3 (DBP sintasa)
SEQ ID NO: 7 : gen rib4
SEQ ID NO: 8 : producto del gen rib4 (DMRL sintasa)
SEQ ID NO: 9 : gen rib5
SEQ ID NO: 10 : producto del gen rib5 (riboflavina sintasa)
SEQ ID NO: 11 : gen rib7
SEQ ID NO: 12 : producto del gen rib7 (HTP reductasa)
La guanosina trifosfato (GTP) se transforma por medio de la GTP ciclohidrolasa II (producto del gen rib1) para dar 2,5-diamino-6-ribosilamino-4-(3H)-pirimidinon-5-fosfato. Este compuesto se reduce a continuación por medio del producto del gen rib7 para dar 2,5-diamino-ribitilamino-2,4 (1H,3H)-pirimidin-5-fosfato y después se desamina por medio del producto del gen rib2 para dar 5-amino-6-ribitilamino-2,4 (1H,3H)-pirimidindiona. A continuación, en una reacción catalizada por el producto del gen rib4 se adiciona el compuesto C4, DBP, y se forma 6,7-dimetil-8-ribitillumazina (DMRL), a partir de la cual se forma riboflavina en la reacción catalizada por el producto del gen rib5. El compuesto C4, DBP (L-3,4-dihidroxi-2-butanon-4-fosfato), se forma a partir de D-ribulosa-5-fosfato en una reacción catalizada por el producto del gen rib3.
Las secuencias de ADN descritas en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, codifican para los polipéptidos descritos en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12.
Además de las secuencias de ADN mencionadas en el protocolo de secuencias, también son adecuadas aquellas que tienen otra secuencia de ADN a causa de la degeneración del código genético, pero que, sin embargo, codifican para los mismos polipéptidos.
Además, también son objeto de la invención aquellas secuencias de ADN que codifican para un producto genético (polipéptido) con otra estructura primaria que la representada en el protocolo de secuencias, siempre que el producto genético presente esencialmente las mismas propiedades biológicas que el producto genético mencionado en el protocolo de secuencias. Por propiedades biológicas se entienden, ante todo, las actividades enzimáticas que provocan la biosíntesis de riboflavina.
Dichos productos genéticos modificados, con esencialmente las mismas propiedades biológicas, pueden obtenerse por deleción o adición de uno o varios aminoácidos o péptidos o por intercambio de aminoácidos por otros aminoácidos o pueden aislarse a partir de otros organismos distintos de Ashbya gossypii.
Generalmente, las secuencias de ADN que codifican para los productos genéticos modificados son homólogas en un 80 o más por ciento con las secuencias de ADN según el protocolo de secuencias. Dichas secuencias de ADN pueden aislarse de otros eucariotas distintos de Ashbya gossypii, partiendo de las secuencias de ADN descritas en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, con procedimientos de hibridación habituales o con la técnica PCR. Estas secuencias de ADN se hibridan en condiciones estándar con las secuencias de ADN descritas en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11.
Por condiciones estándar se entienden, por ejemplo, temperaturas de entre 42 y 58ºC, en una solución tampón acuosa con una concentración de entre 0,1 y 1 x SSC (1 x SSC: NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM pH 7,2). Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN están descritas en los libros de texto de la ingeniería genética, por ejemplo, en Sambrook et al., "Moleuclar Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Otro objeto de la invención son las secuencias de regulación, especialmente secuencias de promotores, que, en dirección 5', se encuentran antes de las secuencias de ADN que codifican para los polipéptidos correspondientes. Las secuencias de regulación están representadas en el protocolo de secuencias y se explican detalladamente a continuación.
Secuencia de regulación para el gen rib1:
SEQ ID NO: 1 Nucleótido 1-242
Secuencia de regulación para el gen rib2:
SEQ ID NO: 3 Nucleótido 1-450
Secuencia de regulación para el gen rib3:
SEQ ID NO: 5 Nucleótido 1-314
Secuencia de regulación para el gen rib4:
SEQ ID NO: 7 Nucleótido 1-270
Secuencia de regulación para el gen rib5:
SEQ ID NO: 9 Nucleótido 1-524
Secuencia de regulación para el gen rib7:
SEQ ID NO: 11 Nucleótido 1-352
Las secuencias de regulación pueden acortarse también en dirección 5' y/o 3', sin que su función disminuya esencialmente.
Generalmente, para el efecto de regulación son esenciales fragmentos de 30 a 100, preferiblemente de 40 a 70 nucleótidos, de las zonas de secuencia indicadas anteriormente.
Estas secuencias de regulación también pueden optimarse en su función por medio de la mutagénesis dirigida en comparación con las secuencias naturales.
Las secuencias de regulación según la invención son adecuadas para la sobreexpresión de los genes en Ashbya, especialmente de los genes que son responsables de la biosíntesis de riboflavina.
Además, son objeto de la invención los vectores de expresión que contienen una o varias secuencias de ADN según la invención. Dichos vectores de expresión se obtienen dotando a las secuencias de ADN según la invención de señales funcionales adecuadas de regulación. Dichas señales de regulación son secuencias de ADN que son responsables de la expresión, por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores, puntos de unión ribosomales, y que son reconocidos y manejados por el organismo huésped.
Dado el caso, otras señales de regulación, que controlan, por ejemplo, la replicación o recombinación del ADN recombinante en el organismo huésped, pueden ser componentes del vector de expresión.
También pertenecen al objeto de la invención los organismos huésped transformados con las secuencias de ADN o los vectores de expresión según la invención. Preferiblemente se emplean como organismos huésped los organismos eucariotas, prefiriéndose especialmente aquellos de los géneros Saccharomyces, Candida, Pichia, Eremothecium o Ashbya. Las especies especialmente preferidas son Saccharomyces cerevisiae, Candida flaveri, Candida famata, Eremothecium ashbyii y Ashbya gossypii.
Además pertenece a la invención un procedimiento recombinante de producción de riboflavina, en el que los organismos huésped según la invención se cultivan de manera conocida por fermentación y la riboflavina formada durante la fermentación se aísla del medio de fermentación y, dado el caso, se purifica.
Los genes rib y los productos de los genes rib pueden aislarse y caracterizarse como se describe en el ejemplo y en el protocolo de secuencias.
Ejemplo 1 Aislamiento de los genes de biosíntesis de riboflavina de Ashbya gossypii (genes rib) a. Construcción de un banco de ADNc de Ashbya gossypii
Se extrajo todo el ARN del micelio de la cepa superproductora de riboflavina Ashbya gossypii ATCC 10195, después del cultivo sobre medio YEPD (Sherman et al., "Methods in yeast genetics", Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), en la fase logarítmica tardía de crecimiento.
El Poli (A)^{+} ARN se purificó realizando dos veces una adsorción y elución en oligo (dT)-celulosa (Aviv y Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 69, 1972, 1408-1412). El ADNc se aisló según el método general de Gubler y Hoffmann (Gene 25, 1983, 263) y se adicionaron adaptadores EcoRI sintéticos en los extremos de las moléculas romas (blunt end) de ADNc. A continuación, los fragmentos de ADNc recortados por EcoRI se fosforilaron mediante T4 polinucleótido quinasa y se clonaron en el vector pYEura3 desfosforilado, cortado por EcoRI, (figura 1). pYEura3 (Clonetech Laboratories, Inc., California) es un vector de expresión de la levadura, que contiene los promotores GAL1 y GAL10, que pueden inducirse con galactosa, y URA, CEN4 y ARS1. Estos elementos de la levadura permiten la transformación y expresión de los fragmentos de ADN clonados en las células de levadura.
Se utilizaron porciones alícuotas de la reacción de ligación, para transformar el E. coli XL1-Blue (Bullock et al., Biotechniques 5 (1987) 376- 378) altamente competente (Hanahan, DNA Cloning, ed. D.M. Glover; IRL Press, Oxford 1985, 109) y los transformantes se seleccionaron basándose en su resistencia a la ampicilina.
Se unieron y amplificaron aproximadamente 3 x 10^{5} células resistentes a la ampicilina y, a partir de ello, se aisló ADN de plásmido (Birnboim y Doly, Nucleic Acids Res. 7, 1979, 1513).
b. Aislamiento de clones de ADNc de Ashbya gossypii, que codifican para las enzimas de producción de riboflavina
Se aislaron clones de ADNc de Ashbya gossypii que codifican para enzimas de producción de riboflavina, por medio de la complementación funcional de mutantes de Saccharomyces cerevisiae que están implicados en la biosíntesis de riboflavina.
Las cepas AJ88 (Mata leu2 his3 rib1::URA3 ura3-52), AJ115 (Mata1pha leu2 inos1 rib2::URA3 ura3-52), AJ71 (Mata1pha leu2 inos1 rib3::URA3 ura3-52), AJ106 (Mata1pha leu2 inos1 rib4::URA3 ura3-52), AJ66 (Mata canR inos1 rib5::URA3 ura3-52) y AJ121 (Mata1pha leu2 inos1 rib7::URA3 ura3-52) son cepas mutadas, que se obtienen por destrucción de uno de los seis genes (RIB1 a RIB5 y RIB7), que están implicados en la biosíntesis de riboflavina con Saccharomyces cerevisiae.
Estas cepas se transformaron en cada caso con 25 \mug de ADNc del banco de ADNc de Ashbya gossypii y se prepararon cultivos en placas sobre un medio consistente con galactosa sin riboflavina. Después de aproximadamente una semana de crecimiento se aislaron los transformantes Rib+ de las placas de cultivo.
Se analizó en cada caso un transformante de cada mutante transformado (Rib1+, Rib2+, Rib3+, Rib4+, Rib5+ y Rib7+) y en todos los casos se halló que el fenotipo Rib+ únicamente se expresó en el medio de galactosa pero, sin embargo, no se expresó en el medio de glucosa.
Estos resultados prueban que el fenotipo Rib+ se expresó bajo el control del promotor GAL10 contenido en el plásmido, que puede inducirse con galactosa.
Se aisló ADN de los plásmidos de los transformantes Rib1+, Rib2+, Rib3+, Rib4+, Rib5+ y Rib7+ por transformación de E. coli y se denominaron pJR715, pJR669, pJR788, pJR733, pJR681 y pJR827.
La secuenciación parcial de las inserciones de ADNc contenidas en estos plásmidos confirmó que codifican para proteínas que son análogas a las proteínas de los productos de los genes rib de Saccharomyces.
c. Aislamiento de clones genómicos de Ashbya gossypii que codifican para enzimas de producción de riboflavina
Para aislar las copias genómicas de los genes de producción de riboflavina de Ashbya gossypii se creó un banco genómico de Ashbya gossypii ATCC 10195 en el cósmido superCos1 (Stratagene Cloning Systems, California) y se detectó con muestras marcadas con ^{32}P, derivadas de las copias de ADNc de los genes RIB1, RIB2, RIB3, RIB4, RIB5 y RIB7 de Ashbya gossypii.
Se aislaron los clones del cósmido con ADN de RIB1, RIB2, RIB3, RIB4, RIB5 y RIB7 por medio de hibridación de colonias (Grunstein y Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 72, 1975, 3961-3965). Otro análisis de ADN del cósmido desdoblado enzimáticamente, mediante la técnica de Southern, utilizando las mismas muestras de ADNc, específicas en cuanto al RIB, permitió la identificación de fragmentos definidos de restricción, que contenían los genes RIB1, RIB2, RIB3, RIB4, RIB5 y RIB7 de Ashbya gossypii.
Se encontró un fragmento de ADN de BamHI-ClaI de 3,1 kb de largo, que contenía el gen RIB1 completo de Ashbya gossypii, que codifica para la GTP ciclohidrolasa II. Este fragmento se aisló de un gel de agarosa y se clonó en el fagomidio pBluescript KS (+) (Stratagene Cloning Systems) cortado por BamHI y ClaI y, de esta manera, proporcionó el plásmido pJR765 (figura 2).
Se obtuvo una secuencia de ADN de 1329 pb de largo (SEQ ID NO:1), que contenía el marco de lectura abierto de RIB1 de 906 pb, 242 pb de la región no codificadora 5' y 181 pb de la región no codificadora 3'.
Todo el gen RIB2 de Ashbya gossypii, que codifica para la DRAP desaminasa, se encontró en un fragmento EcoRI-PstI de 3,0 kb de largo, que, clonado en pBluescript KS (+), dio como resultado el plásmido PJR758 (figura 3).
Una región de 2627 pb de largo de la inserción EcoRI-PstI con el marco de lectura abierto de RIB2 de 1830 pb, 450 pb de la región 5' no traducida y 347 pb de la región 3' no traducida, se secuenció (SEQ ID NO:3).
El gen completo RIB3 de Ashbya gossypii, que codifica para la DNP sintasa, se encontró en un fragmento PstI-HindIII de 1,5 kb de largo, que, clonado en pBluescript KS (+), dio como resultado el plásmido PJR790 (figura 4).
Una región de 1082 pb de largo de la inserción PstI-HindIII con el marco de lectura abierto de RIB3 con 639 pb, 314 pb de la región 5' no traducida y 129 pb de la región 3' no traducida, se secuenció (SEQ ID NO:5).
El gen RIB4 de Ashbya gossypii, que codifica para la DMRL sintasa, se encontró en un fragmento PstI-PstI de 3,2 kb de largo, que, clonado en pBluescript KS (+), dio como resultado el plásmido PJR762 (figura 5).
Una región de 996 pb de largo de la inserción PstI-PstI con el marco de lectura abierto de RIB4 con 519 pb, 270 pb de la región 5' no traducida y 207 pb de la región 3' no traducida, se secuenció (SEQ ID NO:7).
El gen completo RIB5 de Ashbya gossypii, que codifica para la riboflavina sintasa, se encontró en un fragmento PstI-PstI de 2,5 kb de largo, que, clonado en pBluescript KS (+), dio como resultado el plásmido PJR739 (figura 6).
Una región de 1511 pb de largo de la inserción PstI-PstI con el marco de lectura abierto de RIB5 con 708 pb, 524 pb de la región 5' no traducida y 279 pb de la región 3' no traducida, se secuenció (SEQ ID NO:9).
Finalmente, el gen RIB7 de Ashbya gossypii, que codifica para la HTP reductasa, se encontró en un fragmento EcoRI-EcoRI de 4,1 kb de largo, que, clonado en pBluescript KS (+), dio como resultado el plásmido PJR845 (figura 7).
Una región de 1596 pb de largo de la inserción EcoRI-EcoRI con el marco de lectura abierto de RIB7 con 741 pb, 352 pb de la región 5' no traducida y 503 pb de la región 3' no traducida, se secuenció (SEQ ID NO:11).
Ejemplo 2 Análisis de ARNm de los genes RIB de Ashbya gossypii
Para identificar los transcritos específicos en cuanto a RIB se realizaron análisis Northern. Se aisló el ARN completo de la cepa Ashbya gossypii ATCC 10195, como se describió en el ejemplo 1. Las muestras de ARN de la cepa (5 \mug) se separaron mediante electroforesis sobre geles al 0,8% de agarosa-formaldehído, junto con marcadores de tamaño de ARN, y se transfirieron, a vacío, a membranas de nylon (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77, 1980, 5201-5205).
Las membranas de nylon se hibridaron independientemente unas de la otras con muestras de ADN específicas en cuanto a RIB, marcadas con ^{32}P, a 42ºC en 5xSSC y en presencia de un 50% de formamida. El gen RIB1 de Ashbya gossypii se expresa como unique message de aproximadamente 1150 nucleótidos, lo que se detectó en las dos cepas por medio de una muestra SmaI-SacI de 0,7 kpb de largo del plásmido pJR765 (figura 8).
De manera análoga, los transcritos unique de RIB2 de 1900 nucleótidos de largo, de RIB3 de 900 nucleótidos de largo, de RIB4 de 800 nucleótidos de largo, de RIB5 de 1050 nucleótidos de largo y de RIB7 de 1000 nucleótidos de largo se detectaron en las manchas con ayuda de un fragmento SmaI-SmaI de pJR758 de 0,5 kpb de largo, un fragmento HindIII-KpnI de pJR790 de 0,6 kpb de largo, un fragmento ScaI-HindIII de pJR739 de 0,5 kpb de largo y un fragmento PstI-PstI de pJR845 de 0,3 kpb de largo, como muestra específica.
Ejemplo 3 Expresión de los genes RIB de Ashbya gossypii en Saccharomyces cerevisiae
Como se ha descrito en el ejemplo 1, los mutantes bien estudiados de Saccharomyces cerevisiae, que tienen un defecto en una etapa de la biosíntesis de riboflavina, pueden crecer sobre un medio de cultivo sin riboflavina si llevan un plásmido que codifica para las enzimas complementarias de Ashbya. Para comprobar la función de los productos de los genes RIB de Ashbya gossypii se midieron las actividades enzimáticas de producción de flavina en extractos sin células de mutantes de S. cerevisiae que llevaban uno de los plásmidos de expresión pJR715, pJR669, pJR788, pJR733, pJR681 y pJR827.
Estos plásmidos derivados de pYEura3, descritos en el ejemplo 1, contienen fragmentos de ADNc específico en cuanto a RIB de Ashbya gossypii bajo el control del promotor GAL10, que puede inducirse con galactosa.
Se obtuvieron extractos de proteínas de Saccharomyces cerevisiae sin células a partir de cultivos que habían crecido en medio líquido hasta una densidad óptica de aproximadamente 2 OD.
Se recogieron las células, se lavaron con Tris HCl frío 20 mM, pH 7,5 y se resuspendieron en el mismo tampón, que estaba suplementado con fluoruro de feniletilsulfonilo 1 mM.
Los lisados de células se produjeron mediante tratamiento en un vortex en presencia de bolas de vidrio y centrifugación a 3000 g durante 20 minutos a 4ºC.
Se determinaron las actividades enzimáticas de GTP ciclohidrolasa II, DRAP desaminasa, DBP sintasa, DMRL sintasa, riboflavina sintasa y HTP reductasa tal como se describe en la bibliografía (Shavlovsky et al., Arch. Microbiol. 124, 1980, 255-259; Richter et al., J. Baceriol. 175, 1993, 4045-4051; Klein y Bacher, Z. Naturforsch. 35b, 1980, 482-484; Richter et al., J. Bacteriol. 174, 1992, 4050-4056; Nielsen et al., Biol. Chem. 261, 1986, 3661; Plaut y Harvey, Methods Enzymol. 18B, 1971, 515-538; Hollander y Brown, Biochem. Biophys. Res. Commun. 89, 1979, 759-763; Shavlovski et al., Biochim. Biophys. Acta, 428, 1976, 611-618).
La proteína se cuantificó según el método de Peterson (Anal. Biochem. 83, 1977, 346-356). Como muestra la tabla 1, el plásmido pJR715 provoca la expresión de la actividad de la GTP ciclohidrolasa II en el mutante AJ88 de S. cerevisiae. Además, esta actividad únicamente está presente en células que han crecido en un medio de galactosa, lo que indica que la expresión de ADNc RIB1 de Ashbya gossypii tiene lugar bajo el control del promotor GAL10, que puede inducirse con galactosa.
Por tanto, estos resultados prueban que RIB1 codifica para la GTP ciclohidrolasa II en Ashbya gossypii. De manera análoga se ha mostrado que RIB2 codifica para la DRAP desaminasa, RIB3 para la DBP sintasa, RIB4 para la DMRL sintasa, RIB5 para la riboflavina sintasa y RIB7 para la HTP reductasa en este hongo.
TABLA 1 Actividad de la GTP ciclohidrolasa II del mutante AJ88 con RIB1 de S. cerevisiae y sus transformantes
1
TABLA 2 Actividad de la DRAP desaminasa del mutante AJ115 con RIB2 de S. cerevisiae y sus transformantes
2
TABLA 3 Actividad de la DBP sintasa del mutante AJ71 con RIB3 de S. cerevisiae y sus transformantes
3
TABLA 4 Actividad de la GTP ciclohidrolasa II del muntante AJ106 con RIB4 de S. cerevisiae y sus transformantes
4
TABLA 5 Actividad de la riboflavina sintansa del mutante AJ66 con RIB5 de S. cerevisiae y sus transformantes
5
TABLA 6 Actividad de la HTP reductasa del mutante AJ121 con RIB7 de S. cerevisiae y sus transformantes
6
(1) Información general:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Registrante:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre: BASF Aktiengesellschaft
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Calle: Carl-Bosch-Strasse 38
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Lugar: Ludwigshafen
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
País: República Federal de Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
Código postal: D-67056
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
Teléfono: 0621/6048526
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
Telefax: 0621/6043123
\vskip0.333000\baselineskip
(I)
Telex: 1762175170
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Título del registro: Biosíntesis de riboflavina en hongos
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Número de secuencias: 12
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
Formato de lectura por ordenador:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Soporte de datos: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Ordenador: compatible con IBM PC
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Software: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 1329 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Forma de la cadena: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Antisentido: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
Procedencia originaria:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Organismo: Ashbya gossypii 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 5'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1..242
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 243..1148
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1149..1329
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 1:
7
8 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 301 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 2:
9 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 2627 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Forma de la cadena: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Antisentido: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
Procedencia original:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Organismo: Ashbya gossypii 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 5'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1..450
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 451..2280
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 2281..2627
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 3:
10
11
12
13 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 609 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 4:
14
15
16 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 1082 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Forma de la cadena: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Antisentido: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
Procedencia original:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Organismo: Ashbya gossypii 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 5'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1..314
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 315..953
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 954..1082
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 5:
17
18 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 212 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 6:
19 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 996 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Forma de la cadena: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Antisentido: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
Procedencia original:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Organismo: Ashbya gossypii 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 5'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1..270
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 271..789
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 790..996
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 7:
20 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 172 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 8:
21 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 1511 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Forma de la cadena: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Antisentido: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
Procedencia original:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Organismo: Ashbya gossypii 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 5'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1..524
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 525..1232
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1233..1511
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 9:
22
23 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 235 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 10:
24
25 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 1596 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
Forma de la cadena: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: ADNc a ARNm
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Hipotético: no
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
Antisentido: no
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
Procedencia original:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Organismo: Ashbya gossypii 
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 5'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1..352
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 353..1093
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
Características:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Nombre/Código: 3'UTR
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Posición: 1094..1596
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 11:
26
27 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) Información sobre SEQ ID NO: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
Características de la secuencia:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
Largo: 246 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
Tipo: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
Topología: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
Tipo de molécula: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
Descripción de la secuencia: SEQ ID NO: 12:
28

Claims (9)

1. Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 2 (GTP ciclohidrolasa II) o para un análogo o derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 2, en la que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 1.
2. Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 4 (DRAP desaminasa), o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 4, en la que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 3.
3. Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 6 (DBP sintasa), o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 6, en la que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 5.
4. Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 8 (DMRL sintasa), o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 8, en la que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 7.
5. Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 10 (riboflavina sintasa), o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 10, en la que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 9.
6. Secuencias de ADN que codifican para un polipéptido con la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 12 (HTP reductasa), o un análogo o un derivado del polipéptido según SEQ ID NO: 12, en la que uno o varios aminoácidos han sido delecionados, adicionados o sustituidos por otros aminoácidos, sin reducir esencialmente el efecto enzimático del polipéptido, con la condición de que las secuencias de ADN del análogo o derivado del polipéptido sean al menos en un 80% homólogas respecto a SEQ ID NO: 11.
7. Vector de expresión que contiene uno o varias secuencias de ADN según las reivindicaciones 1 a 6.
8. Organismo huésped no humano, que ha sido transformado con un sistema de expresión según la reivindicación 7.
9. Procedimiento recombinante de producción de riboflavina, caracterizado porque se utiliza un organismo huésped según la reivindicación 8.
ES95913119T 1994-03-25 1995-03-15 Biosintesis de riboflavina en hongos. Expired - Lifetime ES2216010T3 (es)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4410382 1994-03-25
DE4410382 1994-03-25
DE4420785A DE4420785A1 (de) 1994-03-25 1994-06-15 Riboflavin-Biosynthese in Pilzen
DE4420785 1994-06-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2216010T3 true ES2216010T3 (es) 2004-10-16

Family

ID=25935071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95913119T Expired - Lifetime ES2216010T3 (es) 1994-03-25 1995-03-15 Biosintesis de riboflavina en hongos.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5821090A (es)
EP (1) EP0751995B1 (es)
JP (1) JP3756180B2 (es)
CN (1) CN1117151C (es)
CA (1) CA2186403C (es)
DK (1) DK0751995T3 (es)
ES (1) ES2216010T3 (es)
WO (1) WO1995026406A2 (es)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6350597B1 (en) 1994-01-13 2002-02-26 E. I. Du Pont De Nemours & Company Riboflavin synthase genes and enzymes and methods of use
ES2160829T3 (es) * 1995-07-13 2001-11-16 Basf Ag Procedimiento para la obtencion de riboflavina por medio de microorganismos con actividad de isocitratoliasa modificada.
US6239264B1 (en) 1996-12-31 2001-05-29 Syngenta Participations Ag Genomic DNA sequences of ashbya gossypii and uses thereof
US6682891B2 (en) 1997-08-15 2004-01-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Methods of identifying nucleic acid sequences encoding plant riboflavin synthase enzymes
US6146866A (en) * 1997-08-15 2000-11-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Lumazine synthase and riboflavin synthase
US6323013B1 (en) 1998-10-28 2001-11-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Lumazine synthase and riboflavin synthase
DE19840709A1 (de) * 1997-12-22 1999-06-24 Forschungszentrum Juelich Gmbh Ein- oder mehrzellige Organismen zur Herstellung von Riboflavin
EP0927761A3 (de) 1997-12-23 2001-09-05 Basf Aktiengesellschaft Gene der Purinbiosyntese aus Ashbya gossypii und deren Verwendung in der mikrobiellen Riboflavinsynthese
DE19801120A1 (de) 1998-01-15 1999-07-22 Basf Ag Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase-Gen, Genkonstrukt enthaltend dieses Gen und seine Verwendung
ID23301A (id) 1998-04-23 2000-04-05 Hoffmann La Roche Produksi yang berlebihan dari riboflavin di dalam ragi
US6074830A (en) * 1998-06-09 2000-06-13 E. I. Du Pont De Nemours & Company 3,4-dihydroxy-2-butanone 4-phosphate synthase
US6291660B1 (en) 1998-10-08 2001-09-18 Syngenta Participations Ag Fungal genes required for normal growth and development
US7009045B2 (en) 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
CA2456828A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Basf Aktiengesellschaft Novel genetic products from ashbya gossypii, associated with the structure of the cell wall or the cytoskeleton
CN1558913A (zh) * 2001-08-29 2004-12-29 巴斯福股份公司 来自棉桃阿舒氏囊霉的与转录、rna加工和/或翻译机制相关的新基因产物
DE10159396A1 (de) * 2001-12-04 2003-06-12 Basf Ag Genetische Stammoptimierung zur verbesserten Herstellung von Riboflavin
DE10209363A1 (de) * 2002-03-02 2003-09-11 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Riboflavin
DE60314258T2 (de) * 2002-09-06 2008-02-07 Basf Ag Gtp cyclohydrolase ii als ziel für fungizide
KR100422305B1 (ko) 2002-12-05 2004-03-10 씨제이 주식회사 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법
KR100422307B1 (ko) 2002-12-05 2004-03-10 씨제이 주식회사 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법
EP1814983B1 (en) * 2004-07-07 2013-08-21 DSM IP Assets B.V. Improved enzymes
US8968093B2 (en) 2004-07-15 2015-03-03 Intel Corporation Dynamic insertion of personalized content in online game scenes
KR101335853B1 (ko) 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
KR102561863B1 (ko) * 2014-11-19 2023-08-01 바스프 에스이 Imp 데히드로게나아제 활성을 증가시키기 위한 에레모테시움의 유전적 변형
CN114592000B (zh) * 2020-12-03 2023-07-21 上海市农业科学院 一种六基因组合在水稻种子中提高vb2含量的应用及方法
CN120173760B (zh) * 2025-05-20 2025-08-05 云南省林业和草原科学院 一种高产苔色酸工程菌yafwy001的制备及培养方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1066486C (zh) * 1989-06-22 2001-05-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 高产核黄素的细菌菌株
DE59310239D1 (de) * 1992-05-11 2002-01-10 Basf Ag DNA-Verbindungen und rekombinante, die Ribloflavinsynthetaseaktivität von S. cerevisiae codierende DNA-Expressionsvektoren
DE4238904A1 (de) * 1992-11-19 1994-05-26 Basf Ag Riboflavin-Synthese in Hefen

Also Published As

Publication number Publication date
EP0751995A1 (de) 1997-01-08
JP3756180B2 (ja) 2006-03-15
WO1995026406A2 (de) 1995-10-05
DK0751995T3 (da) 2004-03-08
JPH09510618A (ja) 1997-10-28
CA2186403C (en) 2006-01-24
EP0751995B1 (de) 2004-02-18
CN1117151C (zh) 2003-08-06
CA2186403A1 (en) 1995-10-05
US5821090A (en) 1998-10-13
CN1146781A (zh) 1997-04-02
WO1995026406A3 (de) 2001-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2216010T3 (es) Biosintesis de riboflavina en hongos.
JP7430189B2 (ja) 外来遺伝子を発現させるためのピキア・パストリス変異株
US4387162A (en) Hybrid plasmids and microorganisms containing them
Iino et al. S. pombe pac1+, whose overexpression inhibits sexual development, encodes a ribonuclease III‐like RNase.
Chary et al. Superoxide dismutase (sod-1) null mutants of Neurospora crassa: oxidative stress sensitivity, spontaneous mutation rate and response to mutagens.
JP2000500014A (ja) ピヒア・メタノリカ中で異種ポリペプチドを生産するための組成物と方法
Yoshimoto et al. Characterization of the ATF1 and Lg-ATF1 genes encoding alcohol acetyltransferases in the bottom fermenting yeast Saccharomyces pastorianus
US6884602B2 (en) Expression of alkaline phosphatase in yeast
JP3433295B2 (ja) キシリトールの製造のための組換え方法および宿主
Yoshimoto et al. Isolation and characterization of the ATF2 gene encoding alcohol acetyltransferase II in the bottom fermenting yeast Saccharomyces pastorianus
CN101432429B (zh) 产生芳香分子的酵母表达系统
US5360901A (en) Gene sequence encoding Aspergillus niger catalase-R
US5360732A (en) Production of Aspergillus niger catalase-R
JPH08502896A (ja) 酵母菌中でのリボフラビン合成
Osiewacz Genetic analysis of senescence in Podospora anserina
JPH07504332A (ja) 黒色アスペルギルスカタラーゼ−ｒの産生
Nosek et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis
RU2155229C2 (ru) Последовательность днк (варианты), штамм saccharomyces cerevisiae, трансформированный для получения рибофлавина (варианты)
JP6724285B2 (ja) シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造方法
Yamashita et al. Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of the secretable acid protease gene from Saccharomycopsis fibuligera
Hammond Yeast genetics
KR20050025180A (ko) 메틸트로픽 효모로부터 유도된 변화된 전사 효율을 갖는프로모터
JP4049364B2 (ja) 多コピー型・ゲノム挿入型の選択両用ベクター
KR101837130B1 (ko) 효모 캔디다 뷰티리 sh-14 유래의 신규 리파아제 및 그의 용도
US6265159B1 (en) Method for producing DNA nested deletions by an in vitro reaction using transposase