JPH0622785A - アルファ−１−アンチトリプシンの発現のための安定なｄｎａ構造物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 宿主細胞における欠陥を補う遺伝子を含むＤ
ＮＡ構造物において、該欠陥が複合培養基での正常細胞
増殖のために必要な機能にあり、ＤＮＡ配列がα−１−
アンチトリプシンをコードするＤＮＡ構造物。 【効果】 本発明に従い、α−１−アンチトリプシンを
発現できかつ特別の選択培養基を要せずに高いコピー数
で維持されるＤＮＡ構造物及び適当な宿主細胞が提供さ
れる。そのような条件における増殖は、より速い増殖、
より大きい細胞密度及び低減された生産コストをもたら
す。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 組換えＤＮＡ技術を利用する有用なポリペプチド生成物
の生産のための微生物の使用は、工業として確立されて
きている。外来遺伝子物質が微生物の培養菌中に導入さ
れることが出来、適当な細胞内及び細胞外条件を与える
と望む生成物が外来遺伝子から合成されうる。そのよう
な遺伝子物質は一般に、プラスミドの形で微生物中に導
入され、これは自律的に複製する染色体外要素である。
形質転換された細胞培養物内にプラスミドを維持するこ
とを保証するために、これら細胞を特別の条件下で成育
することが必要であった。そのような条件の欠除のもと
では、本質的に不安定であろうプラスミドは維持され
ず、細胞群は形質転換されていない状態に戻るであろ
う。プラスミド安定性の増大及びコピー数の増大は、プ
ラスミドでコードされる蛋白質の生産を常に高いレベル
に維持する手段として生物技術工業にとって重要であ
る。プラスミド安定性を増すための従来報告された試み
は、産業的利用のために最適であるとは見えない。安定
性を高めながらＡＲ′Ｓ含有プラスミド中に酵母動原体
を導入することは、プラスミドコピー数を著しく低減す
ることが判っている（クラーケ（ｃｌａｒｋｅ）とカー
ボン（ｃａｒｂｏｎ），ネイチア（Ｎａｔｕｒｅ），２
８７：５０４−５０９，１９８０，及びスティンクコム
（ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、ジャーナル オブ モレ
キュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ
ｌ．），１５８：１５７−１７９．１９８２）。線形動
原体酵母プラスミドは同様に、安定性とコピー数の間の
逆比例関係を示す（マリー（Ｈｕｒｒｙ）とスゾスタク
（Ｓｚｏｓｔａｋ），ネイチア，３０５：１８９−１９
３，１９８３）。プラスミドは典型的には、選択マーカ
ーとて知られている遺伝子配列を含み、これは宿主細胞
の抗生物質耐性又は補助栄養要求をコードする。そのよ
うなプラスミドの存在について選択するために、形質転
換された細胞は、選択剤を含む又は特定の栄養素を除か
れた特別の培養基で生育されなければならない。これら
培養基要件は高価であり、かつ大規模醗酵プロセスの間
の最適細胞生長速度を禁止する。そのようなプラスミド
の多くが、文献に報告されている。抗生物質耐性遺伝子
を含むこれらとしては、ｐＢＲ３２２（ボリバー（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５−１１
３，１９７７）及びその誘導体たとえばｐＵＣベクター
（ビエイラ（ｖｉｅｉｒａ）とメッシング（Ｍｅｓｓｉ
ｎｇ），ジーン，１９：２５９−２６８，１９８２）
（これはアンピシリン耐性を持つ）及びｐＢＲ ３２５
（プレントキ（Ｐｒｎｔｋｉ）ら、ジーン，１４：２８
９，１９８１）（これはアンピシリン，テトラサイクリ
ン及びクロラムフェニコールに対する耐性遺伝子を持
つ）が挙げられる。宿主栄養要求を補うプラスミドとし
ては、酵母ベクターＹＥｐ １３（ブローチ（Ｂｒｏａ
ｃｈ）ら、ジーン，８：１２１−１３３，１９７９）
（これはＬＥＵ２遺伝子を持つ）、及びＹＲｐ ７′
（スティンクコムら、ネイチア，２８２：３９，１９７
９）（これはＴＲＰ１遺伝子を持つ）が挙げられる。ア
ルファ−１−アンチトリプシンは、プロテアーゼインヒ
ビターであり、その主な機能は幅広いスペクトルのプロ
テアーゼであるエラスタ−ゼを抑制することである。哺
乳動物の肺組織は、エラスターゼによる攻撃に特に弱
く、従ってα−１−アンチトリプシンの欠損又は不活性
化は肺組織弾性の喪失及び従って気腫を結果しうる。α
−１−アンチトリプシン活性の損失又は減少は、タバコ
の煙を含む環境汚染物によるα−１−アンチトリプシン
の酸化の結果である。α−１−アンチトリプシンの欠損
は、いくつかの遺伝的欠陥の一つから起りうる。ガデッ
ク（Ｇａｄｅｋ），ジエームスＪａｍｅ）Ｅ．及びＲ．
Ｄ．クリスタル（Ｃｒｙｓｔａｌ），「α−１−アンチ
トリプシン欠損」．遺伝病の代謝的基礎、スタンブリー
（ｓｔａｎｂｕｒｙ），Ｊ．Ｂ．ら編、マグロウーヒ
ル，ニューヨーク（１９８２），ｐｐ１４５０−１４６
７；及びキャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら，ネイチア，２
９８８，３２９−３３４（１９８２）参照。従って、α
−１−アンチトリプシンをコードするＤＮＡ配列、及び
選択マーカーとして、その生成物が複合培養基上で宿主
細胞の生育性又は正常増殖のために必須であるところの
遺伝子配列を含むＤＮＡ構造物を提供することが本発明
の目的である。本発明の別の目的は、複合媒体上での増
殖により選択できかつα−１−アンチトリプシンを発現
しうるプラスミドを含む微生物の形質転換株を提供する
ことである。さらに本発明の別の目的は、必須機能にお
いて欠陥を持ち、これら欠陥的必須機能を補いかつα−
１−アンチトリプシンを発現できる遺伝子配列を持つＤ
ＮＡ構造物のための宿主として働きうる微生物株を提供
することである。本発明の別の目的は、形質転換微生物
中でα−１−アンチトリプシンを作る方法において、α
−１−アンチトリプシンが、選択マーカーとして宿主微
生物における必須遺伝子の欠陥を補う遺伝子配列を含む
ＤＮＡ構造物上に含まれる遺伝子の生成物である方法を
提供することである。本発明の別の目的は、当業者にと
って明らかであろう。

本発明のまとめ 本発明に従い、α−１−アンチトリプシンを発現できか
つ特別の選択培養基を要せずに高いコピー数で維持され
るＤＮＡ構造物及び適当な宿主細抱が提供される。その
ような条件における増殖は、より速い増殖、より大きい
細胞密度及び低減された生産コストをもたらす。本発明
は更に、複合培養基での正常細胞増殖のために必要な機
能における欠陥を持つ宿主細胞においてα−１−アンチ
トリプシンを作る方法であって、この欠陥を補う遺伝子
及びα−１−アンチトリプシンをコードする配列を含む
ＤＮＡ分子により宿主細胞を形質転換の段階を含む方法
を提供することである。本明細書において、ＤＮＡ構造
物という言葉は、分子中のヌクレオチド配列が自然に作
られた配列と同じでないように人により修飾された任意
のＤＮＡ分子を意味する。ＤＮＡ構造物という言葉はま
た、そのように修飾されたＤＮＡ分子のクローンをも包
含する。発現ベクターという言葉は、複製の自律部位、
転写開始部位及び宿主生物において発現されるべき蛋白
質をコードする少くとも一つの構造的遺伝子を含むＤＮ
Ａ構造物として定義される。発現ベクターはまた通常、
宿主生物における蛋白質の発現を制御するプロモーター
及びターミネーターのような適当な制御領域をも含むで
あろう。本発明に従う発現ベクターはまた、本明細書で
述べる必須遺伝子を含む選択マーカーをも含むであろ
う。プラスミドという言葉は、その普通に用いられる意
味、すなわち自津的に複製し、通常閉じたループのＤＮ
Ａを意味する。添付した図面において：第１図は、プラ
スミドｐＢ４の構造を示す。第２図は、プラスミドｐＢ
５の構造を示す。第３図は、プラスミドｐＢ１５Ｌの構
造を示す。第４図は、プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌ
で共形質転換されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）株Ａ２．７．ＣからのＤＮＡのサザーンブロット
を示す。このブロットは、ゲノムＣＤＣ４座の崩壊につ
いてテストするためにＣＤＣ４の５′フランキング領域
からの２．５ｋｂ Ｂａｍ Ｈ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメントでプローブされた。レーンａは、ｐＢ５単独
で形質転換された細胞からのＤＮＡを含む；レーンｂは
形質転換されていない細胞；レーンｃ〜ｈは共形質転換
体を含む。矢印は、プローブにハイブリットするゲノム
フラグメントを示す。第５図は、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂ
ｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セレビシエＴＰＩ １遺伝子の配
列を、各々の推定された蛋白質配列とともに示す。Ｓ．
ポンベＴＰＩ蛋白質配列の全体が与えられる。Ｓ．セレ
ビシエ蛋白質の配列は、それがＳ・ポムベ配列と異る個
所のみ示される。Ｓ．セレビシエ蛋白質配列における位
置１におけるメチオニンは、天然蛋白質には存在しな
い。第６図は、プラスミドｐＣＰＯＴの構造を示す。第
７図は、プラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構造を示す。第８
図は、プラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構造を示す。

詳細な説明 本発明は、必須遺伝子がα−１−アンチトリプシンを発
現できるプラスミドのようなＤＮＡ構造物上の選択マー
カーとして用いられうるという発見に部分的に基づく。
必須遺伝子という言葉は、複合培養基での細胞生育又は
正常増殖のために必要な機能をコードする任意の遺伝子
と定義される。複合培養基は、その中において栄養素
が、組成が良く定義されない生成物たとえば粗細胞エキ
ス、肉エキス、果汁、血清、蛋白質加水分解物などから
導かれる培養基である。従って、本発明に従う望む形質
転換体を選択するために、選択増殖培養基は単に慣用の
複合増殖養基であり、非形質転換宿主細胞に致命的な比
較的高価な抗生物質、金属拮抗剤、又は他の剤を含む、
又は非形質転換宿主に必要な一以上の特定の栄養素を欠
く特別の培養基ではない。必須遺伝子としては、細胞分
割、膜生合成、細胞壁生合成、細胞小器官生合成、蛋白
質合成、炭素源利用、ＲＮＡ転写及びＤＮＡ複製のため
に必要な遺伝子を包含するがこれらに限定されない。Ｄ
ＮＡ構造物たとえばプラスミド上の選択マーカーとして
必須遺伝子を用いるために、適当な突然変異宿主細胞株
を提供することが必須である。ロスステイン（Ｒｏｔｈ
ｓｔｅｉｎ）の一段階遺伝子崩壊法（Ｈｅｔｈ．ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：２０２−２１０．１９
８３）又は本明細書で述べる共形質転換手順を用いて、
ゲノムにおいて適当な必須遺伝子の欠失を有する適当な
宿主株が構成されうる。そのような欠失突然変異体は、
突然変異がプラスミドに担持される遺伝子物質によりコ
ードされる機能によって補われるときに増殖する。宿主
のゲノムの必須遺伝子（単数又は複数）における欠失
は、コード領域及び／又はフランキング領域の主要なセ
グメントを含むことが好ましい。必須遺伝子における突
然変異が点突然変異のみにより達成される様式で行われ
るなら、突然宿主細胞が突然変異又は組換修復メカニズ
ムによって野性種に戻り、それによりプラスミド担持遺
伝子の使用により達成されうる選択性を低減又は除去す
ることがありうる。必須遺伝子は、多重コピー（たとえ
ばヒストン又はリボソームＲＮＡ遺伝子）中に及び／又
は遺伝子ファミリーと呼ばれる多重の関速した形（たと
えば種々のヘキソキナーゼ遺伝子、又は種々のＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子）中にしばしば存する。そのような場
合、これら重複した機能は、所定の必須機能について多
重に欠陥のある宿主細胞を作るために次々と突然変異さ
れうる。しかし、遺伝子の活性を増すために高コピー数
プラスミドを用いることによって、プラスミド上の単一
の必須遺伝子が多重の宿主細胞欠陥を補いうる。高コピ
ー数プラスミドは、クローニングされた外来遺伝子のコ
ピー数の増加がこの遺伝子によりコードされる蛋白質生
成物の産生の増加を結果するので望ましい。必須遺伝子
を持つプラスミドの高コピー数を含む形質転換体の選択
は、各プラスミド担持必須遣伝子の発現レベルを低下さ
せることにより及び／又はプラスミド担持選択マーカー
によりコードされる遺伝子生成物の活性を低下させるこ
とにより達成されうる。一つのアプローチは、必須遺伝
子を突然変異して、遺伝子の転写及び／又は翻訳速度が
低減される又は遺伝子生成物がより低い特異的活動を持
つよう変えられることである。選択マーカーとして用い
られる必須遺伝子の発現レベルを下げるための別の方法
は、宿主細胞における欠陥を補うために別の生物からの
遺伝子を用いることである。そのような外来遺伝子は、
宿主細胞における発現について自然に欠陥的でありう
る。なぜなら転写及び／又は翻訳のためのシグナルは別
の種において最適より低いであろうからである。又は遺
伝子生成物は低減した活性又は安定性を持つかも知れな
い。なぜならそれは異質の細胞環境にあるからである。
複合培養基における細胞生育又は正常増殖のために必要
な幅広い範囲の機能が存在する。必要遺伝子における欠
陥又は欠失は、致死、細胞分割の速度の低下、細胞分割
の終止、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白合成の停止、膜合成の
停止、細胞壁合成の停上、細胞小器官合成の停止、蔗糖
代謝における欠陥などを結果しうる。必須遺伝子の例と
しては、酵母サッカロミケス セレビシエのＣＤＣ（細
胞分割サイクル）遺伝子（プリングル（Ｐｒｉｎｇ１
ｅ）とハートウェル（Ｈａｒｔｗｅｌｌ），「サッカロ
ミケス セレビシエ細胞サイクル」ストラサーン（Ｓｔ
ｒａｔｈｅｒｎ）ら編の酵母サフカロミケス ライフサ
イクル及び遺伝の分子生物学、５７−１４２中、コール
ド スプリング ハーバー（ｃｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ ），１９８１），Ｓ．セレビシエ及びエシェ
リヒア コリ 解糖経路の機能をコードする遺伝子、及
びＳ．セレビシエのＳＥＣ（ノビック（Ｎｏｖｉｃｋ）
とシェクマン（Ｓｃｈｅｋｍａｎ），プロシージングズ
オブ ナショナルアカデミーオブ サイエンスＵＳＡ
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ）７
６：１８５６−１８６２，１９７９、及びノビックら、
セル（Ｃｅｌｌ）２１：２０５−２１５，１９８０）及
びＩＮＯ（カルバートソン（ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎ）と
ヘンリー（Ｈｅｎｒｙ），ジェネティクス（Ｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ）８０：２３−４０，１９７５）遺伝子が挙げら
れる。必須遺伝子欠陥の宿主細胞の一つの好ましいクラ
スは、ｃｄｃ突然変異として知られるＣＤＣ遺伝子にお
ける欠陥を含み、これは細胞分割サイクルの段階特異的
阻止をもたらす。多くのｃｄｃ突然変異は、特定のＣＤ
Ｃ遺伝子生成物の合成又は機能に影響することによっ
て、細抱サイクルに必須の事象の完全な妨害を起す。そ
のような突然変異は、生化学的に又は形態学的に観察さ
れうる事象に対する効果によって同定されうる。多くの
既知のｃｄｃ突然変異は、環境条件的致死性（すなわち
温度敏感な）突然変異であり、これは制限的条件下で増
殖された突然変異細胞の正常な成長の終止を結果する。
しかし、ｃｄｃ突然変異から生じた主な欠陥は、段階特
異的機能における欠陥自体である必要はない。たとえ
ば、連続的に合成された遺伝子生成物は段階特異的機能
を持ちうる；酵母解糖遺伝子ＰＹＫ１における（酵素ピ
ルベートキナーゼに対する）欠陥が細胞分割サイクル突
然変異ｃｄｃ １９（カワサキ，博士論文，ワシントン
大学，１９７９）に対して対立的である。この突然変異
は、典型的酵母複合培養基ＹＥＰＤ（１％酵母エキス、
２％バクトペプトン、及び２％デキストロース）中でイ
ンキュベートされた細胞のＧ１相における細胞サイクル
停止を結果する。すなわち、ｃｄｃ突然変異が段階特異
的機能における欠陥を結果するか又はそれが段階特異的
機能を持つ遺伝子生成物の抑制又は不能化突然変異を起
すかに拘らず、欠陥の効果は、モニターされうる。プリ
ングルとハートウエル（上述）は、いくつかの５１ＣＤ
Ｃ遺伝子の機能を記述している。本発明を実施するに用
いるために、そのような遺伝子は、望む突然変異を持つ
株における補償によって遺伝子ライブラリーから分離さ
れうる。遺伝子ライブラリーは、公知の手順で構成され
うる（たとえばナスミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）とリード
（Ｒｅｅｄ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ７７：２１１９−２１２３，１９８０；及び
ナスミスとタチェル（Ｔａｔｃｈｅｌｌ），セル１９：
７５３−７６４，１９８０）。望む ｃｄｃ突然変異を
持つ株は、本明細書で述べられるように作られ、又は公
共的に入手できる寄託機関たとえばＡＴＣＣ及びバーク
レー イースト ストック センターから入手できる。
必須遺伝子の第二の好ましいクラスは、解糖経路に関係
する生成物をコードするものであり、代謝酵素及び調節
機能をコードする遺伝子を包含する。同定されたＳ．セ
レビシエにおける解糖経路遺伝子の例は、解糖調節遺伝
子ＧＣＲ１及び酵素トリオース ホスフェート イソメ
ラーゼ，ヘキソキナーゼ１，ヘキソキナーゼ２，ホフホ
グルコース イソメラーゼ，ホスホグリセラートキナー
ゼ，ホスホフラクトキナーゼ，エノラーゼ，フラクトー
ス１，６−ビスホスフェート デハイドロゲナーゼ，及
びグリセ ラルデヒド３−ホスフェート デハイドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子である。上述したように、ピ
ルベート キナーゼ遺伝子は、カワサキにより同定さ
れ、記述された。酵母ホスホ グリセラートキナーゼ遺
伝子を含み、調節シグナルを伴うプラスミドは、ヒッツ
ェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、（ジャーナル オブ
バイオロジィー アンド ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．）２２５：１２０７３−１２０８０，１
９８０）により記述された。酵母トリオース ホスフェ
ートの分離及び配列決定は、アルバー（Ａｌｂｅｒ）と
カワサキ（ジャーナル オブ モレキュラー アンド
アプライドジェネティクス）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．
Ｇｅｎｅｔ．）１：４１９−４３４，１９８２）及びカ
ワサキとフレンケル（Ｆｒａｅｎｋｅｌ）（バイオケム
バイオフィズ リス コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．）１０８：１１０７−１１
１２， １９８２）により記述される。特に好ましい解
糖遺伝子は、ＴＰＩ１であり、これは、グリセラルヒド
−３−ホスフェート及びジヒドロキシアセトン−３−ホ
スフェートの相互転化を触媒し従って解糖及びグリコネ
オゲネシスのために必須の酵素、酵母トリオース ホス
フェト イソメラーゼをコードする。Ｓ．セレビシエに
おいて、第一遺伝子座ＴＰＩ１は、この機能を暗号す
る。ＴＰＩ１における突然変異を有する細胞は、グルコ
ース上で増殖せず、他の炭素源上で少ししか増殖しな
い。Ｓ． セレビシエ ＴＰＩ１遺伝子は、ｔｐｉ１突
然変異の補償により分離された（アルバーとカワサキ
（上述）、及びカワサキとフレンケル（上述））。分裂
酵母シゾサッカロミケス ホンベからのトリオース ホ
スフェート イソメラーゼ遺伝子（Ｐ０Ｔ１）が同じ
Ｓ． セレビシエ突然変異の補償により分離され、第５
図に示すように配列決定された。ＰＯＴ１と名付けられ
たＳ． ポンベ遺伝子の配列は、Ｓ． ポンベＴＰＩ蛋
白質がＳ． セレビシエのＴＰＩ蛋白質と相同であるこ
とを示した。通常の場合、ＤＮＡ構造物（プラスミド）
において用いられる必須遺伝子は宿主種からの野生タイ
プ遺伝子であろうが、ある場合には宿主細胞にとって外
来の必須遺伝子を用いることが好ましい。なぜなら外来
遺伝子は自然に欠陥的であり、それによって高プラスミ
ドコピー数に対して選択可能であるからである。用いら
れるそのような外来必須遺伝子の例として、ここでの例
の一つは、Ｓ． ポンベ ＰＯＴ１遺伝子がＳ． セレ
ビシエ宿主における選択マーカーとして有効に用いられ
ることを示す。選択マーカーとして必須遺伝子を含む本
発明に従うＤＮＡ構造物は、必須遺伝子の機能において
欠陥のある突然変異宿主細胞中に形質転換されよう。適
当に突然変異された宿主細胞が作られなければならない
か、又は公共寄託機関から容易に入手できる。適当な突
然変異体を得るために野生タイプの細胞の突然変異化
は、慣用の方法で達成されうる。たとえば、野生タイプ
細胞が、慣用の突然変異化剤たとえばエタン メチルス
ルホネートにより処理され、補償が起るコロニーを同定
するために必須遺伝子を含むプラスミドで形質転換され
る。あるいは、ゲノムが崩壊されて、特定の突然変異を
作る（ロススティン、上述）。宿主細胞中に必須遺伝子
を含むプラスミドの安定性は、宿主細胞における相同の
必須遺伝子配列の不存在に依存しうる。宿主における遺
伝欠陥は、プラスミドが維持されることを保証する。な
ぜなら、宿主細胞の増殖は必須遺伝子機能の欠除により
起らず又は厳しく制限されるであろうからである。加え
て、プラスミド自体の完全性は、プラスミド担持必須遺
伝子と宿主ゲノム中の対応する座の間の相同性の不存在
に依存するであろう。なぜなら、各プラスミドとゲノム
座の間の組換えは突然変異及びプラスミドの両者の細胞
を治ゆするであろうからである。すなわち、ゲノム必須
遺伝子を不活性化する宿主細胞ゲノム中の突然変異が本
質的に自然であること、即ち欠失が染色体遺伝子のコー
ド領部及び／又はフランキング領域の ＤＮＡ配列から
成ることが好ましい。これが達成されると、組換えによ
るゲノム突然変異の治ゆは、あまり起きなくなる。本発
明のフランキングは、適当な突然変異宿主細胞中に維持
されるとき、予期せぬことに安定である。好ましい宿主
細胞は酵母である；しかし他の真核細胞ならびに原核細
胞も用いうる。酵母細胞の場合、本発明に従うフランキ
ングの安定性は、動原体を含む酵母プラスミドのそれを
さえ越えるようである。環状動原体プラスミドは、酵母
について従来報告された最も安定なプラスミドに含まれ
るが、しかし極端に低いコピー数が欠点である（クラー
ケとカーボン、上述、とスティンクコムら、１９８２、
上述）。線形動原体酵母プラスミドは、プラスミド長に
依存して、不安定であるか低コピー数で依存する（ハー
レイとスゾスタク、上述）。従って、必須遺伝子を担持
するプラスミドの改善された安定性が達成されること
は、予期せぬ利点である。ＰＯＴ１及びＣＤＣ４遺伝子
は、発現ベクター上の選択マーカーとしての必須遺伝子
の利用の二つの例である。これら二つの遺伝子は、複合
培養基上での細胞増殖のために必要な幅広いクラスの遺
伝子に属する。他の必須遺伝子の使用は、複合増殖条件
を含む植物又は動物組織培養株におけるプラスミド選択
を可能にし、また極端には、血、血清、又は生きた動物
又は植物からの液汁から栄養を受ける細胞中でのプラス
ミドの維持を可能にする。本明細書で述べるプラスミド
を用いる実験から得たデータは、ヒトα−１−アンチト
リプシン（ＡＴ）産生が選択マーカーとしてＳ． ポン
ベＰＯＴ１遺伝子の使用によって、従来の栄養要求性選
択マーカーＬＥＵ２を含む類似のプラスミドにより得ら
れるＡＴ産生に比べて二倍にされることを示す。これら
の結果は、ＰＯＴｌ含有プラスミドが、これらがそれか
ら誘導されたところの非ＰＯＴ１プラスミドよりもコピ
ー数において機能的により大きいことを示す。本発明に
従うＤＮＡ構造物すなわち特にプラスミドを作るために
用いられる手法は、慣用の方法を含む。ＤＮＡ構造物に
おいて用いられる必須遺伝子は、もし遺伝子の構造が知
られているなら、ラベルされたＤＮＡプローベを用いて
ライブラリーから分離される、又はＤＮＡライブラリー
のセグメントを普通のベクターに結合し、このベクター
を特定の必須遺伝子において欠陥の突然変異細胞中に形
質転換し、そして補償された株をさがすことによって同
定される。必須遺伝子を含む適当なＤＮＡフラグメント
が同定されると、それは発現されるであろう構造的蛋白
質をコードするＤＮＡ配列を含むベクターに結合され
る。必須遺伝子は、宿主生物内での発現に必要なそれ自
身のプロモーター及び他の対照と共に用いられうる。あ
るいは、必須遺伝子の発現を増す又は減らすために、異
種プロモーターが用いられうる。ＤＮＡフラグメントの
結合の方法は、実施するに十分に記載されており、当業
者にとって十分である。ＤＮＡ構造物の調製後に、それ
は形質転換条件下に宿主生物中に形質転換される。原核
細胞及び真核細胞（組織培養細胞を含め）を形質転換す
るための方法は、文献で知られている。上述したよう
に、宿主生物は、プラスミド上の必須遺伝子の選択のた
めの必須機能において欠陥を持たねばならない。突然変
異宿主株は、通常の寄託機関から入手でき、又は突然変
異化及び適当な突然変異を持つ突然変異体をスクリーニ
ングすることにより野生タイプから慣用の手段により作
られうる。形質転換された宿主は、次に慣用の複合培養
基上での増殖により選択されうる。酵母の場合、ＹＥＰ
Ｄ（１％酵母エキス、２％バクトペプチン及び２％デキ
ストロース）のような慣用の培養基が用いられうる。本
発明に従う必須遺伝子を含む選択マーカーが、ＤＮＡ構
成に適当である場合にはいっでもマーカーとして使用で
き、そして従って本発明に従う必須遺伝子選択マーカー
を含む構造物は多くの用途を持つことが認められよう。
下記の実施例は、そのような用途の例示のための示さ
れ、制限のためではない。別記なき限り、標準分子生物
学的手法が用いられた。酵素は、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ）研究所、ニューイングランドバイオラブズ、及
びボーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）マンハイム
バイオケミカルズから得られ、製造者により指示された
ように又はマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（モレキ
ュラークローニング：Ａ実験室マニュアル、コールド
スプリング ハーバー ラボラトリー，１９８２）によ
り記載されたように用いられた。大腸菌培養物は、マニ
アチスら（上述）に開示されるように塩化カルシウム法
によって形質転換された。酵母培養菌は、ベッグズ（Ｂ
ｅｇｇｓ）の方法を本明細書で述べるように修正して用
いて形質転換された。

実施例 １ 選択マーカーとしてのＳ・ セレビシエ ＣＤＣ４遺伝
子Ａ安定なＣＤＣ４含有プラスミドの構成 酵母ゲノム ライブラリーは、Ｓａｎ３Ａによる酵母Ｄ
ＮＡの部分的消化、蔗糖勾配によりサイズ選択、及びＢ
ａｍＨＩで予め消化された酵母ベクターＹＲｐ７中への
選択されたフラグメントの挿入により構成された（ナス
ミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）とリード（Ｒｅｅｄ）、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７７：２１
１９−２１２３，１９８０）。ＣＤＣ４遺伝子を含む組
換えプラスミドが、酵母株ＧＥＢ５（ＭＡＴＡ ｃｄｃ
４−４ ｌｅｕ２ ｔｒｐ１ ｌｙｓ １ ｕｒａ１）
及びＧＥＢ７（ＭＡＴａ ｃｄｃ ４−３ ｌｅｕ ２
ｔｒｐ１ ｌｙｉ１）をライブラリーによる形質転換に
より分離された。これらの株は、株Ａ３６４Ａｃｄｃ
４−３及びＡ３６４Ａｃｄｃ ４−４（ハートウエル
ら、ジェネティクス７４：２６７−２８６， １９７
５）から、高頓度で形質転換すると知られた株（Ｋ７９
〔ＭＡＴαｌｏｕ２ ｔｒｐ１〕（ナスミスら、ネイチ
ア２８９：２４４−２５０，１９８１：タッチェルら、
セル２７： ２５−３５，１９８１）との交配及び続い
ての高形質転換株（Ｋ７９及びＫ８０〔ＭＡＴａ ｌｏ
ｕ２ ｔｒｐ１ ｌｙｓ１〕）への戻し交配により望む
遺伝的背景（ｌｏｕ２ ｔｒｐ１）でｃｄｃ４−３及び
ｃｄｃ４−４突然変異を得ることによって誘導された。
トリプトファン原栄養性及び制限的温度（３７゜）で増
殖する能力についての形質転換体の選択は、ゲノム中に
組込まれＣＤＣ４座にマップすると判った一つのそのよ
うなプラスミド（ｐＪＹ３５と名付けられた）を同定し
た。自発的プラスミド組込み体は、それらの選択的増殖
利点に基づいて同定された。この生長利点は、元のプラ
スミド上での ＣＤＣ４を結合された遺伝子の存在によ
り、これは高コピー数で存在するとき（すなわちプラス
ミドが宿主ゲノム中に組込まれなかったとき）に細胞増
殖にとって有害である。組込み体において、ＴＲＰ１
プラスミドマーカーは、ＳＵＰＩ１に遺伝子的に結合さ
れることが見られ、これは染色体ＶＩ上のＣＤＣ４に結
合される（モルチマー（Ｍｏｒｔｉｍｅｒ）とシルド
（Ｓｈｉｌｄ），「サッカロミケス セレビシエの遺伝
子マップ」，ストラサーンら編、酵母サッカロミケス
セレビシエ ライフサイクルと遺伝の分子生物学，６４
１−６５１，コールド スプリング ハーバー１９８
１）。ｃｄｃ４−３補償領域は６．４ｋｂＢ ａｍＨＩ
フラグメントとして精製され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて、Ｂａｍ ＨＩで予め開裂されたベクターＹＲｐ７
（ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−１０
３９，１９７９）に結合された。この構造物はｐＪＹ５
１として知られ、第１図に示される。第１図において、
ＣＤＣ４コード領域が下記の方法でフランキング ゲノ
ムＤＮＡ配列から精製された。プラスミドｐＪＹ５１が
Ｈｉｎｄｍで開裂され、ＣＤＣ４領域を含む３．６ｋｂ
フラグメントがバクテリア プラスミドｐＢＲ３２２中
でサブクローンされた。この構造物は、Ｂａｍ ＨＩで
完全に消化され、ＨｉｎｃＩＩで部分的に消化され、約
２．３ｋｂのＣＤＣ４含有フラグメントが精製された。
ＨｉｎｃＩＩフラグメント末端は、リンカー配列（配
列：５′ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３′、コラボラティブリ
サーチから得られた）の付加及び続いて過剰のリンカー
除去のためのＢａｍ ＨＩでの消化によって、Ｂａｍ
ＨＩ末端に転化された。ＣＤＣ４遺伝子の約１．９ｋｂ
を含む得たフラグメントは、プラスミドｐＪＹ７０を作
るためにＹＲｐ７のＢａｍ ＨＩ部位中に挿入された。
このプラスミドは、上述のｃｄｃ４−３突然変異を捕う
ように見えた。この１．９ｋｂフラグメントは ＣＤＣ
４遺伝子の５′−及び３′−コード領域の両者の小さな
部分を欠くが、それは驚ろくことに温度感性欠陥を補
う。たぶん、ＣＤＣ４配列の転写及び翻訳はプラスミド
のｐＢＲ３２２領域中に位置する配列により制御され、
機能的遺伝子生成物の産生を可能にする。プラスミドｐ
ＪＹ７０は酵母ＴＲＰ１及びＡＲＳ１配列を除くための
ＥｃｏＲＩで開裂され、そして再び結合されてｐＢＲ３
２２及びＣＤＣ４配列を含むハイブリッド プラスミド
を与えた。このプラスミドはｐＪＹ７１として知られ、
第１図に示される。１．９ｋｂ酵母配列は、Ｂａｍ Ｈ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｐＪＹ７１から
精製された。このフラグメントは、Ｂａｍ ＨＩとＨｉ
ｎｄＩＩＩでの消化により線形化されたｐＢＲ３２２に
結合されてプラスミドｐＢ４を作った。これは第１図に
示される。ＣＤＣ４領域は、高コパー数酵母ベクター中
への挿入のためにｐＢ４から再び分離された。そのよう
なベクターは、酵母２μプラスミドの複製のオリジン、
及び興味ある外来遺伝子のためのクローニング部位とし
て働く一以上の制限酵素開裂部位を含むであろう。好ま
しくは、そのような部位はプラスミド上のユニーク部位
であろう。好ましいベクターはＭＷ５であり、これは酵
母２μプラスミド複製オリジンとユニークＥｃｏＲＩと
Ｂａｍ ＨＩクローニング部位を含む。第２図におい
て、プラスミドＭＷ５は、プラスミドＹＲｐ７′（ステ
ィンクコムら、ネイチア２８２：３９−４３、１９７
９）から、ＥｃｏＲＩで部分的開裂により平均分子当り
二つのＥｃｏＲＩ部位の一つを開裂することによって誘
導された。線形分子の得た非対末端は、ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて満たされ、得られたプラント末端はＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて再結合された。ＡＲＳ１配列に
近接するＥｃｏＲＩ部位を保持する得たプラスミドを次
に選択した。ＡＲＳ１配列はＰｓｔＩと ＥｃｏＲＩで
の消化により除かれ、酵母２μＤＮＡの複製オリジーン
を含むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａｃ
ｈ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１−１３３，１９
７９）のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントで置き代え
られた。ＭＷ５と呼ばれる得たプラスミドを第２図に示
す。ＣＤＣ４領域は、高コピー数酵母ベクター中への挿
入のためにｐＢ４から再び分離された。そのようなベク
ターは、酵母２ プラスミドの複製のオリジン、及び興
味ある外来遺伝子のためのクローニング部位として働く
一以上の制限酵素開裂部位を含むであろう。好ましく
は、そのような部位はプラスミド上のユニーク部位であ
ろう。好ましいベクターはＭＷ５であり、これは酵母２
ラスミド複製オリジンとユニークＥｃｏＲＩと Ｂａ
ｍ ＨＩクローニング部位を含む。第２図において、プ
ラスミドＭＷ５は、プラスミドＹＲ７′（スティンクコ
ムら、ネイチア２８２：３９−４３、１９７９）から、
ＥｃｏＲＩで部分的開裂により平均分子当り二つのＥｃ
ｏ ＲＩ部位の一つを開裂することによって誘導され
た。線形分子の得た非対末端は、ＤＮＡポリメラーゼを
用いて満たされ、得られたブラント末端はＴ４ ＤＮＡ
リガーゼを用いて再結合された。ＡＲＳ１配列に近接す
るＥｌｌ ＲＩ部位を保持する得たプラスミドをつぎに
選択した。ＡＲＳ１配列はＰｓｔ１とＥｌｌ ＲＩでの
消化により除かれ、酵母２μＤＮＡの複製オリジンを含
むプラスミドＹＥｐ１３（ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）
ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１−１３３，１９７
９）のＰｓｔＲＩフラグメントで置きかえられた。ＭＷ
５と呼ばれる得たプラスミドを第２図に示す最終的なＣ
ＤＣ４含有安定プラスミドを構成するために、ＭＷ５は
ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで開裂された。ＣＤＣ４フラグ
メントは、プラスミドｐＢ４から、プラスミドをＢａｍ
ＨＩとＥｃｏ ＲＩで消化することにより精製された。
Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを用いて二つのフラグメントを結
合し、そのようにして作ったキメラ分子を大腸菌株ＲＲ
Ｉ（ナスミスとリード、上述）中に形質転換し、アンピ
シリン耐性、テトラサイクリン感応性のコロニーについ
て選択した。一つのそのようなコロニーから分離された
プラスミドｐＢ５（第２図に示す）は、酵母２μ複製オ
リジン、ｐＢＲ３２２プラスミド配列、選択マーカーＴ
ＲＰ１、酵母ＣＤＣ４コード配列の１９ｋｂ，及びユニ
ークＥｃｏＲクローニング部位を含む。

Ｂ．宿主ＣＤＣ４遺伝子の崩壊のためのプラスミドの構
成 本発明に従うＣＤＣ４含有プラスミドの、形質転換され
た宿主における安定性は、宿主における機能性ＣＤＣ４
遺伝子の欠損に依存する。プラスミドと染色ＤＮＡの間
の組換えを除くために、宿主ゲノムとＣＤＣ４含有安定
プラスミドの間に相同性が存在しないことが更に望まし
い。適当に除去されたＣＤＣ４座を持つ酵素株を得るた
めに、野性型ＣＤＣ４遺伝子を含む酵母宿主は、崩壊さ
れた“ＣＤＣ４遺伝子”（ロスステイン、上述）を持つ
線形化されたプラスミドフラグメントにより形質転換さ
れうる。線形化されたプラスミドフラグメントは、フラ
グメントの自由末端が ＣＤＣ領域内での組換えを高め
るであろう故に、好ましい形質転換剤である。そのよう
なプラスミドフラグメントは、完全なゲノムＣＤＣ４座
との組換えを促進するためにその求端で完全なＣＤＣ４
フランキング領域を持つであろう。プラスミド フラン
キングのＣＤＣ４フランキング領域の間に挿入された遺
伝子物質は、形質転換された宿主中で選択されうる表型
的特徴（ＴＲＰ１又はＬＥＵ２のような選択マーカー）
をコードするであろう。崩壊するプラスミドは好ましく
はまた、宿主ゲノム中への崩壊されたＣＤＣ４選択マー
カー配列の組込みについて選択するために、複製の酵母
オリジンを欠くであろう。線形化されたプラスミドでの
形質転換に続いて、遺伝子組換えは宿主のゲノム配列の
代りに崩壊された配列の置換を結果する。ＣＤＣ４遺伝
子が今や除去された細胞は次に、崩壊において用いられ
たマーカーに従って選択できる。宿主ゲノムの一段階崩
壊のための方法は、ロスステイン（上述）により記述さ
れている。上述のように、宿主株を完全な安定プラスミ
ドと線形プラスミドによる共形質転換の追加的改善によ
り崩壊が行われて、宿主ゲノムの崩壊の達成に加えて宿
主の安定プラスミドの形質転換もまた行われる。宿主Ｃ
ＤＣ４ 座の崩壊のための好ましいプラスミドは、ｐＢ
１５Ｌであり、第３図に示される。それは、ＣＤＣ４の
フランキング領域とベクターｐＵＣ １３（ビエイラ
（ｖｉｅｉｒａ）とメッシング（ｈｅｓｓｉｎｇ），ジ
ーン１９：２５９−２６８，１９８２，及びメッシン
グ，メセッド イン エンザイモロジー１０１：２０ー
７７，１９８３）の間に挿入された酵母ＬＥＵ２遺伝子
を含む。酵母とベクター配列の結合点で線形化されそし
て適当な酵母宿主株中に形質転換されるとき、プラスミ
ドはＣＤＣ４ 領域のためのＬＥＵ２配列の置換から得
られた宿主ゲノムにおけるＣＤＣ４の欠失を作る。宿主
株において、ロイシン栄養要求性の崩壊された形質転換
体は次に、ロイシン原栄養性に基づいて選択されうる。
プラスミドｐＢ１５Ｌを構成するために、ＣＤＣ４ 遺
伝子及びその５′−及び３′−フランキング領域を含む
６．４ｋｂフラグメントが、ｐＪＹ５１のＢａｍＨＩ消
化物から精製された。このフラグメントは、プラスミド
ｐＢ１４を作るためにＢａｍＨＩ消化されたｐＵＣ１３
中に挿入された。ＣＤＣ４ コード領域の多くが、ｐＢ
１４をＣｌａＩで消化し、ｐＵＣ１３とＣＤＣ４ フラ
ンキング配列を含む比較的大きなフラグメントを精製す
ることにより除去された。フラグメント末端は、ｘｈｏ
Ｉ（Ｂｇｌ ＩＩ）スマートリンカー（ワーシングトン
ダイアゴノスチック（ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｄｉａ
ｇｏｎｏｓｔｉｃ）の付加により修飾され、ＹＥｐ １
３の２．８ｋｂＢｇｌ ＩＩＬＥＵ２フラグメント（ブ
ローチら、ジーン８：１２１−１３３．１９７９）が得
られた粘性末端に結合された。そのように作られたＤＮ
Ａは、大腸菌株ＲＲＩを形質転換するために用いられ
た。形質転換体は、酵母ＬＥＵ２配列が大腸菌宿主中の
ｌｅｕ Ｂ欠陥を補うきで、ロイシン原栄養性に基づい
て選択された。プラスミドｐＢ１５Ｌが、そのような形
質転換された一つのコロニーから精製された。プラスミ
ドｐＢ１５Ｌは、５′及び３′フランキング配列に加え
てＣＤＣ４コード配列の５′末端の僅か約５０塩基対を
含む。プラスミドｐＢ５とｐＢ１５Ｌのマップの比較
は、それらの各々のＣＤＣ４配列の間の相同性の欠除を
示す。なぜならｐＢ１５ＬのＣＤＣ４−ＬＥＵ２遺伝子
融合の結合点がｐＢ５中に存在するＣＤＣフラグメント
の領域の外に位置しているからである。この相同性の欠
除は、ｐＢ５と宿主細胞における崩壊されたＣＤＣ４
座の間の組換えを除く。

Ｃ．Ｓ．セレビシエの共形質転換 同時的に、ゲノムＣＤＣ４ 遺伝子を除去しかつプラス
ミドｐＢ５を導入するために、酵母細胞がＢａｍＨＩ開
裂されたｐＢ１５Ｌと完全なプラスミドｐＢ５により共
形質転換された。形質転換において用いられるべき宿主
株は、プラスミドｐＢ５とゲノムＣＤＣ４ 崩壊の同時
選択のために、トリプトファンとロイシンについて栄養
要求性でなければならない。株Ａ２（ＭＡＴα ｌｅｕ
２−２，１１２ ｈｉｓ ３−１１，１５ ｃａｎ
１；スゾスタク，メソッド インエンザイモロジー１０
１：２４５− ２５２，１９８３）の株ＧＥＢ７（実施
例１Ａ 参照）の交配から得られた株Ａ２．７．ｃ（Ｍ
ＡＴα ｃｄｃ４−３ ｔｒｐ１ ｌｅｕ２−１，１１２
ｌｙｓ１ ｈｉｓ３−１１，１５ ｃａｎ１）が用い
られた。典型的な共形質転換実験において、対数増殖相
のＳ．セレビシエＡ２．７．ｃの培養物の１０ｍｌが、
約６μｇのＢａｍＨＩ消化されたｐＢ１５Ｌ，１μｇｐ
Ｂ５及び担体としての１０μｇ子ウシ胸腺ＤＮＡにより
形質転換された。形質転換条件は、ベッグズ（上述）に
記述された通りである。細胞は、ロイシンとトリプトフ
ァンを欠く培地上に置かれた。それらは、２２゜で一夜
増殖され、３７゜に移された。約３０のコロニーが得ら
れた。ｐＢ５単独での対照の形質転換及びトリプトファ
ン原栄養性についての選択は、約１０００の形質転換体
を作った。六つの共形質転換されたコロニーは、ＣＤＣ
４座の崩壊を検証し、そしてｐＢ５プラスミドの安定性
をテストするために分析された。ゲノムＤＮＡは、アブ
ラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら（コールド スプリング
ハーバー シンポジングクオンタムバイオロジー４７：
９８９−９９８，１９８３）による方法により共形質転
換体から分離され、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化さ
れ、アガロースゲル上で電気泳動され、ニトロセルロー
スに移された（サザーン，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９
８：５０３−５１７，１９７５）。ブロットは、ｐＢ１
５Ｌに存在しｐＢ５に存在しないＣＤＣ４ の５′フラ
ンキング領域からの２．５ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩフラグメントによりプローベされた。第４図は、
プローべが非形質転換細胞からのＤＮＡの６．４ｋｂフ
ラグメントにハイブリッドしたことを示す。（レーン
ｂ）；この６．４ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメント内にＥ
ｃｏＲＩ部位はない。ＬＥＵ２ 配列がＥｃｏＲＩ部位
を含むので、ＣＤＣ４ 座の崩壊はハイブリッド化帯の
サイズの減少を結果する（第４図で矢印で示す）。これ
は、レーンｃ，ｄ．ｆ，ｇ及びｈにおいて示された形質
転換体の場合である。レーンｅは、いく分異るパターン
を示し、ゲノムサイズ帯を保持し、ゲノムＣＤＣ４ の
欠失が起きなかったことを示す。（レーンｃ〜ｈに見ら
れる比較的小さな帯は、レーンａとｂにおける対照のパ
ターンにより示されるように、ゲル精製されたプローベ
の汚染による。）六つの共形質転換体が、複合培地（Ｙ
ＥＰＤ）上で増殖することによりプラスミド安定性をテ
ストされる。細胞は、液状ＹＥＰＤ中で２５゜で３０世
代に亘って増殖され、次にＹＥＰＤ上で２５゜でプレー
トされ、そして３７゜のＹＥＰＤ．トリプトファン欠除
培地及びロイシン欠除培地上にレプリカ プレートされ
た。表１にまとめた結果は、＃３を除く総ての共形質転
換体は、複合培地上でプラスミドマーカーについて１０
０％安定であったことを示す。（分離番号３は、第４図
のレーンｅに示された同じ共形質転換体である。）二つ
の共形質転換体、番号１及び２．についてさらに安定性
テストが実施された。テストは、各々６６３と６８１の
コロニーについて行われた。３０゜でＹＥＰＤ上での３
０世代の増殖後に、総てのコロニーはトリプトファンと
ロイシンに対して原栄養性であった。共形質転換体＃１
は、２２゜で増殖速度をテストされ、非形質転換のＡ
２．７．ｃ対照と同じ速度で増殖することが判った。共
形質転換体＃１は、ＢＥＬＬ１と名付けられた。それ
は、ＡＴＣＣに寄託番号２０６９８として寄託された。

実施例 ２ シゾサッカロミケス ポンベＰＯＴ１遺伝子 Ａ．選択マーカーとしてのＳ．ポンベＰＯＴ１遺伝子 サッカロミケス セレビシエ ＴＰＩ１遺伝子は、トリ
オースホスフェートイソメラーゼ蛋白質をコードし、ｔ
ｐｉ１ 欠陥を補うことにより得られた（カワサキとフ
レンケル，上述；アルバーとカワサキ，上述）。驚くべ
きことに、Ｓ． ポンベ からの相同遺伝子は、同じ
Ｓ．セレビシエｔｐｉ１ 突然変異を補うことにより分
離された。ＰＯＴ１ （ｐｏｍｂ ｔｒｉｏｓｅ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）と名付けられた
Ｓ．ポンベ ＴＰＩ遺伝子は、Ｓａｕ３Ａにより部分的
に消化されベクターＹＥｐ１３中に挿入されたゲノム
Ｓ．ポンベ ＤＮＡを含むところの、ラッセル（Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ）とホール （Ｈａｌｌ），（Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５８；１４３−１４９，１９８３）により
記述されたライブラリーからクローンされた。予備的Ｄ
ＮＡ配列（マキサム（Ｍａｘａｍ）とギルバート（Ｇｉ
ｌｂｅｒｔ）Ｍｅｔｈ，ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
６５；４９７−５５９，１９８０ の方法による）は、
ＰＯＴ１ 遺伝子がＴＰＩ蛋白質をコードし、該蛋白質
は他の生物からのＴＰＩ蛋白質と相同であることを示し
た（アルバーとカワサキ、上述）。このＰＯＴ１ ＤＮ
Ａ配列は、Ｓ．セレビシエ ＴＰＩ１ＤＮＡ配列及び各
蛋白質配列と共に第５図に示される。Ｓ．ポンベ ＰＯ
Ｔ１遺伝子は、Ｓ．セレビシエにおける選択マーカーと
してＳ．セレビシエ ＴＰＩ１ 遺伝子よりも、この実
施例で好まれる。Ｓ．セレビシエにおけるＰＯＴ１ の
ような外来遺伝子は、異る宿主細胞中では良好に機能せ
ず、従って宿主細胞欠陥を補うためにより高いコピー数
を必要とするかも知れない。また酵母プラスミド上の選
択しうるＰＯＴ１ 遺伝子は、同じベタター上の産業上
重要な遺伝子の発現のために内在ＴＰＩ１ プロオータ
ー及びＴＰＩ１ターミネーター（ＰＯＴ１ との相同性
を示さない対照領域）の使用を可能にする。ＰＯＴ１，
及びＴＰＩ１のフランキング領域は相同性を示さないの
で、分子内組換え及び結果としてのプラスミド不安定性
が低減される。最後に、ＰＯＴ１遺伝子はＳ．セレビシ
エ染色体ＤＮＡと組換わらないようである。なぜなら、
それは、ＴＰＩ１配列とＤＮＡレベルで少ししか相同性
を共有せず、ＴＰＩ遺伝子の多くは宿主株において除去
された。すなわち、ＰＯＴ１ 含有プラスミドは、酵母
において産業的に興味ある外来遺伝子の高められた発現
のために望ましい高いコピー数を保持しうる。ＰＯＴ１
遺伝子を含むプラスミドは、Ｓ．セレビシエ株Ｎ５８
７−２Ｄ（カワサキとフレンケル、上述）におけるｔｐ
ｉ１ 突然変異の補償によりラッセルとホール（上述）
のＳ．ポンベ から同定された。このプラスミドｐＰＯ
Ｔの制限地図を第６図に示す。ｐＰＯＴはベクターＹＥ
ｐ１３を含むので、それは本来的に不安定である。なぜ
なら、それは酵母において２μプラスミドの維持のため
に必要な複製機能を欠くからである。従って、ＰＯＴ１
遺伝子は、より有能なベクターたとえばＣ１／１及び完
全な２μプラスミド配列を含む関連ベクター中に動かさ
れうる。プラスミドＣ１／１は、ｐＪＤＢ２４８（ベッ
グズ，ネイチア２７５：１０４−１０９，１９７８）及
びｐＢＲ３２２から本明細書の実施例３に記載されるよ
うに誘導された。それは、酵母２μプラスミドＤＮＡ，
選択しうるＬＥＵ２遺伝子及びｐＢＲ３２２配列の総て
を含む。ＰＯＴ１遺伝子は、約３４００塩基対のＢａｍ
ＨＩ−ＸｂａＩ制限フラグメントとしてｐＰＯＴから分
離され、ｐＵＣ１３の対応するポリソンカー部位中に挿
入された。得たプラスミドは、ｐＵＣＰＯＴであり、そ
の部分的制限地図を第６図に示す。ｐＵＣＰＯＴプラス
ミドは、Ｓ．ポンベとＳ．セレビシエＤＮＡの約１８０
０塩基対を除去するためにＳａ１Ｉで切断され、そして
再リゲートされる。この得たｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１プラ
スミドは、第６図に示される。ＰＯＴ１遺伝子は、以下
の方法でＣ１／１中に入れられた。Ｃ１／１及びｐＵＣ
ＰＯＴ−Ｓａ１の両者は、アンピシリン耐性遺伝子中に
Ｂｇ１Ｉ部位、及びどこか他の位置にユニークＢａｍＨ
Ｉを有すので、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１のＰＯＴ１フラグ
メントは、Ｃ１／１のｐＢＲ３２２領域の一部に置き代
わりうる。Ｃ１／１はＢｇ１Ｉ及びＢａｍＨＩで切断さ
れて、ａｍｐ^ｒ遺伝子の一部、２μＤＮＡの総て、及び
ＬＥＵ２遺伝子を含む約７７００塩基対の大きなフラグ
メントを遊離した。同様に、ｐＵＣＰＯＴ−Ｓａ１はＢ
ｇ１Ｉ及びＢａｍＨＩで切断され、ａｍｐ^ｒ遺伝子の別
の一部及びＰＯＴ１遺伝子を含む約３４００塩基対のフ
ラグメントを遊離した。これら二つのフラグメントをリ
ゲートしてｐＣＰＯＴを形成し、これは回復された選択
しうるａｍｐ^ｒ遺伝子、ＰＯＴ１遺伝子、ＬＲＵ２遺伝
子、総ての２μＤＮＡ、及びｐＵＣ１３からの複製領域
のバクテリアオリジンを含む（ｐＵＣ１３からのバクテ
リアオリジン領域は、ｒＢＲ３２２のオリジン領域が行
うよりもより高いプラスミドコピー数を可能にする）。
ｐＣＰＯＴで形質転換された大腸菌株ＨＢ１０１は、寄
託番号３９６８５としてＡＴＣＣに寄託された。ＰＯＴ
１遺伝子はまた、同様の構成によりＣ１／１誘導ベクタ
ー中に挿入されうる。たとえば、プラスミドｐＦＡＴ５
（第７図）は、Ｃ１／１に挿入されたヒトα−１−アン
チトリプシン（ＡＴ）の産生のための発現ユニットを含
む。この発現ユニットは、実施例４で述べるように作ら
れ、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＴｃＤＮＡ配列、及びＴ
ＰＩ１転写ターミネーターより成る。ｐＦＡＴ５の制限
地図は、第７図に示される。ｐＦＡＴ５は、Ｂｇ１ Ｉ
とＢａｍＨＩにより切断され、ＡＴ遺伝子とＴＰＩ１タ
ーミネーターを含むフラグメント（２２００塩基対）を
遊離した。また、上述したようにＣ１／１Ｂｇ１Ｉ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメントと同一のＢｇ１Ｉ−ＢａｍＨＩフ
ラグメントが遊離される。但し、ｐＦＡＴ５からのフラ
グメントは、ＴＰＩ１プロモーターを含むさらに９００
の塩基対を含む。この後者のｐＦＡＴ５片及びｐＵＣＰ
ＯＴ−Ｓａ１ ３４００ｂｐ Ｂｇ１ Ｉ−Ｂａｍ Ｈ
Ｉフラグメント（上述した）は、プラスミドｐＦＰＯＴ
を形成するためにリゲートされ、これは第７図に示す制
限地図を持つ。ベクターｐＦＡＴ５はユニークＢａｍＨ
Ｉ部位で切断され、２２００塩基対ＡＴ遺伝子及びｐＦ
ＡＴ５からのＴＰＩ１ターミネーターフラグメントの挿
入を可能にする。ｐＦＰＯＴ中への適当な定位の２２０
０ｂｐフラグメントのクローニングは、この酵母ベクタ
ー中のヒトＡＴの発現を許す。適当にリゲートされた生
成物は、ｐＦＡＴＰＯＴと名付けられ、その制限地図を
第７図に与える。

Ｂ 宿主ＴＰＩ 遺伝子の崩壊サッカロミケース セレビシエ ＴＰＩ１ 遺伝子がク
ローンされ、配列決定された（カワサキとフレンケル、
上述、及びアルバートカワサキ、上述）。ＴＰＩ蛋白質
のための構造遺伝子を含むプラスミドｐＴＰＩＣ１０
は、アルバーとカワサキ（上述）に記載されている。Ｂ
ｇ１ＩＩ部位が、ＴＰＩ１ コード領域のＤＮＡ位置２
９５に存在し、もう一つのＢｇ１ ＩＩ部位が５′フラ
ンキング領域において約１２００塩基対離れて位置す
る。これらＢｇ１ ＩＩ部位は、ＴＰＩ１ 遺伝子の一
部を除去するため及び別の遺伝子たとえば酵母ＬＥＵ２
遺伝子を挿入するために慣用のクローニング部位であ
る。そのような構造物は、形質転換された宿主における
ゲノムＴＰＩ１ 座の崩壊を作るために用いられうる。
ＴＰＩ１の５′フランキング領域における約−１８００
は、Ｐｓｔ１部位である。従ってｐＴＰＩＣ１０におい
てＴＰＩ１ 遺伝子が、５′側でＰｓｔ１部位によりそ
して３′側でＳａｌ Ｉ部位（ｔｅｔ^ｒ遺伝子におけ
る）によりフランクされる。ＴＰＩ１を含むこのＰｓｔ
Ｉ−Ｓａｌ Ｉフラグメントが、ＰｓｔＩ及びＳａｌ
Ｉ部位でｐＵＣ１３に挿入されてｐＵＣＴＰ１を作っ
た。ＰｓｔＩ−Ｓａｌ Ｉ挿入物（ｐＵＣ１３への）の
制限マップを、第８図に示す。次にプラスミドにｐＵＣ
ＴＰＩがＢｇｌ ＩＩで切断され、二つのＤＮＡフラグ
メントが電気泳動により分離された。比較的大きなプラ
スミドが精製され、自己結合を防ぐためにホスホァター
ゼ分解された。このＤＮＡのＢｇｌ ＩＩ部位中に酵母
ＬＥＵ２遺伝子がリゲートされ、これはＢｇｌ ＩＩフ
ラグメントとしてプラスミドＹＥｐ １３（ブローチ
ら、ジーン８：１２１−１３３，１９７９）から除去さ
れたものである。得られたプラスミドは、ｐＵＣＴＰＩ
−ＬＥＵ２であり、これはＴＰＩ１の部分的欠失及びＬ
ＥＵ２ の挿入を有する。ｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２を第
８図に示す。プラスミドｐＵＣＴＰＩ−ＬＥＵ２は、Ｄ
ＮＡを線形化するためにＰｓｔ１とＢａｍＨＩで切断さ
れた。次に酵母配列が、電気泳動及びゲル精製によりｐ
ＵＣ１３配列から分離された。第８図に示される酵母Ｄ
ＮＡ部分は、ＴＰＩ１染色体遺伝子（ロスステイン、上
述）を「崩壊する」ために、ＬＥＵ２ について欠陥の
あるＳ． セレビシエ株Ｅ２−７Ｂ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．
２０６８９）を形質転換するために用いられる。ｌｅｕ
^＋形質転換体は、３％グリセロール、１％ラクテート
（ｐＨ７に中和された）、１Ｍソルビトール及びロイシ
ン不含の合成（修正ウィッケラムの）培地（モルチマー
とホーソーン著、ローズとハリソン編、ザイーストｖｏ
ｌ．１、３８５−４６０、アカデミックプレス、１９６
９）上で選択された。形質転換体は、ＹＥＰ−デキスト
ロース上でのその増殖不能によりＴＰＩ欠陥についてス
クリーンされた。初めの ９９のスクリーンされた形質
転換体のうち一つのｔｐｉ⁻性質転換対が見い出され
た。この株は、Ｅ２−７ＢΔｔｐｉ＃２９（以下、Δ
ｔｐｉ ＃２９と云う）と名付けられた。Δｔｐｉ＃２
９は、ＹＥＰ−３％グリセロール−１％ラクテート上で
増殖したが、ＹＥＰ−デキストロース上で増殖しなかっ
た。粗細胞抽出物で酵素評価（クリフトン（ｃｌｉｆｔ
ｏｎ）ら、ジェネティクス ８８：１−１１，１９８
０）か行われ、Δｔｐｉ ＃２９が、検出できるレベル
のトリオースホスファートイソメラーゼ活性を欠くこと
が確認された。Δｔｐｉ ＃２９は、ｔｐｉ⁻欠失につ
いてヘテロ接合性である二倍体を形成するために、他の
酵母株に交配されうる。そのような二培体は、トリロー
ス ホスフェート イソメラーゼについて欠陥的な他の
株が発生されうるように、胞子形成されうる。たとえ
ば、Δｔｐｉ ＃２９は、Ｅ８−１０Ａ（Ｍａｔα ｌ
ｅｕ２）（雑種Ｅ２−７ＢＸＧＫ１００〔ＡＴＣＣ２０
６６９〕の胞子分離体）に交配されて、二培体Ｅ１１を
形成した。この二培体は胞子形成されて、半数体子孫Ｅ
１１−３Ｃを発生した。これは次のゲノタイプを持つ：
Ｍａｔα ｐｅｐ４−３ ｔｐｉ１。Ｅ１１−３ＣがΔ
ｔｐｉ ＃２９に戻し交配されて二培体Ｅ１８を形成し
た。これはｔｐｉ１欠失についてホモ接合性である。Ｅ
１８、アミノ酸要求を持たず、より大きな細胞を持ち、
より速く増殖するので、プラスミドのための宿主株とし
てΔｔｐｉ ＃２９より好ましい。これらｔｐｉ⁻株
は、解糖機能をコードする遺伝物質について欠失してお
り、従って戻らない（すなわち安定な）突然変異体であ
ると考えられる。

Ｃ．Ｓ．セレビシエ ｔｐｉ⁻欠失株へのＰＯＴ１遺伝
子の形質転換 プラスミドｐＦＰＯＴ及びｐＦＡＴＰＯＴが、Δｔｐｉ
＃２９及び関連するｔｐｉ欠失株に形質転換された。
この酵母突然変異体は、３０゜でＹＥＰ−２％ガラクト
ース中で対数相後期まで一夜好気的に増殖された。形質
転換条件は、ベッグズ（上述）により記載された通りで
あったが、但し細胞は、上部寒天にプレートされる前に
ＹＥＰ−デキストロースの代りに１Ｍソルビトールを含
むＹＥＰ−３％グリセロールー１％ラクテート又はＹＥ
Ｐ−２％ガラクトース中で１〜２時間３０゜で回復する
のを許された。上部寒天及びプレートは、１Ｍソルビト
ール及び２％デキストロースを含む合成の、修正ウィッ
カラム培地を含んだ。３０゜で３日後に、形質転換体は
見え、ＹＥＰＤへのレプートのために寒天から取り離さ
れた。その後、形質転換体は、ＹＥＰＤ又はデキストロ
ースを含む他の複合培地上で維持された。ｐＦＡＴＰＯ
Ｔで形質転換された株Ｅ１８は、ＺＹＭ−３と名付けら
れた。それは、寄託番号２０６９９でＡＴＣＣに寄託さ
れた。

複合培地上でのｐＦＰＯＴ及びｐＦＡＴＰＯＴの安定性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からのコ
ロニーを、ＹＥＰＤを含む試験管に接種し、合計１０^９
細胞（約３０分裂）まで増殖を許した。酵母細胞を音波
処理して塊を破壊し、適当倍希釈し、ｔｐｉ⁻細胞（Ｐ
ＯＴ１遺伝子を担持するプラスミドあり又はなし）の増
殖を許すＹＥＰ−２％ガラクトース又はＹＥＰ−２％グ
リセロールー１％ラクテート上にプレートされた。ＹＥ
Ｐ一ガラクトース上で生じたコロニーは次に、プラスミ
ドの欠損についてスクリーンするためにＹＥＰＤ上にレ
プリカプレートされた（すなわち、ＰＯＴ１含有プラス
ミドを失ったｔｐｉ⁻細胞はデキストロース上で増殖し
ないであろう）。表２にまとめた結果は、ｐＦＰＯＴと
ｐＦＡＴＰＯＴプラスミドが、酵母ｔｐｉ⁻欠失株にお
いて安定であることを示す。それらは驚ろくべきこと
に、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安定であ
る動原体を持つプラスミド（これはコピー数が小さい）
は、酵母について報告された最も安定なプラスミドの一
つであり、複合培地での一回の分裂当り約１％の細胞の
確率で一般に失われる（マーレイとスゾスタク、上述、
を動原体プラスミド安定性の総説として参照された
い）。表２に示すように、ここで述べるＰＯＴ１プラス
ミドは、ｔｐｉ⁻欠失株において複合培地での３０回分
裂後に１％未満の確率で失われる。

Ｄ．ＰＯＴ１プラスミドを用いるＳ． セレビシア に
おけるヒトα−１−７ンチトリプシンの発現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高める
ためのＰＯＴ１プラスミドの使用をテストするために、
プラスミドｐＦＡＴＰＯＴ及びｐＦＡＴ５を、各々Ｓ．
セレビシア株Δｔｐｉ ＃２９及びＥ２−７Ｂを形質
転換するために用いた。形質転換された細胞は、デキス
トロースを含むロイシン不含培地で選択された。培養菌
は、３０゜で３〜４のＯ．Ｄ．６００まで増殖された細
胞抽出物を調製し、実施例５記載のようにＡＴについて
評価した。ｐＦＡＴＰＯＴ／Δｔｐｉ ＃２９により作
られたとき４〜６％の合計可溶蛋白質を示した。ｐＦＡ
Ｔ５／Ｅ２−７Ｂにより作られたとき２〜３％の合計可
溶蛋白質を示した。プラスミドコピー数は正確に測定し
平均個体数を表わすことが困難であるが、遺伝子生成物
量の経験的観察は、相対的プラスミドレベルの指標を与
え、発現ユニット（プロモーター、興味の遺伝子、ター
ミネーター）は変わらないことを示す。従ってｐＦＡＴ
ＰＯＴは、これがそれから誘導されたところのｐＦＡＴ
５よりも機能的に数がより大きいようである。二つの形
質転換株は遺伝的にほぼ同一であり（Δｔｐｉ ＃２９
はプラスミドに向けられた突然変異化によりＥ２−７Ｂ
から誘導された）、同じ条件下で増殖されたので、これ
らの結果は従来記載されるベクターを上向る本明細書記
載の安定なプラスミド発現系の値を示す。

実施例 ３ プラスミドＣ１／１の調整 Ｃ１／１が、プラスミドｐＪＤＢ２４８（ベッグズ、
Ｊ．，ネイチア２７５、１０４−１０９、１９７８）か
ら作られた。ｐＭＢ９配列が、ＥｃｏＲＩによる部分的
消化によってｐＪＤＢ２４８から除かれ、ＥｃｏＲＩで
切断されたｐＢＲ３２２ＤＮＡにより置代えられた。Ｃ
１／１の制限地図を第６図に示す。Ｃ１／１プラスミド
は、ＥｃｏＲＩ部位でのｐＢＲ３２２挿入を伴い、酵母
（Ｓ．セレビシエ）からの全２μＤＮＡを含む。それは
また、ＬＥＵ２ 遺伝子を含む。

実施例 ４ プラスミドｐＦＡＴ５の調整 ヒトα−１−アンチトリプシン（ＡＴ）の主な形をコー
ドする遺伝子が、ＤＮＡハイプリダイゼーションプロー
べとしてヒヒ配列を用いる慣用の方法によりヒト肝臓ｃ
ＤＮＡライブラリーから分離された（クラチら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６８２
６−６８３０、１９８０；及びチャンドラら、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１０３：
７５１−７５８、１９８１）。このライブラリーは、ヒ
ト肝臓ｃＤＮＡをプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部
位に挿入することにより構造された（ボリバーら、ジー
ン２：９５−１１３．１９７７）。ＡＴ遺伝子は、１５
００塩基体（ｂｐ） ＰｓｔＩフラグメントとしてライ
ブラリーから分離された。このフラグメントは、プラス
ミドｐＵＣα１を作るために、ｐＵＣ１３のＰｓｔＩ部
位に挿入された。ｐＵＣα１において、ＡＴ配列は、ポ
リリンカーにおいてＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位により
３′末端でフランクされた。ＴＰＩターミネーターが、
約７００ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとし
てプラスミドｐＦＧ１（アルバーとカワサキ、上述）か
ら精製され、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで開裂されたｐＵＣ
α１中に挿入された。この構造物は次に、ＥｃｏＲＩで
切断され、オリゴヌクレオチド リンカー（配列：ＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡＣＣＴＣＣＴＡＧ）が多重
リンクされたコピーで付加されて、ＴＰＩターミネータ
ーの３′末端にＢａｍＨＩ部位を与える。得たプラスミ
ドはＢＡＴ５として知られる。ＴＰＩプロモーターフラ
グメントがプラスミドｐＴＰｌＣ１０（アルバーとカワ
サキ、上述）から得られた。このプラスミドは、ユニー
クＫｐｎＩ部位で切断され、ＴＰＩコード領域をＢａ１
３１エキソヌクレアーゼにより除去し、ＥｃｏＲＩリン
カー（配列：ＧＧＡＡＴＴＣＣ）がプロモーターの３′
末端に付加された。ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩでの消化
は、ＢｇｌＩＩ及びＥｃｏＲＩ粘性末端を持つＴＰＩプ
ロモーターフラグメントを与えた。このフラグメントは
次に、ＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断したプラスミドＹ
Ｒｐ７′（スティンクコムら、ネイチア２８２：３９−
４３、１９７９）に結合された。得たプラスミドＴＥ３
２を、テトラサイクリン耐性遺伝子の一部を除去するた
めにＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで開裂した。線形化された
プラスミドは次に、プラスミドＴＥＡ３２を作るため
に、上述のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩリンカー付加により
再線形化された。次にＴＥＡ３２は、ＢｇｌＩＩとＢａ
ｍＨＩで開裂され、ＴＰＩプロモーターは約９００ｂｐ
のフラグメントとして精製された。プラスミドｐＦＡＴ
５を構造するために、プラスミドＣ１／１をＢａｍＨＩ
で線形化し、ＴＥＡ３２からの９００ｂｐＴＰＩプロモ
ーターフラグメントに結合した。プラスミドＦとして知
られる得た構造物は、ＴＰＩプロモーターの３′末端に
位置するユニークＢａｍＨＩ部位を持つ。このプラスミ
ドはＢａｍＨＩで切断され、ＡＴコード領域とＴＰＩタ
ーミネーターを含む２２００ｂｐＢａｍＨＩフラグメン
トがＢＡＴ５から精製され、ＢａｍＨＩ部位中に挿入さ
れた。ｐＦＡＴ５として知られる得たプラスミドは、第
７図に示される。

実施例 ５ α−１−アンチトリプシンについての評価 対照として、１００μｇ／ｍｌトリプシン溶液の１０μ
ｌ（１μｇ）、ウシ血清アルプミンの１００μｇ（１０
０μｌ）及び１ｍＭベンゾイルアルギニフイル−ｐ−ニ
トロアニリドを含むｐＨ８．０の緩衝液０．０５Ｍ Ｔ
ＲＩＳの１００μｌを混合し、４０５ｎｍでの吸光度の
増加を分光光度計で経時測定した。この溶液の吸光度値
は、１００％トリプシン活性の標準として用いられた。
総ての評価されだサンプルは、同じ濃度の基質及びウシ
血清アルブミンを含む。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＢ４の構造を示す。 第２図は、プラスミドｐＢ５の構造を示す。 第３図は、プラスミドｐＢ１５Ｌの構造を示す。 第４図は、プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌで共形質転
換されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ａ
２．７．ｃからのＤＮＡのサザーンブロフトを示す。 第５図は、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．
セレビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された
蛋白質配列とともに示す。 第６図は、プラスミドｐＣＰＯＴの構造を示す。 第７図は、プラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構造を示す。 第８図は、プラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構造を示
す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年６月３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】変更

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＢ４の構造を示す。

【図２】プラスミドｐＢ５の構造を示す。

【図３】プラスミドｐＢ１５Ｌの構造を示す。

【図４】プラスミドｐＢ５及びｐＢ１５Ｌで共形質転換
されたＳ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ａ
２．７．ｃからのＤＮＡのサザーンブロットを示す。

【図５】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図６】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図７】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図８】Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ＰＯＴ１及びＳ．セ
レビシエＴＰＩ１遺伝子の配列を、各々の推定された蛋
白質配列とともに示す。

【図９】プラスミドｐＣＰＯＴの構造を示す。

【図１０】プラスミドｐＦＡＴＰＯＴの構造を示す。

【図１１】プラスミドｐＴＰＩ−ＬＥＵ２の構造を示
す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【図５】

【図１】

【図２】

【図３】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/15 // Ｃ１２Ｎ 9/99 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 グレン カワサキ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト シックスティーンス アベニュー 1547 (72)発明者 レスリー ベル アメリカ合衆国 ワシントン州 98102 イースト シアトル ボイアー アベニュ ー 2518

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 宿主細胞における欠陥を補う遺伝子を含
   むＤＮＡ構造物において、該欠陥が複合培養基での正常
   細胞増殖のために必要な機能にあり、ＤＮＡ配列がα−
   １−アンチトリプシンをコードするＤＮＡ構造物。
2. 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡ構造物を含む形質
   転換体株。