JPH0775551B2 - アルフア−１−アンチトリプシンの発現のための安定なｄｎａ構造物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 組換えDNA技術を利用する有用なポリペプチド生成物の
生産のための微生物の使用は、工業として確立されてい
る。外来遺伝子物質が微生物の培養菌中に導入されるこ
とが出来、適当な細胞内及び細胞外条件を与えると望む
生成物が外来遺伝子から合成されうる。そのような遺伝
子物質は一般に、プラスミドの形で微生物中に導入さ
れ、これは自律的に複製する染色体外要素である。形質
転換された細胞培養物内にプラスミドを維持することを
保証するために、これら細胞を特別の条件下で成育する
ことが必要であった。そのような条件の欠除のもとで
は、本質的に不安定であろうプラスミドは維持されず、
細胞群は形質転換されていない状態に戻るであろう。

プラスミド安定性の増大及びコピー数の増大は、プラス
ミドでコードされる蛋白質の生産を常に高いレベルに維
持する手段として生物技術工業にとって重要である。プ
ラスミド安定性を増すための従来報告された試みは、産
業的利用のために最適であるとは見えない。安定性を高
めながらARS含有プラスミド中に酵母動原体を導入する
ことは、プラスミドコピー数を著しく低減することが判
っている（クラーケ（clarke）とカーボン（carbon），
ネイチア（Nature），287:504−509,1980,及びスティン
クコム（Stinchcomb）ら、ジャーナル オブ モレキュ
ラー バイオロジー（J.Molec.Biol.）,158:157−179,1
982）。線形動原体酵母プラスミドは同様に、安定性と
コピー数と間の逆比例関係を示す（マリー（Murry）と
スゾスタク（Szostak），ネイチア，305:189−193,198
3）。

プラスミドは典型的には、選択マーカーとて知られてい
る遺伝子配列を含み、これは宿主細胞の抗生物質耐性又
は補助栄養要求をコードする。そのようなプラスミドの
存在について選択するために、形質転換された細胞は、
選択剤を含む又は特定の栄養素を除かれた特別の培養基
で生育されなければならない。これら培養基要件は高価
であり、かつ大規模醗酵プロセスの間の最適細胞生長速
度を禁止する。そのようなプラスミドの多くが、文献に
報告されている。抗生物質耐性遺伝子を含むこれらとし
ては、pBR322（ボリバー（Bolivar）ら、ジーン（Gen
e）２:95−113,1977）及びその誘導体たとえばpUCベク
ター（ビエイラ（Vieira）とメッシング（Messing），
ジーン，19:259−268,1982）（これはアンピシリン耐性
を持つ）及びpBR325（プレントキ（Prntki）ら、ジー
ン，14:289,1981）（これはアンピシリン，テトラサイ
クリン及びクロラムフェニコールに対る耐性遺伝子を持
つ）が挙げられる。宿主栄養要求を補うプラスミドとし
ては、酵母ベクターYEp13（ブローチ（Broach）ら、ジ
ーン，８:121−133,1979）（これはLEU2遺伝子を持
つ）、及びYRp7′（スティンクコムら、ネイチア，282:
39,1979）（これはTRP1遺伝子を持つ）が挙げられる。

アルファ−１−アンチトリプシンは、プロテアーゼイン
ヒビターであり、その主な機能は幅広いスペクトルのプ
ロテアーゼであるエラスターゼを抑制することである。
哺乳動物の肺組織は、エラスターゼによる攻撃に特に弱
く、従ってα−１−アンチトリプシンを欠損又は不活性
化は肺組織弾性の喪失及び従って気腫を結果しうる。α
−１−アンチトリプシン活性の損失又は減少は、タバコ
の煙を含む環境汚染物によるα−１−アンチトリプシン
の酸化の結果である。α−１−アンチトリプシンの欠損
は、いくつかの遺伝的欠陥の一つから起りうる。ガデッ
ク（Gadek），ジエームス（Jame）E.及びR.D.クリスタ
ル（Crystal），「α−１−アンチトリプシン欠損」，
遺伝病の代謝的基礎、スタンブリー（Stanbury）,J.B.
ら編、マグロウーヒル，ニューヨーク（1982）,pp1450
−1467;及びキャロル（Garroll）ら，ネイチア，2988,3
29−334（1982）参照。

従って、α−１−アンチトリプシンをコードするDNA配
列、及び選択マーカーとして、その生成物が複合培養基
上で宿主細胞の生育性又は正常増殖のために必須である
ところの遺伝子配列を含むDNA構造物を提供することが
本発明の目的である。

本発明の別の目的は、複合媒体上での増殖により選択で
きかつα−１−アンチトリプシンを発現しうるプラスミ
ドを含む微生物の形質転換株を提供することである。

さらに本発明の別の目的は、必須機能において欠陥を持
ち、これら欠陥的必須機能を補いかつα−１−アンチト
リプシンを発現できる遺伝子配列を持つDNA構造物のた
めの宿主として働きうる微生物株を提供することであ
る。

本発明の別の目的は、形質転換微生物中でα−１−アン
チトリプシンを作る方法において、α−１−アンチトリ
プシンが、選択マーカーとして宿主微生物における必須
遺伝子の欠陥を補う遺伝子配列を含むDNA構造物上に含
まれる遺伝子の生成物である方法を提供することであ
る。

本発明の別の目的は、当業者にとって明らかであろう。

本発明のまとめ 本発明に従い、α−１−アンチトリプシンを発現できか
つ特別の選択培養基を要せずに高いコピー数で維持され
るDNA構造物及び適当な宿主細胞が提供される。そのよ
うな条件における増殖は、より速い増殖、より大きい細
胞密度及び低減された生産コストをもたらす。

本発明は更に、複合培養基での正常細胞増殖のために必
要な機能における欠陥を持つ宿主細胞においてα−１−
アンチトリプシンを作る方法であって、この欠陥を補う
遺伝子及びα−１−アンチトリプシンをコードする配列
を含むDNA分子により宿主細胞を形質転換の段階を含む
方法を提供することである。

本明細書において、DNA構造物という言葉は、分子中の
ヌクレオチド配列が自然に作られた配列と同じでないよ
うに人により修飾された任意のDNA分子を意味する。DNA
構造物という言葉はまた、そのように修飾されたDNA分
子のクローンをも包含する。発現ベクターという言葉
は、複製の自律部位、転写開始部位及び宿主生物におい
て発現されるべき蛋白質をコードする少くとも一つの構
造的遺伝子を含むDNA構造物として定義される。発現ベ
クターはまた通常、宿主生物における蛋白質の発現を制
御するプロモーター及びターミネーターのような適当な
制御領域をも含むであろう。本発明に従う発現ベクター
はまた、本明細書で述べる必須遺伝子を含む選択マーカ
ーをも含むであろう。

プラスミドという言葉は、その普通に用いられる意味、
すなわち自律的に複製し、通常閉じたループのDNAを意
味する。

添付した図面において： 第１図は、プラスミドpB4の構造を示す。

第２図は、プラスミドpB5の構造を示す。

第３図は、プラスミドpB15Lの構造を示す。

第４図は、プラスミドpB5及びpB15Lで共形質転換された
S.セレビシエ（cerevisiae）株A2.7.CからのDNAのサザ
ーンブロットを示す。このブロットは、ゲノムCDC4座の
崩壊についてテストするためにCDC4の５′フランキング
領域からの2.5kb Bam HI−Hind IIIフラグメントでプ
ローブされた。レーンａは、pB5単独で形質転換された
細胞からのDNAを含む；レーンｂは形質転換されてない
細胞：レーンｃ〜ｈは共形質転換体を含む。矢印は、プ
ローブにハイブリットするゲノムフラグメントを示す。

第５図は、S.ポンベ（pombe）POT1及びS.セレビシエTPI
1遺伝子の配列を、各々の推定された蛋白質配列ととも
に示す。S.ポンベTPI蛋白質配列の全体が与えられる。
S.セレビシエ蛋白質の配列は、それがS.ポムベ配列と異
る個所のみ示される。S.セレビシエ蛋白質配列における
位置１におけるメチオニンは、天然蛋白質には存在しな
い。

第６図は、プラスミドpCPOTの構造を示す。

第７図は、プラスミドpFATPOTの構造を示す。

第８図は、プラスミドpTPI−LEU2の構造を示す。

詳細な説明 本発明は、必須遺伝子がα−１−アンチトリプシンを発
現できるプラスミドのようなDNA構造物上の選択マーカ
ーとして用いられうるという発見に部分的に基づく。必
須遺伝子という言葉は、複合培養基での細胞生育又は正
常増殖のために必要な機能をコードする任意の遺伝子と
定義される。複合培養基は、その中において栄養素が、
組成が良く定義されない生成物たとえば粗細胞エキス、
肉エキス、果汁、血清、蛋白質加水分解物などから導か
れる培養基である。従って、本発明に従う望む形質転換
体を選択するために、選択増殖培養基は単に慣用の複合
増殖養基であり、非形質転換宿主細胞に致命的な比較的
高価な抗生物質、金属拮抗剤、又は他の剤を含む、又は
非形質転換宿主に必要な一以上の特定の栄養素を欠く特
別の培養基ではない。必須遺伝子としては、細胞分割、
膜生合成、細胞壁生合成、細胞小器官生合成、蛋白質合
成、炭素源利用、RNA転写及びDNA複製のために必要な遺
伝子を包含するがこれらに限定されない。

DNA構造物たとえばプラスミド上の選択マーカーとして
必須遺伝子を用いるために、適当な突然変異宿主細胞株
を提供することが必須である。ロスステイン（Rothstei
n）の一段階遺伝子崩壊法（Meth.in Enzymology 101:
202−210,1983）又は本明細書で述べる共形質転換手順
を用いて、ゲノムにおいて適当な必須遺伝子を欠失を有
する適当な宿主株が構成されうる。そのような欠失突然
変異体は、突然変異がプラスミドに担持される遺伝子物
質によりコードされる機能によって補われるときに増殖
する。宿主のゲノムの必須遺伝子（単数又は複数）にお
ける欠失は、コード領域及び／又はフランキング領域の
主要なセグメントを含むことが好ましい。必須遺伝子に
おける突然変異が点突然変異のみにより達成される様式
で行われるなら、突然宿主細胞が突然変異又は組換修復
メカニズムによって野性種に戻り、それによりプラスミ
ド担持遺伝子の使用により達成されうる選択性を低減又
は除去することがありうる。

必須遺伝子は、多重コピー（たとえばヒストン又はリボ
ソームRNA遺伝子）中に及び／又は遺伝子ファミリーと
呼ばれる多重の関連した形（たとえば種々のヘキソキナ
ーゼ遺伝子、又は種々のDNAポリメラーゼ遺伝子）中に
しばしば存する。そのような場合、これら重複した機能
は、所定の必須機能について多重に欠陥のある宿主細胞
を作るために次々と突然変異されうる。しかし、遺伝子
の活性を増すために高コピー数プラスミドを用いること
によって、プラスミド上の単一の必須遺伝子が多重の宿
主細胞欠陥を補いうる。高コピー数プラスミドは、クロ
ーニングされた外来遺伝子のコピー数の増加がこの遺伝
子によりコードされる蛋白質生成物の産生の増加を結果
するので望ましい。

必須遺伝子を持つプラスミドの高コピー数を含む形失転
換体の選択は、各プラスミド担持必須遺伝子の発現レベ
ルを低下させることにより及び／又はプラスミド担持選
択マーカーによりコードされる遺伝子生成物の活性を低
下させることにより達成されうる。一つのアプローチ
は、必須遺伝子を突然変異して、遺伝子の転写及び／又
は翻訳速度が低減される又は遺伝子生成物がより低い特
異的活動を持つよう変えられることである。選択マーカ
ーとして用いられる必須遺伝子の発現レベルを下げるた
めの別の方法は、宿主細胞における欠陥を補うために別
の生物からの遺伝子を用いることである。そのような外
来遺伝子は、宿主細胞における発現について自然に欠陥
的でありうる。なぜなら転写及び／又は翻訳のためのシ
グナルは別の種において最適より低いであろうからであ
る。又は遺伝子生成物は低減した活性又は安定性を持つ
かも知れない。なぜならそれは異質の細胞環境にあるか
らである。

複合培養基における細胞生育又は正常増殖のために必要
な幅広い範囲の機能が存在する。必要遺伝子における欠
陥又は欠失は、致死、細胞分割の速度の低下、細胞分割
の終止、DNA、RNA又は蛋白合成の停止、膜合成の停止、
細胞壁合成の停止、細胞小器官合成の停止、蔗糖代謝に
おける欠陥などを結果しうる。必須遺伝子の例として
は、酵母サッカロミケス セレビシエのCDC（細胞分割
サイクル）遺伝子（プリングル（Pringle）とハートウ
ェル（Hartwell），「サッカロミケス セレビシエ細胞
サイクル」ストラサーン（Strathern）ら編の酵母サッ
カロミケス ライフサイクル及び遺伝の分子生物学、57
−142中、コールド スプリング ハーバー（Cold Spr
ing Harbor）,1981）,S.セレビシエ及びエシェリヒア
コリ 解糖経路の機能をコードする遺伝子、及びS.セ
レビシエのSEC（ノビック（Novick）とシェクマン（Sch
ekman），プロシージングズ オブ ナショナルアカデ
ミー オブ サイエンスUSA（Proc.Nat.Acad.Sic.USA）
76:1856−1862,1979、及びノビックら、セル（Cell）2
1:205−215,1980）及びINO（カルバートソン（Culberts
on）とヘンリー（Henry），ジェネティクス（Genetic
s）80:23−40,1975）遺伝子が挙げられる。

必須遺伝子欠陥の宿主細胞の一つの好ましいクラスは、
cdc突然変異として知られるCDC遺伝子における欠陥を含
み、これは細胞分割サイクルの段階特異的阻止をもたら
す。多くのcdc突然変異は、特定のCDC遺伝子生成物の合
成又は機能に影響することによって、細胞サイクルに必
須の事象の完全な妨害を起す。そのような突然変異は、
生化学的に又は形態学的に観察されうる事象に対する効
果によって同定されうる。多くの既知のcdc突然変異
は、環境条件的致死性（すなわち温度敏感な）突然変異
であり、これは制限的条件下で増殖された突然変異細胞
の正常な成長の終止を結果する。しかし、cdc突然変異
から生じた主な欠陥は、階段特異的機能における欠陥自
体である必要はない。たとえば、連続的に合成された遺
伝子生成物は段階特異的機能を持ちうる；酵母解糖遺伝
子PYK1における（酵素ピルベートキナーゼに対する）欠
陥が細胞分割サイクル突然変異cdc19（カワサキ，博士
論文，ワシントン大学,1979）に対して対立的である。
この突然変異は、典型的酵母複合培養基YEPD（１％酵母
エキス、２％バクトペプトン、及び２％デキストロー
ス）中でインキュベートされた細胞のG1相における細胞
サイクル停止を結果する。すなわち、cdc突然変異が段
階特異的機能における欠陥を結果するか又はそれが段階
特異的機能を持つ遺伝子生成物の抑制又は不能化突然変
異を起すかに拘らず、欠陥の効果は、モニターされう
る。

プリングルとハートウエル（上述）は、いくつかの51CD
C遺伝子の機能を記述している。本発明を実施するに用
いるために、そのような遺伝子は、望む突然変異を持つ
株における補償によって遺伝子ライブラリーから分離さ
れうる。遺伝子ライブラリーは、公知の手順に構成され
うる（たとえばナスミス（Nasmyth）とリード（Reed）,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:2119−2123,1980:及びナス
ミスとタチェル（Tatchell），セル19:753−764,198
0）。望むcdc突然変異を持つ株は、本明細書で述べられ
るように作られ、又は公共的に入手できる寄託機関たと
えばATCC及びバークレー イースト ストック センタ
ーから入手できる。

必須遺伝子の第二の好ましいクラスは、解糖経路に関係
する生成物をコードするものであり、代謝酵素及び調節
機能をコードする遺伝子を包含する。同定されたS.セレ
ビシエにおける解糖経路遺伝子の例は、解糖調節遺伝子
GCR1及び酵素トリオース ホスフェート イソメラー
ゼ，ヘキソキナーゼ1,ヘキソナーゼ2,ホフホグルコース
イソメラーゼ，ホスホグリセラートキナーゼ，ホスホ
フラクトキナーゼ，エノラーゼ，フラクトース1,6−ビ
スホスフェート デハイドロゲナーゼ，及びグリセ ラ
ルデヒド３−ホスフェート デハイドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子である。上述したように、ピルベート キ
ナーゼ遺伝子は、カワサキにより同定され、記述され
た。酵母ホスホ グリセラートキナーゼ遺伝子を含み、
調節シグナルを伴うプラスミドは、ヒッツェマン（Hitz
eman）ら、（ジャーナル オブ バイオロジィー アン
ド ケミストリー（J.Biol.Chem.）225:12073−12080,1
980）により記述された。酵母トリオース ホスフェー
トの分離及び配列決定は、アルバー（Alber）とカワサ
キ（ジャーナル オブ モレキュラー アンド アプラ
イド ジェネティクス）（J.Mol.Appl.Genet.）1:419−
434,1982）及びカワサキとフレンケル（Fraenkel）（バ
イオケム バイオフィズ リス コム（Biochem.Biophy
s.Res.Comm.）108:1107−1112,1982）により記述され
る。

特に好ましい解糖遺伝子は、TPI1であり、これは、グリ
セラルヒド−３−ホスフェート及びジヒドロキシアセト
ン−３−ホスフェートの相互転化を触媒し従って解糖及
びグリコネオゲネシスのために必須の酵素、酵母トリオ
ース ホスフェト イソメラーゼをコードする。S.セレ
ビシエにおいて、第一遺伝子座TPI1は、この機能を暗号
する。TPI1における突然変異を有する細胞は、グルコー
ス上で増殖せず、他の炭素源上で少ししか増殖しない。

S.セレビシエ TPI1遺伝子は、tpi1突然変異の補償によ
り分離された（アルバーとカワサキ（上述）、及びカワ
サキとフレンケル（上述））。分裂酵母シゾサッカロミ
ケス ホンベからのトリオース ホスフェート イソメ
ラーゼ遺伝子（POT1）が同じS.セレビシエ突然変異の補
償により分離され、第５図に示すように配列決定され
た。POT1と名付けられたS.ポンベ遺伝子の配列は、S.ポ
ンベTPI蛋白質がS.セレビシエのTPI蛋白質と相同である
ことを示した。

通常の場合、DNA構造物（プラスミド）において用いら
れる必須遺伝子は宿主種からの野生タイプ遺伝子であろ
うが、ある場合には宿主細胞にとって外来の必須遺伝子
を用いることが好ましい。なぜなら外来遺伝子は自然に
欠陥的であり、それによって高プラスミドコピー数に対
して選択可能であるからである。用いられるそのような
外来必須遺伝子の例として、ここでの例の一つは、S.ポ
ンベ POT1遺伝子がS.セレビシエ宿主における選択マー
カーとして有効に用いられることを示す。

選択マーカーとして必須遺伝子を含む本発明に従うDNA
構造物は、必須遺伝子の機能において欠陥のある突然変
異宿主細胞中に形質転換されよう。適当に当然変異され
た宿主細胞が作られなければならないか、又は公共寄託
機関から容易に入手できる。適当な突然変異体を得るた
めに野生タイプの細胞の突然変異化は、慣用の方法で達
成されうる。たとえば、野生タイプ細胞が、慣用の突然
変異化剤たとえばエタン メチルスルホネートにより処
理され、補償が起るコロニーを同定するために必須遺伝
子を含むプラスミドで形質転換される。あるいは、ゲノ
ムが崩壊されて、特定の突然変異を作る（ロススティ
ン、上述）。

宿主細胞中に必須遺伝子を含むプラスミドの安定性は、
宿主細胞における相同の必須遺伝子配列の不存在に依存
しうる。宿主における遺伝欠陥は、プラスミドが維持さ
れることを保証する。なぜなら、宿主細胞の増殖は必須
遺伝子機能の欠除により起らず又は厳しく制限されるで
あろうからである。加えて、プラスミド自体の完全性
は、プラスミド担持必須遺伝子と宿主ゲノム中の対応す
る座の間の相同性の不存在に依存するであろう。なぜな
ら、各プラスミドとゲノム座の間の組換えは突然変異及
びプラスミドの両者の細胞を治ゆするであろうからであ
る。すなわち、ゲノム必須遺伝子を不活性化する宿主細
胞ゲノム中の突然変異が本質的に自然であること、即ち
欠失が染色体遺伝子のコード領部及び／又はフランキン
グ領域のDNA配列から成ることが好ましい。これが達成
されると、組換えによるゲノム突然変異の治ゆは、あま
り起きなくなる。

本発明のフランキングは、適当な突然変異宿主細胞中に
維持されるとき、予期せぬことに安定である。好ましい
宿主細胞は酵母である；しかし他の真核細胞ならびに原
核細胞も用いうる。酵母細胞の場合、本発明に従うフラ
ンキングの安定性は、動原体を含む酵母プラスミドのそ
れをさえ越えるようである。環状動原体プラスミドは、
酵母について従来報告された最も安定なプラスミドに含
まれるが、しかし極端に低いコピー数が欠点である（ク
ラーケとカーボン、上述、とスティンクコムら、1982、
上述）。線形動原体酵母プラスミドは、プラスミド長に
依存して、不安定であるか低コピー数で依存する（ハー
レイとスゾスタク、上述）。従って、必須遺伝子を担持
するプラスミドの改善された安定性が達成されること
は、予期せぬ利点である。

POT1及びCDC4遺伝子は、発現ベクター上の選択マーカー
としての必須遺伝子の利用の二つの例である。これら二
つの遺伝子は、複合培養基上での細胞増殖のために必要
な幅広いクラスの遺伝子に属する。他の必須遺伝子の使
用は、複合増殖条件を含む植物又は動物組織培養株にお
けるプラスミド選択を可能にし、また極端には、血、血
清、又は生きた動物又は植物からの液汁から栄養を受け
る細胞中でのプラスミドの維持を可能にする。

本明細書で述べるプラスミドを用いる実験から得たデー
タは、ヒトα−１−アンチトリプシン（AT）産生が選択
マーカーとしてS.ポンベPOT1遺伝子の使用によって、従
来の栄養要求性選択マーカーLEU2を含む類似のプラスミ
ドにより得られるAT産生に比べて二倍にされることを示
す。これらの結果は、POT1含有プラスミドが、これらが
それから誘導されたところの非POT1プラスミドよりもコ
ピー数において機能的により大きいことを示す。

本発明に従うDNA構造物すなわち特にプラスミドを作る
ために用いられる手法は、慣用の方法を含む。DNA構造
物において用いられる必須遺伝子は、もし遺伝子の構造
が知られているなら、ラベルされたDNAプローベを用い
てライブラリーから分離される、又はDNAライブラリー
のセグメントを普通のベクターに結合し、このベクター
を特定の必須遺伝子において欠陥の突然変異細胞中に形
質転換し、そして補償された株をさがすことによって同
定される。必須遺伝子を含む適当なDNAフラグメントが
同定されると、それは発現されるであろう構造的蛋白質
をコードする。

DNA配列を含むベクターに結合される。必須遺伝子は、
宿主生物内での発現に必要なそれ自身のプロモーター及
び他の対照と共に用いられうる。あるいは、必須遺伝子
の発現を増す又は減らすために、異種プロモーターが用
いられうる。DNAフラグメントの結合の方法は、実施す
るに十分に記載されており、当業者にとって十分であ
る。

DNA構造物の調製後に、それは形質転換条件下に宿主生
物中に形質転換される。原核細胞及び真核細胞（組織培
養細胞を含め）を形質転換するための方法は、文献で知
られている。

上述したように、宿主生物は、プラスミド上の必須遺伝
子の選択のための必須機能において欠陥を持たねばなら
ない。突然変異宿主株は、通常の寄託機関から入手で
き、又は突然変異化及び適当な突然変異を持つ突然変異
体をスクリーニングすることにより野生タイプから慣用
の手段により作られうる。

形質転換された宿主は、次に慣用の複合培養基上での増
殖により選択されうる。酵母の場合、YEPD（１％酵母エ
キス、２％バクトペプチン及び２％デキストロース）の
ような慣用の培養基が用いられうる。本発明に従う必須
遺伝子を含む選択マーカーが、DNA構成に適当である場
合にはいっでもマーカーとして使用でき、そして従って
本発明に従う必須遺伝子選択マーカーを含む構造物は多
くの用途を持つことが認められよう。下記の実施例は、
そのような用途の例示のための示され、制限のためでは
ない。

別記なき限り、標準分子生物学的手法が用いられた。酵
素は、ベセスダ（Bethesda）研究所、ニューイングラン
ドバイオラブズ、及びボーリンガー（Boehrnger）マン
ハイム バイオケミカルズから得られ、製造者により指
示されたように又はマニアチス（Maniatis）ら（モレキ
ュラークローニング:A実験室マニュアル、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー,1982）により記載
されたように用いられた。大腸菌培養物は、マニアチス
ら（上述）に開示されるように塩化カルシウム法によっ
て形質転換された。酵母培養菌は、ベッグズ（Beggs）
の方法を本明細書で述べるように修正して用いて形質転
換された。

実施例 １ 選択マーカーとしてのS.セレビシエ DCD4遺伝子Ａ安定
なCDC4含有プラスミドの構成 酵母ゲノム ライブラリーは、San3Aによる酵母DNAの部
分的消化、蔗糖勾配によりサイズ選択、及びBamHIで予
め消化された酵母ベクターYRp7中への選択されたフラグ
メントの挿入により構成された（ナスミス（Nasmyth）
とリード（Reed）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77:2119−
2123,1980）。CDC4遺伝子を含む組換えプラスミドが、
酵母株GEB5（MATA cdc4−４ leu2 trpl lys1 ura
l）及びGEB7（MATa cdc4−３ leu2 trpl lysl）を
ライブラリーによる形質転換により分離された。これら
の株は、株A364Acdc4−３及びA364Acdc4−４（ハートウ
エルら、ジェネティクス74:267−286,1975）から、高頻
度で形質転換すると知られた株（K79〔MATαlou2 trp
1〕（ナスミスら、ネイチア289:244−250,1981:タッチ
ェルら、セル27:25−35,1981）との交配及び続いての高
形質転換株（K79及びK80〔MATa lou2 trp1 lys1〕）
への戻し交配により望む遺伝的背景（lou2 trp1）でcd
c4−３及びcdc4−４突然変異を得ることによって誘導さ
れた。トリプトファン原栄養性及び制限的温度（37゜）
で増殖する能力についての形質転換体の選択は、ゲノム
中の組込まれCDC4座にマップすると判った一つのそのよ
うなプラスミド（pJY35と名付けられた）を同定した。
自発的プラスミド組込み体は、それらの選択的増殖利点
に基づいて同定された。この生長利点は、元のプラスミ
ド上でのCDC4を結合された遺伝子の存在により、これは
高コピー数で存在するとき（すなわちプラスミドが宿主
ゲノム中に組込まれなかったとき）に細胞増殖にとって
有害である。組込み体において、TRP1 プラスミドマー
カーは、SUP11に遺伝子的に結合されることが見られ、
これは染色体VI上のCDC4に結合される（モルチマー（Mo
rtimer）とシルド（Shild），「サッカロミケス セレ
ビシエの遺伝子マップ」，ストラサーンら編、酵母サッ
カロミケス セレビシエ ライフサイクルと遺伝の分子
生物学,641−651,コールド スプリング ハーバー198
1）。cdc4−３補償領域は6.4kbBamHIフラグメントとし
て精製され、T4DNAリガーゼを用いて、Bam HIで予め開
裂されたベクーターYRp（ストルール（Struhl）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA76:1035−1039,1979）に結合され
た。この構造物はpJY51として知られ、第１図に示され
る。

第１図において、CDC4コード領域が下記の方法でフラン
キング ゲノムDNA配列から精製された。プラスミドpJY
51がHind IIIで開裂され、CDC4領域を含む3.6kbフラグ
メントがバクテリア プラスミドpBR322中でサブクロー
ンされた。この構造物は、Bam HIで完全に消化され、Hi
nc IIで部分的に消化され、約2.3kbのCDC4含有フラグメ
ントが精製された。

Hinc IIフラグメント末端は、リンカー配列（配列:5′C
CGGATCCGG3′、コラボラティブリサーチから得られた）
の付加及び続いて過剰のリンカーの除去のためのBam HI
での消化によって、Bam HI末端に転化された。CDC4遺伝
子の約1.9kbを含む得たフラグメントは、プラスミドpJY
70を作るためにYRp7のBam HI部位中に挿入された。この
プラスミドは、上述のcdc4−３突然変異を捕うように見
えた。この1.9kbフラグメントはCDC4遺伝子の５′−及
び３′−コード領域の両者の小さな部分を欠くが、それ
は驚ろくことに温度感性欠陥を補う。たぶん、CDC4配列
の転写及び翻訳はプラスミドのpBR322領域中に位置する
配列により制御され、機能的遺伝子生成物の産生を可能
にする。

プラスミドpJY70は酵母TRP1及びARS1配列を除くためのE
coRIで開裂され、そして再び結合されてpBR322及びCDC4
配列を含むハイブリッド プラスミドを与えた。このプ
ラスミドはpJY71として知られ、第１図に示される。

1.9kb酵母配列は、Bam HI−Hind IIIフラグメントとし
てpJY71から精製された。このフラグメントは、Bam HI
とHind IIIでの消化により線形化されたpBR322に結合さ
れてプラスミドpB4を作った。これは第１図に示され
る。

CDC4領域は、高コピー数酵母ベクター中への挿入のため
にpB4から再び分離された。そのようなベクターは、酵
母２μプラスミドの複製のオリジン、及び興味ある外来
遺伝子のためのクローニング部位として働く一以上の制
限酵素開裂部位を含むであろう。好ましくは、そのよう
な部位はプラスミド上のユニーク部位であろう。好まし
いベクターはMW5であり、これは酵母２μプラスミド複
製オリジンとユニークEcoRIとBam HIクローニング部位
を含む。第２図において、プラスミドMW5は、プラスミ
ドYRp7′（スティンクコムら、ネイチア282:39−43、19
79）から、EcoRIで部分的開裂により平均分子当り二つ
のEcoRI部位の一つを開裂することによって誘導され
た。線形分子の得た非対末端は、DNAポリメラーゼを用
いて満たされ、得られたブラント末端はT4 DNAリガー
ゼを用いて再結合された。ARS1配列に近接するEcoRI部
位を保持する得たプラスミドを次に選択した。ARS1配列
はPstIとEcoRIでの消化により除かれ、酵母２μDNAの複
製オリジンを含むプラスミドYEp13（ブローチ（Broac
h）ら、ジーン（Gene）8:121−133,1979）のPstI−EcoR
Iフラグメントで置き代えられた。MW5と呼ばれる得たプ
ラスミドを第２図に示す。

CDC4領域は、高コピー数酵母ベクター中への挿入のため
にpB4から再び分離された。そのようなベクターは、酵
母２プラスミドの複製のオリジン、及び興味ある外来遺
伝子のためのクローニング部位として働く一以上の制限
酵素開裂部位を含むであろう。好ましくは、そのような
部位はプラスミド上のユニーク部位であろう。好ましい
ベクターはMW5であり、これは酵母２ラスミド複製オリ
ジンとユニークEcoRIとBam HIクローニング部位を含
む。第２図において、プラスミドMW5は、プラスミドYR
7′（スティンクコムら、ネイチア282:39−43、1979）
から、EcoRIで部分的開裂により平均分子当り二つのEco
RI部位の一つを開裂することによって誘導された。線形
分子の得た非対末端は、DNAポリメラーゼを用いて満た
され、得られたブラント末端はT4 DNAリガーゼを用い
て再結合された。ARS1配列に近接するＥ‖RI部位を保持
する得たプラスミドをつぎに選択した。ARS1配列はPst1
とＥ‖RIでの消化により除かれ、酵母２μDNAの複製オ
リジンを含むプラスミドYEp13（ブローチ（Broach）
ら、ジーン（Gene）8:121−133,1979）のPstRIフラグメ
ントで置きかえられた。MW5と呼ばれる得たプラスミド
を第２図に示す。

最終的なCDC4含有安定プラスミドを構成するために、MW
5はEcoRIとBamHIで開裂された。CDC4フラグメントは、
プラスミドpB4から、プラスミドをBamHIとEco RIで消
化することにより精製された。T4DNAリガーゼを用いて
二つのフラグメントを結合し、そのようにして作ったキ
メラ分子を大腸菌株RRI（ナスミスとリード、上述）中
に形質転換し、アンピシリン耐性、テトラサイクリン感
応性のコロニーについて選択した。一つのそのようなコ
ロニーから分離されたプラスミドpB5（第２図に示す）
は、酵素２μ複製オリジン、pBR322プラスミド配列、選
択マーカーTRP1、酵母CDC4コード配列の19kb,及びユニ
ークEcoRクローニング部位を含む。

B.宿主CDC4遺伝子の崩壊のためのプラスミドの構成 本発明に従うCDC4含有プラスミドの、形質転換された宿
主における安定性は、宿主における機能性CDC4遺伝子の
欠損に依存する。プラスミドと染色DNAの間の組換えを
除くために、宿主ゲノムとCDC4含有安定プラスミドの間
に相同性が存在しないことが更に望ましい。適当に除去
されたCDC4座を持つ酵素株を得るために、野性型CDC4遺
伝子を含む酵母宿主は、崩壊された“CDC4遺伝子”（ロ
スステイン、上述）を持つ線形化されたプラスミドフラ
グメントにより形質転換されうる。線形化されたプラス
ミドフラグメントは、フラグメントの自由末端がCDC領
域内での組換えを高めるであろう故に、好ましい形質転
換剤である。そのようなプラスミドフラグメントは、完
全なゲノムCDC4座との組換えを促進するためにその末端
で完全なCDC4フランキング領域を持つであろう。プラス
ミド フランキングのCDC4フランキング領域の間に挿入
された遺伝子物質は、形質転換された宿主中で選択され
うる表型的特徴（TRP1又はLEU2のような選択マーカー）
をコードするであろう。崩壊するプラスミドは好ましく
はまた、宿主ゲノム中への崩壊されたCDC4選択マーカー
配列の組込みについて選択するために、複製の酵母オリ
ジンを欠くであろう。線形化されたプラスミドでの形質
転換に続いて、遺伝子組換えは宿主のゲノム配列の代り
に崩壊された配列の置換を結果する。CDC4遺伝子が今や
除去された細胞は次に、崩壊において用いられたマーカ
ーに従って選択できる。

宿主ゲノムの一段階崩壊のための方法は、ロスステイン
（上述）により記述されている。上述のように、宿主株
を完全な安定プラスミドと線形プラスミドによる共形質
転換の追加的改善により崩壊が行われて、宿主ゲノムの
崩壊の達成に加えて宿主の安定プラスミドの形質転換も
また行われる。

宿主CDC4座の崩壊のための好ましいプラスミドは、pB15
Lであり、第３図に示される。それは、CDC4のフランキ
ング領域とベクターpUC13（ビエイラ（Vieira）とメッ
シング（Messing），ジーン19:259−268,1982,及びメッ
シング，メセッド イン エンザイモロジー101:20−7
7,1983）の間に挿入された酵母LEU2遺伝子を含む。酵母
とベクター配列の結合点で線形化されそして適当な酵母
宿主株中に形質転換されるとき、プラスミドはCDC4領域
のためのLEU2配列の置換から得られた宿主ゲノムにおけ
るCDC4の欠失を作る。宿主株において、ロイシン栄養要
求性の崩壊された形失転換体は次に、ロイシン原栄養性
に基づいて選択されうる。

プラスミドpB15Lを構成するために、CDC4遺伝子及びそ
の５′−及び３′−フランキング領域を含む6.4kbフラ
グメントが、pJY51のBam HI消化物から精製された。こ
のフラグメントは、プラスミドpB14を作るためにBam HI
消化されたpUC13中に挿入された。CDC4コード領域の多
くが、pB14をCla Iで消化し、pUC13とCDC4フランキング
配列を含む比較的大きなフラグメントを精製することに
より除去された。ブラグメント末端は、XhoI（Bal II）
スマートリンカー（ワーシングトン ダイアゴノスチッ
ク（Worthington Diagonostic）の付加により修飾さ
れ、YEp13の2.8kbBgl II LEU2フラグメント（ブローチ
ら、ジーン8:121−133,1979）が得られた粘性末端に結
合された。そのように作られたDNAは、大腸菌株RRIを形
質転換するために用いられた。形質転換体は、酵母LEU2
配列が大腸菌宿主中のleuB欠陥を補うきで、ロイシン原
栄養性に基づいて選択された。プラスミドpB15Lが、そ
のような形質転換された一つのコロニーから精製され
た。

プラスミドpB15Lは、５′及び３′フランキング配列に
加えてCDC4コード配列の５′末端の僅か約50塩基対を含
む。プラスミドpB5とpB15Lのマップの比較は、それらの
各々のCDC4配列の間の相同性の欠除を示す。なぜならpB
15LのCDC4−LEU2遺伝子融合の結合点がpB5中に存在する
DCCフラグメントの領域の外に位置しているからであ
る。この相同性の欠除は、pB5と宿主細胞における崩壊
されたCDC4座の間の組換えを除く。

C.S.セレビシエの共形質転換 同時的に、ゲノムCDC4遺伝子を除去しかつプラスミドpB
5を導入するために、酵母細胞がBam HI開裂されたpB15L
と完全なプラスミドpB5により共形質転換された。形質
転換において用いられるべき宿主株は、プラスミドpB5
とゲノムCDC4崩壊の同時選択のために、トリプトファン
とロイシンについて栄養要求性でなければならない。株
A2（MATα leu2−2,112 his3−11,15 can1;スゾスタ
ク，メソッド イン エンザイモロジー101:245−252,1
983）の株GEB7（実施例1A参照）の交配から得られた株A
2.7.c（MATα cdc4−３ trp1 leu2−2,112 lys1 h
is3−11,15 can1）が用いられた。

典型的な共形質転換実験において、対数増殖相のS.セレ
ビシエA2,7.cの培養物の10mlが、約６μｇのBam HI消化
されたpB1 5L,1μgpB5及び担体としての10μｇ子ウシ胸
腺DNAにより形質転換された。形質転換条件は、ベッグ
ズ（上述）に記述された通りである。細胞は、ロイシン
とトリプトファンを欠く培地上に置かれた。それらは、
22゜で一夜増殖され、37゜に移された。約30のコロニー
が得られた。pB5単独での対照の形質転換及びトリプト
ファン原栄養性についての選択は、約1000の形質転換体
を作った。

六つの共形質転換されたコロニーは、CDC4座の崩壊を検
証し、そしてpB5プラスミドの安定性をテストするため
に分析された。ゲノムDNAは、アブラハム（Abraham）ら
（コールド スプリング ハーバー シンポジング ク
オンタム バイオロジー47:989−998,1893）による方法
により共形質転換体から分離され、EcoRIとBam HIで消
化され、アガロースゲル上で電気泳動され、ニトロセル
ロースに移された（サザーン,J.Mol.Biol.98:503−517,
1975）。ブロットは、pB1 5Lに存在しpB5に存在しないC
DC4の５′フランキング領域からの2.5kb Bam HI−Hind
IIIフラグメントによりプローベされた。第４図は、プ
ローベが非形質転換細胞からのDNAの6.4kbフラグメント
にハイブリッドしたことを示す。（レーンｂ）；この6.
4kb Bam HIフラグメント内にEcoRI部位はない。LEU2配
列がEcoRI部位を含むので、CDC4座の崩壊はハイブリッ
ド化帯のサイズの減少を結果する（第４図で矢印で示
す）。これは、レーンc,d,f,g及びｈにおいて示された
形質転換体の場合である。レーンｅは、いく分異るパタ
ーンを示し、ゲノムサイズ帯を保持し、ゲノムCDC4の欠
失が起きなかったことを示す。（レーンｃ〜ｈに見られ
る比較的小さな帯は、レーンａとｂにおける対照のパタ
ーンにより示されるように、ゲル精製されたプローベの
汚染による。） 六つの共形質転換体が、複合培地（YEPD）上で増殖する
ことによりプラスミド安定性をテストされる。細胞は、
液状YEPD中で25゜で30世代に亘って増殖され、次にYEPD
上で25゜でプレートされ、そして37゜のYEPD,トリプト
ファン欠除培地及びロイシン欠除培地上にレプリカ プ
レートされた。表１にまとめた結果は、＃３を除く総て
の共形質転換体は、複合培地上でプラスミドマーカーに
ついて100％安定であったことを示す。（分離番号３
は、第４図のレーンｅに示された同じ共形質転換体であ
る。） 二つの共形質転換体、番号１及び2,についてさらに安定
性テストが実施された。テストは、各々663と681のコロ
ニーについて行われた。30゜でYEPD上での30世代の増殖
後に、総てのコロニーはトリプトファンとロイシンに対
して原栄養性であった。

共形質転換体＃１は、22゜で増殖速度をテストされ、非
形質転換のA2.7.c対照と同じ速度で増殖することが判っ
た。

共形質転換体＃１は、BELL1と名付けられた。それは、A
TCCに寄託番号20698として寄託された。

実施例 ２ シゾサッカロミケス ポンベPOT1遺伝子 A.選択マーカーとしてのS.ポンベPOT1遺伝子 サッカロミケス セレビシエ TPI1遺伝子は、トリオー
スホスフェート イソメラーゼ蛋白質をコードし、tpi1
欠陥を補うことにより得られた（カワサキとフレンケ
ル，上述；アルバーとカワサキ，上述）。驚くべきこと
に、S.ポンベからの相同遺伝子は、同じS.セレビシエtp
i1突然変異を補うことにより分離された。POT1（pombe
triose phosphate isomerase）と名付けられたS.ポンベ
TPI遺伝子は、Sau3Aにより部分的に消化されベクターYE
p13中に挿入されたゲノムS.ポンベDNAを含むところの、
ラッセル（Russell）とホール（Hall），（J.Biol.Che
m.258:143−149,1983）により記述されたライブラリー
からクローンされた。予備的DNA配列（マキサム（Maxa
m）とギルバート（Gilbert）,Meth,in Enzymology 6
5:497−559,1980の方法による）は、POT1遺伝子がTPI蛋
白質をコードし、該蛋白質は他の生物からのTPI蛋白質
と相同であることを示した（アルバーとカワサキ、上
述）。このPOT1DNA配列は、S.セレビシエ TPI1DNA配列
及び各蛋白質配列と共に第５図に示される。

S.ポンベ POT1遺伝子は、S.セレビシエにおける選択マ
ーカーとしてS.セレビシエ TPI1遺伝子よりも、この実
施例で好まれる。S.セレビシエにおけるPOT1のような外
来遺伝子は、異る宿主細胞中では良好に機能せず、従っ
て宿主細胞欠陥を補うためにより高いコピー数を必要と
するかも知れない。また酵母プラスミド上の選択しうる
POT1遺伝子は、同じベタター上の産業上重要な遺伝子の
発現のために内在TPI1プロモーター及びTPI1ターミネー
ター（POT1との相同性を示さない対照領域）の使用を可
能にする。POT1,及びTPI1のフランキング領域は相同性
を示さないので、分子内組換え及び結果としてのプラス
ミド不安定性が低減される。最後に、POT1遺伝子はS.セ
レビシエ染色体DNAと組換わらないようである。なぜな
ら、それは、TPI1配列とDNAレベルで少ししか相同性を
共有せず、TPI遺伝子の多くは宿主株において除去され
た。すなわち、POT1含有プラスミドは、酵母において産
業的に興味ある外来遺伝子の高められた発現のために望
ましい高いコピー数を保持しうる。

POT1遺伝子を含むプラスミドは、S.セレピシエ株N587−
2D（カワサキとフレンケル、上述）におけるtpi1突然変
異の補償によりラッセルとホール（上述）のS.ポンベか
ら同定された。

このプラスミドpPOTの制限地図を第６図に示す。pPOTは
ベクターYEp13を含むので、それは本来的に不安定であ
る。なぜなら、それは酵母において２μプラスミドの維
持のために必要な複製機能を欠くからである。従って、
POT1遺伝子は、より有能なベクターたとえばC1/1及び完
全な２μプラスミド配列を含む関連ベクター中に動かさ
れうる。プラスミドC1/1は、pJDB248（ベッグズ，ネイ
チア275:104−109,1978）及びpBR322から本明細書の実
施例３に記載されるように誘導された。それは、酵母２
μプラスミドDNA,選択しうるLEU2遺伝子及びpBR322配列
の総てを含む。

POT1遺伝子は、約3400塩基対のBamHI−XbaI制限フラグ
メントとしてpPOTから分離され、pUC13の対応するポリ
ソンカー部位中に挿入された。得たプラスミドは、pUCP
OTであり、その部分的制限地図を第６図に示す。

pUCPOTプラスミドは、S.ポンベとS.セレビシエDNAの約1
800塩基対を除去するためにSa1 Iで切断され、そして再
リゲートされる。この得たpUCPOT−Sa1プラスミドは、
第６図に示される。

POT1遺伝子は、以下の方法でC1/1中に入れられた。C1/1
及びpUCPOT−Sa1の両者は、アンピシリン耐性遺伝子中
にBg1 I部位、及びどこか他の位置にユニークBam HIを
有すので、pUCPOT−Sa1のPOT1フラグメントは、C1/1のp
BR322領域の一部に置き代わりうる。C1/1はBgl I及びBa
m HIで切断されて、amp^r遺伝子の一部、２μDNAの総
て、多びLEU2遺伝子を含む約7700塩基対の大きなフラグ
メントを遊離した。同様に、pUCPOT−Sa1はBa1 I及びBa
m HIで切断され、amp^r遺伝子の別の一部及びPOT1遺伝子
を含む約3400塩基対のフラグメントを遊離した。これら
二つのフラグメントをリゲートしてpCPOTを形成し、こ
れは回復された選択しうるamp^r遺伝子、POT1遺伝子、LE
U2遺伝子、総ての２μDNA、及びpUC13からの複製領域の
バクテリアオリジンを含む（pUC13からのバクテリアオ
リジン領域は、pBR322のオリジン領域が行うよりもより
高いプラスミドコピー数を可能にする）。

pCPOTで形質転換された大腸菌株HB101は、寄託番号3968
5としてATCCに寄託された。

POT1遺伝子はまた、同様の構成によりC1/1誘導ベクター
中に挿入されうる。たとえば、プラスミドpFAT5（第７
図）は、C1/1に挿入されたヒトα−１−アンチトリプシ
ン（AT）の産生のための発現ユニットを含む。この発現
ユニットは、実施例４で述べるように作られ、TPI1プロ
モーター、ATcDNA配列、及びTPI1転写ターミネーターよ
り成る。pFAT5の制限地図は、第７図に示される。

pFAT5は、Ba1 IとBam HIにより切断され、AT遺伝子とTP
I1ターミネーターを含むフラグメント（2200塩基対）を
遊離した。また、上述したようにC1/1Ba1 I−Bam HIフ
ラグメントと同一のBa1 I−Bam HIフラグメントが遊離
される。但し、pFAT5からのフラグメントは、TPI1プロ
モーターを含むさらに900の塩基対を含む。この後者のp
FAT5片及びpUCPOT−Sa1 3400hp Bg1 I−Bam HIフラグ
メント（上述した）は、プラスミドpFPOTを形成するた
めにリゲートされ、これは第７図に示すように制限地図
を持つ。

ベクターpFAT5はユニークBam HI部位で切断され、2200
塩基対AT遺伝子及びpFAT5からのTPI1ターミネーターフ
ラグメントの挿入を可能にする。pFPOT中への適当な定
位の2200hbフラグメントのクローニングは、この酵母ベ
クター中のヒトATの発現を許す。適当にリゲートされた
生成物は、pFATPOTと名付けられ、その制限地図を第７
図に与える。

Ｂ 宿主TPI遺伝子の崩壊 サッカロミケス セレビシエ TPI1 遺伝子がクローン
され、配列決定された（カワサキとフレンケル、上述、
及びアルバートカワサキ、上述）。TPI蛋白質のための
構造遺伝子を含むプラスミドpTPIC10は、アルバーとカ
ワサキ（上述）に記載されている。Bg1 II部位が、TPI1
コード領域のDNA位置295に存在し、もう一つのBg1 II部
位が５′フランキング領域において約1200塩基対離れて
位置する。これらBg1 II部位は、TPI1遺伝子の一部を除
去するため及び別の遺伝子たとえば酵母LEU2遺伝子を挿
入するために慣用のクローニング部位である。そのよう
な構造物は、形質転換された宿主におけるゲノムTPI1座
の崩壊を作るために用いられうる。

TPI1の５′フランキング領域における約−1800は、Pst1
部位である。従って、pTPIC10においてTPI1遺伝子が、
５′側でPst I部位によりそして３′側でSal I部位（te
t^r遺伝子における）によりフランクされる。

TPI1を含むこのPst I−Sal Iフラグメントが、Pst I及
びSal I部位でpUC13に挿入されてpUCTPIを作った。Pst
I−Sal I挿入物（pUC13への）の制限マップを、第８図
に示す。

次にプラスミドにpUCTPIがBgl IIで切断され、二つのDN
Aフラグメントが電気泳動により分離された。比較的大
きなプラスミドが精製され、自己結合を防ぐためにホス
ホァターゼ分解された。このDNAのBal II部位中に酵母L
EU2遺伝子がリゲートされ、これはBal IIフラグメント
としてプラスミドYEp13（ブローチら、ジーン8:121−13
3,1979）から除去されたものである。得られたプラスミ
ドは、pUCTPI−LEU2であり、これはTPI1の部分的欠失及
びLEU2の挿入を有する。pUCTPI−LEU2を第８図に示す。

プラスミドpUCTPI−LEU2は、DNAを線形化するためにPst
1とBam HIで切断された。次に酵母配列が、電気泳動及
びゲル精製によりpUC13配列から分離された。第８図に
示される酵母DNA部分は、TPI1染色体遺伝子（ロスステ
ン、上述）を「崩壊する」ために、LEU2について欠陥の
あるS.セレビシエ株E2−7B（ATCCNo.20689）を形質転換
するために用いられる。leu⁺形質転換体は、３％グリセ
ロール、１％ラクテート（pH7に中和された）、1Mソル
ビトール及びロイシン不含の合成（修正ウィッケラム
の）培地（モルチマーとホーソーン著、ローズとハリソ
ン編、ザ イーストvol.1、385−460、アカデミックプ
レス、1969）上で選択された。形質転換体は、YEP−デ
キストロース上でのその増殖不能によりTPI欠陥につい
てスクリーンされた。初めの99のスクリーンされた形質
転換体のうち一つのtpi^-性質転換対が見い出された。こ
の株は、E2−7B△tpi＃29（以下、△tpi＃29と云う）と
名付けられた。△tpi＃29は、YEP−３％グリセロールー
１％ラクテート上で増殖したが、YEP−デキストロース
上で増殖しなかった。粗細胞抽出物で酵素評価（クリフ
トン（clifton）ら、ジェネティクス88:1−11,1980）が
行われ、△tpi＃29が、検出できるレベルのトリオース
ホスファートイソメラーゼ活性を欠くことが確認され
た。

△tpi＃29は、tpi^-欠失についてヘテロ接合性である二
倍体を形成するために、他の酵母株に交配されうる。そ
のような二培体は、トリロース ホスフェート イソメ
ラーゼについて欠陥的な他の株が発生されうるように、
胞子形成されうる。たとえば、△tpi＃29は、E8−10A
（Matα leu2）（雑種E2−7BXGK100〔ATCC20669〕の胞
子分離体）に交配されて、二培体E11を形成した。この
二培体は、胞子形成されて、半数体子孫E11−3Cを発生
した。これは次のゲノタイプを持つ:Matαpep4−3tpi
1。E11−3Cが△tpi＃29に戻し交配されて二倍体E18を形
成した。これはtpi1欠失についてホモ接合性である。E1
8、アミノ酸要求を持たず、より大きな細胞を持ち、よ
り速く増殖するので、プラスミドのための宿主株として
△tpi＃29より好ましい。これらtpi^-株は、解糖機能を
コードする遺伝物質について欠失しており、従って戻ら
ない（すなわち安定な）突然変異体であると考えられ
る。

C.S.セレビシエ tpi^-欠失株へのPOT1遺伝子の形質転換 プラスミドpFPOT及びpFATPOTが、△tpi＃29及び関連す
るtpi欠失株に形質転換された。この酵母突然変異体
は、30゜でYEP−２％ガラクトース中で対数相後期まで
一夜好気的に増殖された。形質転換条件は、ベッグズ
（上述）により記載された通りであったが、但し細胞
は、上部寒天にプレートされる前にYEP−デキストロー
スの代りに1Mソルビトールを含むYEP−３％グリセロー
ル−１％ラクテート又はYEP−２％ガラクトース中で１
〜２時間30゜で回復するのを許された。上部寒天及びプ
レートは、1Mソルビトール及び２％デキストロースを含
む合成の、修正ウィッカラム培地を含んだ。30゜で３日
後に、形質転換体は見え、YEPDへのレプートのために寒
天から取り離された。その後、形質転換体は、YEPD又は
デキストロースを含む他の複合培地上で維持された。

pFATPOTで形質転換された株E18は、ZYM−３と名付けら
れた。それは、寄託番号20699でATCCに寄託された。

複合培地上でのpFPOT及びpFATPOTの安定性 プラスミド安定性を研究するために、単一細胞からのコ
ロニーを、YEPDを含む試験管に接種し、合計10⁹細胞
（約30分裂）まで増殖を許した。酵母細胞を音波処理し
て塊を破壊し、適当倍希釈し、tpi^-細胞（POT1遺伝子を
担持するプラスミドあり又はなし）の増殖を許すYEP−
２％ガラクトース又はYEP−２％グリセロール−１％ラ
クテート上にプレートされた。YEP−ガラクトース上で
生じたコロニーは次に、プラスミドの欠損についてスク
リーンするためにYEPD上にレプリカプレートされた（す
なわち、POT1含有プラスミドを失ったtpi^-細胞はデキス
トロース上で増殖しないであろう）。表２にまとめた結
果は、pFPOTとpFATPOTプラスミドが、酵母tpi^-欠失株に
おいて安定であることを示す。それらは驚ろくべきこと
に、動原体を含む酵母プラスミドよりはるかに安定であ
る。動原体を持つプラスミド（これはコピー数が小さ
い）は、酵母について報告された最も安定なプラスミド
の一つであり、複合培地での一回の分裂当り約１％の細
胞の確率で一般に失われる（マーレイとスゾスタク、上
述、を動原体プラスミド安定性の総説として参照された
い）。表２に示すように、ここで述べるPOT1プラスミド
は、tpi^-欠失株において複合培地での30回分裂後に１％
未満の確率で失われる。

D.POT1プラスミドを用いるS.セレビシアにおけるヒトα
−１−アンチトリプシンの発現 形質転換された酵母における異種蛋白質の発現を高める
ためのPOT1プラスミドの使用をテストするために、プラ
スミドpFATPOT及びpFAT5を、各々S.セレビシア株△tpi
＃29及びE2−7Bを形質転換するために用いた。形質転換
された細胞は、デキストロースを含むロイシン不含培地
で選択された。培養菌は、30゜で３〜４のO.D.600まで
増殖された。細胞抽出物を調製し、実施例５記載のよう
にATについて評価した。

pFATPOT/△tpi＃29により作られたとき４〜６％の合計
可溶蛋白質を示した。

pFAT5/E2−7Bにより作られたとき２〜３％の合計可溶蛋
白質を示した。

プラスミドコピー数は正確に測定し平均固体数を表わす
ことが困難であるが、遺伝子生物量の経験的観察は、相
対的プラスミドレベルの指標を与え、発現ユニット（プ
ロモーター、興味の遺伝子、ターミネーター）は変わら
ないことを示す。従ってpFATPOTは、これがそれから誘
導されたところのpFAT5よりも機械的に数がより大きい
ようである。二つの形質転換株は遺伝的にほぼ同一であ
り（△tpi＃29はプラスミドに向けられた突然変異化に
よりE2−7Bから誘導された）、同じ条件下で増殖された
ので、これらの結果は従来記載されるベクターを上向る
本明細書記載の安定なプラスミド発現系の値を示す。

実施例 ３ プラスミドC1/1の調製 C1/1が、プラスミドpJDB248（ベッグズ、J.,ネイチア27
5、104−109、1978）から作られた。pMB9配列が、EcoRI
による部分的消化によってpJDB248から除かれ、EcoRIで
切断されたpBR322DNAにより置代えられた。C1/1の制限
地図を第６図に示す。C1/1プラスミドは、EcoRI部位で
のpBR322挿入を伴い、酵母（S.セレビシエ）からの全２
μDNAを含む。それまた、LEU2遺伝子を含む。

実施例 ４ プラスミドpFAT5の調製 ヒトα−１−アンチトリプシン（AT）の主な形をコード
する遺伝子が、DNAハイブリダイゼーションプローベと
してヒヒ配列を用いる慣用の方法によりヒト肝臓cDNAラ
イブラリーから分離された（クラチら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA78:6626−6830、1980;及びチャンドラら、Bio
chem.Biophys.Res.Comm.103:751−758、1981）。このラ
イブラリーは、ヒト肝臓cDNAをプラスミドpBR322のPst
I部位に挿入することにより構造された（ボリバーら、
ジーン2:95−113,1977）。AT遺伝子は、1500塩基体（b
p）Pst Iフラグメントとしてライブラリーから分離され
た。このフラグメントは、プラスミドpUCα１を作るた
めに、pUC13のpst I部位に挿入された。pUCα１におい
て、AT配列は、ポリリンカーにおいてXba I及びEcoRI部
位により３′末端でフランクされた。

TPIターミネーターが、約700bpのXba I−EcoRIフラグメ
ントとしてプラスミドpFG1（アルバーとカワサキ、上
述）から精製され、Xba IとEcoRIで開裂さたpUCα１中
に挿入された。この構造物は次に、EcoRIで切断され、
オリゴヌクレオチド リンカー（配列:AATTCATGGAG GT
ACCTCCTAG）が多重リンクされたコピーで付加されて、T
PIターミネーターの３′末端にBam HI部位を与える。得
たプラスミドはBAT5として知られる。

TPIプロモーターフラグメントがプラスミドpTPIC10（ア
ルバーとカワサキ、上述）から得られた。このプラスミ
ドは、ユニークKpn I部位で切断され、TPIコード領域を
Bal31エキソヌクレアーゼにより除去し、EcoRIリンカー
（配列:GGAATTCC）がプロモーターの３′末端に付加さ
れた。Bal II及びEcoRIでの消化は、Bal II及びEcoRI粘
性末端を持つTPIプロモーターフラグメントを与えた。
このフラグメントは次に、Bal IIとEcoRIで切断したプ
ラスミドYRp7′（スティンクコムら、ネイチア282:39−
43、1979）に結合された。得たプラスミドTE32を、テト
ラサイクリン耐性遺伝子の一部を除去するためにEcoRI
とBam HIで開裂した。線形化されたプラスミドは次に、
プラスミドTEA32を作るために、上述のEcoRI−Bam HIリ
ンカー付加により再線形化された。次にTEA32は、Bal I
IとBam HIで開裂され、TPIプロモーターは約900bpのフ
ラグメントとして精製された。

プラスミドpFAT5を構造するために、プラスミドC1/1をB
am HIで線形化し、TEA32からの900bpTPIプロモーターフ
ラグメントに結合した。プラスミドＦとして知られる得
た構造物は、TPIプロモーターの３′末端に位置するユ
ニークBam HI部位を持つ。このプラスミドはBam HIで切
断され、ATコード領域とTPIターミネーターを含む2200b
pBam HIフラグメントがBAT5から精製され、Bam HI部位
中に挿入された。pFAT5として知られる得たプラスミド
は、第７図に示される。

実施例 ５ α−１−アンチトリプシンについての評価 対照として、100μg/mlトルプシン溶液の10μ（１μ
ｇ）、ウシ血清アルブミンの100μｇ（100μ）及び1m
Mベンゾイルアルギニフイル−ｐ−ニトロアニリドを含
むpH8.0の緩衝液0.05M TRISの100μを混合し、405nm
での吸光度の増加を分光光度計で経時測定した。この溶
液の吸光度値は、100％トリプシン活性の標準として用
いられた。総ての評価されたサンプルは、同じ濃度の基
質及びウシ血清アルブミンを含む。

実施例 ６ 選択マーカーとしてのアスペルギルスニジュランスTPI 機能性TPI cDNAを、S.セレビシエ株Δtpi29（マックナ
イト（McKnight）等、Cell46:143−147、1986）中のTPI
欠失を補足する為に、その能力でA.ニジュランス（A.ni
dulans）から分離した。1.15kbのTPI cDNAを、EcoRI−B
amHIフラグメントとしてpUC91に挿入した。このcDNA
を、Sst Iでの部分的消化後に得られたプラスミドから
切り取り、BamHIで消化を完結し、プラスミドpM144を造
る為に、Sst I−Bglll消化plC19R（マーシュ（Marsh）
等、Gene32:481−486、1984）に挿入した。BamHI部位
を、EcoRVでプラスミドを線状化し、BamHIリンカーシー
クエンスを添加し、そして再接合する事により、pM144
に導入した。得られた構造体を、pM147と命名した。TPI
cDNAを、次いでSa11−BamHIフラグメントとして、pM14
7から分離した。

このSa1l−BamHI A.ニジュランスTPIを、次いで、同じ
酵素での消化で線化状されたC1/1に挿入した。ベクター
を得たC1/1を、pCTIPと命名した。

プラスミドpTIPを、次いで酵母形質転換での安定性試験
にかけた。S.セレビシエ株GA18−1c（MAT α1cu2−３、
112 ura3 barlΔtpi IILEU2）を、pTIPで形質転換し、
グルコース媒地で培養した。このプラスミドは、宿主で
のTPI欠失を補足する事を示し、エチジウムブロマイド
染色ゲルのリボソマールDNAバンドとの比較で、高いコ
ピー数（細胞当り200コピー）で存在する事が示され
た。

これらの結果は、又ベクター上のプロモーターシークエ
ンスが、TPIシークエンスの発現に、偶然向けられてい
る事を示す。更に分析は、pDPOTのpUC13部分のE coli l
aczプロモーターは、応答可能であった事を示した。

実施例７ 選択マーカーとしてのPGI遺伝子 A.PGIのクローン化 シャトルベクターYEp13中の酵母DNAライブラリーを、ナ
スミス（Nasmyth）とターチェル（Tatchell）（Cell 1
9:753−764、1980）の記述通りに調製した。ホスホグル
コース イソメラーゼ（PGI）遺伝子を運ぶプラスミド
としては、グルコースでの培養の為の同時選択及びロイ
シン原栄養株（Kawasaki and Fraenlel、Biochem.Bioph
ys.Res.Comm.108:1107−1112、1982）を使用して、pgi^-
酵母株の補完で同定され、pPGI19−７と命名した。pPGI
19−７の制限エンドヌクレアーゼ地図は、PGI1遺伝子を
含む5.7kbのBamHI−Hind IIIフラグメントを同定した。
pPGI19−７からPGI1含有インサートを、次いで、pUC13
にサブクローニングした。BamHI及び部分的にHind III
で補足する為に、プラスミドを切断する事に依り、次い
でアガローゼゲルでの単離に依り、5.3kbのフラグメン
トを得た。精製フラグメントを、BamHI及びHind IIIで
切断されたpUC13に接合した。こノクローンの同定は、D
NAシークエンスで確認した。得られたクローンは、pUCP
GIと命名した。

B.PGI欠失株の構成 酵母宿主株中のゲノムPGI1遺伝子座を崩壊するのに使用
する為のプラスミドを構成した。これは、pUCPGIのPGI1
遺伝子にLEU2の挿入を含み、pGD1040と命名した。

プラスミドpGD1040を、次いでBamHI及びHind IIIで消化
し、LEU2シークエンスを含むフラグメントを、S.セレビ
シエ株２−7Bの形質転換に使用した。形質転換体は、1c
u−合成培地含有フルクトース上で選択した。LEU⁺形質
転換体は、次いでYEPDプレート上で培養の可能性に対し
スクリーンされた。突然変異株は、PGIにおいては欠陥
のあるものである事を確認する為に、マイトラ（Maitr
a）及びローボ（Lobo）（J.Biol.Chem.246:475−488、1
971）及びKawasaki及びFraenkel（ibid）の記述通り
に、酵素評価を、粗細胞抽出物で行った。欠失突然変異
株は、酵素活性を示さなかった。trpl^-表現型を運ぶpgi
欠失株が、更に構成された。これを、＃51a（MATα 1cu
2 trpI−289 ura3−53 his3−Δ1 Δpgi1 II LEU2）と
命名した。

C.PGI cDNAの単離 プラスミドpYcDE8（McKnight et al.EMBO J.4:2093−20
99,1985）にプールされている酵母cDNAをマクナイト及
びマッコノーギー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4412−4
416,1983）に記載の方法に準じて調製し、株＃51aの形
質転換に用いた。形質転換体をトリプトファンを含まな
い合成グルコース培地上で選択し、１つの形質転換体を
得た。この形質転換体からプラスミドDNAを調製し、E.c
oli RR1を形質転換するのに用いた。pPHGIcDNAと称する
このプラスミドの制限地図から、2.0kb Sst I−Bam III
フラグメント上に含まれるPGIcDNAが5.4kbのゲノムフラ
グメントの一部に相当し、かつ遺伝子分裂においてすで
に使用したpGD1040の欠失部分と大部分重複するとがわ
かった。このcDNAをM13ファージベクター中でサブクロ
ーニングし、常法により配列した、この配列は、酵母ホ
スホルグルコース イソメラーゼ（Kempe et al.J.Bio
l.Chem.249:4625−4633,1974）のアミノ酸組成に合致し
た。

D.発現ベクターとしてのPG1プラスミドの使用 プラスミドpPGIcDNAをSst I及びBam HIで消化し、PGI c
DNAを含む2.0kbフラグメントをゲルで精製した。このcD
NAを、Sst I及びBam HIで予め消化したpZUC13に結び付
けた（pZUC13はS.セレビシエ染色体LEU2遺伝子及びpUC1
3に挿入されたS.セレビシエ２μｍプラスミドからの複
製源を含んでいる。EP公開公報163,529に記載のプラス
ミドpMT212を用いて、EP公開公報195,691に記載のpZUC1
3に類似の方法で構築した。）。pA1と称する得られたプ
ラスミドは、従って、lacZプロモーターに融合したPGI
cDNA、LEU2配列、２ミクロン複製源及びアンピシリン耐
性マーカーを含んでいる。pA1を株＃51aに形質転換する
と、この形質転換体はleu−グルコースプレート上で成
育し、酵母細胞中でlacZプロモーターが機能しているこ
とを示した。

E.PGI選択を用いたα−アンチトリプシンの発現 pA1中にPTIプロモーター−−α−１−アンチトリプシン
をコードする配列−−TP1ターミネーターの発現ユニッ
トを挿入してなるプラスミドpA1−Ｂを構築した。この
発現ユニットは次の方法で構築した。プラスミドTEA32
（実施例４）をBgl II及びEcoRIで消化し、990bpの部分
的なTPIプロモーターフラグメントをゲルで精製した。
プラスミドplC19HをBgl II及びEcoRIで切断し、ベクタ
ーフラグメントをゲルで精製した。ついで、TPIプロモ
ーターフラグメントを直線化したplC19Hに繋き、該混合
物を用いてE.Coli RP1を形質転換した。プラスミドDNA
を調製し、900bp Bgl II−EcoRIフラグメントの存在を
スクリーニングした。正しいプラスミドを選択しplCTPI
Pと命名した。

次いでプラスミドpMVR1を構築した。プラスミドpIC7（M
arsh et al.同上）をEcoPIで消化し、フラグメントの末
端をDNAポリメラーゼ１（クレノーフラグメント）でブ
ラントしT4DNAリガーゼを用いてこの直線状DNAを再び環
状にした。得られたプラスミドを用いてE.coli RR1を形
質転換した。プラスミドDNAをこの形質転換体から調製
し、Eco R1部位の欠失をスクリーニングした。正しい制
限パターンを有するプラスミドをpIC7R1＊と命名した。
プラスミドpIC7R1＊をHind III及びNar Iで消化し、250
0bpフラグメントで精製した。部分的TP1プロモーターフ
ラグメント（約900bp）をNar1及びSph1を用いてplCTPIP
から除き、ゲルで精製した。

pFATPOTをSph1及びHind IIIで消化し、部分的なTPIプロ
モーター、ATcDNA及びTPIターミネーターを含む1750bp
フラグメントをゲルで精製した。このpIC7R1＊フラグメ
ント、部分的なTPIプロモーター、及びpFATPOTからの部
分的なTPIプロモーター−AT−TPIターミネーターフラグ
メントを３つの繋ぎ目で繋いでpMVR1を製造した。

次にα−１−アンチトリプシンの発現ベクターを構築し
た。プラスミドpMVR1をBal IIで消化し、2.3kb発現ユニ
ットフラグメント（TPIIプロモーター−ATcDNA−TPIIタ
ーミネーター）をゲルで精製し、pA1のBamHI部位に挿入
した。得られたプラスミドをpA1−Ｂと命名した。

pA1−ＢをS.セレビシエ株＃51aに形質転換し、形質転換
体をTEPD液体培地で１リットルのO.D.600まで増殖させ
た。この形質転換体は、α−１−アンチトリプシンを全
可溶性蛋白2.5−4.0％で発現した。このレベルは、POT1
選択を用いて得られたレベルに匹敵する。pA1−Ｂのコ
ピー数は約100/細胞であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドpB4の構造を示す。 第２図は、プラスミドpB5の構造を示す。 第３図は、プラスミドpB1 5Lの構造を示す。 第４図は、プラスミドpB5及びpB1 5Lで共形質転換され
たS.セレビシエ（cerevisiae）株A2.7.cからのDNAのサ
ザーンプロットを示す。 第５図は、S.ポンベ（pombe）POT1及びS.セレビシエTPI
1遺伝子の配列を、各々の推定された蛋白質配列ととも
に示す。 第６図は、プラスミドpCPOTの構造を示す。 第７図は、プラスミドpFATPOTの構造を示す。 第８図は、プラスミドpTPI−LEU2の構造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレン カワサキ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト シツクステイーンス アベニユー 1547 (72)発明者 レスリー ベル アメリカ合衆国 ワシントン州 98102 イースト シアトル ボイアー アベニユ ー 2518

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】複合培養基での正常細胞増殖のために必要
   な機能における欠陥を持つ酵母宿主細胞においてα−１
   −アンチトリプシンを生産する方法において、 （ａ） 該欠陥を補う遺伝子及びα−１−アンチトリプ
   シンをコードする配列を含むDNA分子により上記酵母宿
   主細胞を形質転換すること； （ｂ） 段階（ａ）からの細胞を、上記遺伝子が形質転
   換体細胞のための選択マーカーとして機能する条件下で
   培養すること の段階を含む方法。
2. 【請求項２】段階（ａ）からの細胞を、抗生物質又は重
   金属を含むことを必要とせず、かつ特定の栄養素の欠除
   を必要としない増殖培養基において培養することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。