JPH06228188A - Ｈｃｍｖ特異的ペプチド、その薬剤および使用 - Google Patents
Ｈｃｍｖ特異的ペプチド、その薬剤および使用Info
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- JPH06228188A JPH06228188A JP4255482A JP25548292A JPH06228188A JP H06228188 A JPH06228188 A JP H06228188A JP 4255482 A JP4255482 A JP 4255482A JP 25548292 A JP25548292 A JP 25548292A JP H06228188 A JPH06228188 A JP H06228188A
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- C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
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- C12N2710/16011—Herpesviridae
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣ
ＭＶ）特異的抗体およびＨＣＭＶ抗原の免疫化学的測定
のためのアッセイ手段を提供する。 【構成】 下記のアミノ酸配列の少なくとも１個を含む
ことを特徴とする、ＨＣＭＶに対する抗体と特異的に反
応するペプチド。ASe -gly ala gly ala ala ile leu -
BSm （ペプチド１）、CSn -arg ala trp ala leu -DSo
（ペプチド２）、および／またはESp -ala ser arg asp
ala ala -FSq （ペプチド３）。但し、ＡＳ、ＢＳ、Ｃ
Ｓ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の適
当なアミノ酸であり、ｅは、互いに独立に０〜２２の整
数であり、ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であり、
ｎおよびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であり、ｐ
およびｑは、互いに独立に０〜１１の整数である。
ＭＶ）特異的抗体およびＨＣＭＶ抗原の免疫化学的測定
のためのアッセイ手段を提供する。 【構成】 下記のアミノ酸配列の少なくとも１個を含む
ことを特徴とする、ＨＣＭＶに対する抗体と特異的に反
応するペプチド。ASe -gly ala gly ala ala ile leu -
BSm （ペプチド１）、CSn -arg ala trp ala leu -DSo
（ペプチド２）、および／またはESp -ala ser arg asp
ala ala -FSq （ペプチド３）。但し、ＡＳ、ＢＳ、Ｃ
Ｓ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の適
当なアミノ酸であり、ｅは、互いに独立に０〜２２の整
数であり、ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であり、
ｎおよびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であり、ｐ
およびｑは、互いに独立に０〜１１の整数である。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトサイトメガロウイ
ルス（ＨＣＭＶ）に特異的な抗体およびＨＣＭＶ抗原の
免疫化学的測定のためのペプチドおよびこの方法に好適
な薬剤、およびその使用に関する。
ルス（ＨＣＭＶ）に特異的な抗体およびＨＣＭＶ抗原の
免疫化学的測定のためのペプチドおよびこの方法に好適
な薬剤、およびその使用に関する。
【０００２】ＨＣＭＶの免疫状態を検査するための診断
において、今日までのところ、例えば酵素イムノアッセ
イが用いられてきている。このアッセイでは、特異的に
ＨＣＭＶに向けられた抗体が検出された。用いられた抗
原は、通常は複雑な細胞培養中でヒト線維芽芽細胞上で
生長し、プロセシングの後に、診断に利用可能な表面、
たとえばＥＬＳＡマイクロタイタープレートに付着しウ
イルス物質であった。
において、今日までのところ、例えば酵素イムノアッセ
イが用いられてきている。このアッセイでは、特異的に
ＨＣＭＶに向けられた抗体が検出された。用いられた抗
原は、通常は複雑な細胞培養中でヒト線維芽芽細胞上で
生長し、プロセシングの後に、診断に利用可能な表面、
たとえばＥＬＳＡマイクロタイタープレートに付着しウ
イルス物質であった。
【０００３】細胞培養物から抗体の検出のためにＨＣＭ
Ｖ抗原を得ることは、一般に極めて時間が掛かり且つ経
費が嵩むものであり、それに携わる人々には感染の危険
性が伴うものである。この抗原を免疫学的診断法に用い
るためには、ウイルスを細胞培地または細胞自身から得
なければならず、或いは少なくとも、免疫学的反応を可
能にする形態で存在しなければならない。生化学的方法
によるこの物質のそれ以上の精製は極めて複雑であり、
大きな損失を伴うものであり、例えば細胞結合ウイルス
物質は超音波処理によってのみ遊離するのであり、例え
ば希釈してマイクロタイタープレートをコーティングし
た後に直接用いられるのである。この場合には、これは
マイクロタイタープレートウェルの表面に結合している
ウイルス特異的構造物のみならず、かなりの程度が細胞
特異的タンパク質でもある。また、後者は、ある種の病
気、例えば自己免疫疾患では、偽陽性の結果が得られ易
く、したがって誤診を招きやすい。それ故、偽陽性の徴
候の数を決定するためには、一般的には感染していない
細胞培養物からの検討材料をコントロールとして用いる
のである。これがために、このアッセイの複雑さおよび
試料当たりの経費が必然的に倍加するのである。
Ｖ抗原を得ることは、一般に極めて時間が掛かり且つ経
費が嵩むものであり、それに携わる人々には感染の危険
性が伴うものである。この抗原を免疫学的診断法に用い
るためには、ウイルスを細胞培地または細胞自身から得
なければならず、或いは少なくとも、免疫学的反応を可
能にする形態で存在しなければならない。生化学的方法
によるこの物質のそれ以上の精製は極めて複雑であり、
大きな損失を伴うものであり、例えば細胞結合ウイルス
物質は超音波処理によってのみ遊離するのであり、例え
ば希釈してマイクロタイタープレートをコーティングし
た後に直接用いられるのである。この場合には、これは
マイクロタイタープレートウェルの表面に結合している
ウイルス特異的構造物のみならず、かなりの程度が細胞
特異的タンパク質でもある。また、後者は、ある種の病
気、例えば自己免疫疾患では、偽陽性の結果が得られ易
く、したがって誤診を招きやすい。それ故、偽陽性の徴
候の数を決定するためには、一般的には感染していない
細胞培養物からの検討材料をコントロールとして用いる
のである。これがために、このアッセイの複雑さおよび
試料当たりの経費が必然的に倍加するのである。
【０００４】前記の方法は、異種系、例えば大腸菌(Esc
herichia coli)において高収率で調製することができる
組換えタンパク質を使用することによって、明らかに改
良される。ＨＣＭＶの感染の可能性は、一般的にはウイ
ルスの画定された領域のクローニングおよび発現によっ
て除外される。更に、特異的なウイルスタンパク質に向
けられた識別的な診断が可能である。しかしながら、免
疫学的アッセイにおいて組換えタンパク質を用いるに
は、宿主細胞の混入成分が、血清試料と偽陽性反応を生
じないようにしなければならない。この場合には、この
品質を達成するには、特異的で、通常は極めて複雑な精
製法が必要である。
herichia coli)において高収率で調製することができる
組換えタンパク質を使用することによって、明らかに改
良される。ＨＣＭＶの感染の可能性は、一般的にはウイ
ルスの画定された領域のクローニングおよび発現によっ
て除外される。更に、特異的なウイルスタンパク質に向
けられた識別的な診断が可能である。しかしながら、免
疫学的アッセイにおいて組換えタンパク質を用いるに
は、宿主細胞の混入成分が、血清試料と偽陽性反応を生
じないようにしなければならない。この場合には、この
品質を達成するには、特異的で、通常は極めて複雑な精
製法が必要である。
【０００５】更に、組換えタンパク質は、免疫状態を明
確に画定し且つ診断的妥当性または保護状態（ワクチ
ン）の産生のための妥当性を有する免疫学的反応性エピ
トープを有していなければならない。ほとんどの場合に
は、これらのエピトープは、用いられる発現系のほとん
どについて異種タンパク質を表わし、タンパク質分解反
応を速やかに受けるので、これらを組換え法によっては
本来の形態で調製することができない。このため、それ
らは、発現生成物を安定化させる融合パートナーとして
宿主タンパク質、例えば大腸菌の場合にはβ‐ガラクト
シダーゼと共に通常はハイブリッドタンパク質として発
現される。しかしながら、この融合体の外来部分は、下
記の精製段階のために、組換えタンパク質の診断使用を
妨害する偽陽性反応を生じることがある。
確に画定し且つ診断的妥当性または保護状態（ワクチ
ン）の産生のための妥当性を有する免疫学的反応性エピ
トープを有していなければならない。ほとんどの場合に
は、これらのエピトープは、用いられる発現系のほとん
どについて異種タンパク質を表わし、タンパク質分解反
応を速やかに受けるので、これらを組換え法によっては
本来の形態で調製することができない。このため、それ
らは、発現生成物を安定化させる融合パートナーとして
宿主タンパク質、例えば大腸菌の場合にはβ‐ガラクト
シダーゼと共に通常はハイブリッドタンパク質として発
現される。しかしながら、この融合体の外来部分は、下
記の精製段階のために、組換えタンパク質の診断使用を
妨害する偽陽性反応を生じることがある。
【０００６】一般的にＨＣＭＶに対する免疫状態を測定
するのに好適なタンパク質が同定されている。このタン
パク質については、タンパク質ｐｐ１５０、完全なＤＮ
Ａ配列並びに１６２個のアミノ酸の長さの断片（プラス
ミドとしてクローニングされたｐＸＰ１と呼ばれるＸｈ
ｏＩ−ＰｓｔＩ制限フラグメント）が知られており、明
確な診断に適切な配列を含んでいる（ジャン・ジー(Jah
n, G.)ら、（１９８７年）、J. Virol. 61, 1358-1367
）。
するのに好適なタンパク質が同定されている。このタン
パク質については、タンパク質ｐｐ１５０、完全なＤＮ
Ａ配列並びに１６２個のアミノ酸の長さの断片（プラス
ミドとしてクローニングされたｐＸＰ１と呼ばれるＸｈ
ｏＩ−ＰｓｔＩ制限フラグメント）が知られており、明
確な診断に適切な配列を含んでいる（ジャン・ジー(Jah
n, G.)ら、（１９８７年）、J. Virol. 61, 1358-1367
）。
【０００７】ジェイ・ノバック(J. Novak)ら（ジェイ・
ノバック(J. Novak)ら（１９９１年）、J. Gen. Virol.
72, 1409-1413）は、合成的に調製したペプチドを用い
て、完全なｐｐ１５０タンパク質について、３個だけの
免疫反応性領域であってその内の２個の領域が制限エン
ドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＰｓｔＩの開裂部位の間
（ＸＰ１領域、第１表（表１））に位置している領域を
見出した。
ノバック(J. Novak)ら（１９９１年）、J. Gen. Virol.
72, 1409-1413）は、合成的に調製したペプチドを用い
て、完全なｐｐ１５０タンパク質について、３個だけの
免疫反応性領域であってその内の２個の領域が制限エン
ドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＰｓｔＩの開裂部位の間
（ＸＰ１領域、第１表（表１））に位置している領域を
見出した。
【０００８】アミノ酸は、第１表では、下記のキーにし
たがった単一文字コードとして再現される：Ａｌａ＝
Ａ、Ａｒｇ＝Ｒ、Ａｓｎ＝Ｎ、Ａｓｐ＝Ｄ、Ｃｙｓ＝
Ｃ、Ｇｌｎ＝Ｑ、Ｇｌｕ＝Ｅ、Ｇｌｙ＝Ｇ、Ｈｉｓ＝
Ｈ、Ｉｌｅ＝Ｉ、Ｌｅｕ＝Ｌ、Ｌｙｓ＝Ｋ、Ｍｅｔ＝
Ｍ、Ｐｈｅ＝Ｆ、Ｐｒｏ＝Ｐ、Ｓｅｒ＝Ｓ、Ｔｈｒ＝
Ｔ、Ｔｒｐ＝Ｗ、Ｔｙｒ＝ＹおよびＶａｌ＝Ｖ。
たがった単一文字コードとして再現される：Ａｌａ＝
Ａ、Ａｒｇ＝Ｒ、Ａｓｎ＝Ｎ、Ａｓｐ＝Ｄ、Ｃｙｓ＝
Ｃ、Ｇｌｎ＝Ｑ、Ｇｌｕ＝Ｅ、Ｇｌｙ＝Ｇ、Ｈｉｓ＝
Ｈ、Ｉｌｅ＝Ｉ、Ｌｅｕ＝Ｌ、Ｌｙｓ＝Ｋ、Ｍｅｔ＝
Ｍ、Ｐｈｅ＝Ｆ、Ｐｒｏ＝Ｐ、Ｓｅｒ＝Ｓ、Ｔｈｒ＝
Ｔ、Ｔｒｐ＝Ｗ、Ｔｙｒ＝ＹおよびＶａｌ＝Ｖ。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の基礎となって
いる目的は、第一にできるだけ早期に且つ高い特異性で
ＨＣＭＶ感染を検出することが可能なアッセイを開発す
ることである。
いる目的は、第一にできるだけ早期に且つ高い特異性で
ＨＣＭＶ感染を検出することが可能なアッセイを開発す
ることである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】意外なことには、ＸＰ１
領域についてノバック(Novak) らによって見出された免
疫反応性領域を確かめることはできず、この代わりにノ
バック(Novak) らのものとは異なる３個の免疫反応性領
域を見出した。更に、免疫状態の実質的に完全な測定
は、特にイムノアッセイにおける本発明による総ての３
種類のエピトープを用いことにより可能であることも見
出した。
領域についてノバック(Novak) らによって見出された免
疫反応性領域を確かめることはできず、この代わりにノ
バック(Novak) らのものとは異なる３個の免疫反応性領
域を見出した。更に、免疫状態の実質的に完全な測定
は、特にイムノアッセイにおける本発明による総ての３
種類のエピトープを用いことにより可能であることも見
出した。
【００１１】それ故、本発明は、ＨＣＭＶに対する抗体
と特異的に反応し、且つ下記のアミノ酸配列の少なくと
も１つを含むペプチドに関する： ASe -gly ala gly ala ala ile leu -BSm （ペプチド１） CSn -arg ala trp ala leu -DSo （ペプチド２） および／または ESp -ala ser arg asp ala ala -FSq （ペプチド３） 但し、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互
いに独立に、任意の適当なアミノ酸であり、ｅは、互い
に独立に０〜２２の整数であり、ｍは、互いに独立に０
〜２５の整数であり、ｎおよびｏは、互いに独立に０〜
１８の整数であり、ｐおよびｑは、互いに独立に０〜１
１の整数である。
と特異的に反応し、且つ下記のアミノ酸配列の少なくと
も１つを含むペプチドに関する： ASe -gly ala gly ala ala ile leu -BSm （ペプチド１） CSn -arg ala trp ala leu -DSo （ペプチド２） および／または ESp -ala ser arg asp ala ala -FSq （ペプチド３） 但し、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互
いに独立に、任意の適当なアミノ酸であり、ｅは、互い
に独立に０〜２２の整数であり、ｍは、互いに独立に０
〜２５の整数であり、ｎおよびｏは、互いに独立に０〜
１８の整数であり、ｐおよびｑは、互いに独立に０〜１
１の整数である。
【００１２】好ましいペプチドは、ペプチド１について ：
【化５】
【化６】
【００１３】ペプチド２について：
【化７】
【００１４】ペプチド３について：
【化８】
【００１５】これらのうちで、下記のペプチドが特に好
ましい。ペプチド１について ：１．３、１．４、１．６、１．１
１、１．１３。ペプチド２について ：２．１、２．５、２．９および／
または２．１０。ペプチド３について ：３．２。
ましい。ペプチド１について ：１．３、１．４、１．６、１．１
１、１．１３。ペプチド２について ：２．１、２．５、２．９および／
または２．１０。ペプチド３について ：３．２。
【００１６】発現ペプチドおよびポリペプチドは、約８
０個までのＡＡを有するペプチドおよびタンパク質と同
等なものとして本発明の目的に用いられる。
０個までのＡＡを有するペプチドおよびタンパク質と同
等なものとして本発明の目的に用いられる。
【００１７】免疫反応性ペプチドとは、一般的には少な
くとも１個のエピトープを有するペプチドであって、そ
のペプチドの長さの最小値が通常は約６、好ましくは約
８〜１０アミノ酸であるものを意味する。
くとも１個のエピトープを有するペプチドであって、そ
のペプチドの長さの最小値が通常は約６、好ましくは約
８〜１０アミノ酸であるものを意味する。
【００１８】ペプチドを、各種の方法、例えば１または
２以上のアミノ酸、好ましくはシステインのアミノ末端
またはカルボキシ末端付着によって誘導体形成させ、例
えばペプチドを互いにまたは支持体と結合させるのが有
利であることが多い。この伸長は、通常は１〜４０、好
ましくは１〜２０、特に１〜１０個のアミノ酸を含んで
いる。他の例は、例えばアンモニアまたはメチルアミン
を用いるチオグリコール酸のアミド化、カルボキシ末端
のアミド化である。これらのタイプのものを修飾する
と、ポリペプチド上の真の電荷が変化することがあり、
ペプチドの物理化学的特性が改良されまたはこのペプチ
ドの固形支持体、キャリヤータンパク質またはもう一つ
のペプチドへの共有結合が促進される。
２以上のアミノ酸、好ましくはシステインのアミノ末端
またはカルボキシ末端付着によって誘導体形成させ、例
えばペプチドを互いにまたは支持体と結合させるのが有
利であることが多い。この伸長は、通常は１〜４０、好
ましくは１〜２０、特に１〜１０個のアミノ酸を含んで
いる。他の例は、例えばアンモニアまたはメチルアミン
を用いるチオグリコール酸のアミド化、カルボキシ末端
のアミド化である。これらのタイプのものを修飾する
と、ポリペプチド上の真の電荷が変化することがあり、
ペプチドの物理化学的特性が改良されまたはこのペプチ
ドの固形支持体、キャリヤータンパク質またはもう一つ
のペプチドへの共有結合が促進される。
【００１９】個々のアミノ酸を構造的に関連したアミノ
酸で置換することによって、免疫反応性の変異体を生じ
させることも可能である。例えば、アミノ酸ｖａｌをｌ
ｅｕ、ｉｌｅまたはｎｖａのような天然には存在しない
アミノ酸で置換することができる。
酸で置換することによって、免疫反応性の変異体を生じ
させることも可能である。例えば、アミノ酸ｖａｌをｌ
ｅｕ、ｉｌｅまたはｎｖａのような天然には存在しない
アミノ酸で置換することができる。
【００２０】通常は、このタイプの修飾はペプチドの免
疫反応性の方向を変更しないが、これらのペプチドの免
疫学的特性を改良することはまったく可能である。例え
ば、メチオニンは自然酸化し易いが、これはノルロイシ
ンによって置換することによって、ポリペプチドの抗原
特性を本質的に変化させることなく防止することができ
る。
疫反応性の方向を変更しないが、これらのペプチドの免
疫学的特性を改良することはまったく可能である。例え
ば、メチオニンは自然酸化し易いが、これはノルロイシ
ンによって置換することによって、ポリペプチドの抗原
特性を本質的に変化させることなく防止することができ
る。
【００２１】他のアミノ酸の置換は、例えば下記の群の
内部で起こることができる：ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，
ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓ
ｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；ｐｈｅ，ｔｙｒ；ａｌ
ａ，ｓｅｒ；ａｌａ，ｔｈｒ；ａｌａ，ｖａｌ；ａｌ
ａ，ｐｒｏ；ａｌａ，ｇｌｕ；ｌｅｕ，ｇｌｎ；ｇｌ
ｙ，ｐｈｅ；ｉｌｅ，ｓｅｒおよびｉｌｅ，ｍｅｔ。
内部で起こることができる：ｇｌｙ，ａｌａ；ｖａｌ，
ｉｌｅ，ｌｅｕ；ａｓｐ，ｇｌｕ；ａｓｎ，ｇｌｎ；ｓ
ｅｒ，ｔｈｒ；ｌｙｓ，ａｒｇ；ｐｈｅ，ｔｙｒ；ａｌ
ａ，ｓｅｒ；ａｌａ，ｔｈｒ；ａｌａ，ｖａｌ；ａｌ
ａ，ｐｒｏ；ａｌａ，ｇｌｕ；ｌｅｕ，ｇｌｎ；ｇｌ
ｙ，ｐｈｅ；ｉｌｅ，ｓｅｒおよびｉｌｅ，ｍｅｔ。
【００２２】それ故、本発明は、１または２以上のアミ
ノ酸の置換、付加または欠失によって修飾された本発明
のアミノ酸配列を有するペプチドにも関する。
ノ酸の置換、付加または欠失によって修飾された本発明
のアミノ酸配列を有するペプチドにも関する。
【００２３】約２〜２０個の疎水性アミノ酸を含む疎水
性配列、例えばｐｈｅ ａｌａ ｐｈｅ ａｌａ ｐｈ
ｅを付加することによって、支持体へのポリペプチドの
吸着特性を改良することも、同様に有利であることがあ
る。
性配列、例えばｐｈｅ ａｌａ ｐｈｅ ａｌａ ｐｈ
ｅを付加することによって、支持体へのポリペプチドの
吸着特性を改良することも、同様に有利であることがあ
る。
【００２４】本発明によるペプチドの混合物は、免疫化
学的抗−ＨＣＭＶの検出のための単一のペプチドよりも
良好な診断特性を有することがあることも見出した。
学的抗−ＨＣＭＶの検出のための単一のペプチドよりも
良好な診断特性を有することがあることも見出した。
【００２５】それ故、本発明は、本発明によるペプチド
の混合物にも関する。
の混合物にも関する。
【００２６】ペプチド１、２および３の混合物が特に好
適であり、また下記の混合物が特に好ましい：１．６，
２．１，３．２；１．１１，２．１，３．２；１．６，
２．１０，３．２；１．１１，２．１０，３．２；１．
６，２．７，３．２または１．１１，２．７，３．２。
適であり、また下記の混合物が特に好ましい：１．６，
２．１，３．２；１．１１，２．１，３．２；１．６，
２．１０，３．２；１．１１，２．１０，３．２；１．
６，２．７，３．２または１．１１，２．７，３．２。
【００２７】しかしながら、混合物をペプチドから調製
して、例えばマイクロタイタープレートをコーティング
するのに用いる場合には、ペプチドは、物理的特性が異
なるため表面への結合の効率が変化するため、コーティ
ングが不均一になる危険性がある。
して、例えばマイクロタイタープレートをコーティング
するのに用いる場合には、ペプチドは、物理的特性が異
なるため表面への結合の効率が変化するため、コーティ
ングが不均一になる危険性がある。
【００２８】それ故、もう一つの態様では、前記のペプ
チドの２または３以上、好ましくは２〜１０、特に２〜
４個のペプチドをスペーサーを用いてまたは用いること
なく結合させる。これによって、マイクロタイタープレ
ートのコーティングが均一になる。当業者に知られてい
る方法によって２または３以上のペプチドの重合形態を
調製して、多数の免疫関連エピトープが一つのペプチド
上に存在するようにすることも可能である。前記のよう
に、本発明によるペプチドを、例えばタンパク質または
ラテックス粒子のようなキャリヤーに結合させることも
できる。従って例えば、キャリヤーとして或いは架橋剤
として特に好適なものは、ヒト血清アルブミンおよび／
またはポリリシンである。
チドの２または３以上、好ましくは２〜１０、特に２〜
４個のペプチドをスペーサーを用いてまたは用いること
なく結合させる。これによって、マイクロタイタープレ
ートのコーティングが均一になる。当業者に知られてい
る方法によって２または３以上のペプチドの重合形態を
調製して、多数の免疫関連エピトープが一つのペプチド
上に存在するようにすることも可能である。前記のよう
に、本発明によるペプチドを、例えばタンパク質または
ラテックス粒子のようなキャリヤーに結合させることも
できる。従って例えば、キャリヤーとして或いは架橋剤
として特に好適なものは、ヒト血清アルブミンおよび／
またはポリリシンである。
【００２９】これらのタイプの修飾により、通常は、有
益な方法での固相への受身吸着または共有結合の特性が
変化し、結合法に有利な効果を及ぼし、またはペプチド
に対する多クローン性抗体または単クローン性抗体の生
成において一層強力に抗原として作用する。
益な方法での固相への受身吸着または共有結合の特性が
変化し、結合法に有利な効果を及ぼし、またはペプチド
に対する多クローン性抗体または単クローン性抗体の生
成において一層強力に抗原として作用する。
【００３０】それ故、本発明は、架橋剤を用いてまたは
用いることなしに互いに結合し、またはキャリヤーに結
合させることもできるペプチドにも関する。
用いることなしに互いに結合し、またはキャリヤーに結
合させることもできるペプチドにも関する。
【００３１】前記の免疫反応性ペプチドは、合成または
遺伝子操作により、好ましくは当業者に知られている方
法による合成によって、調製することができる。
遺伝子操作により、好ましくは当業者に知られている方
法による合成によって、調製することができる。
【００３２】それらは、１個のペプチドの形態でも或い
は重複または非重複合アミノ酸配列を有する複数の小さ
なペプチドの混合物の形態でも、合成することができ
る。
は重複または非重複合アミノ酸配列を有する複数の小さ
なペプチドの混合物の形態でも、合成することができ
る。
【００３３】遺伝子操作によって調製されるポリペプチ
ドには、融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク
質も包含する。それらは、例えばグリコシル化、アセチ
ル化またはホスホリル化などにより適当な場合に修飾す
ることができるポリペプチドも包含する。
ドには、融合部分が後で除去されてしまう融合タンパク
質も包含する。それらは、例えばグリコシル化、アセチ
ル化またはホスホリル化などにより適当な場合に修飾す
ることができるポリペプチドも包含する。
【００３４】固相合成、特にジー・ビー・フィールズ
(G.B. Fields) およびアール・エル・ノーブル(R.L. No
ble)のＦｍｏｃ法が、化学的ペプチド合成に好ましく用
いられてきている。この方法を用いると、本発明による
ペプチドは、例えばＦｍｏｃに好適なアンカーを用い
て、ポリスチレン（１％ジビニルベンゼン）上で半自動
的または完全自動的ペプチドシンセサイザー中で調製す
ることができる。カルボキシルまたはカルボキサミド官
能基（functionality ）を、例えばＣ末端に用いること
ができる。カルボキシル基の場合には、アルコキシベン
ジルアルコールを樹脂上でアンカーとして用いることが
可能であり、好ましい。ペプチドアミドは、例えばブラ
イポール(Breipohl)らの方法（ジー・ブライポール(G.
Breipohl) 、ジェイ・クノール(J. Knolle) およびダブ
リュ・ステューバー(W. Stueber)、Int. J. Peptide, P
rotein Res. 34, 1989, 252-267 ）によって［（５−カ
ルボキシラトエチル−２，４−ジメトキシフェニル）−
４′−メトキシフェニル］メチルアミン樹脂上で合成す
ることができる。樹脂の初期の充填量は、１ｇ当たりの
アミノ官能基が０．２〜１．０ミリモル、好ましくは
０．４〜０．６ミリモルであった。合成は、下記の一般
的反応順序によって行った： １． 例えば、ＤＭＦでの樹脂の洗浄。 ２． 例えば、ピペリジン／ＤＭＦのような溶媒混合物
での樹脂の処理。 ３． 好ましくは、最初にＤＭＦ／イソプロパノール
で、次いでＤＭＦでの樹脂の洗浄。 ４． 樹脂と、活性化されたアミノ酸誘導体、例えばＦ
ｍｏｃで活性化されたアミノ酸の１〜６倍、好ましくは
２〜４倍、特に２．５〜３．５倍過剰量との反応。アミ
ノ酸誘導体は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔまたはＤＭＦ中でＴＢ
ＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて活性化した。 ５． 反応段階３および４の繰り返し。
(G.B. Fields) およびアール・エル・ノーブル(R.L. No
ble)のＦｍｏｃ法が、化学的ペプチド合成に好ましく用
いられてきている。この方法を用いると、本発明による
ペプチドは、例えばＦｍｏｃに好適なアンカーを用い
て、ポリスチレン（１％ジビニルベンゼン）上で半自動
的または完全自動的ペプチドシンセサイザー中で調製す
ることができる。カルボキシルまたはカルボキサミド官
能基（functionality ）を、例えばＣ末端に用いること
ができる。カルボキシル基の場合には、アルコキシベン
ジルアルコールを樹脂上でアンカーとして用いることが
可能であり、好ましい。ペプチドアミドは、例えばブラ
イポール(Breipohl)らの方法（ジー・ブライポール(G.
Breipohl) 、ジェイ・クノール(J. Knolle) およびダブ
リュ・ステューバー(W. Stueber)、Int. J. Peptide, P
rotein Res. 34, 1989, 252-267 ）によって［（５−カ
ルボキシラトエチル−２，４−ジメトキシフェニル）−
４′−メトキシフェニル］メチルアミン樹脂上で合成す
ることができる。樹脂の初期の充填量は、１ｇ当たりの
アミノ官能基が０．２〜１．０ミリモル、好ましくは
０．４〜０．６ミリモルであった。合成は、下記の一般
的反応順序によって行った： １． 例えば、ＤＭＦでの樹脂の洗浄。 ２． 例えば、ピペリジン／ＤＭＦのような溶媒混合物
での樹脂の処理。 ３． 好ましくは、最初にＤＭＦ／イソプロパノール
で、次いでＤＭＦでの樹脂の洗浄。 ４． 樹脂と、活性化されたアミノ酸誘導体、例えばＦ
ｍｏｃで活性化されたアミノ酸の１〜６倍、好ましくは
２〜４倍、特に２．５〜３．５倍過剰量との反応。アミ
ノ酸誘導体は、ＤＩＣ／ＨＯＢｔまたはＤＭＦ中でＴＢ
ＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて活性化した。 ５． 反応段階３および４の繰り返し。
【００３５】必要なペプチドを合成した後、ペプチド
を、例えば９０％ＴＦＡ、５％エタンジチオール、５％
レゾルシノールで、室温で処理することによって、樹脂
から開裂させた。開裂したペプチドは、次いでエーテル
から結晶化させ、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフ
ィまたはゲル浸透のような一般的方法によって精製し
た。ペプチドの組成は、アミノ酸分析および／またはマ
ススペクトル分析法によってチェックすることができ、
純度は、例えばＨＰＬＣによって試験することができ
る。
を、例えば９０％ＴＦＡ、５％エタンジチオール、５％
レゾルシノールで、室温で処理することによって、樹脂
から開裂させた。開裂したペプチドは、次いでエーテル
から結晶化させ、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフ
ィまたはゲル浸透のような一般的方法によって精製し
た。ペプチドの組成は、アミノ酸分析および／またはマ
ススペクトル分析法によってチェックすることができ、
純度は、例えばＨＰＬＣによって試験することができ
る。
【００３６】ブリッジ結合したペプチドも、同様に一般
的に知られている方法によって調製した。下記の可能性
は、とりわけブリッジ結合に対して存在する： Ａ） 直接的アミド結合； Ｂ） １〜１０個、好ましくは１〜５個、特に１〜３個
のアミノ酸を有するペプチドを介するブリッジ結合； Ｃ） チオエーテルまたはジスルフィド結合。
的に知られている方法によって調製した。下記の可能性
は、とりわけブリッジ結合に対して存在する： Ａ） 直接的アミド結合； Ｂ） １〜１０個、好ましくは１〜５個、特に１〜３個
のアミノ酸を有するペプチドを介するブリッジ結合； Ｃ） チオエーテルまたはジスルフィド結合。
【００３７】アミノ酸または短いペプチドでブリッジ結
合したペプチドは、前記の方法によって合成することが
できる。好適な短いペプチドの例は、トリグリシンであ
る。いわゆるスペーサーにより、特に疎水性スペーサー
により２つのペプチドを結合すると、前記のように、一
般的にはマイクロタイタープレートの相互作用に有益な
効果を及ぼす。ブリッジ結合要素として特に好ましいア
ミノ酸は、例えばε−アミノ−カプロン酸である。
合したペプチドは、前記の方法によって合成することが
できる。好適な短いペプチドの例は、トリグリシンであ
る。いわゆるスペーサーにより、特に疎水性スペーサー
により２つのペプチドを結合すると、前記のように、一
般的にはマイクロタイタープレートの相互作用に有益な
効果を及ぼす。ブリッジ結合要素として特に好ましいア
ミノ酸は、例えばε−アミノ−カプロン酸である。
【００３８】チオエーテルまたはジスルフィド結合は、
一つのペプチドのＮ末端にマレイミド官能基を合成し、
他のペプチドのＣまたはＮ末端にスルフィドリル基を、
好ましくはシステインの形態で導入した後、２つのペプ
チドを結合することによって得られる。この結合は、固
形支持体上でも、溶液中でも生じさせることができる。
一つのペプチドのＮ末端にマレイミド官能基を合成し、
他のペプチドのＣまたはＮ末端にスルフィドリル基を、
好ましくはシステインの形態で導入した後、２つのペプ
チドを結合することによって得られる。この結合は、固
形支持体上でも、溶液中でも生じさせることができる。
【００３９】免疫化学的検出法は、通常は血清、血漿、
唾液、脳脊髄液または尿のような体液中で抗原および／
または抗体を測定することができる、ホモジニアス（溶
液中）またはヘテロジニアス（固相を用いる）方法とし
ての方法から成っている。これらは、イムノアッセイと
も呼ばれ、例としてはエンザイムイムノアッセイ（ＥＬ
ＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、イムノフルオレッセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラ
ジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）または寒天ゲル拡
散アッセイなどである。
唾液、脳脊髄液または尿のような体液中で抗原および／
または抗体を測定することができる、ホモジニアス（溶
液中）またはヘテロジニアス（固相を用いる）方法とし
ての方法から成っている。これらは、イムノアッセイと
も呼ばれ、例としてはエンザイムイムノアッセイ（ＥＬ
ＩＳＡまたはＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）、イムノフルオレッセンスアッセイ（ＩＦＡ）、ラ
ジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）または寒天ゲル拡
散アッセイなどである。
【００４０】これらの多数の極めて様々な方法は、特定
の態様、検出または測定原理に用いられるマーカー（例
えば光度測定法、放射能測定法、視覚的または凝集、散
乱光または沈降挙動）、および固相が異なる。当業者
は、結合したおよび遊離の試料である抗体または抗原の
分離は、広く用いられているが、例えばいわゆるホモジ
ニアス法には必ずしも必要ではないことを承知してい
る。ヘテロジニアスイムノアッセイ、特にヘテロジニア
スＥＬＩＳＡ法が好ましい。
の態様、検出または測定原理に用いられるマーカー（例
えば光度測定法、放射能測定法、視覚的または凝集、散
乱光または沈降挙動）、および固相が異なる。当業者
は、結合したおよび遊離の試料である抗体または抗原の
分離は、広く用いられているが、例えばいわゆるホモジ
ニアス法には必ずしも必要ではないことを承知してい
る。ヘテロジニアスイムノアッセイ、特にヘテロジニア
スＥＬＩＳＡ法が好ましい。
【００４１】免疫化学的検出法における抗体の検出に
は、操作中に試料を前記のペプチド配列と接触させて、
関連した方法の特定の段階で抗原−抗体複合体を形成さ
せるか、または好適な標識した試薬を加えることによっ
て、競合および阻止アッセイにおいてその形成を防止す
る必要がある。
は、操作中に試料を前記のペプチド配列と接触させて、
関連した方法の特定の段階で抗原−抗体複合体を形成さ
せるか、または好適な標識した試薬を加えることによっ
て、競合および阻止アッセイにおいてその形成を防止す
る必要がある。
【００４２】それ故、本発明は、本発明によるペプチド
を用いるＨＣＭＶ抗体の検出および／または測定のため
の免疫化学的方法、およびそのためのアッセイキットに
も関する。
を用いるＨＣＭＶ抗体の検出および／または測定のため
の免疫化学的方法、およびそのためのアッセイキットに
も関する。
【００４３】直接法では、抗体を、固相に結合したペプ
チドまたは標識したペプチド或いは両方と接触させるこ
とができるが、基本的方法が、一、二または多段階法と
して、第二抗体のアッセイの原理または固相上のおよび
検出のための液体試薬として同一または異なるペプチド
（またはペプチド混合物）を有する免疫学的アッセイ設
定（二重抗原サンドイッチ）に基づいており、且つ特異
的ないわゆる捕獲（例えば、抗−ＩｇＭ）またはアフィ
ニティ試薬（例えば、プロテインＡ）と関連しているか
どうかは無関係である。
チドまたは標識したペプチド或いは両方と接触させるこ
とができるが、基本的方法が、一、二または多段階法と
して、第二抗体のアッセイの原理または固相上のおよび
検出のための液体試薬として同一または異なるペプチド
（またはペプチド混合物）を有する免疫学的アッセイ設
定（二重抗原サンドイッチ）に基づいており、且つ特異
的ないわゆる捕獲（例えば、抗−ＩｇＭ）またはアフィ
ニティ試薬（例えば、プロテインＡ）と関連しているか
どうかは無関係である。
【００４４】ペプチドは、固相に共有結合的に、吸着に
よってまたは特異的抗体または同様なアフィニティ法に
よって、例えばビオチン−アビジン複合体を介して結合
することができるが、吸着が好ましい。
よってまたは特異的抗体または同様なアフィニティ法に
よって、例えばビオチン−アビジン複合体を介して結合
することができるが、吸着が好ましい。
【００４５】固相に対する支持体材料として好適なもの
は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドおよび
他の合成ポリマーのようなプラスチック、セルロースの
ような天然ポリマー、および酢酸セルロースおよびニト
ロセルロースのような誘導体形成した天然ポリマー、並
びにガラス、特にガラス繊維である。ポリスチレンが、
支持体材料として好ましい。
は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミドおよび
他の合成ポリマーのようなプラスチック、セルロースの
ような天然ポリマー、および酢酸セルロースおよびニト
ロセルロースのような誘導体形成した天然ポリマー、並
びにガラス、特にガラス繊維である。ポリスチレンが、
支持体材料として好ましい。
【００４６】支持体は、ビーズ、棒、管およびマイクロ
タイタープレートの形態であるか、または懸濁液、例え
ばラテックス粒子の形態を採ることができる。紙片、デ
ィスクおよび膜のようなシート様構造も、同様に好適で
ある。これらの支持体の表面は、水性溶液に対して透過
性および不透過性のいずれにすることもできる。
タイタープレートの形態であるか、または懸濁液、例え
ばラテックス粒子の形態を採ることができる。紙片、デ
ィスクおよび膜のようなシート様構造も、同様に好適で
ある。これらの支持体の表面は、水性溶液に対して透過
性および不透過性のいずれにすることもできる。
【００４７】好ましい支持体は、ビーズ、管、ウェル、
微小粒子、紙片および膜である。特に好ましい支持体
は、マイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリ
スチレンビーズまたは磁力によって付着可能な粒子であ
る。
微小粒子、紙片および膜である。特に好ましい支持体
は、マイクロタイタープレート、ラテックス粒子、ポリ
スチレンビーズまたは磁力によって付着可能な粒子であ
る。
【００４８】この支持体をコーティングするためのペプ
チド濃度は、一般的には約０．０１〜２０μｇ／ｍｌ、
好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは
２〜１０μｇ／ｍｌである。
チド濃度は、一般的には約０．０１〜２０μｇ／ｍｌ、
好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、特に好ましくは
２〜１０μｇ／ｍｌである。
【００４９】純度が高く且つ抗原性が強いために用いる
量が極めて少量、例えば０．０１〜２．０μｇ／ｍｌ、
好ましくは０．１〜０．５μｇ／ｍｌでよい合成的に調
製したポリペプチドを用いるのが特に有利である。特
に、ポリスチレンを用いるときには、支持体の結合容量
は、通常は飽和せず、複数の異なるポリペプチド、特に
２〜５種類の、特に３〜４種類の異なるポリペプチドで
コーティングすることが通常は可能であり、これは特に
有利である。
量が極めて少量、例えば０．０１〜２．０μｇ／ｍｌ、
好ましくは０．１〜０．５μｇ／ｍｌでよい合成的に調
製したポリペプチドを用いるのが特に有利である。特
に、ポリスチレンを用いるときには、支持体の結合容量
は、通常は飽和せず、複数の異なるポリペプチド、特に
２〜５種類の、特に３〜４種類の異なるポリペプチドで
コーティングすることが通常は可能であり、これは特に
有利である。
【００５０】ペプチドを、検出のための標識誘導体とし
て用いるときには、当業者に知られている総ての結合手
法が好適である。抗体が標識を有する予め形成したペプ
チド−抗体複合体のような多段階法、またはたとえばこ
れらの反応物の一つの標識を有するビオチン／アジビン
のような高アフィニティ系を適用することも可能であ
る。
て用いるときには、当業者に知られている総ての結合手
法が好適である。抗体が標識を有する予め形成したペプ
チド−抗体複合体のような多段階法、またはたとえばこ
れらの反応物の一つの標識を有するビオチン／アジビン
のような高アフィニティ系を適用することも可能であ
る。
【００５１】用いることができるマーカーの例は、放射
性同位元素、螢光または化学ルミネセンス染料である。
用いることができるマーカーには、例えば発色性、発光
性または螢光性基質系によりまたは次の増幅器系であっ
て第一の酵素によって活性化される第二の酵素を有する
系によって検出される酵素も用いることができる。
性同位元素、螢光または化学ルミネセンス染料である。
用いることができるマーカーには、例えば発色性、発光
性または螢光性基質系によりまたは次の増幅器系であっ
て第一の酵素によって活性化される第二の酵素を有する
系によって検出される酵素も用いることができる。
【００５２】好ましく用いられるマーカーは、酵素、特
にアルカリ性ホスファターゼおよび／または西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、または化学発光性化合物、例えばア
クリジニウムエステルである。
にアルカリ性ホスファターゼおよび／または西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ、または化学発光性化合物、例えばア
クリジニウムエステルである。
【００５３】標識は、前記のマーカーについて当該技術
分野に記載されている方法によって行われる。抗体のペ
ルオキシダーゼによる標識の場合には、ナカネ(NAKANE)
ら、１９７４年、J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1
090 の過ヨウ素酸塩法またはイシカワ(ISHIKAWA)ら、１
９８３年、J. Immunoassay 4, 209-327 の、パートナー
を異種二機能性試薬によって結合する方法を用いること
が可能である。
分野に記載されている方法によって行われる。抗体のペ
ルオキシダーゼによる標識の場合には、ナカネ(NAKANE)
ら、１９７４年、J. Histochem. Cytochem. 22, 1084-1
090 の過ヨウ素酸塩法またはイシカワ(ISHIKAWA)ら、１
９８３年、J. Immunoassay 4, 209-327 の、パートナー
を異種二機能性試薬によって結合する方法を用いること
が可能である。
【００５４】これらの方法の外に、好適な表面、例えば
ラテックスまたは赤血球を敏感にするペプチドを用い
て、ペプチド特異性抗体によって誘発される物理化学的
変化、例えば沈澱、凝集または光散乱を自動的にまたは
視覚的に測定することも可能である。誘導体形成されて
いないペプチドを用いて、これらの測定原理並びに前記
の方法を阻止することも可能であることが知られてい
る。
ラテックスまたは赤血球を敏感にするペプチドを用い
て、ペプチド特異性抗体によって誘発される物理化学的
変化、例えば沈澱、凝集または光散乱を自動的にまたは
視覚的に測定することも可能である。誘導体形成されて
いないペプチドを用いて、これらの測定原理並びに前記
の方法を阻止することも可能であることが知られてい
る。
【００５５】抗原は、本発明によるペプチドまたはその
誘導体を用いて調製される多クローン性または単クロー
ン性抗体を用いる免疫診断法を用いて検出することがで
きる。この検出法に好適な態様は、当業者に知られてお
り、特定の段階における抗体−抗原複合体の形成または
標識した抗原を添加することによる競合方法における複
合体の形成の阻止を含んでいる。
誘導体を用いて調製される多クローン性または単クロー
ン性抗体を用いる免疫診断法を用いて検出することがで
きる。この検出法に好適な態様は、当業者に知られてお
り、特定の段階における抗体−抗原複合体の形成または
標識した抗原を添加することによる競合方法における複
合体の形成の阻止を含んでいる。
【００５６】それ故、本発明は、本発明によるペプチド
に対する抗体を用いるＨＣＭＶ抗原の検出および／また
は測定のための免疫化学的方法、およびそのためのアッ
セイキットにも関する。
に対する抗体を用いるＨＣＭＶ抗原の検出および／また
は測定のための免疫化学的方法、およびそのためのアッ
セイキットにも関する。
【００５７】固相、マーカーまたは抗原アッセイの確立
のための測定原理として好適なものは、対応する抗体測
定のために説明した総ての可能性が挙げられ、競合原理
および二重抗体サンドイッチ法が免疫化学的方法として
特に好適である。これに関して、これらの方法が１、２
または３段階法として設定されているかどうかは重要で
はない。したがって多段階法は、標識されていない検出
抗体であってそれらに向けられており適当に標識されて
いるもう一つの抗体を用いて測定される検出抗体を用い
て行うことができる。抗体を生じさせるためには、ペプ
チドを、それらの免疫原性が、例えば天然タンパク質、
例えばガンマーグロブリンまたは血清アルブミンのよう
な血清タンパク質、キーホールリンペット（keyhole li
mpet hemocyanin;ＫＬＨ）のようなヘモシアニンまたは
ジフテリアまたは破傷風トキソイドのようなトキソイド
に結合させることによってできる限り改良するように修
飾するのが有利である（ビー・エス・シャッフハウゼン
(B.S. Schaffhausen) 、生科学および医学におけるハイ
ブリドーマテクノロジー(Hybridoma Technologie in th
e Biosciences and Medicine) 、ティー・エイ・スプリ
ンガー(T.A. Springer) 監修、ブレナム・プレス・ニュ
ーヨーク(Plenum Press NY) 、ロンドン、１９８５
年）。
のための測定原理として好適なものは、対応する抗体測
定のために説明した総ての可能性が挙げられ、競合原理
および二重抗体サンドイッチ法が免疫化学的方法として
特に好適である。これに関して、これらの方法が１、２
または３段階法として設定されているかどうかは重要で
はない。したがって多段階法は、標識されていない検出
抗体であってそれらに向けられており適当に標識されて
いるもう一つの抗体を用いて測定される検出抗体を用い
て行うことができる。抗体を生じさせるためには、ペプ
チドを、それらの免疫原性が、例えば天然タンパク質、
例えばガンマーグロブリンまたは血清アルブミンのよう
な血清タンパク質、キーホールリンペット（keyhole li
mpet hemocyanin;ＫＬＨ）のようなヘモシアニンまたは
ジフテリアまたは破傷風トキソイドのようなトキソイド
に結合させることによってできる限り改良するように修
飾するのが有利である（ビー・エス・シャッフハウゼン
(B.S. Schaffhausen) 、生科学および医学におけるハイ
ブリドーマテクノロジー(Hybridoma Technologie in th
e Biosciences and Medicine) 、ティー・エイ・スプリ
ンガー(T.A. Springer) 監修、ブレナム・プレス・ニュ
ーヨーク(Plenum Press NY) 、ロンドン、１９８５
年）。
【００５８】最後に、固相を含む免疫診断要素と必要な
試薬の一部或いは総てを乾燥形態で用いるときにも、本
発明を適用することができ、この場合にも、新規なペプ
チドは固相上または検出試薬中に或いは両方に存在し、
抗体の測定、抗原の検出または他の分析との組み合わせ
を行うことができる。
試薬の一部或いは総てを乾燥形態で用いるときにも、本
発明を適用することができ、この場合にも、新規なペプ
チドは固相上または検出試薬中に或いは両方に存在し、
抗体の測定、抗原の検出または他の分析との組み合わせ
を行うことができる。
【００５９】本発明によるペプチドは、例えばマイクロ
タイタープレートをこのペプチドでコーティングするこ
とによって試験することができる。コーティングは、通
常は緩衝液、例えば炭酸塩、リン酸塩またはトリスヒド
ロキシメチルアミノメタン緩衝液、好ましくは炭酸緩衝
液中で行われる。コーティングの後に、プレートを血清
試料と共に１：１〜１：２５０、好ましくは１：１〜
１：１０、特に１：１．５〜１：２．５の希釈度でイン
キュベーションした。次いで、抗原−抗体複合体を前記
の方法、例えば抗原−抗体複合体に対する標識第二抗体
を用いて検出した（イムノアッセイ）。
タイタープレートをこのペプチドでコーティングするこ
とによって試験することができる。コーティングは、通
常は緩衝液、例えば炭酸塩、リン酸塩またはトリスヒド
ロキシメチルアミノメタン緩衝液、好ましくは炭酸緩衝
液中で行われる。コーティングの後に、プレートを血清
試料と共に１：１〜１：２５０、好ましくは１：１〜
１：１０、特に１：１．５〜１：２．５の希釈度でイン
キュベーションした。次いで、抗原−抗体複合体を前記
の方法、例えば抗原−抗体複合体に対する標識第二抗体
を用いて検出した（イムノアッセイ）。
【００６０】本発明は、それぞれ異なる病原体に対する
複数の異なる抗体特異性の検出および／または測定のた
めの免疫化学的方法およびそのための組合せキットであ
って、本発明によるＨＣＭＶペプチドの１または２以上
と他の病原体由来の１または２以上の免疫反応性ペプチ
ドを支持体上に固定し、それらに対する抗体を識別的ま
たは非識別的な、好ましくは識別的な前記の方法によっ
て検出するキットにも関する。
複数の異なる抗体特異性の検出および／または測定のた
めの免疫化学的方法およびそのための組合せキットであ
って、本発明によるＨＣＭＶペプチドの１または２以上
と他の病原体由来の１または２以上の免疫反応性ペプチ
ドを支持体上に固定し、それらに対する抗体を識別的ま
たは非識別的な、好ましくは識別的な前記の方法によっ
て検出するキットにも関する。
【００６１】組合せアッセイにおいては、ＨＣＭＶに関
連したウイルス種、例えばヘルペスウイルス単純ヘルペ
ス１および／または２（ＨＳＶ１／２）、エプスタイン
−バールウイルス（ＥＢＶ）、水痘状帯状ウイルス（Ｖ
ＺＶ）またはヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）およ
び／または関連のないウイルス種、例えば肝炎ウイルス
ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはウイルスＨＩＶ１および
ＨＩＶ２を用いることが可能である。特に、ＨＣＭＶペ
プチドと他の病原体の１つまたは２つ以上のペプチドお
よび／または組換えタンパク質の混合物を組合せアッセ
イにおいて用いることが可能であり、この場合には、こ
れらのペプチドは互いに任意の測定可能な交差反応性を
有するべきではない。
連したウイルス種、例えばヘルペスウイルス単純ヘルペ
ス１および／または２（ＨＳＶ１／２）、エプスタイン
−バールウイルス（ＥＢＶ）、水痘状帯状ウイルス（Ｖ
ＺＶ）またはヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）およ
び／または関連のないウイルス種、例えば肝炎ウイルス
ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはウイルスＨＩＶ１および
ＨＩＶ２を用いることが可能である。特に、ＨＣＭＶペ
プチドと他の病原体の１つまたは２つ以上のペプチドお
よび／または組換えタンパク質の混合物を組合せアッセ
イにおいて用いることが可能であり、この場合には、こ
れらのペプチドは互いに任意の測定可能な交差反応性を
有するべきではない。
【００６２】本発明のペプチド、免疫反応性部分および
その変異体は、例えばＨＣＭＶの診断および予防接種に
好適である。これらのペプチドは、酵素イムノアッセ
イ、磁性およびラテックス粒子、様々な方法で製造した
試験片、フィルムおよび紙などの各種の表面と作用する
各種の診断アッセイ系のコーティング抗原として用いる
こともできる。
その変異体は、例えばＨＣＭＶの診断および予防接種に
好適である。これらのペプチドは、酵素イムノアッセ
イ、磁性およびラテックス粒子、様々な方法で製造した
試験片、フィルムおよび紙などの各種の表面と作用する
各種の診断アッセイ系のコーティング抗原として用いる
こともできる。
【００６３】本発明の免疫反応性ペプチドの一つの利点
は、ＨＣＭＶ抗体の検出の感度および特異性が高いこと
であり、希釈試料の外に、希釈しないまたは若干希釈し
ただけの試料を用いることもできる。ペプチドのもう一
つの利点は、それらの配列の長さが比較的短いために、
それらを簡単に且つ高収率で化学的に合成することがで
きることである。化学的合成は、合成ペプチドは細胞特
異性タンパク質を含まないという利点を有する。
は、ＨＣＭＶ抗体の検出の感度および特異性が高いこと
であり、希釈試料の外に、希釈しないまたは若干希釈し
ただけの試料を用いることもできる。ペプチドのもう一
つの利点は、それらの配列の長さが比較的短いために、
それらを簡単に且つ高収率で化学的に合成することがで
きることである。化学的合成は、合成ペプチドは細胞特
異性タンパク質を含まないという利点を有する。
【００６４】本発明は、本発明によるペプチドの少なく
とも一つをコードするＤＮＡ配列にも関する。
とも一つをコードするＤＮＡ配列にも関する。
【００６５】本発明は、ＨＣＭＶの検出および／または
測定のための分析的方法であって、特異的部分において
本発明によるＤＮＡ配列の少なくとも一つに相補的であ
る少なくとも１つの核酸プローブを用いるハイブリダイ
ゼーション反応を特異的段階として用いることを特徴と
する方法にも関する。
測定のための分析的方法であって、特異的部分において
本発明によるＤＮＡ配列の少なくとも一つに相補的であ
る少なくとも１つの核酸プローブを用いるハイブリダイ
ゼーション反応を特異的段階として用いることを特徴と
する方法にも関する。
【００６６】本発明は、本発明によるペプチドの一つま
たは二つ以上に対して向けられている多クローン性およ
び／または単クローン性抗体にも関する。抗体は、一般
に知られている方法によって本発明のペプチドを用いて
好適なドナー、例えばウサギを免疫することによって得
ることができる。
たは二つ以上に対して向けられている多クローン性およ
び／または単クローン性抗体にも関する。抗体は、一般
に知られている方法によって本発明のペプチドを用いて
好適なドナー、例えばウサギを免疫することによって得
ることができる。
【００６７】本発明は、また本発明のペプチドの少なく
とも１個またはそれらに対する抗体を含むＨＣＭＶに対
するワクチンに関する。
とも１個またはそれらに対する抗体を含むＨＣＭＶに対
するワクチンに関する。
【００６８】本発明は、また本発明のペプチドの少なく
とも１個を含むイムノアッセイ、特にヘテロジニアスイ
ムノアッセイに関する。
とも１個を含むイムノアッセイ、特にヘテロジニアスイ
ムノアッセイに関する。
【００６９】略語のリスト ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド、 ＤＩＰＥＡ ジイソプロピルエチルアミン、 ＤＭＦ ジメチルホルムアミド、 Ｂｏｐ １−ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジ
メチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェー
ト、 Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル、 ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール、 ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イ
ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラ
フルオロボレート。
メチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェー
ト、 Ｆｍｏｃ フルオレニルメトキシカルボニル、 ＨＯＢｔ ヒドロキシベンゾトリアゾール、 ＴＢＴＵ ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イ
ル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラ
フルオロボレート。
【００７０】下記の例は、本発明を詳細に説明するため
のものであり、本発明をそれに制限するためのものでは
ない。
のものであり、本発明をそれに制限するためのものでは
ない。
【００７１】
例 １． ｇｌｙ ａｌａ ｇｌｙ ｖａｌ ａｓｎ ｖａｌ ｐｒｏ ａｌａ ｇｌｙ ａｌａ ｇｌｙ ａｌａ ａｌａ ｉｌｅ ｌｅｕ ｔｈｒ ｐｒｏ ｔｈｒ ｐｒｏ ｖａｌ ａｓｎ ｐｒｏ ｓｅｒ ｔｈｒ ａｌａ ｐｒｏ ａｌａ ｐｒｏ ａｌａ ｐｒｏ−アミド（ペプチド１．１１）の調製 Ｆｍｏｃ−アミドアンカー樹脂１．０６ｇを、完全に自
動的なペプチドシンセサイザー（アドバンスト・ケムテ
ク(Advanced ChemTech) R 、ルイスビル、ケンタッキ
ー、アメリカ合衆国）中で、製造業者の使用説明書にし
たがって反応させた。アミノ酸は３倍過剰量であった。
アミノ酸誘導体当たりの反応時間は３０分間であった。
第一のアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−プロリン５０６mgを
ＨＯＢｔ２１３mgおよび（ＴＢＴＵの代わりに）Ｂｏｐ
６９７mgと共に用いた。ジイソプロピルエチルアミン３
ミリモルを、塩基として加えた。カルボキサミド官能基
をトリチルで誘導体形成した。合成は、下記の反応順序
によって行った（１ｇの樹脂について）： １ 各回ＤＭＦ１５mlで樹脂を３回洗浄、 ２ ２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５mlで樹脂を処理（３
分）、 ３ ２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５mlで樹脂を処理（１
０分）、 ４ ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回樹脂を洗
浄、 ５ ＤＭＦで２回樹脂を洗浄、 ６ アミノ酸誘導体を３倍過剰量導入し、ＤＩＣ／ＨＯ
ＢｔまたはＤＭＦ中でＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて活
性化し、樹脂と共に３０分間振盪。 ７ ＤＭＦ／イソプロパノールを用いて交互に２回樹脂
を洗浄。
動的なペプチドシンセサイザー（アドバンスト・ケムテ
ク(Advanced ChemTech) R 、ルイスビル、ケンタッキ
ー、アメリカ合衆国）中で、製造業者の使用説明書にし
たがって反応させた。アミノ酸は３倍過剰量であった。
アミノ酸誘導体当たりの反応時間は３０分間であった。
第一のアミノ酸として、Ｆｍｏｃ−プロリン５０６mgを
ＨＯＢｔ２１３mgおよび（ＴＢＴＵの代わりに）Ｂｏｐ
６９７mgと共に用いた。ジイソプロピルエチルアミン３
ミリモルを、塩基として加えた。カルボキサミド官能基
をトリチルで誘導体形成した。合成は、下記の反応順序
によって行った（１ｇの樹脂について）： １ 各回ＤＭＦ１５mlで樹脂を３回洗浄、 ２ ２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５mlで樹脂を処理（３
分）、 ３ ２０％ピペリジン／ＤＭＦ１５mlで樹脂を処理（１
０分）、 ４ ＤＭＦ／イソプロパノールで交互に３回樹脂を洗
浄、 ５ ＤＭＦで２回樹脂を洗浄、 ６ アミノ酸誘導体を３倍過剰量導入し、ＤＩＣ／ＨＯ
ＢｔまたはＤＭＦ中でＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを用いて活
性化し、樹脂と共に３０分間振盪。 ７ ＤＭＦ／イソプロパノールを用いて交互に２回樹脂
を洗浄。
【００７２】結合反応の最後に、ペプチド樹脂をメタノ
ールおよびジエチルエーテルで洗浄し、高真空下にて乾
燥した。ペプチド樹脂２．３６ｇを、トリフルオロ酢酸
２７ml／レゾルシノール１．５ｇ／エタンジチオール
１．５mlと共に室温で１．５時間撹拌し、ジエチルエー
テル中で結晶化させた。粗製のペプチドをジエチルエー
テルで洗浄し、高真空下にて乾燥した（収量１０９０m
g) 。ペプチドをセファデックス(Sephadex)Ｇ−２５で
０．５％酢酸中でクロマトグラフィを行い、ペプチド画
分を凍結乾燥によって単離した（収量６５４mg）。この
物質の純度をＨＰＬＣによって試験した。精確な組成は
アミノ酸分析によって確かめた。ペプチド含量は８６％
であった。
ールおよびジエチルエーテルで洗浄し、高真空下にて乾
燥した。ペプチド樹脂２．３６ｇを、トリフルオロ酢酸
２７ml／レゾルシノール１．５ｇ／エタンジチオール
１．５mlと共に室温で１．５時間撹拌し、ジエチルエー
テル中で結晶化させた。粗製のペプチドをジエチルエー
テルで洗浄し、高真空下にて乾燥した（収量１０９０m
g) 。ペプチドをセファデックス(Sephadex)Ｇ−２５で
０．５％酢酸中でクロマトグラフィを行い、ペプチド画
分を凍結乾燥によって単離した（収量６５４mg）。この
物質の純度をＨＰＬＣによって試験した。精確な組成は
アミノ酸分析によって確かめた。ペプチド含量は８６％
であった。
【００７３】２． ペプチドの試験 ９６穴のマイクロタイタープレートに、合成したペプチ
ドをコーティングした。このために、炭酸緩衝液１ml当
たりペプチド２．５μｇの溶液を作成し、１００μｌず
つウェルに導入してコーティングした。ペプチドを４℃
で一晩表面に吸着させ、ペプチド溶液を除去した後、ウ
ェルを洗浄用緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２；１
０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．２％ツイーン(Tween) ２０）で
何回か洗浄した。次いで、個々のヒト血清試料を１：２
に希釈したものを導入し、３７℃で１時間インキュベー
ションした。もう一つの洗浄段階の後、ヒトＩｇＧ抗体
またはヒトＩｇＭ抗体に特異的で、ペルオキシダーゼで
標識した複合抗体を加え、混合物を室温で０．５時間イ
ンキュベーションした。次いで、０．５Ｍ硫酸を加えて
反応を停止させ、個々の試料の吸光度を光度計で４５０
／６５０nmの波長で測定した。
ドをコーティングした。このために、炭酸緩衝液１ml当
たりペプチド２．５μｇの溶液を作成し、１００μｌず
つウェルに導入してコーティングした。ペプチドを４℃
で一晩表面に吸着させ、ペプチド溶液を除去した後、ウ
ェルを洗浄用緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．２；１
０ｍＭ ＥＤＴＡ；０．２％ツイーン(Tween) ２０）で
何回か洗浄した。次いで、個々のヒト血清試料を１：２
に希釈したものを導入し、３７℃で１時間インキュベー
ションした。もう一つの洗浄段階の後、ヒトＩｇＧ抗体
またはヒトＩｇＭ抗体に特異的で、ペルオキシダーゼで
標識した複合抗体を加え、混合物を室温で０．５時間イ
ンキュベーションした。次いで、０．５Ｍ硫酸を加えて
反応を停止させ、個々の試料の吸光度を光度計で４５０
／６５０nmの波長で測定した。
【００７４】３． 関連エピトープの局在化 免疫原性を試験するため、ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５
０の７１８から８８０までの完全なアミノ酸配列領域か
らの各種の長さのペプチド（第２表（表２〜４）および
第３表（表５〜１０））を例１に記載したのと同様な方
法で合成した。次いで、例２と同様に、マイクロタイタ
ープレートを合成したペプチドでコーティングし、免疫
学的反応性をアッセイした。一連のアッセイの結果は、
総ての試験ＨＣＭＶ陽性の血清は特に３種類の特異的配
列領域の少なくとも１個と反応したが、他の配列領域は
弱い免疫学的反応しか示さなかった（第２表および第３
表）。３種類の免疫学的に反応性のペプチドは、下記の
配列を有する：
０の７１８から８８０までの完全なアミノ酸配列領域か
らの各種の長さのペプチド（第２表（表２〜４）および
第３表（表５〜１０））を例１に記載したのと同様な方
法で合成した。次いで、例２と同様に、マイクロタイタ
ープレートを合成したペプチドでコーティングし、免疫
学的反応性をアッセイした。一連のアッセイの結果は、
総ての試験ＨＣＭＶ陽性の血清は特に３種類の特異的配
列領域の少なくとも１個と反応したが、他の配列領域は
弱い免疫学的反応しか示さなかった（第２表および第３
表）。３種類の免疫学的に反応性のペプチドは、下記の
配列を有する：
【００７５】ASe -gly ala gly ala ala ile leu -BSm
（ペプチド１）、CSn -arg ala trp ala leu -DSo （ペ
プチド２）、および／またはESp -ala ser arg asp ala
ala -FSq （ペプチド３）。但し、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、
ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の適当な
アミノ酸であり、ｅは、互いに独立に０〜２２の整数で
あり、ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であり、ｎお
よびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であり、ｐおよ
びｑは、互いに独立に０〜１１の整数である。
（ペプチド１）、CSn -arg ala trp ala leu -DSo （ペ
プチド２）、および／またはESp -ala ser arg asp ala
ala -FSq （ペプチド３）。但し、ＡＳ、ＢＳ、ＣＳ、
ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の適当な
アミノ酸であり、ｅは、互いに独立に０〜２２の整数で
あり、ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であり、ｎお
よびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であり、ｐおよ
びｑは、互いに独立に０〜１１の整数である。
【００７６】この方法で、総てのまたは１もしくは２つ
の配列領域のみと反応する血清を区別することが可能で
あった。
の配列領域のみと反応する血清を区別することが可能で
あった。
【００７７】ＨＣＭＶ陰性の血清は、３種類のペプチド
とは反応しないことは明らかであった。
とは反応しないことは明らかであった。
【００７８】４． 本発明のペプチドの診断への使用 見出されたペプチドの免疫活性を試験するために、ペプ
チド１．１１、２．１０および３．２の混合物で、総濃
度２．５μｇ／ml、混合比１：１：１（重量）のもの
を、例２と同様にマイクロタイタープレート中に抗原と
して導入し、そこに記載の方法でアッセイを行った。こ
の場合に用いたものはＩｇＭおよびＩｇＧ反応性につい
て通常のアッセイで既に分析されている画定され且つ予
め試験された血清のグループであった。参考アッセイ：
ＣＭＶエンチグノスト(Enzygnost)R ＩｇＭ−ＰＯＤお
よびＣＭＶエンチグノスト(Enzygnost) R ＩｇＧ−ＰＯ
Ｄ、ベーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG)
、マールブルク。示されたアッセイの形態は、ＩｇＭ
およびＩｇＧ抗体検出のためのＨＣＭＶ免疫状態を診断
するのに極めて好適である（第４表および第５表）。
チド１．１１、２．１０および３．２の混合物で、総濃
度２．５μｇ／ml、混合比１：１：１（重量）のもの
を、例２と同様にマイクロタイタープレート中に抗原と
して導入し、そこに記載の方法でアッセイを行った。こ
の場合に用いたものはＩｇＭおよびＩｇＧ反応性につい
て通常のアッセイで既に分析されている画定され且つ予
め試験された血清のグループであった。参考アッセイ：
ＣＭＶエンチグノスト(Enzygnost)R ＩｇＭ−ＰＯＤお
よびＣＭＶエンチグノスト(Enzygnost) R ＩｇＧ−ＰＯ
Ｄ、ベーリングヴェルケ・アーゲー(Behringwerke AG)
、マールブルク。示されたアッセイの形態は、ＩｇＭ
およびＩｇＧ抗体検出のためのＨＣＭＶ免疫状態を診断
するのに極めて好適である（第４表および第５表）。
【００７９】５． 単クローン性抗体８７−５５／０２
と、同定されたペプチドエピトープの一つとの反応 ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０とのおよび組換えタンパ
ク質断片ｐＸＰ１との明確な免疫学的反応を行い、イム
ノブロットおよびＥＬＩＳＡ反応性として測定される単
クローン性抗体を、第３表における各種の合成ペプチド
を同じ濃度（０．２５μｇ／ウェル）でコーティングし
たＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上で検討した。
プレートの前記の抗体による展開の後、重要なエピトー
プとして予め同定しておいたペプチド２．７との反応
は、極めて明らかであり顕著であった。単クローン性抗
体を選択するための方法から、同定されたエピトープ
は、完全なタンパク質の変性によっても破壊されない極
めて重要な構造を有していなければならないと結論され
た。これに対応して、この単クローン性抗体は、合成ペ
プチド２．７とも、ＨＣＭＶの組換えタンパク質ＸＰ１
およびｐｐ１５０タンパク質とも反応する。
と、同定されたペプチドエピトープの一つとの反応 ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０とのおよび組換えタンパ
ク質断片ｐＸＰ１との明確な免疫学的反応を行い、イム
ノブロットおよびＥＬＩＳＡ反応性として測定される単
クローン性抗体を、第３表における各種の合成ペプチド
を同じ濃度（０．２５μｇ／ウェル）でコーティングし
たＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上で検討した。
プレートの前記の抗体による展開の後、重要なエピトー
プとして予め同定しておいたペプチド２．７との反応
は、極めて明らかであり顕著であった。単クローン性抗
体を選択するための方法から、同定されたエピトープ
は、完全なタンパク質の変性によっても破壊されない極
めて重要な構造を有していなければならないと結論され
た。これに対応して、この単クローン性抗体は、合成ペ
プチド２．７とも、ＨＣＭＶの組換えタンパク質ＸＰ１
およびｐｐ１５０タンパク質とも反応する。
【００８０】第１表 ＸＰ１のアミノ酸配列（ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０
のアミノ酸７１８〜８８０）
のアミノ酸７１８〜８８０）
【表１】
【００８１】第２表： ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０
のＸＰ１領域からの合成ペプチドの個々の反応性 合成ｐＸＰ１断片とＣＭＶのＩｇＧ陽性血清のアッセイ
されたグループとの個々の反応性を百分率で表わす。
のＸＰ１領域からの合成ペプチドの個々の反応性 合成ｐＸＰ１断片とＣＭＶのＩｇＧ陽性血清のアッセイ
されたグループとの個々の反応性を百分率で表わす。
【表２】
【表３】
【表４】
【００８２】第３表： ＨＣＭＶタンパク質ｐｐ１５０
のＸＰ１領域からの特に反応性のペプチドの個々の反応
性 合成ｐＸＰ１断片とＣＭＶのＩｇＧ陽性血清のアッセイ
されたグループとの個々の反応性を百分率で表わす。 ペプチドＮｏ．１
のＸＰ１領域からの特に反応性のペプチドの個々の反応
性 合成ｐＸＰ１断片とＣＭＶのＩｇＧ陽性血清のアッセイ
されたグループとの個々の反応性を百分率で表わす。 ペプチドＮｏ．１
【表５】
【表６】
【表７】 ペプチドＮｏ．２
【表８】
【表９】 ペプチドＮｏ．３
【表１０】
【００８３】第４表： ペプチド混合物のＩｇＭ反応性評価 参照アッセイ ペプチドのアッセイ 陽性 22 21 陰性 13 13 擬陽性 0 0 擬陰性 0 1 アッセイを行ったＩｇＭ血清の数： 35 感受性： 95.5％ 特異性： 100％
【００８４】第５表： ペプチド混合物のＩｇＧ反応性評価 参照アッセイ ペプチドのアッセイ 陽性 133 132 陰性 152 149 偽陽性 0 3 偽陰性 0 1 アッセイを行ったＩｇＭ血清の数： 285 感受性： 99.25 ％ 特異性： 98.03 ％
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 17/00 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ａ 9015−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 ロベルト、ツィーゲルマイアー ドイツ連邦共和国マールブルク、ホーエ、 ロイヒテ、33
Claims (32)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列の少なくとも１個を含
むことを特徴とする、ＨＣＭＶに対する抗体と特異的に
反応するペプチド。ASe -gly ala gly ala ala ile leu
-BSm （ペプチド１）、CSn -arg ala trp ala leu -DS
o （ペプチド２）、および／またはESp -ala ser arg a
sp ala ala -FSq （ペプチド３）。但し、ＡＳ、ＢＳ、
ＣＳ、ＤＳ、ＥＳおよびＦＳは、互いに独立に、任意の
適当なアミノ酸であり、ｅは、互いに独立に０〜２２の
整数であり、ｍは、互いに独立に０〜２５の整数であ
り、ｎおよびｏは、互いに独立に０〜１８の整数であ
り、ｐおよびｑは、互いに独立に０〜１１の整数であ
る。 - 【請求項２】下記のアミノ酸配列の少なくとも１個を含
む、請求項１に記載のペプチド。ペプチド１について： 【化１】 【化２】 ペプチド２について： 【化３】 ペプチド３について： 【化４】 - 【請求項３】アミノ酸配列が、１または２以上のアミノ
酸の置換、付加または欠失によって修飾されている、請
求項１または２項に記載のペプチド。 - 【請求項４】支持体に結合している、請求項１〜３のい
ずれか１項に記載のペプチド。 - 【請求項５】請求項１〜４の少なくとも１項に記載のペ
プチドを含む、ペプチド混合物。 - 【請求項６】ペプチドが、互いに直接にまたはスペーサ
ーを介して互いに結合している、請求項５に記載のペプ
チド混合物。 - 【請求項７】ペプチドが、化学的に合成されたものであ
る、請求項１〜６のいずれか１項に記載のペプチドまた
はペプチド混合物。 - 【請求項８】請求項１〜３に記載のペプチドの少なくと
も１個をコードするＤＮＡフラグメント。 - 【請求項９】請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプ
チドの少なくとも１個に対して二特異的親和性を有する
抗体。 - 【請求項１０】請求項１〜７の少なくとも１項に記載の
ペプチドを用いる、ＨＣＭＶ抗体の検出および／または
測定のための免疫化学的方法。 - 【請求項１１】ペプチドが、互いに直接にまたはスペー
サーを介して結合している、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】スペーサーが、ヒト血清アルブミンおよ
び／またはポリリシンである、請求項１１に記載の方
法。 - 【請求項１３】ペプチドが支持体に結合している、請求
項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】支持体が、ポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリアミドおよび他の合成ポリマー、セルロースの
ような天然ポリマー、および酢酸セルロースおよびニト
ロセルロースのような天然ポリマー誘導体、並びにガラ
ス、特にガラス繊維、から成る群から選択される、請求
項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】支持体がポリスチレンである、請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項１６】エピトープ結合抗体の検出および／また
は測定を、エピトープ結合抗体に対する酵素標識した、
螢光標識した、化学ルミネセンス標識した、ビオチン標
識したまたは放射能標識した抗体を用いて行う、請求項
１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１７】請求項１〜７に記載の少なくとも１個の
ペプチドに対する抗体を用いる、ＨＣＭＶ抗原を検出お
よび／または測定するための免疫化学的方法。 - 【請求項１８】特異的段階として、少なくとも１個の核
酸プローブであって、その特異的部分において請求項８
に記載のＤＮＡ配列の少なくとも１個に相補性である核
酸プローブを用いるハイブリダイゼーション反応を用い
ることを特徴とする、ＨＣＭＶの検出および／または測
定のための分析方法。 - 【請求項１９】ＨＣＭＶ抗体を検出および／または測定
するための免疫学的アッセイキットであって、このアッ
セイキットが、請求項１〜７の少なくとも１項に記載の
ペプチドまたはペプチド混合物の１または２以上のエピ
トープが固定されている１または２以上の支持体を含む
ことを特徴とする、アッセイキット。 - 【請求項２０】支持体がポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリアミドおよび他の合成ポリマー、セルロースの
ような天然ポリマー、および酢酸セルロースおよびニト
ロセルロースのような天然ポリマー誘導体、並びにガラ
ス、特にガラス繊維、から成る群から選択される、請求
項１９に記載のアッセイキット。 - 【請求項２１】支持体がポリスチレンである、請求項２
０に記載のアッセイキット。 - 【請求項２２】同時検出および／または同時測定を、エ
ピトープ結合抗体に対する酵素標識した、螢光標識し
た、化学ルミネセンス標識した、ビオチン標識したまた
は放射能標識した抗体を用いて行う、請求項１９〜２１
のいずれか１項に記載のアッセイキット。 - 【請求項２３】酵素アルカリ性ホスファターゼおよび／
または西洋ワサビペルオキシダーゼを、酵素標識抗体に
用いる、請求項２２に記載のアッセイキット。 - 【請求項２４】ＨＣＭＶ抗原の検出および／または測定
のための免疫学的アッセイキットであって、請求項１〜
７に記載の少なくとも１個のペプチドに対する１または
２以上の抗体が固定されている１または２以上の支持体
を含むことを特徴とする、アッセイキット。 - 【請求項２５】請求項１〜７の少なくとも１項に記載の
１または２以上のペプチドとＨＣＭＶ以外の病原体由来
の１つまたは２つ以上の免疫反応性ペプチドとを用いる
ことを特徴とする、それぞれ異なる病原体に対する複数
の異なる抗体特異性の検出および／または測定のための
免疫化学的組合せ法。 - 【請求項２６】ＨＳＶ １／２、ＥＢＶ、ＶＺＶ、ＨＨ
Ｖ６、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよび／またはＨＩＶ１
／２由来のペプチドまたはその免疫反応性部分を、他の
病原体由来の免疫反応性ペプチドとして用いる、請求項
２５に記載の免疫化学的組合せ法。 - 【請求項２７】方法を識別的に行う、請求項２５または
２６に記載の免疫化学的組合せ法。 - 【請求項２８】請求項１〜７の少なくとも１項に記載の
１または２以上のペプチドとＨＣＭＶ以外の病原体由来
の１または２以上の免疫反応性ペプチドが１つまたは２
つ以上の支持体に固定されていることを特徴とする、そ
れぞれ異なる病原体に対する複数の異なる抗体特異性の
検出および／または測定のための組合せアッセイキッ
ト。 - 【請求項２９】請求項１〜７に記載の少なくとも１個の
ペプチドまたはペプチドの混合物またはそれらに対する
抗体を含むことを特徴とする、ワクチン。 - 【請求項３０】哺乳類、特にウサギに抗体を生じさせる
ための請求項１〜７の少なくとも１項に記載のペプチド
またはペプチドの混合物の使用。 - 【請求項３１】診断または治療目的のための請求項９お
よび３０のいずれか１項に記載の抗体の使用。 - 【請求項３２】診断法がヘテロジニアスイムノアッセイ
である、請求項３１に記載の抗体の使用。
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