JPH06228194A - 可溶性キットリガンド - Google Patents

可溶性キットリガンド

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JPH06228194A
JPH06228194A JP4205800A JP20580092A JPH06228194A JP H06228194 A JPH06228194 A JP H06228194A JP 4205800 A JP4205800 A JP 4205800A JP 20580092 A JP20580092 A JP 20580092A JP H06228194 A JPH06228194 A JP H06228194A
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soluble
kit ligand
cells
soluble kit
ligand
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JP4205800A
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English (en)
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Werner Haas
ハース ウェルナー
Willi Hunziker
ハンズィカー ウィリ
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F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】天然キットリガンド（ＫＬ）の細胞外の受容体
結合領域を含み、天然キットリガンドの細胞質性及びト
ランスメンブラン領域をもたない可溶性ＫＬ。また可溶
性ＫＬをコードしているＤＮＡ配列及び可溶性ＫＬを発
現する発現ベクターと形質転換体及び組換えＤＮＡ技術
を使って可溶性のＫＬを作るための方法。さらに造血器
の疾患治療のため及び自己のものであっても同種のもの
であっても骨髄移植をしたしないに拘らずガン患者への
放射線及び化学療法後の造血器の回復を改善するための
治療に有力な薬剤としての使用。 【効果】本可溶性ＫＬにより再生不良貧血、けいれん性
夜間赤色素尿症 (PNH)、多血球血症、慢性骨ずい性白血
症、骨ずい様化生、血小板血症、急性白血症のような幹
細胞疾患またAIDS、マラリア、ビタミンＢ12や葉酸欠乏
症のような多くの疾患を治療しうる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は天然キットリガンド (Ｋ
Ｌ) の細胞外の受容体結合領域を含み、天然キットリガ
ンドの細胞質性及びトランスメンブラン領域をもたない
可溶性のキットリガンド (ＫＬ) に関するものであり、
また、可溶性ＫＬをコードしているＤＮＡ配列及び可溶
性ＫＬを発現する発現ベクターと形質転換体及び組換え
ＤＮＡ技術を使って可溶性のＫＬを作るための方法に関
するものである。さらに、本発明は、造血器の疾患治療
のため及び自己のものであっても同種のものであっても
骨髄移植をしたしないに拘らずガン患者への放射線及び
化学療法後の造血器の回復を改善するための治療に有力
な薬剤としてこの可溶性ＫＬを使うことに関している。
【０００２】
【従来の技術】レトロウイルス性のオンコジーンのＶ−
キットの細胞性カウンターパートであるｃ−キットは、
大きなサイトカイン受容体ファミリーの一員である膜貫
通性のチロシンキナーゼ受容体をコードしている (Besm
er et al., Nature 320, 415-421［1986］; Qin et a
l., EMBO J., 7, 1003-1011 ［1988］；Yarden et al.,
EMBO J, 6, 3341-3351［1987］; Majumder et al., Mo
l. Cell. Biol. 8, 4896-4903［1988］) 。
【０００３】この受容体に対するリガンド−キットリガ
ンドまたは略してＫＬ−は細胞外領域、トランスメンブ
ラン領域及び細胞質性領域を含んでいる膜貫通蛋白でも
ある(Nocka et al., EMBO J. 9, 3287-3294［1990］; H
uang et al., Cell 63, 225-233［1990］; Martin et a
l., Cell 63, 203-211［1990］) 。ｃ−キットとＫＬの
機能上の意義についての知見は白斑点 (Ｗ) あるいはス
チール (Sl) 遺伝子座に変異をもったマウスでの十分な
研究から得ることができる。Ｗ変異は胚発生とともに成
体生活においても造血、メラニン形成や配偶子形成に典
型的に影響する (Russell, Adv. Genet, 20, 357-459
［1979］) 。ｃ−キット／Ｗ遺伝子は未熟な前駆細胞集
団と、もう少し成熟した細胞型に作用する。造血系にお
いてはＷ変異は幹細胞群、赤血球前駆細胞、組織マスト
細胞に影響する(Russell著、「造血の制御」(Regulatio
n of hematopoiesis) A.S. Gordon 編、ニューヨーク：
Appleton出版、649-675頁［1970］; Kitamura et al.,
Blood53, 492-497［1978］; Nocka et al., Genes De
v., 3, 816-826［1989］) 。いくつかの変異対立遺伝子
の分子欠失についての最近の知見ではそれがｃ−キット
受容体の正常な活性又は発現を破壊する変異であること
が示されている (Nockaet al., EMBO J. 9, 1805-1813
［1990］) 。
【０００４】スチール (Sl) 遺伝子座での変異はＷ変異
をもったマウスにみられるものによく似た形質の特徴を
もたらす。すなわち、それらは造血、配偶子形成やメラ
ニン形成に影響する (Bennett, J. Morphol. 98, 199-2
34［1956］; Russell, 既出)。多くの対立遺伝子がSl遺
伝子座で知られている；それらは半優性の変異でいろい
ろな対立遺伝子がいろいろな細胞系統やその重症度にお
いていろいろな影響を与えている (Russell, 既出) 。
元のSl対立遺伝子は重篤な変異である。Sl／Slのホモ接
合子は胚細胞で欠失していて、コート色素が欠けそして
巨赤血球性の貧血で周産期に死ぬ (Bennett, 既出, Sar
vella and Russell, J. Hered. 47, 123-128［195
6］)。Sld 対立遺伝子に対するマウスのホモ接合は生き
ているけれども重篤な巨赤血球性貧血をもち、コート色
素を欠き、生殖不能である。Sl+ とSld/+のヘテロ接合
体はいずれもうすい皮膜色素をもち、中程度の巨赤血球
性貧血であるが、一方その生殖腺は小さいけれども生殖
能力がある。Ｗ変異に対して、Sl変異は細胞自律性では
なく、これらの変異の標的の微小環境の欠陥によって起
こされると考えられている (Mayer and Green, Dev. Bi
ol. 16, 68-75［1968］; McCulloch et al., Blood 26,
399-410［1965］, Dexter and Moore, Nature 269, 41
2-414 ［1977］) 。SlとＷの変異をもつマウスの並行
的、相補的な特徴のために、Sl遺伝子産物はｃ−キット
受容体のリガンドであることが仮説とされている (Russ
ell,既出；Charot et al,, Nature 335, 88-89［198
8］) 。
【０００５】ごく最近、ＫＬが特異的にｃ−キット受容
体に結合し (Huang et al., 既出)、マスト細胞と赤芽
球を刺激する (Nocka et al., EMBO J. 9, 3287-3294
［1990］) ことが示されている。ラットとヒトのＫＬの
一次構造と機能発現について報告されている (Huang et
al., 既出；Martin et al., 既出；欧州特許出願公開
番号423980) 。その一次構造にもとづいて、ラットとヒ
トの蛋白の末端切断型はE.coli及び哺乳類の細胞で発現
され、生物活性をもつこと、すなわち骨髄細胞とリンパ
球性の造血性前駆細胞を骨髄培養で増殖させ、コロニー
刺激因子と共に相乗的活性を示し、その結果、コロニー
数とその大きさを増すということが示されている (Mart
in et al., 既出；欧州出願公開番号423980) 。
【０００６】ヒトＫＬの最も大きな形は以下の配列をも
った273アミノ酸からなっている。
【０００７】
【化６】
【０００８】25残基のシグナルペプチド ( -25から -１
までの残基) と 189残基 ( +１から+189までの残基) の
細胞外領域、23残基 (+190から+212までの残基) のトラ
ンスメンブラン領域、及び36残基 (+213から+248までの
残基) の細胞質性領域を含んでいる。ラットとヒトのＫ
Ｌ蛋白の最も短かい天然型のカルボキシル末端はAla164
であるとされた。
【０００９】カルボキシ末端の生物活性への寄与を評価
するために、天然ＫＬの細胞外受容体結合領域を含み、
天然ＫＬの細胞質領域とトランスメンブラン領域を欠い
ていて、Martin et al.(既出) 及び欧州特許出願公開番
号423980で記されている末端切断型とは構造的に異なる
一連の欠失変異体が作られた (以後これらを「可溶性キ
ットリガンド」あるいは「可溶性ＫＬ」と略記する) 。
【００１０】全ての末端切断型の可溶性キットリガンド
はアミノ酸１〜164 からなるヒトＫＬ (これを以降「全
長可溶性キットリガンド」という) とほぼ同じ生物活性
をもっている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】それ故本発明はMartin
et al.(既出) で述べられたヒトのＫＬ蛋白の末端切断
型に比べてＣ末端で欠失した１から26アミノ酸までをも
つ可溶性キットリガンドを提供している。さらに、可溶
性キットリガンドは上で示された全長可溶性キットリガ
ンドと同様にＮ末端 (それは Glu-Gly-Ile-Cysときめら
れた) をさらに切りとっても生物活性を保っているよう
である。事実、全長の可溶性キットリガンドのＮ末端グ
ルタミン残基 (Glu 1)の除去は生物活性を損わないない
ことが分かっている。かくして、本発明はＮ末端の Glu
-Gly-Ile-Cys (アミノ酸残基１から４) をもつ可溶性キ
ットリガンドばかりでなく、Ｎ末端で１から４ぐらいま
でのアミノ酸を欠失している可溶性キットリガンド及
び、全長可溶性キットリガンドも包含している。これら
のＮ末端可溶性キットリガンドや全長可溶性キットリガ
ンドを今後「可溶性キットリガンド」あるいは「可溶性
ＫＬ」と称す。
【００１２】可溶性キットリガンドは場合によりＮ末端
に追加のメチオニン残基を含んでいてもよい。付加され
るメチオニン残基はメチオニンをコードするｍＲＮＡの
翻訳の開始シグナルＡＵＧに由来している。親となるヒ
ト遺伝子においては、この翻訳開始シグナルはシグナル
ペプチドの前に位置している。このシグナルペプチドは
翻訳後のプロセシングで翻訳の開始シグナルから由来す
るメチオニンと一緒に脱落されて、メチオニンのない成
熟したヒトＫＬになる。
【００１３】原核性の宿主は正しい位置で成熟したヒト
ＫＬポリペプチドの前にあるシグナルペプチドを切断す
ることができない。それ故シグナルペプチドのコード配
列は成熟した形のヒトＫＬを発現するために遺伝子工学
によって除かれねばならない。成熟蛋白のコード配列の
すぐ前のＡＴＧコドンが組換えヒトＫＬに存在するＮ末
端メチオニンをもたらす。E.coliのような発現系ではこ
のメチオニンは必ずしもプロセシングされない。付加的
なＮ末端メチオニンは組換えによる可溶性ＫＬの生物活
性を損わないことが分っている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】より詳細には本発明は次
の式の可溶性キットリガンドを提供している。
【００１５】
【化７】
【００１６】但し、ここでＸはメチオニンまたは水素、
ＹはＥＧＩ、Ｚは
【００１７】
【化８】
【００１８】またはヒドロキシであり、あるいはここで
Ｘはメチオニンまたは水素で、ＹはＩまたはＧＩ、そし
てＺは
【００１９】
【化９】
【００２０】またはヒドロキシである。ＹがＥＧＩであ
る組換えの可溶性ＫＬのＮ末端メチオニンを微生物的に
除くときは新たに生成されるＮ末端グルタミン残基はピ
ログルタミン酸型に環化するだろうがやはり生物活性を
損うことはないと考えられる。本発明の可溶性ＫＬは、
アミノ酸の置換がその生物活性を変えることがなけれ
ば、そのようなアミノ酸の置換体を含むことができる。
生物活性を本質的に変えない蛋白やポリペプチドのアミ
ノ酸置換は当業界で例えば H. Neurath and R.L.Hill
による「The Proteins」アカデミック・プレス出版、ニ
ューヨーク市 (1979年) の中の特に14ページの図６にみ
られるようによく知られている。最もよくみられるアミ
ノ酸置換は Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala
/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Try/Ph
e, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Al
a/Glu, Asp/Gly,及び以上の逆のものである。本発明の
可溶性ＫＬはさらに「リンカー」配列によってコードさ
れるいくつかのアミノ酸の配列を含むことができる。こ
れらの配列は上に述べたように可溶性ＫＬの発現に使わ
れる発現ベクターに由来している。
【００２１】本発明の可溶性ＫＬは親和性担体物質に望
ましく結合する特異的な配列を含むことができる。その
ような配列の例は少なくとも２つの隣接したヒスチジン
残基を含む配列である (この点に関して欧州特許出願公
開No.282,042を参照) 。この配列はニトリロトリ酢酸ニ
ッケルキレート樹脂に選択的に結合する (Hochuli and
Dobeli, Biol Chem Hoppe-Seyler 368, 748 (1987); 欧
州特許出願公開番号253,303)。そのような特異的配列を
含む可溶性ＫＬは残りのポリペプチドから選択的に分離
されうる。特異的な配列は可溶性ＫＬアミノ酸配列のＣ
末端かＮ末端のいずれかに結合される。
【００２２】本発明の可溶性ＫＬはまたいろいろな免疫
グロブリンＨ鎖またはＬ鎖ポリペプチドと結合される。
これによってin vivo において半減期を増すことのでき
る可溶性ＫＬ免疫グロブリンポリペプチドのキメラ体が
形成される。in vivo で増加した半減期は、例えばヒト
のＣＤ４分子のはじめの２つの領域あるいはその一部と
哺乳類の免疫グロブンリのＨ鎖またはＬ鎖の定常部の異
なる領域とから成るキメラポリペプチドの場合に示され
ている (Traunecker at al., Nature 331, 84-86 ［198
8］及び欧州特許出願公開 No.394827を参照) 。
【００２３】可溶性ＫＬはまた 500から20,000ダルトン
の分子量をもったポリエチレングリコールやポリプロピ
レングリコールのようなポリマーに結合されうる。これ
によって本質的に非免疫原性の保護された可溶性ＫＬ組
成物にすることができる。ポリペプチドとポリマーを結
合するいくつかの方法が使うことができ、例えば米国特
許No.4,179,337に述べられている。
【００２４】本発明の可溶性ＫＬは画像を形成する薬剤
と結合させることもできる。画像形成剤はこの技術に通
常通じるものにとってよく知られており、ラジオアイソ
トープ、色素あるいはパーオキシダーゼやアルカリフォ
スファターゼのような酵素があり、しかし、これらに限
られない。適切なラジオアイソトープは 125Ｉ, 32Ｐ,
35Ｓがあるがこれらに限らない。
【００２５】これら複合のポリペプチドはｃ−キット受
容体蛋白を発現する細胞の存在をivvitroまたはin vivo
で検出するために有用である。この検出をiv vitroで
行うときは、検査すべき細胞または組織試料を複合ポリ
ペプチドが細胞または組織の表層に存在するｃ−キット
受容体に結合するような適当な条件で複合ポリペプチド
と接触させる。それから結合していない複合ポリペプチ
ドを除き、それから結合した複合ポリペプチドの存在を
検出し、それによってｃ−キット受容体蛋白を発現する
細胞または組織を検出する。
【００２６】さらに本発明の可溶性ＫＬは毒素、化学療
法剤、ラジオアイソトープのような治療剤と結合させて
もよい。かくして、効果的な量を患者に投与するとき、
複合分子は組織特異的な送達系として働き、治療剤をｃ
−キット受容体を発現している細胞に送達する。本発明
はまた本発明の可溶性ＫＬをコードしてなるＤＮＡ配
列、これらＤＮＡ配列を含む発現ベクター、ＫＬの生産
のためのベクターを含む宿主細胞、そのようなＤＮＡ配
列組換えベクター及び宿主細胞の作製方法を提供する。
可溶性ＫＬの発現、単離、精製のための方法も記されて
いる。
【００２７】天然のＫＬをコードしている遺伝子の完全
なＤＮＡ配列が知られている (Mar-tin et al., 既出)
ので、本発明の可溶性ＫＬをコードしているアミノ酸配
列は当業界で知られた標準的な方法望ましくはMerrifie
ldの方法 (J. Am Chem. Soc.85, 2149-2154［1963］)
のような固相法を使って化学的に合成することができ
る。一方、本発明の可溶性ＫＬはＤＮＡ組換え技術の方
法 (Maniatis et al.,「Molecular Cloning- a Laborat
ory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory［198
2］) を使って生産できる。望ましくは、本発明の可溶
性ＫＬをコードしているＤＮＡ配列は天然のＫＬをコー
ドしているＤＮＡから調製され、その後必要な発現シグ
ナルをもたらす適当な発現ベクターに組みこまれる。
【００２８】原核性の宿主細胞を使う際に適切な発現ベ
クターは例えば、先述の Maniatiset al.の教科書に記
されている。特に適切なベクターは pDSファミリーのプ
ラスミドである Bujard et al., Methods in Enzymolg
y, Wu and Grossmann 編, Academic Press社, 155巻,
416-433 (1987)］。発現制御配列と機能しうる状態で結
合された本発明の可溶性ＫＬをコードしているＤＮＡ配
列を含んでいる原核性の発現ベクターは、従来法によっ
て適当な原核宿主細胞にくみこまれる。適切な原核性宿
主細胞の選択はこの技術でよく知られたいろいろな要素
によって決められる。かくして例えば選ばれたベクター
との適合性、発現産物の毒性、発現の特徴、必要な生物
学的安全性に対する注意及びコストなどが重要で、これ
ら要因の全ての間での妥協点をみつけねばならない。
【００２９】適切な原核性宿主生物はグラム陰性、グラ
ム陽性菌、例えばE.coliや B.sub-tilis 株が含まれ
る。特に、望ましい本発明の原核宿主生物はE.coli M15
株 (J.Bacteriol. 120, 466-474［1974］ではVillarejo
et al.によって OZ291株として記されている) やE.col
i HB101［Maniatis et al., 既出］である。しかし、前
記のE.coli株に加えて他の一般に利用できる E.coli 29
4 (ATCC No.31446),E.coli RR1 (ATCC No.31343) やE.c
oli W3110 (ATCC No.27325) のようなものも利用でき
る。
【００３０】哺乳動物の宿主細胞で使われるのに適当な
発現ベクターは pBC12MI, pBC12BI,pSV2dhFr, p91023
(B), pcDV1, pRSVcat, pGA291, pGA293, pGA296, pBC12
/HIV/IL-2, pGA300, pK21, pSV2-DHFR などが含まれる
がこれに限定されない。ベクターpK21とpSV2-DHFR が望
ましい。そのようなベクターは好ましくはトランスフェ
クションによって適当な哺乳類の宿主細胞に導入され
る。
【００３１】使用される哺乳類の宿主細胞には例えばヒ
トのHela、H9、Jurkat細胞、マウスのNIH3T3、C127細
胞、CV1 アフリカミドリザルの腎細胞、ウズラのQC1-３
細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞 (ＣＨＯ) 、マ
ウスＬ細胞、ＣＯＳ細胞系等が含まれる。ＣＯＳ-1細胞
系が好適である。本発明の可溶性ＫＬの発現が行われる
様式は選ばれた発現ベクター／宿主細胞系によって左右
される。
【００３２】通常望ましい発現ベクターを含む原核性宿
主生物がその原核宿主生物の生育に最適な条件下で生育
される。対数増殖期の終りに時間当りの細胞数の増加が
減ってくるときに望ましい可溶性ＫＬの発現が誘導さ
れ、すなわち望ましい可溶性ＫＬをコードしているＤＮ
Ａが転写され、転写されたｍＲＮＡが翻訳される。生育
培地に誘導剤あるいは脱抑制剤を加えるかまたは物理的
パラメータ、例えば温度を変えることによって誘導が行
われる。本発明の好適な実施態様で使われる発現ベクタ
ーでは、発現が lacリプレッサーによって調節される。
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (ＩＰ
ＴＧ) を加えることによって、発現制御配列が抑制解除
され、望ましい可溶性ＫＬの合成が誘導される。
【００３３】望ましい発現ベクターを含む哺乳類宿主細
胞はその細胞の生育に最適な条件下で生育される。典型
的な発現ベクターはｍＲＮＡの転写を仲介するプロモー
タ要素、蛋白コード配列、及び効果的な終止と転写物の
ポリアデニル化に必要なシグナルを含んでいる。その他
の要素にはエンハンサー及びスプライス供与及び受容部
位により境界される介在配列を含んでいる。
【００３４】与えられたコード配列の一時的な発現に使
われるベクターの多くはSV40複製起点をもっていて、そ
れがウイルスのＤＮＡ合成を開始するのに必要なＴ抗原
を構成的に発現する細胞 (例えばＣＯＳ細胞) 内に多コ
ピー数に複製させる。一時的な発現はＣＯＳ細胞に限ら
れない。トランスフェクトされる哺乳類の細胞株はこの
目的に利用できる。高効率の転写をコントロールする要
素にはSV40からの初期のあるいは後期のプロモータとレ
トロウイルス（例えば RSV, HIV, HTLV-I ）からのロン
グ・ターミナル・リピート (ＬＴＲ）が含まれる。しか
しながら、細胞性のシグナルもまた使える (例えばヒト
−β−アクチン−プロモーター) 。また染色体にくみこ
まれた当該の遺伝子をもつ安定な細胞系が gpt, dhfr,
ネオマイシン, ハイグロマイシンのような選択マーカー
との同時トランスフェクションにより選ばれる。
【００３５】ここで、トランスフェクトされた遺伝子は
外来の蛋白を多量発現するために増幅される。1000コピ
ー以上の当該の遺伝子をもっている細胞株を作るために
はジヒドロ葉酸リダクターゼ (ＤＨＦＲ) が有効なマー
カーである。哺乳動物細胞はメトトレキセートの量を増
やしながら培養する。その後、メトトレキセートが除か
れると、細胞株は染色体にくみこまれた増幅遺伝子を含
んでいる。本発明の好適な実施態様で使われる発現ベク
ターにおいては、その発現はラウス肉腫ウイルスのＬＴ
Ｒによって調節される。
【００３６】バキュロウイルス昆虫細胞ベクター系も本
発明の可溶性ＫＬの生産に使われる(概説のためには Lu
clow and Summers, Bio/Technology 6, 47-55［1988］
を参照) 。組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞
により産生された可溶性ＫＬはＮ−グリコシレーション
(Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,840
4- 8408) やＯ−グリコシレーション (Thomsen et al.,
12. InternationalHerpe-svirus Workshop,フィラデル
フィア大学, ペンシルバニア) を含む翻訳後のプロセシ
ングをうけることがある。
【００３７】ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような
分析目的のために原核性宿主細胞で発現された可溶性Ｋ
Ｌを少量単離する場合は、宿主細胞をドデシル硫酸ナト
リウム (SDS)のような洗剤で処理することによって破壊
する。大量の可溶性ＫＬは機械的［Charm et al., Met
h. Enzymol. 22, 476-556 (1971)］、酵素的 (リゾチー
ム処理) あるいは化学的 (洗剤処理、尿素やグアニジン
塩酸塩処理等) な処理をして、その後例えばいろいろな
重力での遠心分離、硫安沈澱、透析 (常圧あるいは減圧
で) 、調製用焦点電気泳動、調製用ゲル電気泳動あるい
はゲルろ過、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) 、イ
オン交換クロマトグラフィー (例えば、Sepharose(登録
商標) Blue CL-6Bや天然のＫＬや本発明の可溶性ＫＬに
対して誘導された担体に結合したモノクローナル抗体な
ど) のようないろいろなクロマトグラフィーにより、既
知の方法を使って得ることができる。
【００３８】原核性宿主細胞で発現される可溶性ＫＬを
大量に単離するための好適な方法は次のようなステップ
を含んでいる： (Ｉ) 細胞の破壊とグアニジン塩酸塩による蛋白の抽
出； (II) 蛋白の再生； (III） 銅キレートクロマトグラフィー；及び (IV) 陰イオン交換カラムによるクロマトグラフィ
ー。
【００３９】哺乳類の宿主細胞あるいはバキュロウイル
ス−昆虫細胞ベクター系で発現される可溶性ＫＬは標準
的蛋白精製法を用いて宿主細胞培地から単離される。可
溶性ＫＬは造血疾患の治療や自己のあるいは同種の骨ず
い移植をした、しないに拘らず、ガン患者の放射線や化
学療法をしたあとで造血器の回復を改善させるための医
薬組成物を調製するために使われる。可溶性ＫＬは単独
であるいは１つ以上の EPO, G-CSF あるいは GM-CSF の
ような他の造血因子と組合わせて用いられる。
【００４０】再生不良貧血、けいれん性夜間赤色素尿症
(PNH)、多血球血症、慢性骨ずい性白血症、骨ずい様化
生、血小板血症、急性白血症のような幹細胞疾患が本発
明の可溶性ＫＬで治療しうるものである。可溶性ＫＬで
治療できる疾患には後天性免疫不全症候群 (AIDS) 、骨
ずい線維症、骨ずい硬化症、骨化石症、転移性ガン、多
発性骨髄腫、マラリア、ビタミンＢ12や葉酸欠乏症のよ
うな多くの疾患がある。
【００４１】可溶性ＫＬはまたｃ−キット受容体への機
能性リガンドの結合によって仲介される生物活性が破壊
されるが、ｃ−キット受容体への結合能が保たれるよう
に変異を起こされることができる。従って、これら変異
型ＫＬはアレルギーを治療するのに使用されうる。可溶
性ＫＬは化学療法や放射線療法によって機能が減退した
骨髄をもった患者のマスト細胞の増殖を刺激するのに使
用される。
【００４２】可溶性ＫＬはまた、自己あるいは同種の骨
髄移植で早期の造血前駆細胞の増殖に使われる。本発明
の可溶性ＫＬは単離された天然に存在するヒトのＫＬや
全長可溶性ＫＬと同様、放射線や化学療法をする前にガ
ン患者の早期骨髄球やリンパ球血液前駆細胞を豊富にす
るのに利用される。ガン患者はここに記されたようなＫ
Ｌを単独であるいは他の造血因子、特に G-CSF, GM-CS
F, IL-3, または IL-6 のような因子と組み合わせて、
循環性血液前駆細胞数を増加させるために放射線あるい
は化学療法の前に処置される。放射線治療や化学療法後
に、これら増やされた血液前駆細胞はガンを患っている
患者に注入される。
【００４３】可溶性ＫＬでのin vivo 治療はガンとたた
かう免疫系に投与されるものとして有用である。可溶性
ＫＬはまた造血幹細胞にレトロウイルスベクターをトラ
ンスフェクトあるいは感染させることに基づく遺伝子治
療の効率を高めるのに有用である。これによってトラン
スフェクトされるべき初期造血前駆細胞の培養と増殖が
可能である。この培養は可溶性ＫＬ単独かあるいは１つ
以上の他の造血因子と組み合わせて行われる。一旦トラ
ンスフェクトされると、これら細胞は遺伝的疾患にかか
った患者に骨髄移植物として注入される。遺伝的疾患を
治療するのに有用な遺伝子の例はアデノシンデアミナー
ゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン、のう胞性
線維症などが含まれる さらに可溶性ＫＬは不妊症の治療やiv vitro受精法にお
いて有用である。
【００４４】可溶性ＫＬは薬学的に認められる経口、注
射、あるいは局所剤の形で単独または１つ以上の他の造
血因子と一緒に投与される。投与は患者に投与した組成
物の量がＫＬの機能に関連した生物学的機能を改善する
のに効果的であるような量で行われる。本発明の医薬組
成物は適合した薬学的に認められる担体物質と一緒に可
溶性ＫＬを含有する。従来からある担体は全て利用でき
る。担体は腸内、経皮あるいは非経口的な投与に適する
有機あるいは無機性のものでよい。適切な担体には水、
ゼラチン、アラビアゴム、乳糖、デンプン、ステアリン
酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリ
コール、黄色ワセリンのようなものが含まれる。さらに
医薬組成物は他の薬学的に活性のある薬剤を含むことが
できる。香味料、保存料、安定剤、乳化剤、緩衝剤等の
添加剤が薬品配合の認められた基準に従って加えられ
る。
【００４５】医薬組成物はａ）錠剤、カプセル、丸剤、
粉剤、顆粒剤などのような経口投与のための固形物、
ｂ) 液剤、シロップ、懸濁液、エリキシル等のような経
口投与のための液体、ｃ) 無菌の溶液、懸濁液あるいは
乳液のような経皮投与のための製剤、ｄ) 液剤、懸濁
液、軟膏、クリーム、ゲル、微粉体、エアロゾル等のよ
うな局所投与のための製剤などを含む従来からある剤型
に成型される。この医薬組成物は滅菌され、かつ／また
保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧をかえるた
めの塩あるいは緩衝剤のような補助剤を含めることがで
きる。
【００４６】非経口投与剤型は静脈内または筋肉内に注
入される注射液あるいは注入液にしうる。これらの製剤
は他の医学的に活性のある物質を含んでいてもよい。保
存剤、安定化剤、乳化剤、緩衝液等の添加物が薬品の配
合の承認基準に従って加えられる。その上、本発明の可
溶性ＫＬに対して抗体を誘導することができる。これら
の抗体は診断あるいは治療の目的のために、あるいは精
製の目的のためによく知られた方法で使われる。かかる
抗体は本発明の可溶性ＫＬと適合した製剤上の担体から
なる十分な量のワクチン処方物を哺乳動物または鳥類に
投与してそのＫＬに対する抗体を産生させることによっ
て作られる。必要とされる可溶性ＫＬの適量は当業界で
知られているか、あるいは通常の実験を行うことによっ
て決定できる。この発明と関連して使われるとき、「製
剤上の担体」という用語はヒトの投与に適した標準組成
物または動物のワクチン接種に使われる典型的なアジュ
バントを意味している。
【００４７】動物のワクチン接種に適当なアジュバント
には、フロイントの完全または不完全アジュバント (ヒ
ト用あるいは家畜用途には適当でない) 、アジュバント
65 (ピーナッツ油、マンニド・モノオレエート、燐酸ア
ルミニウム及びミョウバンを含む）；ヘキサデシルアミ
ン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオ
クタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ1,Ｎ−ジオクタデ
シル−Ｎ'-Ｎ−ビス (２−ヒドロキシエチルプロパンジ
アミン) 、メトキシヘキサデシルグリセロール、プルロ
ニックポリオールのような界面活性化剤；ピラン、デキ
ストラン硫酸、ポリＩＣ、ポリアクリル酸、カルボポー
ル等のポリアニオン；ムラミルジペプチド、ジメンチル
グリシン、タフトシンのようなペプチド；オイルエマル
ジョンなどがあるがこれらに限るものでない。可溶性Ｋ
Ｌはまたリポソームあるいはその他のマイクロキャリア
に入れてから投与されたり、多糖類、他の蛋白又はポリ
マーと結合した後に、あるいは「Iscoms」 (免疫刺激複
合体) を形成するために Quil-A と組合せて投与される
(Morein et al, Nature 308, 457［1984］) 。
【００４８】典型的には最初の免疫のあと１回あるいは
それ以上の追加免疫を数週間後におこない、それにより
通常の方法で回収される可溶性ＫＬに対する高力価の抗
体を産生させる。もう一つの方法はモノクローナル抗体
をつくるためのよく知られた Koehler and Milstein法
を使うことである。同じ抗原に対して誘導されるが異な
るエピトープに対する別々のモノクローナル抗体を見つ
けるためには、 Stahli らの方法［J.of Immunological
Methods 32, 297-304 (1980)］が使われる。
【００４９】最後に本発明の可溶性ＫＬはｃ−キットの
アンタゴニストまたはアゴニストを同定するためのスク
リーニング法に有効である。一般的に本発明について記
載してきたが、特定の実施例を参照することにより本発
明をさらによく理解できるようになるであろう。これら
の実施例は以下に示す図面とともに説明のためにここに
示されており、特にことわらない限りそれらに限定する
ものではない。 図１. はE.coliの発現プラスミドpOC56/RBSII, NeoＩの
完全なヌクレオチド配列を示している。このヌクレオチ
ド配列には制限酵素 NeoＩとHindIII の認識部位が示し
てある。 図２. はE.coliのコドン優先性のために一部最適化した
全長可溶性ＫＬはコード配列のヌクレオチド配列及び全
長可溶性ＫＬのアミノ酸配列を示している。このヌクレ
オチド配列には制限酵素 NeoＩ, SmaＩ及びHindIII の
認識部位が示してある。 図３. はプラスミドpREP4 の完全なヌクレオチド配列を
示している。 図４. はカルボキシ末端で切断された可溶性ＫＬのＭ１
−Ｍ９の生産に使われる3'−プライマーのヌクレオチド
配列を示している。 図５. は可溶性ＫＬのＭ１−Ｍ10のアミノ酸配列を示し
ている。 図６. は末端切断された可溶性ＫＬのＭ２, Ｍ５, Ｍ
７, Ｍ10によるHEL 92.1.7細胞に対する 125Ｉ−ＫＬの
結合阻害を示している。 図７. はＫＬ濃度に依存したTF-1細胞への 3Ｈ−チミジ
ンの取込みを示している。 (ａ：全長可溶性ＫＬ、ｂ〜
ｅ：末端切断された可溶性ＫＬのＭ２, Ｍ５, Ｍ７, Ｍ
10)
【００５０】
【実施例】実施例１ E.coli細胞での可溶性ＫＬの発現 Ａ. 全長hKL配列及び全長可溶性hKL配列をコードしてい
るプラスミドの調製 １. ヒトのキットリガンド (hKL)ｃＤＮＡの調製 ヒトのＫＬ配列から得られる４種のプライマーと hKLを
生産しているヒト胚繊維芽細胞株由来のｍＲＮＡとを使
ってポリメラーゼ・チェイン・リアクション (ＰＣＲ)
法によってヒトＫＬをコードしているｃＤＮＡが得られ
た。ＰＣＲ反応のためのプライマーの配列は次のとおり
である。
【００５１】5'プライマー (１): 5'-GGGATCCACCATGAAG
AAGACACAAACTTGG-3' 3'プライマー (２): 5'-GGGAGATCTGATACAAGCCACAATTTAC
AC-3' 5'プライマー (３): 5'-GGGCCATGGAAGGTATCTGCAGGAATCG
-3' 3'プライマー (４): 5'-GGGAAGCTTATGCAACAGGGGGTAACAA
AATGG-3' プライマー１と２は全長hKLのコード配列 (アミノ酸残
基 -25から248まで) を増幅するためにデザインされ
た。プライマー１はhKL配列に相補的な配列に加えて、
最適化されたKozak 配列 (CCACCATG) 、BamHＩ(GGATCC)
及び SmaＩ(GGG) 制限部位の半分を含む5'拡張部分をも
っている。3'プライマー２は BglII部位とやはり SmaＩ
部位の半分をその拡張部分に含んでいる。
【００５２】プライマー３と４は、他方、ヒトＫＬのア
ミノ酸残基１〜164のみをコードしている配列を増幅す
るためにデザインされた。プライマー３は hKLのアミノ
酸残基１に先行するＡＴＧ翻訳開始コドンを提供する拡
張部をもっている。このＡＴＧは NcoＩ部位にくみこま
れている。プライマー３は SmaＩ制限部位の半分も含ん
でいる。プライマー４は hKLのアミノ酸残基 164のコド
ンの後にＴＡＡ停止コドンを導入するようデザインされ
る。さらにプライマー４の突出部分は Hind III と Sma
Ｉ制限部位の半分を含んでいる。
【００５３】ＰＣＲは１分間の95℃変性、１分間の55℃
でのアニーリング、２分間の72℃での伸長を30サイクル
行う標準法で行った。これらの反応の増幅物 (増幅され
た断片) をアガロースゲル電気泳動で分析した。 ２. 全長hKL (アミノ酸残基 -25〜248)をコードしてい
るプラスミドpKLの構築 プライマー１と２によるＰＣＲ反応の増幅物は低融点ア
ガロース (ＬＭＡ) でゲル電気泳動により精製した。得
られた断片の突出末端部を標準条件でクレノーＤＮＡポ
リメラーゼを用いて修復した。5'末端を燐酸化した後断
片を再びＬＭＡゲル電気泳動により精製した。
【００５４】プラスミド pUC18を酵素 SmaＩで直線化
し、アルカリホスファターゼで処理し、そしてＬＭＡ電
気泳動で精製した。プライマー１及び２からの精製増幅
物を直線化した pUCベクターの中にクローン化し、全長
ｈＫＬ (アミノ酸残基 -25〜248)をコードしているプラ
スミドpKLを作製した。プラスミドpKL で形質転換した
E.coli HB101細胞はブダペスト条約に従い1991年６月17
日にブラウンシュバイクにある Deutsche Sammlung von
Mikroorganismenに寄託された［E.coli HB101 (pKL),
DSM No.6570 ］。 ３. 全長可溶性ｈＫＬをコードしているプラスミドpKLm
の構築。
【００５５】ａ. プラスミドpKLmn１の構築。 プライマー３と４によるＰＣＲ反応の増幅物はＬＭＡ電
気泳動で精製し、NcoＩとHindIII で消化し、再度ＬＭ
Ａによって精製した。プラスミドpDS56/RBSII, NcoＩ
(Stuber ら、「Immunological Methods」第４巻121〜152
頁［1990年］、アカデミックプレス社版) を NcoＩと X
baＩで消化し、アルカリホスファターゼで処理し、そし
てベクターの骨格をＬＭＡで精製した。第二の消化にお
いてプラスミド pDS56/RBSII, Nco Ｉを XbaＩとHindII
I で消化し、ＣＡＴ遺伝子をコードしている断片をＬＭ
Ａを用いて単離した。NcoI‐XbaＩベクターの骨格、Ｃ
ＡＴ遺伝子を含む XbaＩ- HindIII 断片、そして全長可
溶性 hKLをコードしている NcoＩ-HindIII断片 (プライ
マー３と４の精製増幅物）を連結してプラスミドpKLmn
１を作製した。
【００５６】ｂ. E.coli発現プラスミドpOC56/RBSII, N
coＩの構築。 ＣＡＴをコードしている配列を欠失することによってプ
ラスミドpDS56/RBSII,NcoＩからプラスミドpOC56/RBSI
I, NcoＩを構築した。制限部位HindIII と XbaＩの間に
あるpDS56/RBSII, NcoＩの配列を除き、ターミネータｔ
0 のみを含むHindIII- XbaＩ断片によって置換した。得
られるプラスミドは pOC56/RBSII, NcoＩと命名され
た。その完全なＤＮＡ配列は図１に示してある。
【００５７】ｃ. プラスミドpKLmn２の構築。 プラスミドpKLmn1 を酵素 NcoＩとHindIII で消化し、
ＫＬをコードする断片をＬＭＡゲル電気泳動で単離し
た。プラスミドpOC56/RBSII,NcoＩも NcoＩとHindIII
で消化し、アルカリホスファターゼで処理し、ＬＭＡゲ
ル電気泳動で単離した。全長可溶性ＫＬをコードする断
片を NcoＩとHindIII で消化したプラスミドpOC56/RBSI
I,NcoＩに連結し、プラスミドpKLmn2を作製した。
【００５８】ｄ．プラスミドpKLmの構築 全く同一の配列をコードしているがE.coliのコドン優先
性を考慮した合成ＤＮＡによって hKLのアミノ酸残基１
〜34 (hKLコード配列の中にあるNcoＩから SmaＩ部位ま
で) のコドンを置換することによってプラスミドpKLmが
構築された。E.coliのコドン優先性について部分的に最
適化したhKL のコード領域の配列を図２に示してある。
pKLmの構築のために、 hKLコード配列の5'部分を遊離さ
せる NcoＩと SmaＩを用いてプラスミド pKLmn２を消化
した。アルカリフォスファターゼで処理した後、ＬＭＡ
を用いて骨格を単離した。２つの合成オリゴヌクレオチ
ドを燐酸化し、アニーリングし、そして消化したベクタ
ー pKLmn２に連結して、アミノ酸Met-1-164 をもった全
長可溶性ＫＬをコードしているプラスミドpKLmを作製し
た。
【００５９】プラスミドpKLmで形質転換したE.coli M15
細胞はブダペスト条約に従い、1991年６月17日ブラウン
シュワイクにある Deutsche Sammlung von Mikroorgani
smenに寄託された［E.coli M15 (PkLM), DSM No.6572］Ｂ. 全長可溶性hKLの発現 プラスミドpREP4 (その完全な配列は図３に示してある)
を生産する lacリプレッサーを含むE.coli M15細胞を
プラスミドpKLmで形質転換した。その細胞を100mg/l の
アンピシリンと25mg/lのカナマイシンを含むＴＢ培地
(12g/l バクトトリプトン、24g/l の酵母エキス、４ml/
lのグリセロール、0.017MのKH2PO4, 0.072M K2HPO4 )
で培養した。600nm での吸光度が0.６から1.０になった
ときにＩＰＴＧを最終濃度２mMになるよう添加した。さ
らに37℃で2.５から５時間培養を続けた後、細胞を遠心
分離で集菌した。全長可溶性hKL蛋白の存在は文献 (Lae
mmli, Nature 227, 680-685［1970］) に記載されてい
るようにして還元または非還元条件下でSDS-PAGE (ドデ
シル硫酸ソーダの存在下でのポリアクリルアミドゲル電
気泳動) によって示された。Ｃ. カルボキシ末端で切断された可溶性ＫＬの発現 １. カルボキシ末端を切りとった可溶性ＫＬをコードし
ているプラスミド pKLmM1−M9の調製 可溶性ＫＬのカルボキシ末端の切断型は5'プライマーの
5'-ACAATTTCACACAGAATTCA-3'と3'プライマーとして hKL
配列の別の部分に相応するオリゴヌクレオチドを使って
ＰＣＲによって作られた。3'プライマーは hKLコード配
列の中にある決められた場所に停止コドンを導入し、そ
の結果可溶性ＫＬのカルボキシ末端切断型を生じるよう
デザインされた。カルボキシ末端で切断された可溶性Ｋ
Ｌを産生するのに使われた3'プライマーの配列は図４に
示してある。ＰＣＲの条件は１分間95℃で変性、１分間
の47℃でのアニーリング、２分間の72℃での伸長を１サ
イクルとする30サイクルであった。このＰＣＲ反応の増
幅物はまたＬＭＡで精製し、 Klenow ＤＮＡポリメラー
ゼと４種全てのヌクレオチドで処理し、そして燐酸化し
た。それからこの増幅物は酵素 NcoＩで消化し、 NcoＩ
の突出部分と平滑末端を有する断片を得た。これらの断
片もＬＭＡを用いて精製した。
【００６０】NcoＩとHindIII 部位の間にカルビンディ
ンＤ９挿入物を含むプラスミドpOC56/RBSII, NcoＩをHi
ndIII で消化し、その突出部分をKlenow DNAポリメラー
ゼを用いて修復した。精製後、直線化されたベクターを
さらにカルビンディンＤ９挿入物配列を放出させる Nco
Ｉで消化した。アルカリホスファターゼで処理した後、
ベクターの骨格をＬＭＡゲル電気泳動を用いて単離し
た。カルボキシ末端で切断された可溶性ＫＬをコードし
ているＰＣＲ断片をこのベクターに連結した。得られた
プラスミドは以下のように命名した： pKLm M1, アミノ酸Met-1-138(M1) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M2, アミノ酸Met-1-141(M2) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M3, アミノ酸Met-1-144(M3) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M4, アミノ酸Met-1-147(M4) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M5, アミノ酸Met-1-150(M5) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M6, アミノ酸Met-1-153(M6) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M7, アミノ酸Met-1-156(M7) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M8, アミノ酸Met-1-159(M8) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； pKLm M9, アミノ酸Met-1-162(M9) をもった可溶性ＫＬ
をコードしている； これらの可溶性ＫＬ Ｍ１からＭ９のアミノ酸配列は一
文字表示で図５に示してある。 ２. カルボキシ末端で切断された可溶性ＫＬのE.coliで
の発現 プラスミドpREP4 を含むE.coli M15細胞をプラスミドpK
Lm M1-M9で形質転換した。細胞を100mg/l のアンピシリ
ン、25mg/lのカナマイシンを含むＴＢ培地 (12g/l のバ
クトトリプトン、24g/l の酵母エキス、４ml/lのグリセ
ロール、0.017MのKH2PO4, 0.072M K2HPO4 ) で培養し
た。 600nmにおける吸光度が0.６から1.０になったとき
ＩＰＴＧを最終濃度が２mMになるよう添加した。さらに
37℃で2.５〜５時間培養を続けた後、細胞を遠心分離で
集菌した。可溶性ＫＬの存在は文献(Laemmli, Nature 2
27, 680-685 ［1970］) に記載されているように還元条
件及び非還元条件下 (β−メルカプトエタノールの存在
及び非存在下) でSDS-PAGE(ドデシル硫酸ソーダの存在
下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動) によって示さ
れた。Ｄ. アミノ末端で切断された可溶性ＫＬの発現 １. アミノ末端で切断された可溶性ＫＬをコードしてい
るプラスミドpKLm M10の調製 アミノ末端で切断されたＫＬは5'プライマー5'-GGTATTT
GTCGTAACCGTGT-3'を使ってＰＣＲ法によって生産され
た。使った3'プライマーの配列は5'-CATTACTGGATCTATCA
ACAGG-3'であった。ＰＣＲの条件は95℃１分間変性、52
℃１分間アニーリング、72℃２分間の伸長で20サイクル
であった。このＰＣＲ反応の増幅物 (hKL2-164)をＬＭ
Ａで精製し、 Klenow ＤＮＡポリメラーゼと４種全ての
ヌクレオチドとで処理し、そして燐酸化した。この断片
をその後HindIII で消化し、ＬＭＡを用いて精製し、 K
lenow ＤＮＡポリメラーゼで処理して、燐酸化した。そ
の後増幅物をHindIII で消化し、再度ＬＭＡで精製し
た。
【００６１】NcoＩとHindIII 部位の間のカルビンディ
ンＤ９挿入物を含むプラスミドpOC56/RBSII, NcoＩを N
coＩで消化し、得られた突出部分を Klenow ＤＮＡポリ
メラーゼを用いて修復した。精製後、直線化されたベク
ターをさらにHindIII で消化しアルカリフォスファター
ゼで処理した。ベクター骨格ＬＭＡゲル電気泳動で精製
した。
【００６２】hKL 2-164 をコードしているＰＣＲ断片は
その後このベクターに連結した。得られるプラスミドは
アミノ酸Met-2-164(M10)をもった可溶性ＫＬをコードし
ているpKLm M10と命名された。この可溶性ＫＬのアミノ
酸配列は一文字表示で図５に示してある。 ２. アミノ末端で切断された可溶性ＫＬのE.coliでの発
現 プラスミドpREP4 を含むE.coli M15細胞をプラスミドpK
Lm M10で形質転換した。この菌を100mg/l のアンピシリ
ン、25mg/lのカナマイシンを含むＴＢ培地 (12g/l バク
トトリプトン、24g/l 酵母エキス、４ml/lのグリセロー
ル、 0.017MKH2PO4、0.072MのK2HPO4 ) で培養した。 6
00nmでの吸光度が0.６から1.０になったときＩＰＴＧを
最終濃度が２mMになるよう加えた。さらに37℃で2.５か
ら５時間培養を続けた後、遠心分離で集菌した。可溶性
ＫＬの存在は文献 (Laemmli、既出) に記載のとおり還
元及び非還元条件 (β−メルカプトエタノールの存在ま
たは非存在) 下でSDS-PAGE (ドデシル硫酸ソーダの存在
下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動) によって示さ
れた。
【００６３】実施例２ 哺乳動物細胞での可溶性ＫＬの発現 Ａ. 可溶性ＫＬとその断片をコードしている断片の調製 いろいろな長さのＫＬを含む断片がポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション (Saikl et al., 1985, Science 23
0, 1350-1354 ［1985］) を用いて得られた。ＰＣＲは
ＤＮＡ断片の酵素的増幅にもとづいている。お互いに向
き合ってその3'末端に向けられている２つのオリゴヌク
レオチドプライマーが標的となる配列の相反するＤＮＡ
鎖にハイブリダイズされる。鋳型の熱変性、その相補的
な配列へのプライマーのアニーリング、アニーリングさ
れたプライマーのＤＮＡポリメラーゼによる伸長をくり
返すサイクルによってＰＣＲプライマーの5'末端によっ
て決められる部分の増幅が行われる。各々のプライマー
の5'末端に制限酵素部位を付加すると、最終的なＰＣＲ
産物のクローニングが容易になる (Scharf et al.,Scie
nce 233, 1076-1078 ［1986］) 。
【００６４】以下のようなオリゴヌクレオチドがいろい
ろな長さのＫＬをコードしているＤＮＡ断片を増幅する
ために使われた： ａ. 5'プライマー
【００６５】
【化10】
【００６６】ｂ. 3'プライマー 断片Ａ (全長ＫＬ)
【００６７】
【化11】
【００６８】断片Ｂ (最後のアミノ酸：Ala164)
【００６９】
【化12】
【００７０】断片Ｃ (最後のアミノ酸：Val140)
【００７１】
【化13】
【００７２】増幅された断片は市販されているキット
「Geneclean」 (BIO 101 Inc., La Jolla, Ca)を使っ
てアガロースゲルから単離された。それからその断片は
エンドヌクレアーゼHindIII とBamHＩ (プライマー中の
制限部位に下線をつけてある)で消化し、その後上記の
ように再び精製した。これによって以下のアミノ酸配列
をもった全長ＫＬをコードしている断片Ａが得られた：
【００７３】
【化14】
【００７４】また、次のアミノ酸配列をコードしている
断片Ｂも得られた：
【００７５】
【化15】
【００７６】(アミノ酸残基 -25から164まで)さらに以
下のアミノ酸配列をコードする断片Ｃも得られた：
【００７７】
【化16】
【００７８】(アミノ酸残基 -25から140まで)全ての増
幅された断片はラットのプレプロインスリン遺伝子に由
来する９ヌクレオチドにより先行されるＫＬの真正の翻
訳開始コドンＡＴＧ (太字で示した5'プライマーを参
照）を含んでいる。翻訳停止コドン (ＴＡＡ) は制限エ
ンドヌクレアーゼBamHＩの認識部位が続く全構築物の最
後のアミノ酸のうしろの部分に読み枠を一致させて挿入
した (３つの 3' プライマーにおいて太字で示してある
（方向によりＴＴＡ))。Ｂ. ベクター断片の調製 １. プラスミドpK21 プラスミドpK21はラウス肉腫ウイルスのロング・ターミ
ナル・リピート (ＬＴＲ) の強力なプロモータを含み、
次の配列のポリリンカー領域がその後に続いて対象の遺
伝子の組みこみを可能にしている。
【００７９】
【化17】
【００８０】遺伝子のクローニング部位のうしろにプラ
スミドはラットのプレプロインスリン遺伝子の3'イント
ロン、ポリアデニル化部位、及び終止シグナルを含んで
いる。プラスミドpK21で形質転換されたE.coli HB101細
胞はブダペスト条約に従って1991年６月17日にブラウン
シュバイク市にある Deutsche Sammlung von Microorga
nismenに寄託された［E.coli HB101(pK21), DSM No.657
1］。 ２. ベクター断片Ｖ１の調製 プラスミドpK21をHindIII とBamHＩで消化し、それから
ＤＮＡ断片の5'末端から燐酸基を除くためにウシ小腸ア
ルカリホスファターゼで処理した。その後脱燐酸化され
たベクター (Ｖ１) を上記のようにアガロースゲルから
単離した。 Ｃ. 可溶性ＫＬ及びその断片をコードしているプラスミ
ドの調製 断片Ａ, Ｂ, Ｃを夫々ベクター断片Ｖ１に連結した。
【００８１】E.coli HB101を形質転換し、断片Ａ, Ｂ,
Ｃを含む形質転換体は制限酵素地図の作成と配列の決定
によって同定された。得られたプラスミドをpN298, pN3
00,pN301 と命名した。Ｄ. 発現プラスミドの調製 １. 発現カセットの調製 強いＲＳＶプロモータ、修飾されたＫＬ遺伝子、ラット
のプレプロインスリン遺伝子の3'イントロン及びポリＡ
シグナルを含む発現カセットを夫々制限酵素XhoＩと Xb
aＩでプラスミドpN298, pN300, pN301 を切ることによ
って単離した。突出末端を標準条件を用いたKlenow酵素
で修復した。最後に３つの断片を上記のようにして単離
して断片Ａ'(全長ＫＬ) 、断片Ｂ'(アミノ酸 -25から16
4まで)及び断片Ｃ'(アミノ酸 -25から140まで) を得
た。 ２. ベクター断片Ｖ２の調製 プラスミド pSV2-DHFR (Pouwels et al., 「Cloning V
ectors-A LaboratoryManual 」Elsevier出版、アムス
テルダム−ニューヨーク−オクスフォード［1988］) を
制限酵素PvuII で直線状にし、それからウシ小腸のアル
カリフォスファターゼで処理した。脱燐酸化されたベク
ター (Ｖ２) を上記のようにアガロースゲルから単離し
た。断片Ａ',Ｂ',Ｃ' は夫々ベクターＶ２と連結させ
た。
【００８２】その後E.coli HB101細胞を形質転換した。
発現カセットを含んだ形質転換体は制限酵素分析と配列
決定によって同定した。断片Ａ',Ｂ',Ｃ' がdhfr遺伝子
と同じ方向で転写されるクローンだけを以下の研究に使
用した。これらはpN298' (断片Ａ' を含む), pN300'(断
片Ｂ' を含む), pN301'(断片Ｃ' を含む) と命名した。
他の方向に組みこまれた発現カセットをもつクローンは
捨てた。Ｅ. トランスフェクトされたＣＯＳ１細胞でのＫＬの発
現 ＣＯＳ１細胞 (ATCC CRL1650) をリポフェクチンでトラ
ンスフェクトした (Felgner et al., PNAS USA 84, 74
13-7414 ［1987］) 。培養３日後、上清を遠心分離で集
め (12000rpm、10分間) 、実施例５Ａに記載のようにＫ
Ｌの発現を分析した。対照に使われたＣＯＳ１細胞はプ
ラスミドpSV2-dhfr とpK21でトランスフェクトした。両
プラスミドにはＫＬ遺伝子またはその断片は組みこまれ
ていない。
【００８３】 表１ 結合の阻害 (ＣＯＳ１細胞の上清) プラスミド cpm pK21 (ネガティブコントロール) 54061 pSV2-dhfr (ネガティブコントロール) 53032 pN298' (全長) 13134 pN300' (断片Ｂ) 3696 pN301' (断片Ｃ) 1555 精製したKL (1.３μg/mlポジティブコントロール) 2448/2422 ＫＬまたはその断片を発現するプラスミドでトランスフ
ェクトされた細胞は全て上清に結合活性を示している。
【００８４】実施例３ E.coliで発現された組換えＫＬの精製 E.coli 294における全長可溶性ヒトＫＬ(hKL１〜164 )
の発現が実施例１Ｂに従って行われた。150gの凍結細胞
ペーストを1050mlの ８M グアニジウム塩酸塩 50mM トリス 20mM NaH2PO4 ２％ ツィーン20 (pH5.5) の中に懸濁し、室温で窒素下に攪拌した。１時間後懸濁
液のpHをpH5.５に調整し、窒素下での攪拌をさらに５時
間続けた。
【００８５】再生／酸化のために抽出液を攪拌しながら 0.24M グアニジウム塩酸塩 150mM NaCl 20mM Na2HPO4 0.1% ツィーン20 (pH8.0) の溶液28.8Ｌ(4℃) に入れて希釈し、この結果グアニジ
ン塩酸塩の最終濃度は0.6Mとなった。pHを直接８に調整
した。懸濁液は空気にさらして16時間４℃で攪拌した。
沈澱物を Zetaplus 10S (0.35m2 ) フィルター部材を通
す濾過によって除去した (４℃) 。
【００８６】清澄化された抽出液をRP-HPLC で分析し
た。分析は Nucleosil 300-5 C4 分析用カラム (4.５×
30cm；Macherey-Nagel) を使って行われた。異なる折り
たたみ形のものをバッファーＡ (30％アセトニトリル、
0.２％トリフルオロ酢酸) からの段階的勾配により流速
１ml/minで分離した。生物学的に活性のある形に相当す
る主要な折りたたみ形は約60％のアセトニトリルで溶出
する。その他の形はより高いアセトニトリル濃度で溶出
する。
【００８７】SDS-PAGE (非還元) では再生／酸化法によ
って得られるＫＬの主要な折りたたみ形は還元した蛋白
マーカーと比べて 17000ダルトンのバンドに相当する
が、一方、メルカプトエタノールで還元したときはバン
ドは約 19000ダルトンに移った。再生して活性のある形
の全収量はRP-HPLCに従えば448mgである。
【００８８】濾液をキレート・セファロース・ファース
トフローカラム (Pharmacia社、14cm径×10cm、60cm/h)
にかけたが、このカラムは銅イオンでキレート化され 0.6M グアニジウム塩酸塩 150mM NaCl 20mM NaH2PO4 (バッファーＣ) 0.1% ツィーン20 (pH8.0) で予め平衡化された。
【００８９】試料を加えたあとカラムを 4.5倍カラム容
量のバッファーＣ (60cm/h) と2.８倍カラム容量のバッ
ファーＤで洗浄し、次いで25％のバッファーＤと75％の
バッファーＥの混液で洗浄した。 (バッファーＤ) (バッファーＥ) 20mM NaH2PO4 50mM CH3COOH 150mM NaCl 50mM NaCl 0.1% ツィーン20 0.1% ツィーン20 (pH8.0) NaOHでpH3.0に調整 その後25％バッファーＤ／75％バッファーＥから70％バ
ッファーＤ／30％バッファーＥへの勾配を４時間42分以
内で使用して蛋白の溶出を行った (30cm/h) 。pH4.９と
4.２の間で溶出する。ＫＬを含むと考えられる画分は直
接pH７に調節し、試料をSDS-PAGE (非還元と還元条件
で) とRP-HPLC で分析した。
【００９０】pH-勾配溶出のこの方法を使うことによっ
て活性形態を誤った再生形態から分離することができ、
また、大部分の二量体 (非還元下の SDS-PAGE での見か
け分子量：35−38kD) も除かれた。その収量はRP-HPLC
によれば363mg であった。銅キレートクロマトグラフィ
ーから集めた画分 (5.０Ｌ) を水で14Ｌに希釈した (４
℃で) 。pHを７に調整し、蛋白溶液をＱ−セファロース
・ファーストフローカラム (ファルマシア社、７cm径×
16cm、流速115cm/h)にかけた。
【００９１】カラムを10倍カラム容量の20mMトリス／塩
酸、pH7.０ (バッファーＦ) で洗い、蛋白は 100％のバ
ッファーＦから20mMトリス塩酸0.５M NaCl、pH7.０ (バ
ッファーＧ) までの段階的勾配で溶出した。流速は40cm
/hであった。ＫＬはバッファーＧの22から24％の間に溶
出した。溶出した画分は非還元及び還元下の SDS-PAGE
と RP-HPLCによって分析した。収量は262mg であった。
【００９２】純粋なＫＬを含む画分 (1250ml) をPTGCカ
セットを４つ使ったMinitan 限外濾過システム (Millip
ore 社) によって220ml まで濃縮した。アミコンYM10膜
を使った攪拌セルによって液量をさらに少なくした。最
終容量は38mlであった。濃縮された溶液３ml部分を Sup
erdex 75プレプグレードカラム (ファルマシア社、2.６
cm径×60cm、30cm/h) にかけた。溶出画分は SDS-PAGE
(非還元、還元) と RP-HPLCによって確認された。12回
流して集めた画分は非還元 SDS-PAGE によれば98％以上
の純度、還元下 SDS-PAGE によれば98％以上、 RP-HPLC
によれば97％の純度であった。最終的な収量は hKL 1-1
64が138mg であった。
【００９３】実施例４ 全長可溶性ＫＬと末端切断型可溶性ＫＬ、Ｍ２, Ｍ５,
Ｍ７, Ｍ10の活性 Ａ. ヒトの赤白血病細胞株への放射リガンド結合 10mlのポリプロピレン試験管の底部を50μg のIODO-GEN
(Pierce社、アメリカイリノイ州 ロックフォード市、
カタログNo.28600) でコーティングした。クロロフォル
ムにとかした１mg/ml 液50μl を試験管を回転しながら
窒素気流をゆるやかに流しながら乾かした。 600μl の
燐酸緩衝溶液 (pH7.2) (=PBS) 中に６μg のＫＬを含む
溶液を試験管に加え、氷で冷やした。 125Ｉを入れたヨ
ウ化ナトリウム (イギリス、Amersham社、カタログNo.I
MS 30)溶液を10μl 加えた。試験管を10分間氷中に回転
しながらおいた。溶液は予めＰＢＳ中１％ウシ血清アル
ブミン (Sigma 社、アメリカ ミズーリ州 セントルイス
市、画分Ｖ、カタログNo.A4503) とした溶液で平衡化し
たゲルカラム (Bio-Rad 社、アメリカ カリフォルニア
州 リッチモンド市、Econo-Pac10 DG) の頂部に移した
後ＰＢＳで十分に洗った。ゲルカラムは室温でＰＢＳに
より自然流下させて放射性ヨード化された蛋白を含むボ
イドボリューム画分をガンマモニターで検出した。ボイ
ドボリュームと関連した放射活性を含む画分を集め (3.
0ml)、ＰＢＳ中ＢＳＡの１％溶液0.５mlを加えた。比放
射活性は 55000cpm/μl で放射活性の95％は酸で沈澱す
る。 1 25Ｉ−ＫＬ溶液を小分けして使用するまでは−80
℃に凍結した。
【００９４】HEL 92.1.7細胞 (ATCC受託No.TIB 180) は
1：100 グルタミンと 1：100 ペニシリン／ストレプト
マイシン (いずれもGIBCO)及び10％馬血清 (KC Biologi
cal社、アメリカ カンサス州 ラネクサ市) を含むRPMI
1640 (GIBCO社、アメリカニューヨーク州 グランドアイ
ランド市) 培地に維持した。高密度に生育した細胞 (２
×105/ml)を冷ＰＢＳで洗った。結合試験にはHEL 92.1.
7細胞の培養液に 1：100 のHEPES (GIBCO社) 、0.05％
NaN3 (Fluka社、スイス、ブックス市) 及び示された濃
度の拮抗剤ＫＬ蛋白試料を補充した (図１)。８×105 c
pm/mlの 125Ｉ- ＫＬを加えた。２×106 のHEL 92.1.7
細胞を２時間氷水中で0.５mlの 125Ｉ−ＫＬ含有培地と
4.５mlプラスチック試験管中でインキュベートした。細
胞懸濁液を予め１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で湿らせた５mm
フィルター (ミリポア社、アメリカ マサチュセッツ州
ベッドフォード市、カタログNo.SVLP 02500)を通した。
細胞をフィルター上で２×10mlのＰＢＳで４℃で洗浄し
た。放射活性の結合したフィルターをガンマカウンター
(Kontron Gammamatic社) で測定した。全ての実験を三
回くり返して行った。これらの実験結果は図６に示して
ある。Ｂ. TF-1細胞での増殖検定 100U/ml のヒト組換えIL-3 (Genzyme 社、アメリカ マ
サチュセッツ州 ケンブリッジ、カタログ No.HIL-3C)
と0.４U/mlのヒト組換えエリスロポエチン(Boehringer
Mannheim/FRG：カタログNo.1 120 166) 、10％の牛胎児
血清 (Flow Laboratories 社、アーヴィン市／スコット
ランド) を補った 1：100 グルタミンと 1：100 ペニシ
リン／ストレプトマイシン (いずれも GIBCO社) を加え
た RPMI 1640 (GIBCO社) 中で TF-１細胞 (T.Kitamura
et al., J. Cell. Physiol.140, 323-324 ［1989］)
を維持した。細胞をＰＢＳで一度洗い、それからIL-3と
エリスロポエチンを含まない完全培地に懸濁した。その
細胞を指示された濃度のＫＬ蛋白と混合したウェル当り
200μl に104 細胞になるよう96ウエル組織培養プレー
ト (Coaster 社) に播種した (図２) 。48時間細胞を培
養し、 3Ｈ−チミジン(Amersham社、カタログNo.TRA 12
0) を加え (培地で１：25に希釈した原液をウェル当り2
5μl ) 、さらに３時間インキュベートした。細胞をセ
ルハーベスター(LKB-Wallac社 1295-001)で集め、 3Ｈ
−チミジンのとり込みをベータプレートリーダー (LKB-
Wallac社 1205)で測定した。全ての実験は３回くり返し
行われた。これらの結果は図７に示してある。Ｃ. ヒトの骨髄細胞コロニー形成検定 ３mlの正常ヒト骨ずいを15℃で６mlのＰＢＳで希釈し、
２本の14ml試験管に２×３mlのフィコール (Litton Bio
neticsからのＬＳＭ、アメリカ サウスカロライナ州 チ
ャールストン市) の上に重層した。試験管を20分間 500
×ｇで15℃において遠心した。界面の細胞を集め、15℃
でＰＢＳで３回 (１×45ml、２×12ml) 洗った。細胞を
6U／mlのヒトエリスロポエチン (GIBCO カタログ No.38
26SA：ヒト骨ずい幹細胞増殖キット) を加えた希釈用培
地(GIBCO社、カタログ No.3826SA：ヒト骨ずい幹細胞増
殖キット) で6.５×105 細胞／mlにして再懸濁した。細
胞懸濁液 200μl を10mlの試験管中で希釈培地にＫＬ試
料を入れた 200μl または希釈培地のみの 200μl と混
合した。２mlシリンジを使って２mlの生育培地(GIBCO
社、カタログNo.3826SA ：ヒト骨ずい幹細胞増殖キッ
ト) を加えた。懸濁液を完全に混合するために15秒間ず
つ５回ボルテックス混合した。この懸濁液の２mlを２ml
シリンジで吸引し、Ｃ６組織培養クラスター (Costar
社) のウェルの底部に一様に分配した。このクラスター
は蒸発を避けるためサランラップで覆い、液を乱さぬよ
うにインキュベータ (５％ CO2, 37℃) に保持した。14
日後、各ウェル中のコロニーの数を２人の別の観測者に
よって顕微鏡下で計測した。エリスロポエチンとＫＬ蛋
白の存在でヒトの骨髄細胞から作られた14日目のコロニ
ー (BFU-e とCFU-GMM)の数を以下の表２に示してある。
【００９５】
【表１】
【図面の簡単な説明】
【図１】E.coliの発現プラスミドpOC56/RBSII, NeoＩの
完全なヌクレオチド配列を示す図。
【図２】E.coliのコドン優先性のために一部最適化した
全長可溶性ＫＬコード配列のヌクレオチド配列及び全長
可溶性ＫＬのアミノ酸配列を示す図。
【図３】プラスミドpREP4 の完全なヌクレオチド配列を
示す図。
【図４】カルボキシ末端で切断された可溶性ＫＬのＭ１
−Ｍ９の生産に使われる3'−プライマーのヌクレオチド
配列を示す図。
【図５】可溶性ＫＬのＭ１−Ｍ10のアミノ酸配列を示す
図。
【図６】末端切断された可溶性ＫＬのＭ２, Ｍ５, Ｍ
７, Ｍ10によるHEL 92.1.7細胞に対する 125Ｉ−ＫＬの
結合阻害を示す図。
【図７】ＫＬ濃度に依存したTF-1細胞への 3Ｈ−チミジ
ンの取込みを示す図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 17/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 次の式で表わされる可溶性キットリガン
    ド： 【化１】 ここでＸはメチオニンまたは水素であり、ＹはＩ, ＧＩ
    またはＥＧＩであり、Ｚは 【化２】 またはヒドロキシであり、あるいはＸがメチオニンまた
    は水素であり、ＹがＩまたはＧＩでＺが 【化３】 またはヒドロキシである。
  2. 【請求項２】 Ｘがメチオニンで、ＹがＥＧＩで、Ｚが 【化４】 またはヒドロキシである請求項１の可溶性キットリガン
    ド。
  3. 【請求項３】 Ｘがメチオニンで、ＹがＧＩで、Ｚが 【化５】 である請求項１の可溶性キットリガンド。
  4. 【請求項４】 キットリガンドが蛋白Ｍ１, Ｍ２, Ｍ
    ３, Ｍ４, Ｍ５, Ｍ６, Ｍ７, Ｍ８またはＭ10である請
    求項２または３の可溶性キットリガンド。
  5. 【請求項５】 請求項１から４までに請求されている可
    溶性キットリガンドをコードしているＤＮＡ配列。
  6. 【請求項６】 請求項５に請求されているＤＮＡ配列を
    含み、適切な原核生物または哺乳動物の宿主細胞でその
    ＤＮＡ配列を発現させることができる発現ベクター。
  7. 【請求項７】 請求項６の発現ベクターで形質転換され
    た原核生物または哺乳動物の宿主細胞。
  8. 【請求項８】 請求項６の発現ベクターで形質転換され
    た原核生物の、望ましくはE.coliである宿主細胞。
  9. 【請求項９】 請求項６の発現ベクターで形質転換され
    た哺乳動物の、望ましくはＣＯＳ細胞である宿主細胞。
  10. 【請求項10】 適当な培地で形質転換された原核生物ま
    たは哺乳動物の宿主細胞を請求項１から４までに請求さ
    れた可溶性キットリガンドを発現させるように培養し、
    そのキットリガンドを精製し、再生のためのまきもどし
    をすることを含む可溶性キットリガンドの生産方法。
  11. 【請求項11】 治療的に活性のある薬物としての請求項
    １−４に請求された可溶性キットリガンド。
  12. 【請求項12】 造血性疾患の治療やガン患者において放
    射線や化学療法後の造血の回復を改善するための治療的
    に活性のある薬物としての請求項１−４に請求された可
    溶性キットリガンド。
  13. 【請求項13】 請求項１−４に請求された可溶性キット
    リガンドとそれに適合する薬学的に容認される担体物質
    を含む医薬組成物。
  14. 【請求項14】 医薬組成物の調製のための請求項１−４
    に請求された可溶性キットリガンドの使用。
  15. 【請求項15】 造血性疾患及び癌患者の放射線及び化学
    療法後の造血の回復を改善させるための医薬組成物の調
    製のための請求項１−４に請求された可溶性キットリガ
    ンドの利用。
  16. 【請求項16】 ｃ−キットアゴニストあるいはアンタゴ
    ニストを同定するための請求項１−４に請求された可溶
    性キットリガンドの利用。
  17. 【請求項17】 請求項１−４に請求された可溶性キット
    リガンドに対して誘導されたポリ−及び／またはモノク
    ローナル抗体。
  18. 【請求項18】 請求項10に請求された方法によって生産
    された請求項１−４に請求された可溶性キットリガン
    ド。
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