JPH02215385A - インターロイキン４レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般にサイトカインレセプターに関し、より詳
細にはインターロイキン４レセプターに関する。

（従来の技術） インターロイキン４（ＩＬ−４と略記する；Ｂ細胞刺激
因子またはＢＳＦ−１とも呼ばれている）はもともと、
細胞表面免疫グロブリンに特異的な抗体の低濃度に応答
してＢ細胞の増殖を刺激する能力により同定された。比
較的最近になって、ＩＬ−４はＴ細胞、肥満細胞、顆粒
球、血小板生成細胞および赤血球の増殖の同時刺激を含
めたかなり広範囲の生物学的活性スペクトルを有するこ
とが判明した。さらに、ＩＬ−４は数種のＩＬ−２およ
びＩＬ−３依存性細胞系列の増殖を刺激し、休止Ｂ細胞
面でのクラス■主要組織適合複合分子の発現を誘導し、
そして刺激されたＢ細胞によるＩｇＥおよびＩｇＧ１ア
イソタイプの分泌を増強する。

ネズミおよびヒトＩＬ−４は両方とも、組換えＤＮＡ技
術および天然ネズミタンパク質の均一精製により最終的
に同定された（　Ｙｏｋｏｔａ　ａｔ　ａｌ、。

Ｆｒｏ　Ｃ，ＮａｔＬ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｅｔ、　
　ＵＳＡ　８３　　二　５８９４．１９８６　”、Ｎｏ
ｍａ　ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｓｒｍ　３１９　：６４Ｃ
．１９８６；およびＧｒａｂｓｔａｉｎ　ａｔ　ａｔ、
、　Ｊ、Ｅｚｐ。

Ｍｇｄ、１６３：１４Ｃ５．１９８６）。

ＩＬ−４の生物学的活性は、哺乳動物由来の一次細胞お
よびｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞株により発現されるＩＬ−４
に特異的な細胞表面レセプターによって仲介される。Ｉ
Ｌ−４はこのレセプターに結合し、その後レセプターは
種々の免疫エフェクター細胞へこの生物学的信号を伝達
する。従って、精製されたＩＬ−４レセプター（ＩＬ−
４Ｒと略記する）組成物は、ＩＬ−４またはＩＬ−４レ
セプターの診断検定に、あるいは診断または治療に用い
るためのＩＬ−４レセプターに対する抗体を誘起させる
のに有用であるだろう。さらに、精製されたＩＬ−４レ
セプター組成物はＩＬ−４を結合または排除するために
治療において直接用いられ、このサイトカインの生物学
的活性を調節する手段を提供するであろう。

ＩＬ−４は十分詳しくその性状が決定されているが、そ
のレセプターについての性状決定はほとんど進歩してい
ない。広範囲の細胞型にＩＬ−４レセプターが存在する
ことを論じた数多（の研究が発表されたが、その構造的
性状決定はレセプターと放射性標ＲＩＬ−４分子との化
学的架橋によって形成される共有結合複合体のＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析により測定されたこのタンパク質の概算分
子量に限られている。０ｈａｒａら（Ｎａｔｓｒｍ　３
２５　：５３７．１９８７）およびＰａｒｋら（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８４　：　１６６９．１
９８７）は、Ｂおよび１９７８球並びに広範囲の造血系
統の細胞上に少数発現された高親和性レセプターと結合
する放射性ヨウ素化組換えネズミＩＬ−４を用いて、Ｉ
Ｌ−４レセプターの存在を初めて証明した。

””Ｉ−ＩＬ−４をＩＬ−４Ｒへ親和性架橋させること
により、０ｈａｒａらおよびＰａｒｋらはそれぞれ６０
．０００および７５，０００ダルトンの見掛は分子量を
もつレセプタータンパク質を同定した。ネズミ細胞にお
いて観察された小さい分子量のレセプターは天然レセプ
ターの加水分解により開裂された断片でありうる。酵母
により誘導された１２５Ｉ標識組換えヒトＩＬ−４を用
いるＰａｒｋら（７゜Ｅｚｐ、ｋｂｄ、　１６６　：４
７６．１９８７）によるその後の実験は、ヒトＩＬ−４
レセプターがＢ、Ｔおよび造血系統の細胞に存在するば
かりでなく、ヒト線維芽細胞、上皮および内皮由来の細
胞にも見られることを示した。ＩＬ−４レセプターはそ
れ以来ＣＢＡ／Ｎ１１！！Ｂ細胞（Ｎａｋａｊｉｔｎａ
　ａｔ　ａｌ、、　／。

ｌｍｍ５ｓｏｌ　、　１３９　：　７７４．１９８７）
、バーキットリンパ種ジショイ（Ｊｉｊｏｙｍ）細胞（
ＣａｂｒｔＬｌａｔａｔ　ａｌ　、、　Ｂｉｏｃｈｍｍ
、　＆　Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｒａｓ、　Ｃｏｔｔｖｎｓ
ｎ。

１４９二９９５．１９８７）、多種多様の造血および非
造血細胞（Ｌｏｗｍｎｔｈａｌ　ａｔ　ａｌ、、　／、
　Ｉｒｔｍｘｒｓｏｌ。

１４〇二４５６．１９８８）、およびネズミＬｙｔ−２
−／Ｌ３Ｔ４　　胸腺細胞を含む他の細胞系列にも存在
することが見出されている。最近、Ｐａｒｋら（ＵＣＬ
Ａ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ、　／、　Ｃａ１ｌ　Ｂｉｏｌ、
、　５ｕｐｐｌ。

１２．４，１９８８）は、十分量のプロテアーゼ阻害剤
の存在下で、１３８〜１４５　ｋＤαの１２’ＪＪ−Ｊ
Ｊ。

−４結合性原形質膜レセプターを数種のネズミ細胞系列
において同定したと報じている。このように、ＩＬ−４
レセプターの実際の分子量および構造に関して、かなり
の論争がなお残されている。

ＩＬ−４レセプターの構造および生物学的特性、並びに
ＩＬ−４または他のサイト力イン刺激に対する種々の細
胞集団の応答においてＩＬ−４レセプターが演する役割
、あるいは治療、診断または検定においてＩＬ−４レセ
プターを効果的に使用する方法等の研究は、十分量の精
製ＩＬ−４レセプターを得ることが困難であったために
、実行できなかった。以前には、高レベルのＩＬ−４レ
セプターを構成的かつ連続的に発現する細胞系列が全（
知られていなかった。検出可能なレベルのＩＬ−４レセ
プターを発現することが知られている細胞系列では、一
般に細胞あたりのレセプターの発現レベルが約２０００
より少ない。従って、生化学分析用のＩＬ−４レセプタ
ー分子を精製する試み、あるいはＩＬ−４レセプターを
コードする哺乳動物遺伝子をクローン化して発現させる
試みは、精製レセプターおよび適当なレセプターｍ　Ｒ
Ａ’　Ａ源の不足により妨げられている。

（発明の目的） 本発明は、哺乳動物インターロイキン４レセプター（Ｉ
Ｌ−４Ｒ）またはそのサブユニットをコードするＤＮＡ
配列を提供する。好ましくは、このようなりＮＡ配列は
次の群：（ａ）天然ＩＬ−４Ｒ遺伝子のコード領域から
誘導されるヌクレオチド配列を有するｃ　Ｄ　Ａ’　Ａ
クローン；（ｂ）適当なストリンジェント条件下で（α
）の０ＤＮＡクローンとハイブリダイズでき且つ生物学
的に活性なＩＬ−４Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；お
よび（１）遺伝暗号の結果として、（α）および（ｂ１
で定義したＤＮＡ配列に対し縮重（ｄｅｇｇｎｅデａａ
ｙ　）の関係にあり且つ生物学的に活性なＩＬ−４Ｒ分
子をコードするＤＮＡ配列から選ばれる。本発明はさら
に、上記のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクター、組換
え発現ベクターを用いて生産された組換えＩＬ−４Ｒ分
子、および発現ベクターを用いて組換えＩＬ−４Ｒ分子
を生産する方法を提供する。

本発明はまた哺乳動物ＩＬ−４Ｒを含む実質的に均質な
タンパク質組成物を提供する。全長ネズミ分子はＳＤＳ
−１）ＡＧＥで測定して約１３０．０００〜約１４Ｃ，
０００Ｍｒの分子量をもつ糖タンパク質である。ＣＴＬ
Ｌ　　１９．４ライブラリーからのネズミＩＬ−４レセ
プタークローン１６および１８によりトランスフェクシ
ョンされたＣＯ５細胞の見掛は結合親和性（ＫｃＬ）は
１〜８　Ｘ　１０ｇＭ−’である。ネズミ７Ｂ９ライブ
ラリーからのネズミＩＬ−４レセプタークローン７Ｂ９
−２および７Ｂ９−４によりトランスフェクションされ
たＣＯ５細胞のＫａは２　Ｘ　１０５　〜Ｉ　Ｘ　１０
１０１ｃ”である。成熟ネズミＩＬ−４レセプター分子
は次のようなＮ末端アミノ酸配列を有する二ＩＫＶＬＧ
ＥＰＴＣＦＳＤＹＩＲＴＳＴＣＥＷ０ ヒトＩＬ−４Ｒ分子は約１１０，０００〜約１５０．０
００Ｍｒの分子量をもつと考えられ、ａＤＮＡ配列から
推定されるそのＮ末端アミノ酸配列は、成熟ネズミタン
パク質の生化学的に決定されたＮ末端配列から類推して
、次のとおりであル：　ＭＫＶＬＱＥＰＴＣＶＳＤＹＭ
ＳＩＳＴＣＥＩｉ’０本発明はさらに、上記方法に従っ
て生産された可溶性レセプタータンパク質を有効量含有
する、治療、診断、ＩＩ、−４レセプターの検定、また
はＩＬ−４レセプターに対する抗体の誘導に用いるため
の組成物を提供する。このような可溶性組換えレセプタ
ー分子には、ＩＬ−４の結合に必要でないレセプター分
子の領域が欠失されている切断タンパク質が含まれる。

本発明のこれらの面および他の面は以下の詳細な説明お
よび添付図面を参照することにより明らかになるであろ
う。

ここで、図面について簡単に説明する。

第１図はネズミおよびヒトＩＬ−４ＲａＤＮＡのコード
領域（黒の太線で示す）を含むａ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン
の制限地図を示す。制限部位Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　。

Ｐｖｓｒｌ、　ＨｉｓｃＴｌおよび５ｓｔＩ　はそれぞ
れ文字Ｒ，Ｐ、ＨおよびＳで表す。

第２Ａ−Ｃ図は、７Ｂ９ライブラリーのクローン７Ｂ９
−２から誘導されるような、ネズミＩＬ−４レセプター
のコード領域の６　Ｄ　Ａ’　Ａ配列および推定アミノ
酸配列を示す。成熟タンパク質のＮ末端イソロイシンは
アミノ酸番号１とする。クローン７Ｂ９−２からの全長
膜結合タンパク質のコード領域はアミノ酸１−７８５で
定められる。成熟Ｎ末端を構成するインロイシン残基を
指定するＡＴＣコドンはタンパク質配列の１位に下線が
弓いてあり；アミノ酸２０９−２３２の推定トランスメ
ンブラン領域にも下線が引いである。クローン７Ｂ９−
４、およびＣＴＬＬ１９．４ライブラリーのクローンＣ
ＴＬＬ−１８並びにＣＴＬＬ−１６のコード領域の配列
は次の点を除いて７Ｂ９−２と同じである。ＣＴＬＬ−
１６のコード領域はアミノ酸−２５から２３３（推定上
の２５個のアミノ酸から成るシグナルペプチド配列を含
む）により定められる膜結合ＩＬ−４レセプターをコ−
ドするが、オープン・リーディング・フレームを終結さ
せるＴＡＧターミネータ−コドン（図示せず）がその後
に続いている。核酸配列はこの位置（第１図に矢印で示
す）にスプライス供与部位が、そして３′末端の近傍（
第二の矢印で示す）にスプライス受容部位が存在するこ
とを示しており、ＣＴＬＬ−１６がスプライシングを受
けていないｍＲＮＡ中間体から誘導されたものであるこ
とを示唆する。クローン７Ｂ９−４およびＣＴＬＬ−１
８はそれぞれアミノ酸２３から１９９までと−２５から
１９９までをコードする。アミ酸１９９の後に、１１４
塩基対挿入物（両方のクローンとも同じ、第１図に白の
ボックスで示す）が６個の新たなアミノ酸を導入し、こ
の挿入物の次に終結コドンが来る。この形態のレセプタ
ーは可溶性である。

第３図は実施例８に詳述される哺乳動物高度発現プラス
ミド、ＣＡＶ／ＮＯＴの模式図である。

第４Ａ−Ｃ図は、Ｔ細胞系列Ｔ２２から誘導されたＣＤ
ＮＡライブラリーより得られた、クローンＴ２２−８か
らのヒトＩＬ−４レセプターｃ　Ｄ　Ａ’　Ａのコード
配列を示す。成熟タンパク質の推定Ｎ末端メチオニンお
よびトランスメンプラン領域には下線が引いである。

第５Ａ−Ｂ図はヒト（上段）とネズミ（下段）のＩＬ−
４レセプターｃ　Ｄ　Ａ’　Ａクローンの推定アミノ酸
配列の比較を示す。

（発明の構成ン 定義 本明細書において用いる”ＩＬ−４レセプター”および
’ＩＬ−４Ｒ”なる用語は、第２図と第４図に示した天
然哺乳動物インターロイキン４レセプターのアミノ酸配
列と実質的に類似したアミノ酸配列を有し、且つそれら
がインターロイキン４（ＩＬ−４）分子と結合すること
ができる、またはＩＬ−４分子の結合によって開始され
る生物学的信号を細胞へ伝達することができる、あるい
は天然（すなわち弁組換え）源由来のＩＬ−４Ｈに対し
て誘導された抗ＩＬ−４Ｂ抗体と交差反応することがで
きるという点で生物学的に活性であるタンパク質を意味
する。天然ネズミＩＬ−４レセプター分子はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで測定して約１４Ｃキロダルトン（ｋＤａ）の見
掛は分子量をもつと考えられる。”ＩＬ−４レセプター
”または″ＩＬ−４Ｒ”なる用語には、限定するもので
はないが、ＩＬ−４Ｒと共通した生物学的活性の一部を
少なくとも示す２０個以上のアミノ酸を有する天然タン
パク質の類縁体またはサブユニットが含まれる。

明細書全体を通して用いられる”成熟”なる用語は、天
然遺伝子の全長転写物として存在しうるような、リーダ
ー配列を欠（形で発現されたタンパク質を意味する。種
々の生物学的に均等なタンパク質およびアミノ酸類縁体
は以下で詳細に説明する。

アミノ酸または核酸を定義する際に用いられる１実質的
に類似した”なる表現は、対象となる特定配列（例えば
突然変異配列）が１以上の置換、欠失または付加によっ
て基準配列と異なるが、その最終結果としてＩＬ−４Ｒ
タンパク質の生物学的活性を保有していることを意味す
る。また、核酸サブユニットおよび類縁体は＝（α）Ｄ
ＮＡ配列が天然哺乳動物ＩＬ−４Ｒ遺伝子のコード領域
から誘導される；　（ｂ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列が適度なス
トリンジェント条件下で（、＄１のＤＮＡ配列とハイブ
リダイズすることができ且つ生物学的に活性なＩＬ−４
Ｈ分子をコードする；または（ｏ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列が
遺伝暗号の結果として（α）または（＆）で定義したＤ
ＮＡ配列に対し縮重の関係にあり且つ生物学的に活性な
ＩＬ−４Ｈ分子をコードする場合、本明細書中で開示し
た特定のＤＮＡ配列に”実質的に類似している。′実質
的に類似した類縁タンパク質は天然ＩＬ−４Ｒの対応す
る配列に約３０％以上類似しているだろう。類似性の度
合がより低いが匹敵する生物学的活性を有する配列は均
等物であると見なされる。より好ましくは、類縁タンパ
ク質は天然ＩＬ−４Ｈの対応する配列に約８０％以上類
似しており、この場合それらは“実質的に同一”である
と定義される。核酸配列を定義する際に、実質的に類似
したアミノ酸配列をコードしうる対象の核酸配列はすべ
て、基準の核酸配列に実質的に類似していると見なされ
る。類似性のパーセントは、例えばｔｈｅ　Ｕ％１ｖｅ
ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　１Ｆｔａｃｏｎａｉｓ　Ｇｅｎａｔ
ｉ　−ｓｓ　Ｃｏｔｙ＊ｐ＊ｔａｒ　Ｇｒｏｓｐ　（Ｕ
ＷＧＣＧ）から入手し５るＧＡｐコンピュータプログラ
ム６．０版を用いて、配列情報を比較することにより測
定できる。ＧＡＰプログラムはＮａｇｄｌｅｍａ％およ
びｗｔ％ａａｈの整列法（／、　Ｍｏ１．　Ｂｉａｓ、
　４８　：　４４３．１９７０）をＦｍ１ｔｈおよびＷ
ａｔｅｒｔｙｈａｓが改変した方法（Ａｄｖ、Ａ”ｌｌ
ｐｌ−Ｍａｔｈ、　２　：　４８２．１９８１）を利用
している。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは２つの
配列の短い方の配列中の記号（すなわち、ヌクレオチド
またはアミノ酸）の総数で類似した整列記号の数を割っ
た値として類似性を規定している。ＧＡＰプログラムの
ための予め設定された好適なパラメーターには次のもの
が含まれる二（１）ヌクレオチドに対して単一の比較マ
トリックス（同一性に対して１の値および非同−性につ
いてＯの値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚ　ａｎｄ
　Ｄａｙん６ｆｆ、’ａｄ、、　Ａｔ１ａｓげ　Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ　　５ａｑｓａｓｏｅ　　ａｎｄ　　５ｔｒｓ
ｏｔｓｒａ。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｔａａｌ　Ｒａａａｅ
ｂｒａルＦｏｖｓｄａｔｉｏｓ。

ｐｐ、３５３−３５８．１９７９に開示されるような、
　Ｇｒｉｂｓｋｏｖ　　ａｎｄ　　Ｂｓｒｇａｓｓｐ−
Ｎｓｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒａｓ。

１４：６７４５，１９８６に記載の荷重された比較マト
リックス；（２）各ギャップに対して３．０のペナルテ
ィ−および各ギャップ中の各記号に対して０．ｌＯの追
加のペナルティ−；および（３）末端ギャップに対して
ペナルティ−なし。

本明細書中で用いる１組換え”なる用語は、タンパク質
が組換え（例えば、微生物または哺乳動物）発現系から
誘導されることを意味する。　マイクロバイアル（ｍ１
ｃｒｏｂｉａＬ）″は細菌または真菌（例、酵母）発現
系において生産された組換えタンパク質を意味する。生
産物としての９組換えマイクロバイアル”は本質的に天
然の内因性物質を含まない、微生物発現系により生産さ
れたタンパク質な意味する。大部分の＃Ｉ菌培養物（例
、Ｅ。

ｃｏｌｉ）Ｋより発現されたタンパク質はグリカンを含
まないであろう。酵母により発現されたタンパク質は、
哺乳動物細胞により発現されたものと異なるグリコジル
化パターンを示すかもしれない。

ＩＬ−４レセプターの特性として明細書全体を通して用
いられる“生物学的に活性”なる表現は、特定の分子が
十分なアミノ醗配列の類似性をここに開示した本発明の
具体例と共有し、その結果として検出可能な量のＩＬ−
４と結合することができ、ＩＬ−４刺激を（例えば、ハ
イブリッドレセプター構築物の一成分として）細胞へ伝
達することができ、または天然（すなわち、弁組換え）
源由来のＩＬ−４ＲＫ対して誘導された抗ＩＬ−４Ｒ抗
体と交差反応することができることを意味する。好まし
くは、本発明の範囲内の生物学的に活性なＩＬ−４レセ
プターはＩｎｔｎｏｌ−のレセプターあたり０．１ｓｓ
ｏＩｇ以上のＩＬ−４と結合することができ、最も好ま
しくは、標準結合検定（下記参照）において１％ｓｎｇ
ｅのレセプターあたり０．５ｎｍｏＥｍ以上のＩＬ−４
と結合し得る〇 ”ＤＮ、４配列”　とは、実質的に純粋な形で（すなわ
ち、内因性の夾雑物質を含まない）且つ標準生化学的方
法（例えば、クローニングベクターを使用）によるその
配列およびその成分ヌクレオチド配列の同定、操作およ
び回収を可能にする量または濃度で少なくとも１回単離
されたＤＮＡから誘導された、別個の断片の形をしたも
しくはより大きいＤＮＡ構築物の一成分としての、ＤＮ
Ａ分子を意味する。この種の配列は好ましくは内部非翻
訳配列（すなわちイントロン；通常真核生物遺伝子中に
存在する）が介在しないオーブン・＋７−ゾイング・フ
レームの形で提供される。関連配列を含むゲノムＤＮＡ
も使用し得るだろう。非翻訳ＤＮＡの配列は、それがコ
ード領域の操作または発現を妨害しない場合、オープン
・リーディング・フレームから５′側にまたは３′側に
存在してもよい。

“ヌクレオチド配列”とはデオキ７リボヌクレオチドの
ヘテロポリマーを意味する。本発明によって提供される
タンパク質なコードするＤＮＡ配列はｃＤＮＡ断片と短
いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリ
ゴヌクレオチドから組み立てられ、これにより組換え転
写単位において発現され得る合成遺伝子が得られる。

１組換え発現ベクター”とはＩＬ−４ＲをコードするＤ
ＮＡを増幅または発現させるために用いられる複製可能
なりＮＡ構築物を意味し、これは（１）遺伝子発現の調
節的役割を有する遺伝要素（例。

プロモーターまたはエンハンサ−）；（２）　　惰ＲＮ
Ａに転写され且つタンパク質に翻訳される構造配列また
はコード配列；および（３）　　適当な転写および翻訳
開始配列と終結配列；の組合せから成る転写単位を含む
。酵母発現系での使用を目的とした構造要素は、宿主細
胞による翻訳タンパク質の細胞外分泌を可能にするリー
ダー配列を含むのが好ましい。これとは別に、組換えタ
ンパク質がリーダー配列または輸送配列の不在下で発現
される場合、それはＮ床端メチオニン残基を含むことが
できる。

この残基はその後最終生産物を与えるべく、発現された
組換えタンパク質から随意（て切断され得る。

“組換え微生物発現系”とは、組換え転写単位を染色体
ＤＮＡに安定して組み込んだ、または組換え転写単位を
内在プラスミドの一成分として保有する適当な宿主微生
物（例えば、Ｅ、ｔｏｌｉのような細菌またはｓ、　ａ
ｍデｇｖｔｓｉａ−のような酵母）の実質的に均質な単
一培養物を意味する。一般に、この系を構成する細胞は
１個の原始形質転換細胞の子孫である。ここで定義した
組換え発現系は、発現しようとするＤＮＡ配列または合
成遺伝子に連結された調節要素の誘発により異種タンパ
ク質を発現するであろう。

本発明は、実質的に内因性の夾雑物質を含まず且つ、場
合によっては、天然パターンのグリコジル化を伴わない
、実質的に均一な組換え哺乳動物ＩＬ−４Ｒポリペプチ
ドを提供する。天然ネズミおよびヒトＩＬ−４レセプタ
ー分子は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して約１３０〜１４
５キロダルトン（＋ｌα）の見掛は分子量を有する糖タ
ンパク質として細胞溶解液から回収される。本発明の哺
乳動物ＩＬ−４Ｒには、例えば、霊長目の動物、ヒト、
ネズミ、イヌ、ネコ　ウシ、ヒツジ、ウマおよびブタの
ＩＬ−４Ｒが含まれる。本発明の範囲内のＩＬ−４Ｒ誘
導体には、生物学的活性を保有、する−次タンパク質の
徨々の構造形体が含まれる。

イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基の存在ゆ
えに、例えばＩＬ−４Ｒタンパク質は酸性塩もしくは塩
基性塩の形体、または中性形体であり得る。個々のアミ
ノ酸残基は酸化または還元によって修飾することもでき
る。

一次アミノ酸構造は他の化学成分（例えば、グリコジル
基、脂質、ホスフェート、アセチル基など）との共有結
合または凝集複合体を形成することにより、あるいはア
ミノ酸配列の突然変異体を形成することにより改変しう
る。共有結合誘導体は特定の官能基をＩＬ−４Ｒアミノ
酸側鎖へ、またはＮもしくはＣ末端へ結合させることに
より製造し５る。本発明の範囲内の他のＩＬ−４Ｒ誘導
体には、Ｎ末端またはＣ末端融合体として組換え培養物
により合成されるような、ＩＬ−４Ｒまたはその断片と
他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合もしく
は凝集複合体が含まれる。例えば、結合されるペプチド
はタンパク質のＮ末端領域におけるシグナル（またはリ
ーダ＝）ポリペプチド配列であり得、この配列は翻訳と
同時に、または翻訳後に、タンパク質をその合成場所か
ら細胞膜または細胞壁の内側もしくは外側のその機能場
所へ移動させる（例、酵母のα因子リーダー）。

ＩＬ−４Ｒタンパク質の融合体はＩＬ−４Ｒの精製また
は同定を容易にするために付加されるペプチド（例、ポ
リ−Ｈｔ　ｓ　）を含みうる。ＩＬ−４Ｒのアミノ酸配
列は次のペプチド：　Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｅ−Ａｓ　
ｐ−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙ　ｓ　（ＤＹ
ＫＤＤＤＤＫ　）に結合させることもできるＣＨｏｐｐ
　ａｔ　ａｌ、ａ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６
　：　ｌ　２０４．１９８８）、　　後者の配列は高度
な抗原性を有し、特異的なモノクローナル抗体が可逆結
合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク
質の速やかな検定および容易な精製を可能にする。この
配列はまたウシ粘膜エンテロキナーゼによってＡｓｐ−
Ｌｙｅ対のすぐ後の残基において特異的に開裂される。

このペプチドでキャップされた融合タンパク質はまたＥ
。

ｃｏｌｔによる細胞内分解に対して抵抗を示す。

ＩＩ、−４Ｒ誘導体は免疫原、レセプターに基づいたイ
ムノアッセイ用の試薬、またはＩＬ−４や他の結合性リ
ガンドのアフィニティー精製法のための結合剤としても
使用できる。ＩＬ−４Ｒ誘導体はまた、システィン残基
およびリシン残基において、Ｍ−マレイミドベンゾイル
スクシンイミドエステルやＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドのような試薬を架橋することによっても得られる。Ｉ
Ｌ−４Ｒタンパク質はまた、反応性の側基を介して、各
種の不溶性支持体（例えば、臭化シアン活性化、ビスオ
キシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化また
はトシル活性化アガロース構造体）へ共有結合され、あ
るいはポリオレフィン表面へ（グルタルアルデヒド架橋
の存在下または不在下で）吸着される。ひとたび支持体
へ結合されると、ＩＬ−４Ｒは（検定または精製のため
に）抗ＩＬ−４Ｒ抗体またはＩＬ−４と選択的に結合さ
せるべく使用される。

本発明はまた天然パターンのグリコジル化を伴うまたは
伴わないＩＬ−４Ｒを包含する。酵母または哺乳動物発
現系（例、ＣＯ５−７細胞）において発現されたＩＬ−
４Ｒは、その発現系に応じて、分子量およびグリコジル
化パターンが天然分子と類似していたり、有意に相違し
ていたりする。

Ｅ、　ｃｏＬｉのような細菌によるＩＬ−４ＲＤＮＡの
発現は非グリコジル化分子を与える。不活性化Ｎ−グリ
コジル化部位を有する哺乳動物ＩＬ−４Ｒの機能的な突
然変異類縁体は、オリゴヌクレオチドの合成および連結
により、あるいは部位特異的変異導入法により製造でき
る。これらの類縁タンパク質は酵母発現系を用いて良好
な収量で均一な還元炭水化物形体として生産される。真
核生物タンパク質のＮ−グリコジル化部位は次のアミノ
酸トリプレット：　Ａｓｎ−Ａ、−Ｚ　（ここでＡ、は
ｐｒｏ以外のアミノ酸であり、ＺはｓＭｒまたはＴｈｒ
である）によって特徴づけられる。この配列において、
アスパラギンは炭水化物が共有結合するための側鎖アミ
ン基を与える。このような部位はＡ＃％または残基Ｚを
他のアミノ酸で置換するか、ＡｓｓまたはＺを欠失させ
るか、またはＡ１とＺの間に非Ｚアミノ酸を挿入するか
、あるいはＡ８？＆とＡ、の間に３８％以外のアミノ酸
を挿入することにより取り除（ことができる。

ＩＬ−４Ｒ誘導体はＩＬ−４Ｒまたはそのサブユニット
の突然変異によっても得られる。ここで述べるＩＬ−４
Ｒ突然変異体はＩＬ−４Ｒと相同であるが、欠失、挿入
または置換のために天然ＩＬ−４Ｒと異なるアミノ酸配
列を有するポリペプチドである。大部分の哺乳動物遺伝
子と同様に、哺乳動物ＩＬ−４レセプターは恐らく多重
エクンン遺伝子によってコードされている。転写後の異
なる鴨ＲＮＡスプライシング現象に起因すると考えられ
る別のｔｎ　ＲＡ’　Ａ　（ここに記載の−ＤＮＡと同
一性または類似性の大きい領域を共有する）は、本発明
の範囲内であるとみなされる。

ＩＬ−４Ｒタンパク質の生物学的に均等な類縁体は、例
えば残基または配列をいろいろに置換させるか、あるい
は生物学的活性に関与しない末端または内部の残基もし
くは配列を欠失させることにより構築し５る。例えば、
システィン残基は。

タンパク質の再生の際に誤った分子内ジスルフィド橋の
形成を防止するために、欠失させるか又は他のアミノ酸
と置換することができる。その他の変異導入法には、Ｋ
ＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系での発現を高
めるために、隣接する二塩基性アミノ酸残基な修飾する
ことが含まれる。

一般に、置換は保存的に行われるべきであり；すなわち
、最適な代替アミノ酸は置換しようとする残基の物理化
学的特性に類似した特性を有するものである。同様に、
欠失または挿入戦略が採用される場合、欠失または挿入
が生物学的活性に及ぼしうる影響を考慮すべきである。

ＩＬ−４Ｈのサブユニットは末端または内部の残基もし
くは配列を欠失させることにより構築される。特に好適
なサブユニットには、ＩＬ−４Ｈのトランスメンプラン
領域および細胞内ドメインが欠失されるか、あるいは培
地へのレセプターの分泌を促進する親水性残基で置換さ
れたものが含まれる。生成するタンパク質はＩＬ−４へ
の結合能を保有する可溶性ＩＬ−４Ｒ分子である。可溶
性ＩＬ−４Ｈの特定例には、第２Ａ図に示すアミノ酸残
基１−２０８、および第４Ａ図に示す残基１−２０７の
配列に対して実質的な同一性を有するポリペプチドが含
まれる。

ＩＬ−４Ｒ類縁体の発現のために構築されるヌクレオチ
ド配列中の変異は、もちろん、コード配列のリーディン
グ・フレームを保存していなければならず、好ましくは
、レセプターｍ　Ｒ＃　Ａの翻訳に悪影響を及ぼすｍ　
ＲＡ’　Ａの二次構造（例えば、ループやヘアピン構造
）をもたらすようにハイブリダイズする相補領域を形成
しないであろう。変異部位は前もって決定しうるが、変
異自体の本質を予め決定する必要はない。例えば、所定
の部位における最適特性の変異体を選択するために、標
的コドンでランダムな変異誘発を行って、目的とする活
性について発現されたＩＬ−４Ｒ変異体なスクリーニン
グすることができる。

ＩＬ−４Ｒをコードするヌクレオチド配列中のすべての
変異が最終生産物において発現されるわけではない。例
えば、ヌクレオチド置換は発現を高めるために、主とし
て転写ｒｔｈ　ＲＡ’　Ａの二次ループ構造を避けるた
めに（参考としてここに引用する欧州特許公開第７５４
４４Ａ号を参照されたい）、または所定の宿主によって
一層容易に翻訳されるコドン（例えば、　Ｅ、　ｃａｌ
イ発現用のＥ、　ｃｏｌｉ優先コドン）を与えるために
行われる。

変異は変異配列を含み且つ天然配列の断片への連結を可
能にする制限部位を両末端に有するオリゴヌクレオチド
を合成することにより、特定位置に導入することができ
る。連結後に得られる再構築配列は所望のアミノ酸挿入
、置換または欠失を有する類縁体をコードする。

また、オリゴヌクレオチドにより誘導される部位特異的
変異導入法は、必要な置換、欠失または挿入に従って改
変された特定コドンを有する改変遺伝子を得る際にも使
用できる。上記の改変を行うための代表的な方法はＷａ
ｒｄｅｒ　ａｔ　ａＬ、　（Ｇｇｎｖ４２：１３３．１
９８６　）　；　Ｂａ５ｅｒ　ａｔ　ａｌ、　（Ｇｖｎ
ａ３７：７３．１９８５　）　；　Ｃｒａｉｋ　（Ｂｉ
ｏ　Ｔｇｃｈ％ｉｑ　−５ａｓ、　Ｊａｎｍａｒｌ　１
９８５．１２　１９）；Ｓｍ１ｔｈａｔ　ａｌ、　（Ｇ
ａｓｍｔｉａ　Ｅｓｇｉｎａｅｒｉ％ｇ　：Ｐｒｉｎａ
ｉｐｌｍａｃＬｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｐｌａｎｓｍ
　Ｐｒｅｓｓ、　１９８１　）　；および米国特許第４
５１８５８４号並びに同第４７３７４６２号に開示され
ている（どれらの文献は参照によりここに引用される）
。

本発明は哺乳動物、微生物、ウィルスまたは昆虫遺伝子
由来の適当な転写または翻訳調節要素に機能しうる状態
で連結された、哺乳動物ＩＬ−４７？ｔたは生物学的に
均等な類縁体をコードする合成のもしくはｃＤＮＡから
誘導されたＤＮＡｖｌＴ片を含む組換え発現ベクターを
提供する。前記の調節要素には以下で詳述するような転
写プロモーター、転写を調節する任意のオペレーター配
列、適当なｍ　ＲＡ’　Ａリポソーム結合部位をコード
する配列、および転写と翻訳の終結を調節する配列が含
まれる。通常、複製起点により与えられる宿主内での複
製能力、および形質転換細胞の認識を容易にする選択遺
伝子もさらに組み込むことができる。ＤＮＡ領域は、そ
れらが互いに機能的に関連している場合、機能し５る状
態で連結される。例えば、シグナルペプチド（分泌リー
ダー）のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関係す
る前駆物質として発現される場合、そのポリペプチドの
ＤＮＡに機能し５る状態で連結され；プロモーターは、
それがコード配列の転写を調節する場合、コード配列に
機能し５る状態で連結され；またリポソーム結合部位は
、それが翻訳を可能にするように配置される場合、コー
ド配列に機能し５る状態で連結される。一般に、１機能
しうる状態で連結される”とは隣接していることを意味
し、分泌リーダーの場合には隣接し且つ同じリーディン
グ・フレームであることを意味する。

微生物により発現される哺乳動物ＩＬ−４レセプターを
コードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡの溝ＲＮＡへの転写を
早期に終結させうるイントロンを含まないのが好ましい
。しかしながら、例えば転写の早期終結が有利なＣ末端
切断（例えば、細胞膜に結合しない可溶性レセプターを
生成するためのトランスメンプラン領域の欠失）を有す
る変異体をもたらす場合には、それは望ましいかもしれ
ない。遺伝暗号の縮重（ｄａｇ−％ｇｒａａｙ　）ゆえ
に、同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
にはかなりの変動があり、代表的なりＮＡの例は図面に
示したヌクレオチド配列に相当するものである。他の例
には適度なストリンジェント条件（ａ０℃、２ＸＳＳＣ
）下で図面の配列とハイブリダイズし得る配列、および
上記のものとハイブリダイズするか又は縮重の関係にあ
り生物学的に活性なＩＬ−４レセプターポリペプチドを
コードする他の配列が含まれる。

形質転換宿主細胞は組換えＤＮＡ法を用いて構築された
ＩＬ−４Ｒベクターにより形質転換またはトランスフェ
クションされている細胞である。

形質転換宿主細胞は通常ＩＬ−４Ｒを発現するが、ＩＬ
−４ＲＤＮＡをクローン化または増幅する目的で形質転
換された宿主細胞はＩＬ−４Ｒを発現する必要がない。

発現されたＩＬ−４Ｒは、所定のＩＬ−４ＲＤＮＡに応
じて、細胞膜に付着するか、あるいは培養上清に分泌さ
れる。哺乳動物ＩＬ−４Ｒの発現に適する宿主細胞は、
適当なプロモーターの支配下にある原核細胞、酵母また
は高等真核細胞である。原核細胞にはダラム陰性または
ダラム陽性菌が含まれ、例えばＥ、　ｃｏｌｔまたはバ
シラス属の細菌である。高等真核細胞には後述するよう
な哺乳動物由来の樹立された細胞系列が含まれる。また
、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて
咄乳動物ＩＬ−４Ｒを生産するために、細胞を含まない
翻訳系も使用し得るであろう。細菌、真菌、酵母および
哺乳動物細胞の宿主と共に使用するのに適したクローニ
ングベクターおよび発現ベクターはＰｏｓｗｅｔａら（
Ｃｒｏｗｉｎｇ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ　　二　Ａ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ。

Ｅｌｓａｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８５　
）によって開示されており、関連したその記載内容は参
照によりここに９用される。

原核細胞発現宿主は多くのタンパク質加水分解およびジ
スルフイドプロセツンングを必要としないＩＬ−４Ｒの
発現のために使用される。原核細胞発現ベクターは一般
に１つ以上の表現製選択マーカー（例えば、抗生物質耐
性をもたらす遺伝子、または独立栄養要求物を供給する
タンパク質をコードする遺伝子）、および宿主によって
認識されて宿主内での増幅を可能にする複製起点を含む
。

形質転換用の適当な原核細胞宿主にはＥ、　ａｏｌｉ（
大腸菌）、Ｂａａｉｌｌｓａ　ａｓｂｔｉｌｉｇ（枯草
菌）、Ｓａ１等ｏｓｍｌｌａ　ｔｙｐｈｉｔｎｓｒｉｓ
ｗｈ　（ネズミテ７ス菌）・およびシュードモナス属、
ストレプトミセス属並びにブドウ球菌属に含まれるいろ
いろな菌種が含まれるが、随意に他のものも使用できる
。

細菌と共に使用するのに有用な発現ベクターは、公知の
クローニングベクターＰＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１
７）の遺伝要素を含む市販のプラスミドから誘導される
選択マーカーおよび細菌の複製起点を含むことができる
。この種の市販ベクターには例えば５．ｆＡ’２２３−
３　（スウェーデン国つプサラ、ファルマシア・ファイ
ン・ケミカルズ社）およびｐＧＥＭｌ（米国ウィスコン
シン州マディソン、７’ｏメガ・バイオチク社）が含ま
れる。これらのｐＢＲ３２２′″主鎖”部分は適当なプ
ロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わさ
れる。Ｅ、　ｃｏｌｉは一般にＥ、ａｏｌｉ種由来のプ
ラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換
される（Ｂｏｌｉｔｔａｒ　ａｔ　ａｌ、、　Ｇ−％−
２：９５．１９７７）。

、ＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐
性遺伝子を含み、こうして形質転換細胞の単純な同定手
段を提供する。

組換え微生物発現ベクター中で通常用いられるプロモー
ターには、β−ラクタマーゼ（ペニン、リナーゼ）およ
びラクトースプロモーター系（Ｃｈ　８ｎｇ　　ａｔ　
　ａｌ、、Ｎａｔｓｒｅ　　２７５　　二　６１５．１
９７８　；ＧｏｍｄｄａＬ　ａｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２８１　：５４４．１９７９）、トリプトファン
（ｔ　ｒｐ）　　プロモーター系（Ｇｏｇｄｄａｌ　ａ
ｔ　ａｌ、、　Ｎ５ａ１．　ＡｃｉｄｓＲｇａ、８二４
Ｃ５７．１９８０；欧州特許公開第３６フ７６ （Ｍａｓｉａｔｔａａ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＣｌ０
ｎｉｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏ　−ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ，　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｅａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂ　−ｏｒａｔｏｒｙｅ　ｐ．　４　１　２、１９８２
）が含まれる。特に有用な細菌発現系はファージλＰＬ
　プロモーターおよびａｊ８５７ｔａ非耐熱性リプレッ
サーを使用する。λＰＬプロモーターの誘導体を組み込
んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから入手し得るプラスミドベクターにはＥ。

ｃ　ｏ　ｌ　ｉ　Ｊ　Ｍ　Ｂ　９株中に保有されるプラ
スミド、ＨＵＢ２　ＣＡＴＣＣ３７０９２）およびＥ、
ｃｏｌｉＲＲ１中に保有されるｐＰＬａ２Ｂ（ＡＴＣＣ
５３０８２）がある。

組換えＩＬ−４Ｒタンパク質は酵母宿主、好ましくはＳ
、　ｃｍτ＃τ１８１σのようなサツカロミセス属から
のもの、においても発現される。他の属の酵母、例えば
ピチア（Ｐｉａｈｉａ　）またはクルイベロミセス（Ｋ
ｌｕｙｖａｒｏ倶ｙｃａａ　）も使用できる。酵母ベク
ターは一般に２μ酵母プラスミドからの複製起点、自律
複製配列（ＡＲ５）、プロモーター、ＩＬ−４Ｒをコー
ドするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための
配列、並びに選択遺伝子を含むであろう。好ましくは、
酵母ベクターは酵母とＥ、　ｃｏｌｉの両方の形質転換
を可能にする複製起点および選択マーカー（例えば、Ｅ
、　ａｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子およびトリプト
ファン中での生育能力を欠（酵母変異株に選択マーカー
を提供するＳ、　ａａｒｇｖｉａｉａｍ　ｔｒｐＬ遺伝
子）、並びに下流の構造配列の転写を誘導する冒度発現
酵母遺伝子からのプロモーターを含むであろう。その後
、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐＬ障害の存在は、トリ
プトファンの不在下での生育により形質転換を検出する
ための効果的な環境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列には、メタロ
チオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼＣＨｉｔ
ｚｅｔｎａｎ　ａｔ　ａｌ、ｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ
ｈａｒｎ、　２５５：２０７３．１９８０）または他の
解糖系の酵素（Ｅａｓｅ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｄ
ｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｇｇ、　７　：　１４９．１９６
８；およびＨｏ１ｌａｎｄ　ａｔ　ａｊ、、　Ｂｉｏｃ
ｈａｔｎ。

１７：４９００、Ｌ９７８）、例えばエノラーゼ、グリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソ
キナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ、グルコース−６−リン酸インメラーゼ、
３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ
、トリオースリン酸インメラーゼ、ホスホグルコースイ
ソラーゼ、およびグルコキナーゼのプロモーター類が含
まれる。酵母発現に用いられる適当なベクターおよびプ
ロモーターはＨｉｔｚｅｍａｎの欧州特許公開第７３６
５７号にさらに詳しく記載されている。

好適な酵母ベクターはＥ、ａｏｌｉ内での複製および選
択のための、ＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（複製起点お
よびＡｍｐ’遺伝子）、並びにグルコース抑制ＡＤＨ２
プロモータ　およびα因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮ
Ａ配列を用いて構築することができる。ＡＤＨ２プロモ
ーターはＲｔｂａａｍｌＬら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ
、　２５８　：２６７４．１９８２）およびＢｇｉｇｒ
ら（Ｎａｔ％ｒｅ　３００　：　７２４．１９８２）に
よって報じられた。異種タンパク質の分泌を支配する酵
母α因子リーダーは、プロモーターと発現されるべき構
造遺伝子の間に挿入することができる。例えば、Ｋｓｒ
ｊｔｓｎ　ｓｔ　ｔｓＬ、、ＣＡＬＬ　３０　：９３３
．１９８２；およびＢｉｔｔｅｒ　ａｔ　ａｌ　、、　
Ｐｒｏｅ。

ＮａｔＬ、Ａａａｄ、　Ｓａｔ、　ＵＳＡ　８１　：　
５３３０．　ｉ　９８４を参照されたい。リーダー配列
は外来遺伝子とリーダー配列との融合を容易にするため
に、１つ以上の有用な制限部位をその３′末端に含むよ
５修飾してもよい。

適当な酵母形質転換プロトコールは当分針で知られてお
り、代表的な技法はＨｉｎｎａｎ　ａｔα１．。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、ＵＳＡ　
　７５　：　１９２９　＋１９７８に記載され、０．６
７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ散、２％グルコー
ス、１０μｙ／ｌＪアデニンおよび２０μｙ／ｌｌウラ
シルから成る選択培地中でＴｒｐ　　形質転換細胞を選
択することから成る。

ＡＤＢ２プロモーターを含むベクターで形質転換された
宿主菌株は、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１
％グルコースを含み、さらに８゜μｙ／ＭＪアデニンお
よび８０μｙ／Ｍウラシルを補給した栄養培地中で発現
のために増殖させる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除
は培地ゲルコールの欠乏により起こる。粗製酵母上溝は
一過により回収され、精製に先立って４℃で保持される
。

種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系は組換えタンパク
質の発現に利用することができる。昆虫細胞により異種
タンパク質を生産するためのバキュ１＝ｘウィルス系は
Ｌｓｃｋｏｗ　ａｎｄ　Ｓｓｔｙｖｍａｒｓ、Ｂｔｏｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　６　：　４７　（１９８８）
に論評されている。適当な哺乳動物宿主細胞系列の例は
Ｇ！ｓｇｍｚｓ（ＣｇｆＪ　　２３：１７５，１９８１
）に記載のサル腎細胞のＣＯ５−７系列、および適当な
ベクターを発現しうる他の細胞系列、例えばＬ細胞、Ｃ
１２７，３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＤ□
）、ＥａＬａおよびＢＥＫ　細胞系列などである。哺乳
動物発現ベクターは複製起点、発現されるべき遺伝子に
連結された適当なプロモーターおよびエンハンサ−１他
の５′または３′フランキングＣｆｌαｎｋｉｎｇ　）
非転写配列のような非転写要素、並びに必要なリポソー
ム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与およ
び受容部位、転写終結配列のような５′または３′非翻
訳配列を含むことができる。

を椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター中の
転写および翻訳調節配列はウィルス源によって供給され
る。例えば、一般的に用いられるプロモーターおよびエ
ンハンサ−はポリオーマ、アゾンウィルス２、シミアン
ウィルス４Ｃ（ＳＶ４Ｃ）、およびヒトサイトメガウィ
ルスから誘導される。ＳＶ４Ｃウィルスゲノム由来のＤ
ＮＡ配列、例えばＳＶ４Ｃ複製起点、初期および後期プ
ロモーター、エンハンサ−、スプライス、おヨヒポリア
デニル化部位は異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされる他
の遺伝要素を提供すべ（用いられる。

初期および後期プロモーターは、これらが５Ｖ４Ｑウィ
ルス複製起複製本含む断片としてウィルスから容易に得
られるので、特に有用である（Ｆｉｅｒ８ａｔａ１．ｍ
Ｎａｔｓｂｒｅ　２７３：１１３ｙ１９７８）。ｌ１ｉ
ｎｄ■部位からウィルス複製起点に存在するＢｃｔｌ　
Ｉ部位の方へ延びる約２５０　ｂｐ配列が含まれるとい
う条件で、より小さいまたはより大きい５Ｖ４Ｑ断片も
使用できる。さらに、哺乳動物ゲノムＩＬ−４Ｒプロモ
ーター、調節および／またはシグナル配列も、これらの
調節配列が所定の宿主細胞と適合し５るという条件で、
利用できる。組換え哺乳動物ＩＬ−４レセプターを生産
するための哺乳動物高度発現ベクターの使用に関しては
、以下の実施例８においてさらに詳しく説明する。代表
的なベクターは岡山−Ｂｇｒｇ法（ＪｌｏＪ　、　Ｃａ
１ｌ　、　Ｂｔｏｌ　。

３：２８０．１９８３）により構築することができる。

Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞による哺乳動物レセプター
ａ　Ｄ　Ａ’　Ａの有用な安定した高レベル発現系は、
実質的にｃｏａｒｇａｎらの方法（Ｎｏ　ｌ　、　Ｉｎ
ｍ５−５ｏｊ、２３：９３５．１９８６）により構築す
ることができる。

ＩＬ−４ＲＤＮＡ発現用の特に好適な真核細胞ベクター
は実施例２において以下で説明する。

、ＣＡＶ／ＮＯＴ　　と呼ばれるこのベクターは哺乳動
物高度発現ベクター、ＤＣ２０１から誘導され、ＳＶ４
Ｃ、アゾンウィルス−２およびヒトサイトメガロウィル
ス由来の調節配列を含む。ヒトＩＬ−７レセプターを含
む、ＣＡＶ／ＮＯＴはアメリカン°タイプカルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託番号６８０１４として
寄託されている。

精製された哺乳動物ＩＬ−４レセプターまたは類縁体は
、適当な宿主／ベクター系を培養して本発明ＤＮＡの組
換え翻訳産物を発現させ、その後培地または細胞抽出物
から精製することにより得られる。

例えば、組換えタンパク質を培地へ分泌する系からの上
清は、初めに市販のタンパク質濃縮濾過器（例えば、Ａ
ｍ１６６ｇ＠またはＭｉｌＬｉｐｏｒｍ　Ｐａ目−４ｃ
ｏｎ限外濾過装置）を用（・て濃縮する。濃縮工程後、
濃縮物は適当な精製マ）　ＩＪラックスかける。

例えば、適当なアフィニティーマトリックスは適当な支
持体に結合されたＩＬ−４、レクチンまたは抗体分子で
ありうる。別法として、アニオン交換樹脂、例えばペン
ダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマ
トリックスまたは支持体、を使用することができる。マ
トリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラ
ン、セルロースまたはタンパク質精製において一般的に
用いられる他のタイプであり得る。また、カチオン交換
工程を使用してもよい。適当なカチオン交換体にはスル
ホプロピルまたはカルボキシメチル基な含む種々の不溶
性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好適で
ある。

最後Ｋ、疎水性ＢＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダン
トメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用
いる逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）工程を１回以上行って、ＩＬ−４Ｒ組成物をさらに
精製する。上記精製工程のいくつかまたは全部を゛いろ
いろな組み合わせで用いて、均質な組換えタンパク質を
得ることができる。

細菌培養物により生産された組換えタンパク質は通常、
初めに細胞ペレットから抽出し、次に１回以上の濃縮、
塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフ
ィー工程を行うことにより単離される。最後に、高性能
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が最終精製工程と
して使用される。

組換え哺乳動物ＩＬ−４Ｈの発現に用いた微生物細胞は
、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、また
は細胞溶解剤の使用を含めた有利な方法のいずれかを用
いて破壊することができる。

哺乳動物ＩＬ−４Ｒを分泌タンパク質として発現する酵
母による発酵は精製を非常に簡単にする。

大規模発酵により得られる分泌組換えタンパク質はＵｒ
ｄａＬらの方法（／、（’ルｒｏｍａｔｏｇ、　２９６
　：１７１．１９８４）に類似した方法により精製する
ことができる。この文献は、分離用ＨＰＬＣカラムによ
る組換えヒトＩＬ−２の精製のために、２回の連続逆相
ＨＰＬＣ工程を開示している。

組換え培養物により合成されたヒトＩＬ−４Ｒは、ヒト
ＩＬ−４Ｒを培養物から回収する際に用いた精製工程に
左右される量および性質の非ヒト細胞成分（タンパク質
を含む）の存在により特徴づけられる。これらの成分は
通常酵母、原核生物またはヒト以外の高等真核生物に由
来するものであり、好ましくは約１重量％未満程度の無
毒の汚染量で存在するであろう。さらに、組換え細胞の
培養は、本来その起源種（例えば細胞、細胞滲出液また
は体液）中に存在するよ５なＩＬ−４Ｒと通常関連があ
るタンパク質を含まないＩＬ−４Ｒの生産を可能にする
。

ＩＬ−４Ｒ組成物は、所望純度のＩＬ−４Ｒを生理学的
に許容しうる担体と混合することにより、投与用に製剤
化される。このような担体は投与量および使用濃度で受
容者に無毒性であるだろ５゜一般に、この種の組成物の
製剤化はＩＬ−４Ｒを緩衝剤、酸化防止剤（例、アスコ
ルビン酸）、低分子量（約１００残基以下）ポリペプチ
ド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例、グルコース
、スクロースまたはデキストラン）、キレート化剤（例
、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、並びに他の安定剤および
賦形剤と組み合わせることを伴５゜ＩＬ−４Ｒ組成物は
Ｂ細胞の機能を調節するために使用しうる。例えば、可
溶性ＩＬ−４Ｒ（ｓｌＬ−４Ｒと略記する）は抗Ｉ、の
存在下でＩＬ−４により誘導されるＢ細胞培養物の増殖
を阻止する。また、ａｌＬ−４Ｒはアイソタイプ特異的
ＥＬＩＳＡで測定したときＬＰＳ活性化Ｂ細胞によるＩ
Ｌ−４誘導ＩｇＧ１分泌を抑制し、且っＥＰＩＣ５分析
で測定したときネズミＢ細胞によるＩＬ−４誘導Ｉα発
現を抑制する。ａｌＬ−４ＲはまたＩＬ−４誘導１．Ｅ
合成を抑制し、従ってアレルギー性鼻炎（通常の枯草熱
）、気管支ぜん息、アトピー性皮膚炎、および胃腸食物
アレルギーのようなＩｇＥ誘導即時型過敏反応を治療す
るために使用される。

ＩＬ−４ＲはまたＴ細胞を調節するためにも使用できる
。例えば、ＩＬ−４ＲはＴ細胞系列（例えばＣＴＬＬ　
Ｔ細胞系列）の！Ｌ−４誘導増殖を阻止する。ａｌＬ−
４Ｒはまた内因的に生産されたＩＬ−４により仲介され
る機能活性を抑制する。

例えば、５ｌＬ−４ＲがＩＬ−’ｌに対するモノクロー
ナル抗体（例、５４Ｂ６）と共に付随的に培養物中に存
在する場合、５ｌＬ−４Ｒは二次混合白血球培養でのア
ロ反応性細胞溶解１９７８球（ＣＴＬ）の生成を抑制す
る。ＩＬ−２とＩＬ−４の両方の中和剤は内因性ＩＬ−
２およびＩＬ−４（両方ともＣＴＬの生成を調節し、こ
のような培養物により生産される）を抑制するために用
いられる。

治療用途において、治療上有効な量のＩＬ−４レセプタ
ー組成物は、製剤学的に許容し７うる担体または希釈剤
と共に哺乳動物（好ましくはヒト）に投与される。

以下の実施例は例示するためのものであって、制限する
ためのものではない。

（実施例） Ａ、ＩＬ−４の放射性標識対は二組換えネズミおよびヒ
トＩＬ−４は酵母により発現させ、それぞれＰａｒｋ、
　ａｔ　ａｌ　、　、　Ｆｒｏｇ、　Ｎａｔｌ　、　Ａ
ａａｄ、　Ｓｅｔ。

ＵＳＡ８４：５２６７（１９８７）およびＰａｒｋ　ａ
ｔａｌ　、　、　　Ｊ、　　Ｅｚｐ、　Ｍａｄ、　　１
　６６　　二　４７６（１９８７）　　に記載の方法に
より均質になるまで精製した。この精製タンパク質を市
販の酵素ビーズ（ｇｎｔｙｍｏ−ｂａａｄ）放射性ヨウ
素化試薬（バイオランド社製）により放射性標識した。

この方法では、０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，２
）　５０　Ａｌｌ中のｒｌＬ−４２，５μｔを、０．０
５％ｆリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）２０μ！中の酵
素ビーズ試薬５０μｊ（２Ｍｃｉのヨウ化ナトリウム）
および２．５％ｂ−Ｄ−グルコース１０μｌと組み合わ
せた。１０分後２５℃で、アジ化ナトリウム（ａ０ｍ＆
を１０μｌりおよびメタ重亜硫酸ナトリウム（ａ〜／−
を１０μｌ）を加え、インキュベーションを２５°Ｃで
５分間続けた。この反応混合物は２．５％（ｗ／ｌ）ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％（、／ν）アジ
化ナトリウムおよび２０ｍＭヘペス（ｐＨ７，４）を含
有するロスウェル・パーク・メモリアル・インステイテ
ユート（ＲＰＭＩ）　１６４Ｃ媒体（結合媒体）中で平
衡化した２ｄ床容量のＳｍｐｈａｄｍｚ＠　Ｇ　−２５
（シグマ社製）でゲル濾過することにより分画化した。

”５ｌ−ＩＬ−４の最終プールは結合媒体中２　Ｘ　１
０ｍ’　Ｈの使用原液へ希釈し、レセプター結合活性の
検出しうる低下なしに４℃で最高１ケ月間貯蔵した。比
活性は一般に１〜２　Ｘ　ｉ　０１６ｃｐｓ／ｆｎｍｏ
ｔｅ　　Ｉ　Ｌ　−４の範囲である。

Ｂ６　　付Ｎ細胞への結合：悪濁培％により増殖させた
細胞（すなわち、ＣＴＬＬおよびＣＴＬＬ−１９，４）
を用いて行った結合検定は、本質的にＰａｒｋ　　ａｔ
　　ａｌ、、Ｊ、Ｂｔｏｌ、Ｃｈｇｍ、２６１　　：４
１７７゜１９８６およびＰａｒｋ　ａｔ　ａｌ、、　５
ｓｐｒａに記載されるような７タレ一ト油分離法（Ｄｏ
ｗ−デーｔ　ａｌ−。

Ｊ、Ｉ鴫ｓｍｏｇ、１３２ニア５１，１９８４）　によ
り行った。また、結合検定はＩＬ−４レセプター分子を
コードする。ＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクターにより
トランスフェクションしたＣＯ５細胞に対しても行った
。付着細胞への結合のスカツチャード分析のために、Ｃ
ＯＳ細胞はＬｕｔｈｔｙｔａｎ　ａｔａＬ　、　、　Ｎ
５ａｌ　、　Ａｅｉｄａ。Ｒａｍ、　１　ｉ　：１２９
５．１９８３およびＭｃＣｓｔａｈａｔｓ　ｍｔ　ａｌ
、、　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｅｅｒ７ｓｓｔ、４１’：
３５Ｉ、１９６８に記載の方法によりプラスミドＤＮＡ
でトランスフェクションした。

トランスフェクションの８時間後、細胞をトリプシン処
理し、セして６ウエルプレート（マサチューセッツ州ケ
ンブリッジ、コスタ−社製）に１×１０５Ｃ０５−ＩＬ
−４レセプタートランスフエクト細胞（キャリアーとし
ての５×１０１１ＣＯ５対照トランスフエクト細胞と十
分に混合したもの）をまいた。２日後、単層は本質的に
Ｐａｒｋ　ａｔａＬ、。

Ｊ、Ｅｚｐ、！ｋｂｄ、　１６６　：４７６．１９８７
に記載される方法により４℃で”Ｉ−ＩＬ−４結合につ
いて検定した。”Ｉ−ＩＬ−４の非特異的結合は２００
倍以上の過剰モル量の未標識ＩＬ−４の存在下で測定し
た。３７℃でＩｔｓＩ−ＩＬ−４が細胞内に取り込まれ
る（インターナリゼーション）のを防ぐために、すべて
の結合検定においてアジ化す）　ＩＪウム（０，２％）
を使用した。

可溶性ＩＬ−４Ｈによる結合の阻害を分析するために、
組換えＩＬ−４Ｒ構築物でトランスフェクションしたＣ
Ｏ５細胞からの上清をトランスフェクションの３日後に
回収した。連続２倍希釈のならし培地（ｃｏｎｄｔｔｉ
ｏ％ｅｄ　ｍｕｔｉｓｍ）は３　Ｘ　１　（ｉ”ＭＩ２
ｓＩ−ＩＬ−４（比活性約Ｉ　Ｘ　１０　”　ａ　ｐｅ
ｎ／１ｎｓｏｊを有する）と共に３７℃で１時間ブレイ
ンキュベートし、その後２Ｘ　Ｉ　０ＯＣＴＬＬ細胞を
加えた。３７℃で３０分インキュベーション後、遊離ネ
ズミ１ｘｓＩ−ＪＬ−４と細胞に結合したネズミ１”Ｉ
−ＩＬ−４とを分離した。

Ｃ９固相結合検定二ニトロセルロースに安定して吸着さ
れるＩＬ−４レセプター（ＩＬ−４結合活性をまだ保有
するＣＴＬＬＬ９．４細胞の界面活性剤抽出物に由来す
るもの）の能力は精製のモニター手段をもたらした。１
ｍｌアリコートの細胞抽出物（実施例３参照）、ＩＬ−
４アフイニテイ一カラム画分（実施例４参照）または他
のサンプルを１ＪｋＢＡ８５／２１ニトロセルロース膜
にューハンプシャー州キーン、シュライチャー浸シュエ
ル社製）上に置き、乾かした。この膜は非特異的結合部
位をブロックするために、３％（、／ν）ＢＳＡを含む
トリス（０，０５Ｍ）緩衝食塩水（０，１５Ｍ　）　（
ｐＨ７，５）を加えた組織培養皿において３０分間イン
キュベートした。その後、膜は２００倍過剰モルの未標
識ＩＬ−４の存在下またハネ右下ニ、ＰＢＳ＋３％ＢＳ
Ａ中の４　ｘ　ｌ　Ｑ−”Ｍ”Ｉ−ＩＬ−４を加えて、
振と５しながら４℃で２時間インキュベートした。最後
に、この膜をＰＢＳで３回洗い、乾かしてコダックＸ−
ＯＸ−０ｔｎａｔＴフィルム上に一７０℃で１８時間装
いた。

実施例２６ 高いＩＬ−４レセプター発現を得るための好適な細胞系
列はＣＴＬＬ、すなわちネズミＩＬ−２依存性細胞溶解
Ｔ細胞系列（ＡＴＣＣＴＩＢ２１４）である。より高レ
ベルのＩＬ−４レセプター発現を得るために、ＣＴＬＬ
細胞（母細胞）は螢光活性化細胞分類を用いて選択した
。フルオセイン結合組換えネズミＩ　Ｌ　−４（ｒｒｈ
ｌＬ−４と略記する）（酵母宿主のためにデｔｎ　Ｉ　
Ｌ　−４には十分量の炭水化物が結合している）は、フ
ルオレセインヒドラジドを過ヨウ素酸塩酸化糖部分にカ
ップリングすることにより有利に用いられる。フルオレ
セイン結合ＩＬ−４は、高グリコジル化デｍＩＬ−４（
０，１Ｍクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（ｐＨ５，５）３
００μｌ中３００μｆ）を、０．１Ｍクエン酸塩−リン
酸塩緩衝液（ｐＨ５，５）中で新たに調製した１０ｍｍ
ｍ−過ヨウ素酸ナトリウム（シグマ社製）３０μｊと混
合することにより製造され、この混合物を暗室中４℃で
３０分インキュベートした。

この反応はｏ、ｉＭグリセロ・−ル３０μｌで停止させ
、０．１Ｍクエン酸塩−リン酸塩（ｐＨ５，５）に対し
て４℃で１８時間透析した。透析後、ＤＭＳＯに溶解し
た１００ｍＭ５−（（（２−（カルボヒドラジノ）メチ
ル）チオ）アセチル）−アミノフルオレセイン（オレゴ
ン州ニージーン、モレキュラー・プローブズ社製。）品
　容量をサンプルに加え、２５℃で３０分インキュベー
トした。その後、ＩＬ−４−フルオレセインはＰＥ５（
ｐＨ７，４）に対して４℃で徹底的に透析し、アミノ駿
分析によりタンバク質濃度を測定した。最終生成物は１
％（ｗ／ｖ　）　Ｂ　Ｓ　Ａを添加して滅菌濾過しだ後
４℃で貯蔵した。

選別するために、ＣＴＬＬ細胞（ａＸ１０５）は１ｘｌ
Ｏ−’＆　ＩＬ−４−フルオレセインを含むＰＢＳ＋１
％Ｂ５Ａ１５０μ！中３７℃で無菌条件下に３０分イン
キュベートした。次に、この混合物を４℃に冷却し、多
量のＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１回洗い、ＥＰＩＣ５■Ｃフ
ローサイトメーター（クールターインスツルメント社製
）を使って分類した。最高レベルの螢光信号（最高１．
０％）を与える細胞を大量に集めて、その集団を液体培
地中で増殖させた。別法として、単一細胞クロー二ング
のために、最高１．０％の螢光信号を示す細胞は９６ウ
工ル組織培養マイクロタイタープレートＫ　１　細胞／
ウェルで分配した。

各回のＦＡＣ５選別の後に、＋ｔｓ（−ＩＬ−４を用い
る結合検定を行うことにより経過を監視した。

選別していないＣＴＬＬ細胞（ＣＴＬＬ母細胞）は一般
に１０００〜２０００ＩＬ−４レセプター／細胞を示し
た。ＣＴＬＬ細胞は１９回のＦＡＣ５選別にかけた。選
別した最終ＣＴＬＬ細胞（ＣＴＬＬ−１９＞は５Ｘ１０
５〜１ｘ１０６ＩＬ−４レセプター／細胞を示した。こ
の時点でＣＴＬＬ−１９集団はＥＰＩＣ５［Ｆ］Ｃフロ
ーサイトメーターを用いて単一細胞クロー二ングに付し
、個々のクローン集団を増殖させてＨｌｌ　ｌ　−Ｉ　
Ｌ−４結合について試験した。ＣＴＬＬ−１９，４と名
づけだ単一クローンはｉ　ｘ　１０６ＩＬ−４レセプタ
ー／細胞を示し、精製およびクローニング実験のために
選別された。計算した見掛けＮａ値は２つの系列におい
て類似しているが、ＣＴＬＬ−１９，４はその表面上に
ＣＴＬＬ母細胞よりも約４Ｃ０倍多いレセプターを発現
する。

た。細胞は激しく混合しながら抽出緩衝液と混合し、こ
の混合物を氷上で２０分インキュベートし、その後１２
０００　Ｘｆ、８℃で２０分遠心して核および他の細胞
破片を除いた。上清はすぐ使用するか、または使用する
まで一７０℃で貯蔵した。

ＣＴＬＬ１９．４細胞は１０％ウシ胎児血清、５０Ｕ／
ｍｌペニシリン、５０μｙ／ｍｌストレプトマイシンお
よび１０　ｎｙ／Ｔｒｌｔの組換えヒトＩＬ−２を含有
するＲＰＭ１１６４Ｃ中に維持した。細胞をローラボト
ル中で５　Ｘ　１０５細胞／ｄへ増殖させ、遠心により
回収し、無血清ＤＭＥＭ中で２回洗い、２０００　Ｘｔ
で１０分沈降させて固化ペレット（約２Ｘ１０５細胞／
ＩＮ／）を形成させた。このペレットに１％Ｔｒｉｔｏ
％［Ｆ］Ｘ−１００およびプロテアーゼ阻害剤混合物（
２ｍ＆フッ化フェニルメチルスルホニル、１０ＭＭペプ
スタチン、１０ＭＭロイペプチン、２ｍＭｏ−フェナン
トロリン、および２ｍＭＥＧＴＡ）を含有するＰＢＳを
等容量加えネズミＩＬ−４ＲのＮ末端配列を決定するの
に十分な量のネズミＩＬ−４Ｒを得るために、あるいは
ヒトＩＬ−４Ｈの特性をさらに決定するために、細胞の
界面活性剤抽出から得られたタンパク質を、アフィニテ
ィークロマトグラフィーによりさらに精製した。組換え
ネズミまたはヒトＩＬ−４は製造者の指示に従ってＡｆ
ｆｉｇａＬ［Ｆ］−１０（バイオランド社製）に結合さ
せた。例えば、ＩＬ−４溶液（０，１Ｍヘペス（Ｔ）１
１７．４　）　０．４　ｍｌ中の３．４ｍｔｌ　／ｍｌ
　）に洗浄したＡ／／　ｓ　ｇ　ａ　Ｌ■−１０１−□
ｍｊ！を加えた。この溶液を４℃で一晩揺動させ、上清
のアリコートは標準としてＢＳＡを用いて製造者の指示
どおりにバイオランドタンパク質検定によりタンパク質
について試験した。９５％以上のタンパク質がゲルに結
合されており、このことはカラムが１．３〜ＩＬ−４／
Ｉｐｔｌゲルの最終負荷を有することを示す。グリシン
エチルエステルを０．０５Ｍの最終濃度で加えてゲル上
の未反応部位をすべてブロックした。このゲルはＰＢＳ
−１％Ｔｒｉｔｏ％［Ｆ］次いで０．１グリシン−ＨＣ
ｌ　（ｐＨ３，０）で十分に洗った。上記のとおりに製
造したＩＬ−４結合’／／　ｉ　ｇ　ａ　ｌ　＠を用い
て０．８　Ｘ　４．０ＣＩｒＬカラム（床容量４、　Ｑ
　ａｔ　）を調製し、ネズミＩＬ−４Ｈの精製のために
１％ｒｒｔｔｏｓ＠ｘ　−１００含有ＰＢＳで洗った。

これとは別に、ＩＬ−４結合”ｆｆ１ｙａｌ”の２０％
懸濁液の５０μ！アリコートは、小規模アフィニティー
精製およびゲル電気泳動のために、５ｓ５−システィン
／メチオニン標識細胞抽出物と共にインキュベートした
。

界面活性剤で抽出したＩＬ−４レセプター保有ＣＴＬＬ
１９．４細胞のアリコート（２５＋ｎＡ’）は、４℃で
ネズミＩＬ−４アフィニティーカラムに遅い流速（３，
０ｍｌ／時）で加えた。その後、順次１％Ｔｒｉｔｏ％
■Ｘ−１００含有ＰＢ、Ｓ、ＲＩＰＡ緩衝液（０，０５
Ｍ）リス、０．１５　Ｊｆ　ＮａＣ１，１％ＮＰ−４Ｃ
，１％デオキシコーレートおよび０．１％ＳＤＳ）、０
．１％Ｔｒｉｔｏ＊”　Ｘ　−１００および１０惰Ｍ　
ＡＴＰを含有するＰＢＳ、最後に１％Ｔｒｉｔｏｎ＠Ｘ
　−１００含有ＰＢＳでカラムを洗って、％ＩＬ−４Ｒ
以外の汚染物質をすべて除いた。その後、カラムは０．
１％Ｔｒｔｔｏｎ■Ｘ−１００を含むグリシンＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ３，０）で溶出してＪＬ−４Ｒを溶離させ、
次いで０．１％Ｔｒｉｔｏ％”Ｘ　−１００含有ＰＢＳ
で洗った。溶出の間はｌ　ｍ１画分を集め、洗浄の間は
２ｍ１画分を集めた。溶出後すぐに、サンプルをＩＭヘ
ペス（、Ｈ７，４）８０μ！で中和した。各画分中のレ
セプターの存在はＨ５Ｉ標識ＩＬ−４を用いる上記の固
相結合検定により検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
析のために各両分からアリコートを分取し、残りは使用
するまで一７０℃で凍結保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
ために、各カラム画分４Ｃμｌは２ｘＳＤＳサンプル緩
衝液（０，１２５Ｖ）リスＨＣＩ　ｐＨ６，８，４％Ｓ
ＤＳ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエタ
ノール）４Ｃμｌに加えた。このサンプルを沸騰水浴中
に３分間置き、そして８０μｌアリコートをＬａｍｍｍ
１ｔの方法（Ｎａｔｓｒｅ　２２７　：６８０．１９７
０）に従って作製および注入した１０％ポリアクリルア
ミドゲルの試料溝に入れた。

電気泳動後、ゲルはＵデｄαｌらによって以前に開示さ
れた方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ
ｔ、、ＵＳＡ８１　：６４８１．１９８４）によって銀
染色した。

上記方法による精製は、ＩＬ−４結合活性を示す両分中
に存在する平均４５〜５５　ｋＤａ〜５５ｋＤａと３０
〜４Ｃ　ｋＤａの２本のｍ　Ｉ　Ｌ　−４Ｒタンパク質
バンドのポリアクリルアミドゲル銀染色による同定をも
たらした。ＣＴＬＬ−１９，４細胞の細胞表面タンパク
質を放射性標識し、その後１２５Ｉ標識レセプターをア
フィニティークロマトグラフィーで精製した実験は、こ
れら２つのタンパク質が細胞表面で発現されたことを示
唆した。低分子量バンド対高分子量バンドの比は４℃で
の画分の貯蔵の際に増加し、このことは前駆体生産物と
の関係（恐らくは遅いタンパク質加水分解による）を示
している。上記方法により精製されたｓ　Ｉ　Ｌ　−４
レセプタータンパク質は、溶解しているときも、ニトロ
セルロースに吸着されているときも、ＩＬ−４を結合す
る能力を保有している。

ＩＬ−４レセプタータンパク質の配列決定ｓ　Ｉ　Ｌ　
−４７フイニテイーカラム精製からのＣＴＬＬ１９．４
ｍＩＬ−４レセプター含有画分は、アミン末端タンパク
質配列の分析のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画
化し、その後ＰＶＤＦ膜に移行させた。ポリアクリルア
ミドゲル上でタンパク質画分を泳動する前に、初めにア
フィニティー精製法からの残留界面活性剤を除く必要が
あった。３つの調製物からのｍＩＬ−４アフイニテイー
カラムに結合したタンパク質を含む画分は融解させて、
スピードバク（ａｐｅｅｄ　ｖσＧ）により減圧下で最
終容量１　ａｔにそれぞれ濃縮した。その後、濃縮画分
は５０％（、／ν）ＴＦＡの添加によりｐＨ２に調整し
、０．１％（ｖ／ｖ　）　　Ｔ　Ｆ　Ａ　／水で平衡化
したブラウンリース（Ｂｒｏｗｎｌａｍａ　）　ＲＰ　
−３００逆相ＨＰＬＣカラム（２，ｘｘ３ｏｍ）に、ヒ
ユーレットパラカード（Ｈａｗｌａｔｔ　Ｐａａｋａｒ
ｄ）１０９０＃型ＨＰＬＣで流しながら２００μｌ／−
の流速で注入した。このカラムは注入後０６１％ＴＦＡ
／水で２０分間洗った。その後、結合タンパク質を含む
ＨＰＬＣカラムは次のような勾配を用いて展開した： ５分ごとにｌ　ａｔ画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
び銀染色によりタンパク質の存在を調べた。

ＨＰＬＣからの各画分はスピードバクで蒸発乾固させ、
Ｌａｍｔｗｍｌ　ｔ、　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　２２
７　：　６８０゜１９７０に記載のとおりに調製したレ
ムリ還元試料緩衝液中に再懸濁した。この試料を５−２
０％勾配のレム’Ｉ）ＳＤＳゲルに加え、色素の先端が
ゲルの底に達するまで４５ｍＡで泳動した。ゲルはそｔ
ｖ後ＰＶＤＦペーパー１ｃ移ｔ、、Ｍｔｓｔａｓｄａｔ
ｒａ。

Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈａｔｓ、　２６２二１００３５
．１９８７に記載されるように染色した。３つの各々の
調製物からの画分には約３０，０００〜４Ｃ，０００Ｍ
ｒに染色バンドがはっきりと認められた。

先のＰＶＤＦブロッティングからのバンドは切り出して
、本質的にＭａｒｃｈらの方法（＃ａｔｓｒｇ３１５　
：６４１．１９８５）に従ってアプライド・バイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔａｍｓ　）　
４７７Ａ型タ／バク質シークエンサーで自動ニドフッ分
解にかけた。ただし、ＰＴＨアミノ酸は自動的に注入し
、アプライド・バイオシステムズ１２０Ａ型ＨＰＬＣで
製造者により供給される勾配および検出系を用いてｏｓ
　１ｔｎ−分析した。次のアミノ末端配列がシーフェン
シングの結果から決定された　：　　ＮＨ！−１１ａ−
Ｌｙｅ−Ｖａｌ−Ｌｇｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｓ−Ｐｒ。

−Ｔｈｒ−Ｃｙａ／Ａａｎ−Ｐｈｍ−５ｕｒ−Ａｓｐ−
Ｔｙｒ−１１ｇ。

アミノ末端配列決定に用いた２番目の調製物からのバン
ドはＭａｒｓｈらのｔ％５ｉｔｓ法（Ｎａｔｓｒｅ３１
５：６４１．１９８５）を用いてＣＮＢｒで処理し、内
部メチオニン残基の後でタンパク質を切断した。

生成した切断産物の配列決定は次のデータをもたらし、
ＣＮＢｒが２個の内部メチオニン残基の後でタンパク質
を切断したことを示している：観測された残基 ＶａＥ、Ｓ−デ ＧＥｙ、Ｌ−％ １１ｅ、ＶａＥ Ｔ、デ、Ｓａデ Ａ、Ｑ、Ｔｙｒ Ｇｌｓ、Ｔｈｒ Ａｓｐ、Ａｌａ ＡＥａ、Ｌａ５ Ｐｒｏ　、Ｖａｌ Ａにα ０１％、Ｖａｌ Ｐｈ　ａ　、Ｇ　（ｙ ＩＬ呼、　ＡＥａ Ｖａ　ｌ　ｒ　Ｇ　ｌ　ｓ Ｔ、デ、ＩＬｅ ’４／８　＊Ａ８ｎ ＶａＥ、Ｔｈｒ Ｔｈｒ、ＧＥｙ ８かも誘導されたタンパク 質配列（第２図参照）と比較したとき、配列は次のよう
に合致した： 配列１　　：　　（Ｍａｔ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１１ａ
−５ａｒ−Ａｒｇ−Ｇｔｓ−幻 Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＡＥａ−Ｇｌｓ−Ｐｈａ−１
１ａ−幻 Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−５
ａｒ−Ｇｌｎ−Ｉｔｓ　−Ｌａｓ−Ｔｈｒ−ＧＥｙ 、４ＪＩ％（２）を除く配列ｌおよび８．１Ｏ１１２位
のＡｒｇ１１３位のＳ−デ、１６位のＬａｇを除（配列
２のすべての位置において一致が見られた。上記配列は
第２図のアミノ１１１！残基１３７−１５４および１６
９−１８７に対応する。

さらに、アミノ末端配列は９位がＣ１０と定められたク
ローンから誘導された配列と合致した。

上記データは、クローン１６および１８がＩＬ−４レセ
プターの遺伝情報から誘導されたものであるという結論
を支持している。

ネズミＩＬ−４レセプターをコードするクローンについ
てライブラリーなスクリーニングするために、減算ハイ
ブリダイゼーション戦略（Ｓ％ｂｔｒａｃｔｉｖｍｈｙ
ｂｒｉｄｔｍａｔｉｏｎ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　）を用い
て、高度に純化されたＩＬ−４レセプターａＤＮＡ　　
プローブを得た。ポリアデニル化（ポリＡ　）ｍＲＮＡ
は２つの類似した細胞系列、すなわち母細胞系列ＣＴＬ
Ｌ（約ｚｏｏｏレセプター／細胞を発現する）および選
別した細胞系列ｃｒｔ、、Ｌ　　１９．４　（ＩＸ　１
０５レセプター／細胞を発現する）、から単離した。こ
れら２つの細胞系列のｍ　ＲＮ　Ａ含量は、ＩＬ−４レ
セプター惰ＲＮＡの相対レベルを除けば同じであると予
測される。その後、放射性標識−本鎖ａＤＮＡ調製物は
、Ｍａｔｓｉａｔｉａ　ａｔ　ａｌ、、Ｍｏｔｇｃｓｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ
ｎｓａｌ（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｈｅ　１９８２　）
に記載の方法と類似した方法を用いて、ＣＴＬＬｌ９．
４細胞からのポリアデニル化ｓ　ＲＡ’　Ａの逆転写に
より作製した。簡単に述べると、ポリＡ＋ｓ　Ｒ＃　Ａ
をＨａ　ｒ　ｃ　ｈら（Ｎａｔｔｂｒｅ　３１５　：　
６４１−６４７．１９８５）に記載されるとおりに精製
し、プライマーとしてオリゴｄＴを用いて逆転写酵素に
よりｃＤＮＡＫ複製した。ｅＤＮＡをｓｔｐで高レベル
標識するために、１００　ｔｔＣｉノ”　Ｐ　−ｄｃＴ
Ｐ（比活性−３０００Ｃｉ／ｍｒｎｏｌ　）は１０ｔｔ
Ｍの非放射性ｄＣＴＰを含有する反応混合物５０μ！中
で使用した。４２℃で２時間逆転写後、ＥＤＴＡを２０
ｍＭ加え、次にＮａ０Ｅを０．２Ｍ加え、ｅＤＮＡ混合
物を６８℃で２０分インキュベートすることＫよりＲＮ
Ａを加水分解した。−重鎖ｃＤＮＡは１０　ｍＭ　トリ
ス−Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡで予め平衡化したフェノー
ル／クロロホルム（ａ０１５０）混合溶剤で抽出した。

水相を清浄な試験管に移して、ＮａＯＨを０．５　Ｍ添
加すること釦より再びアルカリ性にした。その後、ｃＤ
ＮＡは６　ＲｔＳａｐｈｔｕ１ｍｚ■Ｇ５０カラムによ
るクロマトグラフィーにかけ、３０　ｍＪ／　Ｎａ０Ｅ
および１ｒｎＭ　ＥＤＴＡを流して大きさに基づいて分
画化し、これにより低分子量の汚染物質を除いた。

選別したＣＴＬＬ　１９．４　ｍ胞から得られた分画化
ｃＤＮＡはその後、ＣＴＬＬｌ　９．１細胞由来のｃＤ
ＮＡを、選別していないＣＴＬＬ細胞から分離したポリ
Ａ＋ｍＲＮＡ　　３０μｍと共にエタノール沈殿させ、
１６　Ｔ’Ｓ　ＬｖＯ−２５Ｍ　Ａ’　ａＰ　０４（ｐ
Ｈ６，８）、０．２％ＳＤＳ、　ＺｙｘＪｆ　ＥＤＴＡ
中に再懸濁した後６８℃で２０時間インキュベートする
ことにより、未選別ＣＴＬＬ母細胞由来のｍＲＩＪＡの
過剰量とハイブリダイズさせた。未選別ＣＴＬＬ細胞由
来のｍＲＮ　Ａに相補的な選別ＣＴＬＬ１９．４細胞由
来のｃＤＮＡは二本＠ｃＤＮＡ／　鵠ＲＮＡハイブリッ
ドを形成し、このハイブリッドはその後ヒドロキシルア
パタイトに対するそれらの異なる結合親和性に基づいて
一本鎖ｃＤＮＡから分離することができる。この混合物
は３０倍容量の０．０２Ａｆ　ＮａＰＯ，（ｐＨ６，８
）で希釈し、室温でヒドロキシルアパタイトに結合させ
、そして５ｉｎｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１
２　：　５４１　ｐ１９８４に記載されるように６０℃
で０．１２ＭＮａＰＯ，（ｐＨ６，８）を用いて樹脂か
ら一本鎖、ＤＮＡを溶出した。りン陵塩緩衝液はその後
水中の２ｎｔ　　５ａｐｈａｄａ＠■Ｇ５０スピンカラ
ムでの遠心により除去した。このノ・イブリッド減算法
はＣＴＬＬｌ　９．４細胞と未選別ＣＴＬＬ細胞との共
通配列を大部分除き１．ＤＮＡライブラリーの検索（以
下で説明する）に使用できる放射性標＠ＩＬ−４レセプ
ター、ＤＮＡについて純化された一重鎖、ＤＮＡを残存
させる。

一ニング ｅＤＮＡライブラリーはＣＴＬＬｌ　９．４細胞から分
離したポリアデニル化、ｌＲＮＡから標準技法（Ｇ％ｂ
ｉｇデ＊　ａ　ｔ　　ａｔ　、　、ＧａＴＬｓ　　２５
　”　２６３　＊　１９８３　ｐＡｓｓｓｂｍｔ　　ａ
ｔ　　ａｌ、ｍｅｄｓ、、ｃｓｒｒｍｎｔ　　Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏｌｇｃｓｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙｐＶｏｌ、　　１　　ｐ　　１９８７　）Ｋより作製
した。オリゴｄＴをプライマーとして用いて逆転写した
後、−重鎖ＣＤＮＡをＤＮＡ　　ポリメラーゼ■により
二本鎖となし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端を作
り、ＥｃｏＲ（メチラーゼでメチル化して、ＤＮＡ内の
Ｅ６ｏＲ１切断部位を保護し、セしてＥｃｏＲｌ　リン
カ−へ連結させた。得られた構築物はＥ６ｏＲ１で消化
して、ＤＮＡの両末端におけるリンカ−を１コピーだけ
除いて全部除去し、その後等モル濃度のＥｃｏ　Ｒｌ切
断および脱リン醸化したλＺＡＰ■アームに連結させ、
この連結混合物を製造者の指示どおりにｉｎ　ｖｉｔｒ
。

（Ｇｉｇａｐａｃｋ■）パッケージングした。λフアー
ジベクター内に、ＤＮＡライブラリーを作製するための
他の適当な方法および試菓はＨｓｙｎｈ　ａｔ　ａｌ　
−ｅＤＮＡ　　Ｃｌｏｓｉｎｇ　Ｔａｃｈｎｉｑｓａｓ
：Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃ五、ＩＲＬ　
　Ｐｒｅｓｓ、０ｚｆｏｒｄ　　（１９８４）；Ｍａｉ
ｓｓｎａｒ　ｓｃ　ａＬ、、Ｐｒｏｃ、ＮａｇＬ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８４：４１７１（１９８７）およ
びＡ％８％ｂｅｇ　ａｔαｌ　、　＊　５ｓｐｒｎ−に
開示されている。λＺＡＰ■はλｇｔ１１（米国特許第
４７８８１３５号）Ｋ類似したファージスクローニング
ベクターであり、ｐＵＣ１９（Ｎｏｒｒａｎｄａｒ　　
ｔ＃　　ａｌ、ｙＧｇｎｅ　　２６：１０Ｌ１９８７）
からのプラスミド配列、ｌａｃ　Ｚ遺伝子中に配置され
たポリリンカ一部位、および／１ファージ複複製点（宿
主細菌がｆ１ヘルパーファージに重感染するとき、ｓｓ
　ＤＮＡの回収を可能にする）を含む。ＤＮＡは前記要
素を含むプラスミド（ＢＥｓｇｓｃｒｔｐｔ■と呼ばれ
る）の形で切り出される。ＧｉｇａｐａｃＪｇ■はλフ
アージＤＮＡのパッケージングに用いられる音波処理Ｅ
、ｃｏｒ、ｉ抽出物である・　λＺＡＰ■、Ｂｔｓａｓ
ｃｒｉｐｔ〜よびＧｉｇａｐａｃｋ■は米国カリフォル
ニア州すンジエゴ、ストラタジー７社の登録商標である
。

実施例６からハイブリッド減算法により得られた放射性
標ＲｃＤＮＡはその後、ｃＤＮＡライブラリーをスクリ
ーニングするためのプローブとして使用した。増幅した
ライブラリーは２０枚の１５０朋プレートのそれぞれに
２５，０００プラークの密度でＢＢ４細胞上にまき、３
７℃で一晩インキュヘー）１ｊ、：。λＺＡＰ■の全操
作およびＥ１％ｅｓｃデ１−ｐｔ■プラスミドの切り出
しは、５ｈｏｒｔら（ＮｓｃＬＡｃｉｄｓ　Ｒａｓ、１
６：７５８５，１９８８）およびストラタジーン社の製
品文献に記載のとおりに行った。プラークを写し取った
フィルターはＶａ屓ａｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ４
１．Ａａａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　　　７　６　　：３
６８３．１９７９に記載されるように、５０％ホルムア
ミド、５　Ｘ　ＳＳＣ，５Ｘ　Ｄｅｎｋａデｄｉ試薬お
よび１０％硫酸デキストランを含むハイブリダイゼーシ
ョン緩衝液中で実施例６かものハイブリッド減算したｃ
ＤＮＡプローブと４２℃で４８時間インキュベートした
。その後、０．２ＸＳＳＣ中６８℃でフィルターを洗っ
た。１６個の陽性プラークは更なる分析のために精製し
た。

ｃＤＮＡ挿入物を含むＢ１５ａｓｃｒｉｐｃ■プラスミ
ドは製造者の指示どおりにファージから切り出し、Ｅ、
ｃｏＬｉに形質転換した。プラスミドＤＮＡは個々のコ
ロニーから単離し、Ｅｃ６　Ｒ■で消化してａＤＮＡ挿
入物を放出させ、そして標準１％アガロースゲル上で電
気泳動した。４枚の同じゲルをナイロンフィルターへ移
行させて同一のサザンプロットをつくり、ＩＬ−４レセ
プター陰性マウス細胞系列（ＬＢＲＭ　　３３１Ａ５Ｂ
６）からのポリＡ＋、、ＲＮＡへの２回目のハイブリダ
イゼーション後に、数種のプローブ：すなわち（１）未
選別ＣＴＬＬ細胞由来の放射性標＠０ＤＮＡ、（２）　
　ＣＴＬＬ　１９．４選別細胞由来の放射性標＠ｃＤＮ
Ａ、（３）　　ＣＴＬＬ　１９．４選別細胞由来のハイ
ブリッド減算したｃＤＮＡ、および（４）　　ＣＴＬＬ
　１９．４選別細胞由来のハイブリッド減算したｃＤＮ
Ａ、を用いて分析した。これらのプローブは選別細胞系
列ＣＴＬＬ１９．４に特異的なｍＲＮＡの、ＤＮＡコピ
ーが次第に濃縮されたものであった。ライブラリーから
単離された１６個の陽性プラークの５ち、４つのクロー
ン（１１，（。

１４．１６および１８）はプローブの濃縮にりれて信号
強度の増加を示した。

単離したＣＴＬＬクローンの制限地図作成（第１図に示
すンおよびＤＮＡ塩基配列決定は、少なくとも２つの別
個の＝ＲＮＡ果団の存在を明らかにした。両方の型のｍ
ＲＮＡはコード領域の大部分にわたって同じオープン・
リーディング−７レームな有するが３′末端では相違し
ており、従って異なるＣ０ＯＨ末端配列を有する相同タ
ンパク質をコードしている。両方のクローンのオープン
・リーディング−フレーム内部のＤＮＡ配列は、実施例
５に詳述した精製ＩＬ−４レセプターの塩基配列決定か
ら誘導されたタンパク質配列と同じタンパク質配列をコ
ードする。クローン１６および１８はこれら２つの別個
の遺伝情報の原型（プロトタイプ）として用いた。クロ
ーン１６は第２Ａ図のアミノ酸−２５から２３３までを
含む２５８個のアミノ酸から成るポリペプチドをコード
するオープン・リーディング・フレームを含んでいる。

クローン１８は２３０個のアミノ酸から成るポリペプチ
ドをコードし、そのうちＮ末端の２２４個のアミノ酸は
クローン１６ＯＮ末端と同一であるが、その３′末端は
次の配列：　ＣＣＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＴＣＴＧ（
これはＣ末端の６個のアミノ酸：　Ｐｒｏ−５ｇｒ−Ａ
ｓｎ−Ｇｇｓ−Ａｓｎ−Ｌａｓをコードする）および終
結コドンＴＧＡを有し、クローン１６と相違している。

両方のクローンは実施例８に記載するように哺乳動物発
現系により発現させた。

胞によるＩＬ−４Ｈの発現 Ａ、ＣＯ５−７細胞による発現：　第３図に示す真核細
胞発現ベクターｐＣＡＶ／ＮＯＴは哺乳動物の高度発現
ベクターｐＤＣ２０１（ａｉｆｎｓ　ｍｔ、ａｌ、ｅＳ
ｃｉｅｎｃｅ　　２４１　：　５８５　＃　１９８８　
）から誘導された。ｐＤｃ２０１はＣｏｓｍａｎ　ａｔ
　ａＥ、、Ｎａｔｕｒｅ３１２ニア６８，１９８４に以
前に報じられたｐＭＬｓＶの誘導体である。ｐＣＡＶ／
ＮＯＴは、哺乳動物細胞にトランスフェクトされたとき
、その多重クローニング部位（ＭＣ５）に挿入されたＣ
ＤＮＡ配列を発現できるように作られており、次の成分
を含む：すなわち５Ｖ４Ｑ（斜線ボックス）は複製起点
、エン７１ンサ一配列および初期並びに後期プロモータ
ーを含む座標５１７１−２７０からのＳＶ４Ｃ配列を含
む。この断片は、初期プロモーターからの転写方向が矢
印で示すように方向づげられる。ＣＭＶはヒトサイトメ
ガロウィルス由来のプロモーターおよびエンハンサ−領
域（Ｅｏｓｈａｒｔ　ａｔ　ａｌ、、Ｃａ１Ｋ４１　：
　５２１−５３０　ｔ１９８５）に発戎された配列から
のヌクレオチド−６７１から＋７まで）を含む。３分節
（ｔｒｉ営ｒ−ｃｉｔｅ）リーダー（点描ボックス）は
アデノウィルス−２３分節リーダーの第一エキソンおよ
び第一と第二エキソン間のイントロンの一部、３分節リ
ーダーの第二エキンンおよび第三エキンンの一部、　並
ヒＫ　Ｘｈｏ　Ｉ　、　Ｋｐｎ　Ｉ、　Ｓｍａ　■、Ｎ
ｏｔ！およびＢｇｌｆ１部位を含む多重クローニング部
位（ＭＣ５）を包含する。ｐＡ　（斜線ボックス）は初
期転写のためのポリアデニル化シグナルおよび終結シグ
ナルを含む４１２７−４１００および２７７０−２５３
３からのＳＶ４Ｃ配列を包含する。ｐＡから時計回りに
、ＶＡ■およびＶＡｆｌ遺伝子を含むアデノウィルス−
２配列１０５３２−１１１５６　（黒の太線で示す）が
存在し、これに続いてアンピシリン耐性遺伝子と複製起
点を含む４３６３−２４８６および１０９４−３７５か
らのｐＢＲ３２２配列（実線）が存在する。得られた発
現ベクターはｐ　ＣＡ　Ｖ　／　Ｎ　ＯＴと名づけられ
た。

クローン１６およびクローン１８中の挿入物は両方とも
Ａｓｐ７１８およびＮｏｔｌで消化してＢ１５ｂａｓｅ
ｒｉｐｔ■プラスミドから分離した。その後、クローン
１６からの３．５ｋｂ挿入物は、ポリリンカー領域中の
Ａａｐ７Ｌ８およびＮｏｔ１部位で切断した発現ベクタ
ーｐＣＡＶ／ＮＯＴに１接連結した。

クローン１８からの挿入物はＴ４ポリメラーゼで平滑末
端とした後、Ｓｍａ　Ｉで切断し脱リン酸化したベクタ
ーｐＣＡＶ／ＮＯＴに連結させた。

両方のＩＬ−４レセプター発現プラスミドからのプラス
ミドＤ　ｔＶ　Ａは、Ｌｓｔｈｍａｎ　ｇｔ　ａＥ、（
Ｎ５ｃｌ。

、４ｃｓｄｇＲｇ１１１：１２９５，１９８３）および
ＮｃＣｓｔｃｈａｎ　ｇｇ　ａに、（Ｊ、ＮａｔにＣａ
ｎｃｇｔ−ｈｓｓｔ。

４１：３５１，１９６８）に記載されるようなりＥＡＥ
−デキストラン、その後のクロロキン処理を用いて、サ
ルＣＯ５−７細胞の半集密細胞層をトランスフェクショ
ンするために使用した。細胞はその後挿入配列の一時的
発現を起こさせるべく３日間培養下で増殖させた。３日
後、培養上溝および細胞単層を（実施例ＩＫ記載したよ
５Ｋ）検定し、ＩＬ−４の結合を確認した。

Ｂ、　Ｃｌｌ０ａ胞ニヨル発現：　ＩＬ−４Ｒは１ｆ、
ニー、初めにクローン１８のＡｓｐ７１８／Ｎｏｔ　Ｉ
制限断片を実施例８に記載のｐＣＡＶ／ＮＯＴベクター
に連結することにより、哺乳動物ＣＢＯ細胞系列で発現
させた。クローン１８からの挿入物を含むｐＣＡＶ／Ｎ
ＯＴベクターはその後、標準リン酸カルシウム法を用い
て、ＳＶ４Ｃ初期プロモーターの制御下にあるジヒドロ
葉数還元酵素（ＤＨＦＲ）、ＤＮＡ選択マーカーと共に
Ｃｌ１Ｏ細胞に同時トランスフェクションした。ＤＨＰ
Ｒ配列はこのプラスミドを保有する哺乳動物細胞のメト
トレキセート選択を可能にする。この種の細胞でのＤｉ
ｉＦＲ配列の増幅現象は高濃度のメトトレキセートを用
いて選択した。この方法では、近傍のＤＮＡ配列も増幅
されるので、高められた発現が達成される。トランスフ
ェクト細胞の大量の細胞培養物は、約１００　ｎｙ／ｍ
ｌの量で可溶性の活性ＩＬ−４Ｒを分泌した。

Ｃ０ＨａＬａ細胞による発現：　　ＩＬ−４ＲはＣＭＶ
前初期（ｉｍｔｎａｄｉａｔｅ　−ｅａｒｌｙ）工ンハ
ンナー／プロモーターの支配下でＥＢＶ核抗原−１を構
成的に発現するヒトＨｅｒ、α−ＥＦ３ＮＡ細胞株６５
３−６により発現させた。用いた発現ベクターはｐＤＣ
２０１の誘導体であるｐＨＡＶ−ＥＯ−ＮＥＯ（Ｄｏｗ
ｅｒ　　ａｔ　ａｌ、Ｊ、ｌｍｍ５ｎｏＬ、　　１４２
　：　４３１４　＊１９８９）であり、このベクターは
ＥＢＶ複製起点を含み、６５３−６細胞系列での高レベ
ル発現を可能にする。ｐＨＡＶ−ＥＯ−ＮＥＯは、アデ
ノウィルス主要後期プロモーターを、ウィルスｓＲＮ　
Ａのキャップ部位に対して−１４８から＋７８まで延び
るＥＩＶ−１からの合成配列と置き換え、そしてＨＩＶ
−１ｔＧｇ遺伝子を５Ｆ−４Ｃ初期プロモーターの支配
下におくことによって、ｐＤＣ２０１か誘導された。そ
れはまたＢＱＬｆＪおよびＨｐｃＬ１部位に挿入された
ｐｓＶ　２ＮＫＯ（Ｓｏｘｔｈ＊ｒｎ＆Ｉｈｒｇ、）、
Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｇｎａｔ、　　１　　：　　３　
３　２　　ｐ１９８２）のネオマイシン耐性遺伝子を含
むＢｇｌｌ−５ｒｓαＩ断片（ａｃＬｌｌクロ一ニング
部位の下流にサブクローニングされる）を含んでいる。

得られたベクターはネオマイシン耐性によるトランスフ
ェクト細胞の選択を可能にする。

７６０　ｂｐのＩＬ−４Ｒ断片はＥＱＱＮ■および５ｓ
ｔＩ制限酵素で消化することによりＢＬｓ＊５ｃｒｓ、
ｐ＊■プラスミドから分離した。クローン１８のこの断
片は５′床端ヌクレオチド配列：　ＧＴＧＣＡＧＧＣＡ
ＣＣＴＴＴＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡ、　　第２Ａ図のヌク
レオチド６７２の後続のＴＧＡ終止コドン、並びに３′
末端ヌクＶ　、ｔ　ｆ　）”　配列：　ＣＴＧＡＧＴＧ
ＡＣＣＴＴＧＧＧＣ；０ＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧ
ＡＧＡＧＣＴを追加した、第２Ａ図のヌクレオチド１−
６７２に対応する。この断片はその後Ｔ４ポリメラーゼ
を用いて平滑末端となし、ｐＥＡＶ−ＥＯ−ＮＥＯのＳ
ａｔ　１部位にサブクローニングした。

得られたプラスミドはＤｏ町ｙ　６ｔａ！−＋（）、Ｉ
謝罪ｎｏｒ・１４２：４３１４，１９８９）に記載され
るような改変したポリブレントランスフェクション法に
より６５３−６ｍ胞系列にトランスフェクションした。

ただし、細胞はトランスフェクション後２日でトリプシ
ン処理を行い、１■／１の濃度の０４１８（ギブコ社製
）を含有する培地に１＝８の比で分配した。培地はネオ
マイシン耐性コロニーが樹豆されるまで１週間に２回取
り換えた。七の後、コロニーはクローニングリングを使
って別々に採取するか、または−緒にプールして、い（
りかの異なる細胞系列を発生させた。これらの細胞系列
は２５０μｙ／ｒｔｔｌのＧ４１Ｂ濃度で薬物選択下に
維持した。細胞が集密的生長に達した時点で上清を採取
し、実施例ＩＢの阻害検定により試験した。細胞系列は
１００〜６００　ｎｙ、／ｍｌの可溶性ＩＬ−４Ｒタン
パク質を産生じた。

ｍ　Ｉ　Ｌ　−４Ｒ（’）　発現（’）　タＪｅ）　Ｋ
、ｐ　ＩＸＹ　１２０カら誘導される酵母発現ベクター
を次のように構築した。ｐｌＸＹ１２０は、それがｃＤ
ＮＡ挿入物を含まずかりＮｃｏ　１部位を有するポリリ
ンカー／多重クローニング部位を含むことを除いて、ｐ
ＹαＢｓＧＭ（ＡＴＣＣ５３１５７）と同一である。こ
のベクターは次の供給源からのＤＮＡ配列を含む：すな
わち（１）　　プラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７
０１７）から切り出した、複製起点およびＥ、ｃｏｌｉ
選択用のアンピシリン耐性マーカーを含む大きいＳｐｈ
　［（ヌクレオチド５６２　）　−ＥｃｏＲＩ　（ヌク
レオチド４３６１）断片；（２）　’ｒＲＰ−１マーカ
ー、２μ複製起点、ＡＤＨｚプＣＩ％−ターを含むＳ、
ｃａｒａｖｉｓｉａａＤＮＡ；および（３）分泌ペプチ
ドα因子をコードする遺伝子から誘導された、８５個の
アミノ酸から成るシグナルペプチドをコードするＤ　Ｎ
　Ａ　（Ｋｓｒｊａｎらの米国特許第４５４６０８２号
参照）。Ａｓｐ７１８制限部位は異種遺伝子への融合を
容易忙するために、α因子シグナルペプチド中の２３７
位に導入した。これはＣｒｔＬｉｋ、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｓｇｓ＋Ｊａｎｓａｒｙ　　１９８５　ｒ　ｐｐ
、　１２　１９に記載されるような特定オリゴヌクレオ
チドによるｉｎ　ｖｉｔｒ。

変異導入法を用いて、ヌクレオチド２４１のチミジン残
基をシトンン残基に変えることによって達成された。多
重クローニング部位を含み、α因子シグナルペプチドの
３′末端近傍のアミノ酸７９におけるＡｓｐ　７１８部
位から２μ配列中のＳｐｙ　！部位までの次の配列を有
する合成オリゴヌクレオチドが挿入された： ｐＢＣ１２０はｐＢＲ３２２配列中のＮｒｒｔ、■部位
に挿入された、複製起点および遺伝子開領域を含む一本
鎖ファージｆ１由来の５１４ｂｐＤＮＡ断片の存在によ
ってｐＹαＥｓＧＭと異なっている。ｆ１複製起点の存
在は、適当なＥ、ｃｏｌｉ株に形質転換してバクテリオ
ファージ／１を重感染させる場合、ベクターの一重鎖Ｄ
ＮＡコピーを生じさせ、これはベクターのＤＮＡ塩基配
列決定を容易にし、またｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異導入の土
台を提供する。、ＤＮＡを挿入するために、ｐｌＸＹ１
７：ＱはＡｓｐ　７１８　（α因子リーダーペプチドの
３′末端近傍（ヌクレオチド２３７）で切断する）と、
例えばＢα怖Ｈ■（ポリリンカー中で切断する）とで消
化する。その後、大きいベクター断片を精製して、発現
すべきタンパク質をコードするＤＮＡ断片に連結させる
。

、ＢＩＬ−４Ｒを発現する分泌ベクターを作るために、
ｓｌ　Ｌ　−４７？をコードする。ＤＮＡ断片は、実施
例８のＢＥｓｍｓｃｒｉｐｔ■プラスミドをＰｐｓｍ　
ｌと８！＃誼で消化して、惰ＩＬ−４Ｒ配列（１ｇ−お
よびＬｙｓをコードする最初の２個の５′コドンな除く
）を含むＰｐｓｍ１部位（図面参照）からオープン・リ
ーディング・フレームの３′側にあるＢｇｘ■部位まで
の８３１　ｈｐ断片を分離することにより、Ｂ１５ａ＆
０ｒｉｐｔ■プラスミドから切り出した。ｐｌＸＹ１２
０はＡｓｐ７１Ｂ（α因子リーダーの３′末端近傍）お
よびＥａｎ＊Ｅ　ｌで消化した。ベクター断片はＰＦ％
Ｓ　ＩＩＢｑｌ　ＩＩ　ｈｌＬ−４ＲｃＤＮＡ断片、お
よびα因子リーダーの最後の６個のアミノ酸と成熟ｍＩ
Ｌ−４Ｂの最初の２個のアミノ酸とを再形成させる一対
の合成オリゴヌクレオチドリアニーリングにより作った
次の断片に連結させた：αα因子クンｌングー−−−−
８ ＧＴＡ　ＣＣＴ　ＣＴＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　Ａ
ＴＣＡＡＧＧＡ　Ｇｔｒ　ＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　Ｔ
ＡＧ　ＴＴＣＣＡＧＶａｔ　　Ｐｒｙ　　Ｌａｓ　　Ａ
ｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　７！＃　　ＬｙｓＮ−ｔ
ｎｌＬ−４Ｒ このオリゴヌクレオチドはまた、コードされるアミノ酸
配列を変えることな（、Ｘｂａ　ｌ制限部位を導入する
ためのヌクレオチド配列ＴＧＧＡＴＡからＣＴＡＧＡＴ
への変更を含んでいた。

前記の発現ベクターはその後精製し、これを用いて標準
技法（例えば欧州特許公開第１６５６５４号に記載され
る方法）により５．６ａデ＃１８（α−の二倍体簿母株
（１’２１８１）を形質転換し、トリプトファン原栄養
株について選択した。得られた形質転換細胞は分泌、Ｉ
ＩＬ−４Ｒタンパク質の発現のために培養した。生物学
的活性を検定するための培養物は、ＹＰＤ培地（１％酵
母エキス、２％ペプトン、１％グルコース）２０〜５０
ｔｊ中３７℃で１〜５ｘｌＯ’ｉ胞／Ｍの細胞密度へ増
殖させた。細胞を培地から分離するために、遠心により
細胞を除き、検定に先立って培地を０．４５μ酢酸セル
ロースフイルターに通して濾過した。形質転換酵母株に
よりもたらされた上溝、またはプラスミドにより形質転
換され、その後破壊された酵母細胞からの粗製抽出物は
、生物学的に活性なタンパク質の発現を証明するために
検定を行った。

切断形態のネズミＩＬ−４レセプターｃＤＮＡの分離Ｃ
５７ＢＬ／６マウスより訪導された抗原依存性ヘルパー
Ｔ細胞クローンである７Ｂ９Ｍｉ胞からポリアデニル化
ＲＮＡを分離し、これを用いて実施例７に記載したごと
くλＺＡＰ（サンジエゴ、ストラタジーン社製）にｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。λＺＡＰライブラリーは
一度増幅させ、そして実施例７に記載したように全部で
３００，０００イ固のブ、ラークをスクリーニングした
。ただし、フ。

ローブはＣＴＬＬｌ９．４クローン１６から単離し、ラ
ンダムプライマーを用いて作った３ｔｐ標識７００ｂｐ
ＥｃｏＲ■断片であった。１３個のクローンが単離され
、制限分析により同定された。

クローン７Ｂ９−２の核酸配列分析は、それがポリアゲ
ニル化尾部、推定上のポリアデニル化シグナル、および
８１０個のアミノ酸のオーブン・リーディング・フレー
ム（第２図に示す）を含み、この５ちの最初の２５８個
はＣＴＬＬ’Ｊ、９．４クローン１６によりコードされ
るものと同一であり、２５個のアミノ酸から成る推定上
のシグナルペプチド配列を含むことを明らかにした。７
Ｂ９−２０ＤＮＡは真核細胞発現ベクターｐＣＡＶ／Ｎ
ＯＴにサブクローニングし、得られたプラスミドは実施
例８に記載したとおｒ）ＫＣＯ５−７細胞にトランスフ
ェクションした。ＣＯ５−７トランスフエクト細胞は実
施例１２で説明するように分析した。

ＣＴＬＬｌ９．４ライブラリー中のクローン１８に類似
した第二ａＤＮＡ形態が７Ｂ９ライブラリーから分離さ
れ、配列分析にかけられた。このｃＤＮＡ。

クローン７Ｂ９＝４、はその５′末端においてクローン
７Ｂ９−２よりも３７６　ｂｐ短（，７Ｂ９−２により
コードされる最初の４７個のアミノ酸を欠くが、残りの
Ｎ末端アミノ酸２３−１９９をコードする（第２図参照
）。２００位に１クローン７Ｂ９−４は（ＣＴＬＬ　１
９．４からのクローン１８と同様に）アミノ酸配列をＰ
デＯ５げＡ８？＆Ｇｌｓ　Ａｓｎ　Ｌｇｍに変える１　
１４　ｂｐ挿入物および後続の終結コドンな含む。クロ
ーン７Ｅ９−４とＣＴＬＬｌ　９．４クローン１８の両
方に存在する１１４ｂｐ挿入物は核酸配列が同一である
。このｃＤＮＡ形態（（？（：）Ｓ−７細胞中で発現さ
せると分泌型のＩＬ−４レセプターをもたらす）がこれ
ら２つの異なる細胞系列から分離された事実は、それが
クローニング人工産物でもな（選別ＣＴＬＬＨｉ胞に特
有の変異体でもないことを示している。

ポリアデニル化ＲＮＡは、標準フィコール精製により分
離してＩＬ−２中で６日間培養し、その後ＰＭＡ　オ！
　ヒＣｏｎ　−Ａで８時間刺激したヒト末梢血リンパ球
（ＰＢＬ）から単離した。オリゴｄＴをブライマーとし
て用いたｃＤＮＡライブラリーは実施例７に記載した手
法を用いてλｇｔｌＯＫ作製した。プローブはＴ７ＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて７Ｅ９−４ｃＤＮＡの未標識Ｒ
ＮＡ転写物を合成し、次ニランダムブライマー（べ−！
ｊンガー・マンハイム社製）を用いて逆転写酵素でｓｔ
ｐ標＠ｃＤＮＡを合成することにより作った。このネズ
ミ−本鎖、ＤＮＡプローブを用いて、ヒ）　ｃＤＮＡラ
イブラリーからの５０，０００個のプラークを５０％ホ
ルムアミド／　０．４　Ｍ　ＮａＣ１中４２℃でスクリ
ーニングし、その後ＺｘＳＳＣ中５５℃で洗った。３個
の陽性プラークを精製し、ＥｃＯＲ１挿入物をＢ１５ｍ
５ｃｒｉｐｔ■プラスミドベクターにサブクローニング
した。クローンＰＢＬ−１（３，４ｋｂのｃ　ＤＮＡ　
）の一部の核酸配列決定は、このクローンがネズミＩＬ
−４レセプターの対応配列に対し約６７％相同であるこ
とを示した。しかしながら、終結コドンを含み且つマウ
スＩＬ−４レセプタークローンに対し相同でない６８　
ｂｐの挿入物が、成熟タンパク質の推定上のＮ床端から
４５アミノ酸下流に存在しており、このことはクローン
ＰＢＬ−１が非機能的な末端切断形態のレセプターをコ
ードしていることを示唆した。同一のライブラリーを（
ストリンジェント条件下で）クローンＰＥＬ−１（３，
４＆６のＥｃｏ　ＲＩ　　ｃＤＮＡ挿入物）からランク
”ムプライマーを用いて作ったｓａｐミル標識プローブ
クリーニングすることにより、９個の追加ヒト細胞クロ
ーンが得られた。これらのクローンのうち２個（ＰＢＬ
−１１およびＰＢＬ−５）は、ＰＢＬ−Ｉにおいて６８
　ｂｐ挿入物を含む５′領域へ延びているが６８　ｂｐ
挿入物を含まず、そしてそれらの大きさから明らかであ
るよ５に、完全に３′へ延びていない。そのため、これ
らのクローンは哺乳動物発現による機能分析を妨げる。

ＣＯ５−７細胞において発現可能な構築物を得るために
、りｏ　−ンＰＢＬ　−１１およびＰＥＬ−５の５’Ｎ
ｏｔｌ−Ｅｉｎｃ　Ｉｆ断片を別々にりｏ　−７ＰＢｌ
、−１ｆ）　３　’ＭｉｎＧｌ　−ＢａｍＥ　ｉ末端に
連結させ、そして実施例８に記載のＮｏｔｌとＢｇｌｍ
で切断したｐＣＡＶ／ＮＯＴ発現ベクターにサブクロー
ニングした。ＰＢＬ−１１／ＰＢＬ−１およびＰＢＬ−
５／ＰＢＬ−ＩＤＮＡ配列を含むこれらのキメラヒトＩ
Ｌ−４ＲｃＤＮＡは、実施例１２で詳述するように、そ
れぞれクローンＡ５およびＢ４と名つけられた。これら
の構築物はＣＯ５−７細胞にトランスフェクションし、
実質的ＫＳｉｎｓ　ａｔ　ａｌ、（Ｓｃｉｅｎｃｅ　　
２４１：５８Ｌ１９８８）に記載されるようなプレート
結合検定でＩＬ−４Ｍ合について分析した。両方の複合
構築物はＩＬ−４結合活性を示すタンパク質をコードし
ていた。複合Ａ５構築物のヌクレオチド配列および推定
上のアミノ酸配列は第４Ａ〜４Ｃ図に示した配列情報に
一致するが、ただしＧＴＣコドンが５０位のＩｌｍの代
わりＫＶａｌをコードする。塩基配列の決定を行った他
のクローンにはこの変更が見られなかった。クローンＰ
ＢＬ−１、ＰＥＬ−５およびＴ２２−８からのコンセン
サスコドンはｔｒｃであって、第４Ａ図に示すようにＩ
Ｉｇ”をコードする。複合Ｂ４構築物のヌクレオチド配
列および推定上のアミノ酸配列もまた、ＰＢＬ−Ｌｌの
２５個の７ミノ醗から成るリーダー配列が次の配列：Ｍ
ｅ　ｔ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｓ−ＯＸｙ−Ａｎによって置き換えられてい
ることを示す。

可溶性形態のと）ＩＬ−４レセプターを発現する構築物
は、ＰＢＬ−５から５′宋端（００，８ｋｂ　　５ｔｎ
ａ１−Ｄｒａ’ｆｆＪ断片を、そしてＰＢＬ−１１から
対応する０、８　ｋｂ　　Ａｓｐ７１８−ＤｒＧｍ断片
を、それぞれ切り出し、Ｄｒα■突出部分を１４ポリメ
ラーゼで平滑末端とすることにより作った。ＰＢＬ−５
およびＰＢＬ−１１断片は別々に、Ｓ惰α■またはＡＢ
ｐ７１８＋Ｓ慣ａｌでそれぞれ切断したＣＡＶ／ＮＯＴ
にサブクローニングした；これらはそれぞれ可溶性ｈｌ
Ｌ−４Ｒ−５および可溶性ルＩＬ−４Ｒ−１１と呼ばれ
る。両方の構築物とも、最後のＩＬ−４レセプターアミ
ノＷ１．Ｔｔ＊−ｇａコドンの後で、しかも終結コド／
の前に、ベクターによりコードされるアミノ酸：　Ｇｌ
ｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｇｓ　Ｇｉｎ　Ｉｒｅ
　ＴｙｒＡｌＧＩｒｍが存在する。

ＣＤ４＋／ＣＤＢ−ヒト細胞クローン、Ｔ２２、（Ａｃ
ｒｅｓ　　ａｔ　　ａｌ、Ｊ、Ｉｎｗｎｓｎｏｌ、　　
　１３８：２ｉ３２゜１９８７）から作製した第二のラ
イブラリーは、上記のように合成した２つの異なるプロ
ーブで（写し取ったフィルターを用いて）スクリーニン
グした。第一のプローブはクローンＦＢＩ、−１の５′
末端からの２２０ｂｐＰｖｓｎ断片より得られ、第二の
プローブはクローンＰＢＬ−１の３′末端からの３００
　ｂｐ　　ＰｒｏＨ−ＥｃｏＲ（断片より得られた。

５個の追加の０ＤＮＡクローンがこれら２つのブロ−ブ
を用いて同定された。これらのクローンの５ち２りは６
８　ｂｐ挿入物を含む５′領域へ延びているが、この挿
入物をどちらも含んでいない。これらのクローンの３番
目のもの、Ｔ２２−８、は大きさが約３．６ｋｂであり
、２５個のアミノ酸から成るリーダー配列、２０７個の
アミノ酸から成る成熟外部ドメイン、２４個のアミノ酸
から成るトランスメンプラン領域および５６９個のアミ
ノ酸から成る細胞質ドメインを含む、８２５個のアミノ
酸のオーブン・リーディング・フレームを含んでいた。

クローンＴ２２−８の配列は第４Ａ〜４Ｃ図に示す。第
５Ａおよび５Ｂ図は推定上のヒ）ＩＬ−４Ｒアミノ酸配
列と推定上のネズミＩＬ−４Ｒ配列とを比較するもので
あり、これら２種類のタンパク質問での約５３％の配列
同一性を示す。

第三の可溶性ヒトＩＬ−４レセプター構築物は次のよう
に作製した。ｃＤＮＡクローンＴ２２−８をＴｈｒｌ　
ｌ’　４コドン中のＩ）ｒα■部位で切断し、合成オリ
ゴヌクレオチドで修復してＴｈｒｌ＠４コドンおよび２
．、Ｓ１＠ゝコドン、後続の終結コドン、並びにＮｏｔ
■制限部位を生成させた。その後、このクローンの０．
６８　ｋｂ　　Ｓｌｙ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉ制限断片を５
ｔ１１部位で平滑末端となし、５ｒｎｔｚ　ｊ　−Ｎｏ
客Ｉで切断したｐＣＡＶ／ＮＯＴベクターにサックロー
ユングしだ。このｃＤＮＡ発現ベクターはルＩＬ−４Ｒ
−ｆ３と名づけだ。

平衡結合実験はＣＴＬＬｌ　９．４ライブラリーからの
ネズミＩＬ−４レセプタークローン１６および１８でト
ランスフェクションしたＣＯ５細胞に対して実施した。

すべての場合に、スカツチャード座標系（ａｃａｔｃｈ
ａｒｄ、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　５１：
６６０−６７２．１９４９）でのデータの分析は直線を
もたらし、ネズミＩＬ−４１Ｃ対する単一クラスの高親
和性レセプターを示した。ＣＯ５ｐＣＡＶ−１６ＭＪ胞
の場合、計算された見掛けにαは３．６ＸＩＱ”Ｍ″″
にであり、細胞あたりの特異的結合部位数は５．９Ｘ１
０５であった。同様の見掛けにα１．５ｘＩＱ”Ｍ−’
がＣＯ５ｐＣＡＶ−１８細胞に対して算出されたが、細
胞表面に発現されたレセプター数は４．２Ｘ１０５であ
った。７Ｂ９細胞ライブラリーから分離したＩＬ−４Ｒ
ＤＮＡクローンでトランスフェクションしたＣＯ５細胞
に対して実施した平衡結合実験もまた、ＩＬ−４へのレ
セプターの高親和性結合を示した。特に、ｐＣＡＶ−７
８９−２でトランスフェクションしたＣＯ５細胞を用い
た実験は、全長ネズミＩＬ−４レセプターが４２５７−
（（、−４に見掛けにα約１．４　Ｘ　１０１０Ｍ弓で
結合し、細胞あたりの特異的結合部位数が４．５Ｘ１０
５であることを証明した。ＣＡＶ−７Ｂ９−４　ＩＬ−
４Ｒの見掛けにαは約１．７　Ｘ　１０５　＃−１であ
ると算出された。

Ｋαの絶対値および細胞あたりの結合部位数はトランス
フェクション間で変化したが、結合親和性は一般に近似
しており（Ｉ　Ｘ　１０５−Ｉ　Ｘ　１０５Ａｆ−１）
、以前に発表されたＩＬ−４の結合親和性定数とよく合
致した。

プラスミドｐＣＡＶ、ｐｃＡ１’−１８またはｐＣＡＶ
−７８９−４でトランスフェクションしたＣＯ５細胞か
らのならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｔｎａｄｉ
ｘｍ　）によるＣＴＬＬ細胞への”’Ｉ−ｎｃｌＬ−４
結合の阻害は、これらのｃＤＮＡが機能的な可溶性レセ
プター分子をコードするのかどうかを調べるために用い
られた。最終検定容量１５０μｊ中のｃｏｓ　ｐｃｚ−
１８ならし培地約１．５μｅは、ＣＴＬＬ細胞上のＩＬ
−４レセプターへの”５ｌ−ＩＬ−４結合の約５０％凪
害を与える。”Ｉ−ＩＬ−４レセプターの競合活性は対
照のｐＣＡＶトランス７エク）ＣＯ５細胞上清において
検出されない。＋１１１！−７Ｌ−４結合を５０％阻書
するのに要するｐＣＡＶ−１８上清の希釈物の定量分析
から、約６０〜１００　ｎｆ／Ｈこの可ｆｆｓ性ＩＬ−
４レセプターが、トランスフェクションの３日後に回収
した場合、ＣＯ５細胞によって分泌されたと概算される
。同様の結果が、ＣＡＶ　−７Ｂ９−４でトランスフェ
クションしたＣＯ５細胞からの上清を用いても得られた
。

ｐＣＡＶ　−１８またはｐＣＡＴ’−７Ｂ９−４　（実
施例８参ｍ）でトランスフェクションを行い、３％ＦＢ
Ｓを含むＤＭＥＭ中で増殖させたｃｏｓ　ａ胞からのな
らし培地はトランスフェクション後３日目に回収した。

上清は３０００　ｃｐｓで１０分遠心し、使用するまで
凍結保存した。ならし培地２００Ｍは、上記のように調
製１．たｍ５ｌＬ−４ＡｌＩ３（１ｇ’４１を含むカラ
ムにかけた。カラムをＰＢＳで十分に洗い、ＩＬ−４レ
セプターを０．１　Ｍグリシン、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ
ＣｐＨ３，０）　で溶出した。ｌｊ直後に、試料をＩＭ
ヘペス（ｐＨ７，４）で中和した。

試料は実施例ＩＢで説明したようにＣＴＬＬ細胞への１
２″Ｉ−ｔｎｕｌＬ−４の結合を阻害するそれらの能力
について試験した。さらに、試料は先に述べたようなＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上での分析および銀染色により純度につ
いて調べた。機能的な可溶性レセプターの活性またはＩ
Ｌ−４結合の阻害を試験する他の方法には、実施例ＩＣ
に記載したような固相結合検定、または放射性ヨウ素化
されたあるいは比色定量用に開発されたＩＬ−４の結合
を利用するＲＪＡまたはＥＬＩＳＡのような無細胞検定
が含まれる。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥで還元条件下に分析したタンパク質は
約３７５００の分子量を有Ｉ、、ゲルの銀染色分析によ
り約９０％の純度であると思われる。

精製した組換え可溶性ネズミＩＬ−４レセプタータンパ
ク質は、ＣＴＬＬ細胞内へのＩＬ−４誘導ｓＨ−チミジ
ン取込みを阻害するその能力についても試験することが
できる。このような方法によって、可溶性ＩＬ−４レセ
プターはＩＬ−４で刺激される増殖を阻止することが判
明したが、ＩＬ−２によって誘起されるマイトジエ／応
答には影響を及はさないＯ 分子量の概算はＣＯ５細胞にトランスフェクションサし
たｍ　Ｉ　Ｌ　−４レセプタークローンについて行った
。ネズミＣＴＬＬ　１９．４細胞に対して作られたＭ２
モノクローナル抗体（実施例１３参照）を用いて、ＣＡ
Ｖ　−１６、ＣＡＶ−７８９−２およびＣＡＶ−７Ｂ９
−４でト２ンスフエクショ／し、その後３５５−システ
インおよび５ｓＳ−メチオニンで標識したＣＯ５細胞か
らＩＬ−４レセプターを免疫沈降させた。ＣＡＶ−７Ｅ
　９−４からの細胞関連レセプターは３２〜３９　ｋＤ
ａ　の範囲の分子量不均一性を示す。分泌されたＣＡＶ
−７８９−４レセプターは３６〜４１　ｋＤａ　　の分
子量を有する。ＣＡＶ−１６トランスフエクトＣＯ５細
胞からの細胞関連レセプターは約４Ｃ〜４’ｌ　ｋＤａ
である。これはＰａｒｋ　　ａｔ　　ｃＬｌ、、Ｊ、Ｅ
ｚｐ、Ｍａｄ、　　１　６　６　　：　　４　７　６　
　ｅ１９８７；ムＣａｔ　ｌ　、Ｂｉｏｌ　、、、５ｓ
ｐＴ！１　、１２Ａ、　１９８８に開示された架橋実験
からの分子量概算値よりもはるかに小さい。ＣＯ５ＣＡ
Ｖ−７Ｂ９−２細胞関連レセプターの免疫沈降は、Ｐａ
ｒｋ　ａｔαｇ、、Ｊ４Ｃａｔｘ、Ｂｉｏに、、５ｓｐ
ｐｌ、Ｌ２Ａ、Ｌ９８８の概算値に類似した１３０〜１
４Ｃ　ｋＤａの分子量を示し、全長ＩＬ−４レセプター
であると見なされた。細胞関連ＣＡＶ−１６およびＣＡ
Ｖ−７Ｂ９−２　ＩＬ−４レセプターの同様の分子量概
算はまた、これらのｃＤＮＡでトランスフェクションし
たＣＯ５細胞への１１５１−ＩＬ＝４の架橋に基づいて
も行われた。個々のクローンの分子量の不均一性は幾分
かはグリコジル化のためであると考えられる。このデー
タは、ＤＮＡ塩基配列の解析と合わせて、７Ｂ９−２　
　ｃＤＮＡが全長細胞表面ＩＬ−４レセプターをコード
し、一方７Ｂ９−４およびクローン１８が両方とも可溶
性形態のネズミＩＬ−４レセプターを表すことを示唆し
【いる。

レセプターの性状決定実験もまたｈｌＬ−４Ｒ金含有現
プラスミドでトランスフェクションしたＣＯ５細胞を用
いて行った。２つのキメラヒトＩＬ−４Ｒ分子Ａ５およ
びＢ４（実施例１１に記載）をＣＯ５細胞にトランスフ
ェクションし、その後平衡結合実験を行った。ＣＯＳサ
ル細胞はそれ自体がｈＩＬ−４に結合可能なレセプター
を持っている；それ故に、ルＩＬ−４ＲｃＤＮＡでトラ
ンスフェクションされ、それを過剰発現するＣＯ５細胞
に対して行った結合計算値は、内因性サルＩＬ−４Ｒ分
子からのバックグラウンド結合を全結合から減じた値を
表す。ｈｌＬ−４Ｒ，４５でトランスフェクションされ
たＣＯＳ細胞は５．３Ｘ１０５のｈｌＬ−４結合部位を
有し、算出されたにαは３．４８Ｘ１０９　）ｄ−１で
あった。同様に、ＣＯ５細胞により発現されたｈｌＬ−
４ＲＥ４は３．９４　Ｘ　ｉＯ’　Ｍ−１の親和性でｌ
ｔｓ　１−ｈｌＬ　−４を結合し、３．２Ｘ１０５レセ
プター／細胞を示した。

ＣＯ５細胞により発現されたヒ）ＩＬ−４Ｒの分子量の
概算も行った。ｐ　ＣＡ　Ｖ　／　Ｎ　ＯＴ中のクロー
ンＡ５ｐたはＢ４でトランスフェクションしたＣＯ５細
胞は■Ｓ−システィン／メチオニンテ１１識し、その後
溶解した。ｈｌＬ−４結合Ａｙｓσ−ｌ■を用いて、（
実施例４に記載したように）この細胞溶解液からヒ）Ｉ
Ｌ−４Ｒをアフィニティー精製した。このアフィニティ
ー担体から溶出されたルＩＬ−４ＲＡ５およびＢ４はＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）：を約１４Ｃ，０００ダルトンで泳動
し、これは架橋によるｈｌＬ−４Ｒ分子量の従来の概算
値（Ｐａｒｋａｔ　ｃＬｌ、、Ｊ、Ｅｚｐ、Ｍａｄ、　
１６６　：　４７６　、１９８７　）、並びに本明細書
中で示した全長、ＩＩＬ−４Ｒの概算値とよく一致する
。

ネズミレセブター（クローン１８および７Ｂ９−４）の
場合と同様に、可溶性ヒ）　ＩＬ−４ＲｃＤＮＡはこれ
まで自然界に存在していなかったので、実施例１１に記
載したよ５Ｋｔて末端切断形態を構築した。ＣＯ５細胞
での発現後、上溝は可溶性ｈｌＬ−４Ｂ−１１および可
溶性ルＩＬ−４Ｒ−５でトランスフェクション後３臼目
に回収して、ヒトＢ細胞系列Ｒａｊイへのｔｔｓ　１−
ｈＩＬ−４結合の阻害について試験した。可溶性ｈｌＬ
−４Ｒ−１１でトランスフェクションしたプレートのう
ち２つからの上清と、可溶性ＡＩＺ、−，ｌ−５でトラ
ンスフェクションしたプレートのうち１つからの上清は
２９〜１４９　ｎｙ／１ｌＩｔのＩＬ−４Ｒ競合活性を
培地中に含んでいた。さらに、末端切断タンパク質はｈ
ｌＬ−４結合’ｆｆｉＵｇｌ■でのアフィニティー精製
により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約４４　ｋＤａタンパク質
として　５ｓ５−メチオニン／システィン標識トランス
フェクトＣＯ５細胞においても検出することができた。

ｈｒＬ−４Ｒ−８（可溶性末端切断ＩＬ−４Ｒをコード
するンでトランスフェクションされたＣＯ５細胞からの
上溝は、２５倍に濃縮したとき、Ｒａｊｉ細胞へのヒト
／Ｌ−４結合を阻害し、約１６　ｎｙ／ｘｔｌの競合活
性を含んでいた。

精製された組換えＩＬ＝４レセプター（例えば、ヒトま
たはネズミＩＬ−４レセプター）、高レベルのＩＬ−４
レセプターを発現するトランスフェクトＣＯＳ細胞、ま
たはＣＴＬＬｌ　９．４細胞の調製物は、米国特許第４
４１１９９３号に記載されるような慣用技法を用いて、
ＩＬ−４レセプターに対するモノクローナル抗体なつ（
るために用いられる。この種の抗体はＩＬ−４レセプタ
ーへのＩＬ−４の結合を妨げるのに有用であり、例えば
ＩＬ−４の有毒なまたは他の望ましくない作用を改善す
るのに有用であるだろう。

ラットを免疫するために％ＩＬ−４レセプターを保有す
るＣＴＬＬｌ　９．４細胞は完全フロインドアジュバン
ト中に乳化して免疫原として使用し、１０〜１００μｊ
の量でＬｍｗｚｉｓラットに皮下注射した。

３週間後、免疫した動物は不完全フロインドアジュバン
ト中に乳化した追加の免疫原で二次免疫を施し、その後
３週間ごとに追加免疫を施した。血清試料はドツト−プ
ロット検定、ＥＬＩＳＡ　（酵素結合免疫吸着検定）、
またはＣＴＬＬ細胞抽出物へのｉｔゝＩ−ＩＬ−４の結
合阻害（実施例１に記載）Ｋより調べるために、眼窩後
の出血または足先端部の切除により定期的に採血する。

他の検定法も適している。適当な抗体価の検出後、陽性
動物には最後に食塩液中の抗原を静脈注射した。３〜４
日後、動物を殺滅し、肺細胞を採゛取し、そしてネズミ
黒色朧細胞系列ＡＧ８６５３に融合させた。この方法に
より得られたハイブリドーマ細胞系列は多重マイ・クロ
タイタープレート中の非融合細胞、黒色型細胞ハイブリ
ッドおよび牌細胞ハイ°ブリッドの増殖を阻止するＳＡ
Ｔ選択培地（ヒボキサンチン、アミノプテリン、および
チミジン）Ｋまいた。

このようにして得られたハイブリドーマクローンはＩＬ
−４レセプターとの反応性についてスクリーニングした
。ハイブリドーマ上清の初期スクリーニングは部分精製
した１２ｓＩ−ＩＩｓＩＬ−４レセプターの抗体捕獲・
結合を利用したものであった。スクリーニングした４Ｃ
０個以上のハイブリドーマのうち２個がこの方法で陽性
であった。これら２つのモノクローナル抗体、＆１およ
びＭ２、は阻止抗体を検出する抗体捕獲の変法により試
験した。

Ｍｌのみが完全なＣＴＬＬ細胞への”　Ｉ　−ｒｍ、Ｉ
Ｌ　−４結合を阻止することができた。両方の抗体はＩ
Ｌ−４Ｒクローンでトランスフェクションされ、５１Ｓ
−システィン／メチオニンで標識されたＣＯ５−７細胞
またはＣＴＬＬ細胞からの天然ｍＩＬ−４Ｂタンパク質
を免疫沈降させることができる。その後、ＭｌおよびＭ
２はヌードマウスの腹腔内に注入し、高濃度（＞　１１
ｎ９／ｍｊ　）　ノ抗ＩＬ−４Ｒ％ツクローナル抗体を
含む腹水を生じさせた。得られたモノクローナル抗体は
硫安沈殿とその後のゲル排除クロマトグラフィー、およ
び／またはプロティンＧに対する抗体の結合に基づいた
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

実験は腋窩リンパ節検定を用いてｉｎ　ｖｉｖｏでの同
種異系宿主対移植片（ＢＶＧ）応答に対する可溶性ＩＬ
−４Ｈの影響を調べるために行った。このモデルでは、
マウスの足裏のふくらみ（ｆｏｏｔｐａｄ　）に、照射
した同種異系の牌細胞を注入する。その後、反対側の足
裏に、照射した同種同系細胞を注入する。同種異系細胞
を受容する足裏にはアロ反応性応答（ａｌｌｏｒｍａｃ
ｔｉｖｅｌｒｅｓｐｏｎｓｅ）が起こりｔこの応答の度
合は抗原沈着部位から排出される膝窩リンパ節の大きさ
および重さの相対的増加により測定することができる。

０白目に、３匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの足裏のふ
（らみにｃ５７ＢＬ／６マウス由来の照射した同種異系
細胞を注入し、反対側の足裏に照射した同種同系牌細胞
を注入した。−１日月、０白目および＋１日１に、３匹
のマウスにリン酸緩衝溶液中の精製可溶性ＩＬ−４Ｒ（
ａｌＬ−４Ｒ）　１００　ｎｙを（−１日月とＯ８目に
は静脈に、＋１日１には皮下に）注射し、３匹のマウス
に５ｌＬ−４Ｒ１μ？を静脈注射し、３匹のマウスに５
ｌＬ−４Ｒ２μＶを注射し、そして３匹のマウスにＭＳ
Ａ（対照）を注射した。同種異系および同種同系牌細胞
の部位からのリンパ節の重さの平均差は、ＭＳＡ処置マ
ウスの場合が約２．５■、５ｌＬ−４Ｒ１００ｎｙで処
置したマウスの場合が１１９、そして５ｌＬ−４Ｒ１μ
？で処置したマウスの場合が０．５１！１９テあった。

８ＩＬ−４Ｒ２Ａｆで処置したマウスの場合には、リン
パ節の重さの検出可能な差を確認できなかった。こ５し
て、ＩＬ−４Ｒは対照マウスに対して用量依存の関係で
ｉｎνｉｗｏ　ＩＪンパ節増殖応答を有意に（両側Ｔテ
ストを用いて、すべてのグループにおいて、ｐ＜０．５
）抑制した。

【図面の簡単な説明】

第１図はネズミおよびヒ）ＩＬ−４ＲｃＤＮＡのコード
領域（黒の太線で示す）を含むｃＤＮＡクローンの制限
地図を示す。 第２Ａ−Ｃ図は、７Ｂ９ライブラリーのクローン７Ｂ９
−２から誘導されるような、ネズミＩＬ−４レセプター
のコード領域のｃＤＩｉＡ配列および推定アミノ酸配列
を示す配列図である。 第３図は哺乳動物高度発現プラスミドｐＣＡＶ／ＮＯＴ
の模式図である。 第４Ａ−Ｃ図は、ｒａ胞系列Ｔ２２から誘導された。　
ＤＩＶＡライブラリーより得られた、クローンＴ２２−
８からのヒトＩＬ−４レセプターｃＤＮＡのコード配列
を示す配列図である。 第５Ａ、Ｂ図はヒト（上段）とネズミ（下段）のＩＬ−
４レセプター、ＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列を示
す配列図である。 （外４名） ＄タ　急δ　ｇ、：　　、＝　　１屑　８ご　ミ粥　定
寞８＄　に３８ｋ　層だ　ｉ≧　８社　１ｎ　６０ｕｅ
ｙ＋　　（Ｊｌｌ＋　　！−１＞　　ｏｐ　　Ｌｌ−ｏ
＞　　Ｅ−１０ｏｐ　　＜ｏ　　ぺａＩ−ＩＣＪＰ４　
　（り、−１　　＜ｓ　　ｈ旬　Ｏ−〇−べ−ＣＪＬＩ
　　ＣＪｕ＜　　　ａ＜　　　（！＋（！ｌ　　　Ｇｌ
！ｌ　　　（り＞　　　ｏｏ　　　ｕ〜　　ＯＱ　　Ｑ
山　　００コ　　＜ｊ陶　　Ｃ５ロ　　ペ飄　　ト−の
り　　０へ　　の切　　０−　　〇Ｅ−４ａｔ　　ｕａ
Ｊ＜ｓ　　ｏ＋　　ｕ−ベ一　ベＩｌｌ　　Ｃ！＞１−
１　　ｕｓ　　６４Ｃ−　←ＣＱ　　（Ｊ（り　　Ｃり
（り　　Ｃりべ　ＱＱ　Ｏベ　ベベ　トψ　ぺ？シ　？
１　定只　ご会　赳諺　ゴ月　８シ　足片　８駈　足＜
Ｈ（ａ＞　　　（！１（ａｕ〜　　べψ　　ＣＱ　　の
の　　のべ　　べの　　の（ａ（：　　Ｃｏｏ　　（り
−１ＣＪＯｏｈ　　ｏ＞　　Ｅ−１０ｏｐ　　ｕｈ　　
Ｃ５ＡＨＦ４（ＪＬＩ　　Ｅ−１１＋１　　ｕｕ　　ｃ
ａａ＋　　（ａ，−４ｕｈ　　Ｅ−１Φ　０Φ　べＣＪ
Ｃ：）　　（Ｊ１１１＋　　Ｌ）＞　　（ＪＯ４ぺの　
Ｌ）Ｃ５ｏ〜　０−−の　ＱＧ：ｊ　　　Ｃ）句　　Ｑ
−ト為　　Ｑ喝　　トー　　０リ　　べｈ　　ぺ０　　
べくＦ−１ｕ＋　　Ｌ）Ｆ−１（ａ１−１（Ｊｌ−１ｏ
ｓ　　ａ諷　Ｃ３Ｆ４　　（Ｊｌ−Ｉ　　！−１ｃりの
　　ｖ＜　　　ａ＜　　　ａｕ　　　ａ＜　　　べＣＱ
　　　Ｅ４ＣＪ　　　Ｌ）の　　（Ｊｌｌｂ　　　（Ｊ
ｃ５ｐ　　　ｈｅ　　　ｏａ　　　の句　　υΦ　　の
＞ＣＪ　口ａ　　　００　　　Ｇ（：　　　ｅ）く−ぺ
−Ｐ−＋　べＨ０−ト淵　０−　べの　υ−ペ一　ベ（
りＣ！ｌ　　　ｕ：ａ　　　（ＪＣ！ｌ　　　Ｃ５べ　
　）ＩＱＩ　　　Ｃ！ｌ（り　　　（りべ　　（Ｊｌｌ
＋　　　ＣＪＬ）　　　Ｃ■ Ｃ８淀只　ミミ　拐箒　８二　赳ス　乏二　ｇ’；；　
　８ｉＥ　　Ｘ（ＪＱＩ　　　υＣ５［−４−べの　　
Ｑべ　　）１（Ｊ　　　（Ｊの　　Ｑ〉　　Ｑ山　　０
番と５１基コｕｕ目眠りぶ包

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳動物ＩＬ−４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）をコー
   ドする単離されたＤＮＡ配列。 ２、原核または真核生物宿主発現のポリペプチド産物で
   あり、哺乳動物ＩＬ−４Ｒの一次構造コンホメーシヨン
   の全部または一部を有し且つ哺乳動物ＩＬ−４Ｒの生物
   学的活性を保有する該ポリペプチド産物をコードする単
   離されたＤＮＡ配列。 ３、（ａ）天然哺乳動物ＩＬ−４Ｒ遺伝子のコード領域
   から誘導されるヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクロ
   ーン； （ｂ）適度のストリンジェント条件下で（ａ）のクロー
   ンとハイブリダイズすることができ且つ生物学的に活性
   なＩＬ−４ＲをコードするＤＮＡ配列；および （ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）および（ｂ）に定
   めるＤＮＡ配列に対し縮重の関係にあり且つ生物学的に
   活性なＩＬ−４ＲをコードするＤＮＡ配列より成る群か
   ら選ばれる、請求項１記載のＤＮＡ配列。 ４、第４Ａ図に示すアミノ酸残基１−２０７の配列の全
   部または一部に実質的に類似したアミノ酸配列をコード
   する、請求項１記載のＤＮＡ配列。 ５、第４Ａ図に示すアミノ酸残基１−２０７の配列の全
   部または一部に実質的に同一であるアミノ酸配列をコー
   ドする、請求項４記載のＤＮＡ配列。 ６、請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含む
   組換え発現ベクター。 ７、請求項６記載のベクターを含む適当な宿主細胞を発
   現促進条件下で培養することから成る、哺乳動物ＩＬ−
   ４レセプターまたはその類縁体の生産方法。 ８、請求項６記載のベクターを含む適当な宿主細胞を発
   現促進条件下で培養することから成る、ヒトＩＬ−４レ
   セプターまたはその類縁体の生産方法。 ９、細胞あたり１０＾４以上の表面ＩＬ−４レセプター
   を発現する真核細胞集団。 １０、細胞あたり１０＾５以上の表面ＩＬ−４レセプタ
   ーを発現する、請求項９記載の真核細胞集団。 １１、均質で生物学的に活性な哺乳動物ＩＬ−４レセプ
   ター組成物。 １２、本質的にネズミＩＬ−４レセプターから成る、請
   求項１１記載の均質で生物学的に活性な哺乳動物ＩＬ−
   ４レセプター組成物。 １３、本質的にヒトＩＬ−４レセプターから成る、請求
   項１１記載の均質で生物学的に活性な哺乳動物ＩＬ−４
   レセプター組成物。 １４、ＩＬ−４レセプターはＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分
   子量約１１０，０００〜１５０，０００Ｍｒおよびヒト
   ＩＬ−４に対する結合親和性（Ｋａ）約１〜８×１０＾
   ９Ｍ＾−＾１を有する糖タンパク質の形態である、請求
   項１３記載のヒトＩＬ−４レセプター組成物。 １５、ＩＬ−４レセプターは次のＮ末端アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を有する、請求項１４記載のヒトＩＬ−４レセプター組
   成物。 １６、天然レセプターのトランスメンプラン領域および
   細胞質ドメインが欠失されている、請求項１３記載のヒ
   トＩＬ−４レセプター組成物。 １７、第４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ図に示すアミノ酸残基１
   −８００の配列の全部または一部に約８０％以上類似し
   ている、請求項１３記載のヒトＩＬ−４レセプター組成
   物。 １８、第４Ａ図に示すアミノ酸残基１−２０７の配列の
   全部または一部に約８０％以上類似している、請求項１
   ３記載のヒトＩＬ−４レセプター組成物。 １９、有効量の請求項１１記載の組成物および適当な希
   釈剤または担体を含有する、哺乳動物における免疫反応
   を調節するための組成物。 ２０、少なくとも約０．０１ナノモルＩＬ−４／ナノモ
   ルＩＬ−４レセプターの特異的結合活性を有する、請求
   項１９記載の組成物。 ２１、ヒトＩＬ−４に対する結合親和性（Ｋａ）約１〜
   ８×１０＾９Ｍ＾−＾１および次のＮ末端アミノ酸配列
   ：【遺伝子配列があります】 を有する糖タンパク質の形態をしたヒトＩＬ−４レセプ
   ターを含む実質的に均質なタンパク質組成物から本質的
   に成る、請求項１９記載の組成物。 ２２、ＩＬ−４レセプターはニトロセルロースに固定し
   たときＩＬ−４結合活性を保持することができる、請求
   項１１記載の均質で生物学的に活性なＩＬ−４レセプタ
   ー組成物。 ２３、請求項１９記載のタンパク質組成物を使用するこ
   とから成る、ＩＬ−４またはＩＬ−４レセプター分子、
   もしくはこれらの相互作用を検出するための検定法。 ２４、哺乳動物ＩＬ−４レセプターと免疫反応性である
   抗体。 ２５、ヒトまたは動物の医薬として用いられる哺乳動物
   ＩＬ−４レセプター。 ２６、哺乳動物における免疫反応を調節する医薬を製造
   するためのＩＬ−４レセプターの使用。 ２７、ＩＬ−４レセプターはヒトＩＬ−４レセプターで
   あり、処置すべき哺乳動物はヒトである、請求項２６記
   載の使用。