JPH06233690A - Ｄ−α−アミノ酸の製造法 - Google Patents
Ｄ−α−アミノ酸の製造法Info
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- JPH06233690A JPH06233690A JP5249167A JP24916793A JPH06233690A JP H06233690 A JPH06233690 A JP H06233690A JP 5249167 A JP5249167 A JP 5249167A JP 24916793 A JP24916793 A JP 24916793A JP H06233690 A JPH06233690 A JP H06233690A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 一般式：
【化１】
［式中、Ｒはフエニル基、水酸基で置換されたフエニル
基、置換または未置換アルキル基、もしくはチエニル基
を示す。］で表わされるＮ−カルバミル−Ｄ−α−アミ
ノ酸に、水性媒体中で、微生物の産生する酵素を作用さ
せ、一般式： 【化２】 ［式中、Ｒは前記と同意義である。］で表わされるＤ−
α−アミノ酸を製造する方法において、Ｎ−カルバミル
−Ｄ−α−アミノ酸をＤ−α−アミノ酸に変換する酵素
デカルバミラーゼとして、コマモナス属、ブラストバク
ター属、アルカリゲネス属、スポロサルシナ属、リゾビ
ウム属、ブラディリゾビウム属またはアルスロバクター
属に属する微生物が産生することのできる酵素を用い
る。 【効果】 中性ないしアルカリ性においてＮ−カルバミ
ル−Ｄ−α−アミノ酸からＤ−α−アミノ酸を製造する
ことができる。
基、置換または未置換アルキル基、もしくはチエニル基
を示す。］で表わされるＮ−カルバミル−Ｄ−α−アミ
ノ酸に、水性媒体中で、微生物の産生する酵素を作用さ
せ、一般式： 【化２】 ［式中、Ｒは前記と同意義である。］で表わされるＤ−
α−アミノ酸を製造する方法において、Ｎ−カルバミル
−Ｄ−α−アミノ酸をＤ−α−アミノ酸に変換する酵素
デカルバミラーゼとして、コマモナス属、ブラストバク
ター属、アルカリゲネス属、スポロサルシナ属、リゾビ
ウム属、ブラディリゾビウム属またはアルスロバクター
属に属する微生物が産生することのできる酵素を用い
る。 【効果】 中性ないしアルカリ性においてＮ−カルバミ
ル−Ｄ−α−アミノ酸からＤ−α−アミノ酸を製造する
ことができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般式：
【化６】 ［式中、Ｒはフエニル基、水酸基で置換されたフエニル
基、置換または未置換の、好ましくは炭素数１〜５のア
ルキル基またはチエニル基を示す。］で表わされるＤ−
Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸に、カルバミル基を除去
する能力を有する酵素（以下、「デカルバミラーゼ」と
言う。）を作用させ、一般式:
基、置換または未置換の、好ましくは炭素数１〜５のア
ルキル基またはチエニル基を示す。］で表わされるＤ−
Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸に、カルバミル基を除去
する能力を有する酵素（以下、「デカルバミラーゼ」と
言う。）を作用させ、一般式:
【化７】 ［式中、Ｒは前記と同意義である。］で表わされるＤ−
α−アミノ酸を製造する方法に関する。
α−アミノ酸を製造する方法に関する。
【０００２】このような光学活性なＤ−α−アミノ酸類
は、医薬中間体として重要な化合物であり、特に半合成
ペニシリン、半合成セファロスポリンの製造中間体とし
ての、Ｄ−フェニルグリシンやＤ−(４−ヒドロキシフ
ェニル)グリシン（以下、「Ｄ−ＨＰＧ」と言う。）等が
工業的に有用な化合物として挙げられる。
は、医薬中間体として重要な化合物であり、特に半合成
ペニシリン、半合成セファロスポリンの製造中間体とし
ての、Ｄ−フェニルグリシンやＤ−(４−ヒドロキシフ
ェニル)グリシン（以下、「Ｄ−ＨＰＧ」と言う。）等が
工業的に有用な化合物として挙げられる。
【０００３】
【従来の技術】Ｄ−α−アミノ酸類の製造法としては、
対応するＤ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸類のカルバ
ミル基を除去して、これを得る方法が知られており、こ
の際のカルバミル基の除去は、化学的方法（特公昭５８
−４７０７号公報参照）や微生物の酵素反応を利用する
方法（特公昭５７−１８７９３号公報、特公昭６３−２
０５２０号公報および特公平１−４８７５８号公報参
照）によって行われている。
対応するＤ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸類のカルバ
ミル基を除去して、これを得る方法が知られており、こ
の際のカルバミル基の除去は、化学的方法（特公昭５８
−４７０７号公報参照）や微生物の酵素反応を利用する
方法（特公昭５７−１８７９３号公報、特公昭６３−２
０５２０号公報および特公平１−４８７５８号公報参
照）によって行われている。
【０００４】しかし、これらの微生物の酵素は、中性付
近に至適pＨをもつものが多い。Ｄ−α−アミノ酸に対
応するＤＬ−５−置換ヒダントインを、酵素の作用によ
りＤ−体を選択的に加水分解してＮ−カルバミル−Ｄ−
α−アミノ酸を得、続いてデカルバミラーゼを作用させ
てＤ−α−アミノ酸を得る反応では、第１段階のヒダン
トイン水解酵素の至適pＨがpＨ８〜９にあるため、第２
段階のデカルバミラーゼとは異なる反応系で行う必要が
あった。
近に至適pＨをもつものが多い。Ｄ−α−アミノ酸に対
応するＤＬ−５−置換ヒダントインを、酵素の作用によ
りＤ−体を選択的に加水分解してＮ−カルバミル−Ｄ−
α−アミノ酸を得、続いてデカルバミラーゼを作用させ
てＤ−α−アミノ酸を得る反応では、第１段階のヒダン
トイン水解酵素の至適pＨがpＨ８〜９にあるため、第２
段階のデカルバミラーゼとは異なる反応系で行う必要が
あった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、Ｄ−Ｎ
−カルバミル−α−アミノ酸類に作用して酵素的にカル
バミル基を除去してＤ−α−アミノ酸類に変換させる
（以下、「脱カルバミル」と言う。）能力を有する微生
物について、従来デカルバミラーゼの存在が知られてい
ない属を中心に種々検討した結果、コマモナス（Ｃomam
onas）属、ブラストバクター（Ｂlastobacter）属、ア
ルカリゲネス（Ａlcaligenes）属、スポロサルシナ（Ｓ
porosarcina）属、リゾビウム（Ｒhizobium）属、ブラ
ディリゾビウム（Ｂradyrhizobium）属またはアルスロ
バクター（Ａrthrobacter）属に属する細菌類に脱カル
バミル活性が存在することを見い出し、本発明を完成す
るに至った。
−カルバミル−α−アミノ酸類に作用して酵素的にカル
バミル基を除去してＤ−α−アミノ酸類に変換させる
（以下、「脱カルバミル」と言う。）能力を有する微生
物について、従来デカルバミラーゼの存在が知られてい
ない属を中心に種々検討した結果、コマモナス（Ｃomam
onas）属、ブラストバクター（Ｂlastobacter）属、ア
ルカリゲネス（Ａlcaligenes）属、スポロサルシナ（Ｓ
porosarcina）属、リゾビウム（Ｒhizobium）属、ブラ
ディリゾビウム（Ｂradyrhizobium）属またはアルスロ
バクター（Ａrthrobacter）属に属する細菌類に脱カル
バミル活性が存在することを見い出し、本発明を完成す
るに至った。
【０００６】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、一
般式（Ｉ）：
般式（Ｉ）：
【化８】 ［式中、Ｒはフエニル基、水酸基で置換されたフエニル
基、置換または未置換の、好ましくは炭素数１〜５のア
ルキル基、もしくはチエニル基を示す。］で表わされる
Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸に、水性媒体中で、
微生物の産生する酵素を作用させ、一般式（II）：
基、置換または未置換の、好ましくは炭素数１〜５のア
ルキル基、もしくはチエニル基を示す。］で表わされる
Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸に、水性媒体中で、
微生物の産生する酵素を作用させ、一般式（II）：
【化９】 ［式中、Ｒは前記と同意義である。］で表わされるＤ−
α−アミノ酸を製造する方法において、Ｎ−カルバミル
−Ｄ−α−アミノ酸をＤ−α−アミノ酸に変換する酵素
デカルバミラーゼとして、コマモナス（Ｃomamonas）
属、ブラストバクター（Ｂlastobacter）属、アルカリ
ゲネス（Ａlcaligenes）属、スポロサルシナ（Ｓporosa
rcina）属、リゾビウム（Ｒhizobium）属、ブラディリ
ゾビウム（Ｂradyrhizobium）属またはアルスロバクタ
ー（Ａrthrobacter）属に属する微生物が産生すること
のできる酵素を用いることを特徴とするＤ−α−アミノ
酸の製造法を提供する。
α−アミノ酸を製造する方法において、Ｎ−カルバミル
−Ｄ−α−アミノ酸をＤ−α−アミノ酸に変換する酵素
デカルバミラーゼとして、コマモナス（Ｃomamonas）
属、ブラストバクター（Ｂlastobacter）属、アルカリ
ゲネス（Ａlcaligenes）属、スポロサルシナ（Ｓporosa
rcina）属、リゾビウム（Ｒhizobium）属、ブラディリ
ゾビウム（Ｂradyrhizobium）属またはアルスロバクタ
ー（Ａrthrobacter）属に属する微生物が産生すること
のできる酵素を用いることを特徴とするＤ−α−アミノ
酸の製造法を提供する。
【０００７】本発明で使用するデカルバミラーゼは、Ｄ
−異性体に特異的に作用するものであっても、Ｄ−体、
Ｌ−体いずれに作用する酵素であっても、実際上差し支
えない。なお、Ｄ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸に対
する立体選択性の厳しい酵素は、Ｄ−Ｎ−カルバミル−
α−アミノ酸アミドヒドロラーゼと呼ばれることがあ
る。
−異性体に特異的に作用するものであっても、Ｄ−体、
Ｌ−体いずれに作用する酵素であっても、実際上差し支
えない。なお、Ｄ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸に対
する立体選択性の厳しい酵素は、Ｄ−Ｎ−カルバミル−
α−アミノ酸アミドヒドロラーゼと呼ばれることがあ
る。
【０００８】これらの微生物の中で脱カルバミル活性が
比較的高い菌株としては、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１１号）、コマモナスsp．Ｅ２
０６a、コマモナスsp．Ｅ２１７a、ブラストバクターs
p．ＮＡ８８−b、ブラストバクターsp．Ａ１７p−４
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１０号）、アルカリゲネスsp．
Ｅ２１５（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４０９号）、アルカリゲ
ネス・キシロソキシダンスsubsp．デニトリフィカンス
（Ａlcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans）
ＣＬ６６−２ａ、スポロサルシナsp．ＮＣＡ２８−ｂ
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４０８号）、リゾビウムsp．ＫＮ
Ｋ１４１５（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１９号）、ブラディ
リゾビウム・ジャポニカム（Ｂradyrhizobium japonicu
m）ＩＦＯ１４７８３、ブラディリゾビウムsp．ＩＦＯ
１５００３、アルスロバクターsp．ＣＡ１７−２（ＦＥ
ＲＭＢｐ．第４４２０号）などがある。
比較的高い菌株としては、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１１号）、コマモナスsp．Ｅ２
０６a、コマモナスsp．Ｅ２１７a、ブラストバクターs
p．ＮＡ８８−b、ブラストバクターsp．Ａ１７p−４
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１０号）、アルカリゲネスsp．
Ｅ２１５（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４０９号）、アルカリゲ
ネス・キシロソキシダンスsubsp．デニトリフィカンス
（Ａlcaligenes xylosoxidans subsp. denitrificans）
ＣＬ６６−２ａ、スポロサルシナsp．ＮＣＡ２８−ｂ
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４０８号）、リゾビウムsp．ＫＮ
Ｋ１４１５（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１９号）、ブラディ
リゾビウム・ジャポニカム（Ｂradyrhizobium japonicu
m）ＩＦＯ１４７８３、ブラディリゾビウムsp．ＩＦＯ
１５００３、アルスロバクターsp．ＣＡ１７−２（ＦＥ
ＲＭＢｐ．第４４２０号）などがある。
【０００９】上記細菌の代表例として、コマモナスsp．
Ｅ２２２Ｃ、ブラストバクターsp．Ａ１７p−４、アル
カリゲネスsp．Ｅ２１５、スポロサルシナsp．ＮＣＡ２
８−b、リゾビウムsp．ＫＮＫ１４１５およびアルスロ
バクターsp．ＣＡ１７−２の菌学的性質を次に示す。
Ｅ２２２Ｃ、ブラストバクターsp．Ａ１７p−４、アル
カリゲネスsp．Ｅ２１５、スポロサルシナsp．ＮＣＡ２
８−b、リゾビウムsp．ＫＮＫ１４１５およびアルスロ
バクターsp．ＣＡ１７−２の菌学的性質を次に示す。
【００１０】コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ （a）形態的性質 ・桿菌（曲がっている） ・グラム染色性 バリアブル（Ｖariable） ・胞子の有無 なし ・コロニー形態 淡黄色、やや半透明、丸い、規則
的な、真円の、輝きのある、低い凸面の、滑らかな、直
径１mm（４８hr）
的な、真円の、輝きのある、低い凸面の、滑らかな、直
径１mm（４８hr）
【００１１】（b）生理学的性質 ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ − ・グルコース発酵性 − ・ＮＯ3還元性 − ・インドール生成 − ・グルコースからの酸生成 − ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・ウレアーゼ − ・エスクリン(Ａesculin)加水分解 − ・ゼラチン加水分解 − ・β−ガラクトシダーゼ − ・チトクロムオキシダーゼ ＋（弱い）
【００１２】（c）資化性 ・グルコース − ・アラビノース − ・マンノース − ・マンニトール − ・Ｎ−アセチル・グルコサミン − ・マルトース − ・グルコン酸 ＋ ・カプロン酸 ＋ ・アジピン酸 − ・リンゴ酸 ＋ ・クエン酸 ＋ ・フエニルアセテート ＋
【００１３】ブラストバクターsp．Ａ１７p−４ （a）形態的性質 ・桿菌（卵型） ・グラム染色性 陰性 ・胞子の有無 なし ・コロニー形態 白、やや半透明、丸い、規則的
な、真円の、輝きのある、低い凸面の、平滑な、ムコイ
ド生成、直径１．０〜１．５mm（４８hr）
な、真円の、輝きのある、低い凸面の、平滑な、ムコイ
ド生成、直径１．０〜１．５mm（４８hr）
【００１４】（b）生理学的性質 ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ ＋（弱い） ・グルコース発酵性 − ・ＮＯ3還元性 − ・インドール生成 − ・グルコースからの酸生成 − ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・ウレアーゼ ＋ ・エスクリン(Ａesculin)加水分解 ＋ ・ゼラチン加水分解 − ・β-ガラクトシダーゼ ＋ ・チトクロムオキシダーゼ ＋
【００１５】（c）資化性 ・グルコース ＋ ・アラビノース ＋ ・マンノース ＋ ・マンニトール ＋ ・Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ ・マルトース ＋ ・グルコン酸 − ・カプロン酸 − ・アジピン酸 − ・リンゴ酸 − ・クエン酸 − ・フエニルアセテート −
【００１６】アルカリゲネスsp．Ｅ２１５ （a）形態的性質 ・桿菌 ・グラム染色性 バリアブル（Ｖariable） ・胞子の有無 なし ・運動性 あり ・コロニー形態 淡黄色、やや半透明、丸い、規則
的な、真円の、低い凸面の、輝きのある、滑らかな、直
径１mm（４８hr）
的な、真円の、低い凸面の、輝きのある、滑らかな、直
径１mm（４８hr）
【００１７】（b）生理学的性質 ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ − ・グルコース醗酵性 −
【００１８】スポロサルシナsp．ＮＣＡ２８−b （a）形態的性質 ・球菌 ・グラム染色性 バリアブル（Ｖariable） ・胞子の有無 あり ・運動性 なし ・コロニー形態 丸い、規則的な、真円の、クリー
ム色又は白色、やや半透明、直径０．５mm以下（４８h
r） ・各温度での生育 ３７℃ − ４５℃ −
ム色又は白色、やや半透明、直径０．５mm以下（４８h
r） ・各温度での生育 ３７℃ − ４５℃ −
【００１９】（b）生理学的性質 ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ ＋ ・グルコース発酵性 −
【００２０】リゾビウムsp．ＫＮＫ−１４１５（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４４１９） （a）形態的性質 ・桿菌（やや棍棒状の短桿菌） ・グラム染色性 陰性 ・胞子の有無 なし ・ベン毛 極付近又は周生 ・コロニーの形態 やや黄色かかった白色、光沢のな
い、真円の、大きさのそろった滑らかな、やや凸面の、
直径５mm（５日）、ムコイド生成 ・各温度での成育 ３０℃ ＋ ３７℃ （±）
Ｍ ＢＰ−４４１９） （a）形態的性質 ・桿菌（やや棍棒状の短桿菌） ・グラム染色性 陰性 ・胞子の有無 なし ・ベン毛 極付近又は周生 ・コロニーの形態 やや黄色かかった白色、光沢のな
い、真円の、大きさのそろった滑らかな、やや凸面の、
直径５mm（５日）、ムコイド生成 ・各温度での成育 ３０℃ ＋ ３７℃ （±）
【００２１】（b）生理学的性質 ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ ＋ ・グルコース発酵性 − ・ＮＯ3還元性 ＋ ・インドール生成 − ・グルコースからの酸生成 − ・アルギニンデヒドロラーゼ − ・ウレアーゼ ＋ ・エスクリン(Aesculin)加水分解 ＋ ・ゼラチン加水分解 − ・β−ガラクトシダーゼ ＋ ・チトクロムオキシダーゼ ＋ ・３−ケトラクトース生成 − ・Ｈ2Ｓ生成 −
【００２２】（c）資化性 ・グルコース ＋ ・アラビノース ＋ ・マンノース ＋ ・マンニトール ＋ ・Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ ・マルトース ＋ ・グルコン酸 − ・カプロン酸 − ・アジピン酸 − ・リンゴ酸 ＋ ・クエン酸 − ・フェニルアセテート − ＧＣ含量 ６３.４％ キノン分析 Ｑ−１０ ９５.７％ Ｑ−９ ３.３％ Ｑ−１１ ０.６％ Ｑ−８ ０.４％ 菌体脂肪酸分析 （全菌体脂肪酸）成分名 面積比（％） ３−ＯＨ Ｃ１４：０ ４.６ Ｃ１６：１ ５.９ Ｃ１６：０ １４.０ ３−ＯＨ Ｃ１６：０ ０.１ Ｃ１８：１ ７０.７ Ｃ１８：０ ３.３ 不明 １.４ （３−ＯＨ脂肪酸）成分名 面積比（％） ３−ＯＨ Ｃ１４：０ ８８.８ ３−ＯＨ Ｃ１６：０ ６.６ ３−ＯＨ Ｃ１８：０ ４.６ （２−ＯＨ脂肪酸） 検出されず
【００２３】アルスロバクターsp．ＣＡ１７−２（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４４２０） （a）形態的性質 ・桿菌又は球菌 ・グラム染色性 陽性 ・胞子の有無 なし ・運動性 有り ・コロニー形態 やや黄色かかった白色、光沢のな
い、丸い、大きさのそろった、凸面の、滑らかな、直径
約０.５mm（２日） ・各温度での生育 ３０℃ ＋ ３７℃ （＋） ４５℃ −
ＲＭ ＢＰ−４４２０） （a）形態的性質 ・桿菌又は球菌 ・グラム染色性 陽性 ・胞子の有無 なし ・運動性 有り ・コロニー形態 やや黄色かかった白色、光沢のな
い、丸い、大きさのそろった、凸面の、滑らかな、直径
約０.５mm（２日） ・各温度での生育 ３０℃ ＋ ３７℃ （＋） ４５℃ −
【００２４】（b）生理学的性質 ・カタラーゼ ＋ ・オキシダーゼ − ・グルコース発酵性 − （c）化学分類学的分析 ・ペプチドグリカンのアミノ酸 Ｌ−Ｌysine ・ミコール酸 − ・脂肪酸組成 anteiso Ｃ15:0(12-メチルテトラデカ
ン酸) ５８％ iso Ｃ15:0(13-メチルテトラデカン酸）５.５％ iso Ｃ16:0(14-メチルペンタデカン酸）８％ anteiso Ｃ17:0(14-メチルヘキサデカン酸）２５％
ン酸) ５８％ iso Ｃ15:0(13-メチルテトラデカン酸）５.５％ iso Ｃ16:0(14-メチルペンタデカン酸）８％ anteiso Ｃ17:0(14-メチルヘキサデカン酸）２５％
【００２５】これらの脱カルバミル活性を示す酵素系
は、微生物を通常の方法で培養することにより調製する
ことができる。培養は、通常液体栄養培地で行われる
が、固体表面培養によっても行うことができる。培地に
は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物の生育に
必須の無機塩栄養素を含有させる。更にＤ−p−ヒドロ
キシフェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン等のＤ−
アミノ酸；Ｎ−カルバミル−ＤＬ−メチオニン、Ｎ−カ
ルバミル−Ｄ−フエニルアラニン等のＮ−カルバミル−
α−アミノ酸類；ＤＬ−５−p−ヒドロキシフェニルヒ
ダントイン、ＤＬ−５−フエニルヒダントイン等の５置
換ヒダントイン類；ウラシル、ジヒドロウラシル、β−
ウレイドプロピオン酸等のピリミジン代謝物；Ｆe2+、
Ｆe3+、Ｂe2+、Ｃo2+、Ａl3+、Ｌi+、Ｍn2+、Ｍg2+、Ｃ
s+等の金属イオン類；尿素などを少量添加してデカルバ
ミラーゼを増強蓄積させることが好ましい。これらデカ
ルバミラーゼ生産増強物質の培地中濃度は、金属イオン
類で０．１〜１０mＭ、その他の基質で０．０１〜１重
量％の範囲から選ばれる。
は、微生物を通常の方法で培養することにより調製する
ことができる。培養は、通常液体栄養培地で行われる
が、固体表面培養によっても行うことができる。培地に
は、通常資化し得る炭素源、窒素源、各微生物の生育に
必須の無機塩栄養素を含有させる。更にＤ−p−ヒドロ
キシフェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン等のＤ−
アミノ酸；Ｎ−カルバミル−ＤＬ−メチオニン、Ｎ−カ
ルバミル−Ｄ−フエニルアラニン等のＮ−カルバミル−
α−アミノ酸類；ＤＬ−５−p−ヒドロキシフェニルヒ
ダントイン、ＤＬ−５−フエニルヒダントイン等の５置
換ヒダントイン類；ウラシル、ジヒドロウラシル、β−
ウレイドプロピオン酸等のピリミジン代謝物；Ｆe2+、
Ｆe3+、Ｂe2+、Ｃo2+、Ａl3+、Ｌi+、Ｍn2+、Ｍg2+、Ｃ
s+等の金属イオン類；尿素などを少量添加してデカルバ
ミラーゼを増強蓄積させることが好ましい。これらデカ
ルバミラーゼ生産増強物質の培地中濃度は、金属イオン
類で０．１〜１０mＭ、その他の基質で０．０１〜１重
量％の範囲から選ばれる。
【００２６】培養時の温度としては２０〜８５℃の範
囲、pＨとしては４〜１１の範囲が用いられ、通気撹拌
によって微生物の生育を促進することもできる。
囲、pＨとしては４〜１１の範囲が用いられ、通気撹拌
によって微生物の生育を促進することもできる。
【００２７】Ｄ−Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸の脱カ
ルバミル反応においては、前記のようにして得ることの
できる微生物の培養液、菌体または菌体処理物を酵素源
として使用する。菌体は、生菌体のままで用い得ること
は勿論であるが、凍結乾燥菌体のような乾燥菌体、ま
た、菌体破砕物や菌体抽出物や、界面活性剤や超音波で
処理した菌体処理物を微生物酵素源として本発明の反応
に利用することができる。さらに、これら菌体の破砕
物、抽出物や処理物より酵素を精製または部分精製した
酵素または粗酵素の状態で使用することができる。ま
た、これら酵素または粗酵素を固定化し、固定化酵素と
して使用できる。固定化方法としては、例えば、国際特
許出願ＰＣＴ／ＪＰ９１／０１６９６の固定法が使用で
きる。
ルバミル反応においては、前記のようにして得ることの
できる微生物の培養液、菌体または菌体処理物を酵素源
として使用する。菌体は、生菌体のままで用い得ること
は勿論であるが、凍結乾燥菌体のような乾燥菌体、ま
た、菌体破砕物や菌体抽出物や、界面活性剤や超音波で
処理した菌体処理物を微生物酵素源として本発明の反応
に利用することができる。さらに、これら菌体の破砕
物、抽出物や処理物より酵素を精製または部分精製した
酵素または粗酵素の状態で使用することができる。ま
た、これら酵素または粗酵素を固定化し、固定化酵素と
して使用できる。固定化方法としては、例えば、国際特
許出願ＰＣＴ／ＪＰ９１／０１６９６の固定法が使用で
きる。
【００２８】さらに、これらの微生物から遺伝子操作に
より産生させた酵素も、基本的には該微生物の産生する
ことの出来る酵素と等価である。
より産生させた酵素も、基本的には該微生物の産生する
ことの出来る酵素と等価である。
【００２９】脱カルバミル反応は、水性媒体中で行わ
れ、そのpＨとしては６〜１１の範囲が用いられるが、
特に好ましくは、pＨ７〜９．５である。さらに、pＨ８
〜９に至適pＨを持つ酵素もある。脱カルバミル反応の
温度としては、通常２０〜８５℃の範囲が用いられる
が、使用する菌株の酵素系に適した温度が採用される。
れ、そのpＨとしては６〜１１の範囲が用いられるが、
特に好ましくは、pＨ７〜９．５である。さらに、pＨ８
〜９に至適pＨを持つ酵素もある。脱カルバミル反応の
温度としては、通常２０〜８５℃の範囲が用いられる
が、使用する菌株の酵素系に適した温度が採用される。
【００３０】本発明において、デカルバミラーゼの基質
となるＮ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸化合物の例と
しては、Ｄ−Ｎ−カルバミルアラニン、Ｄ−Ｎ−カルバ
ミルメチオニン、Ｄ−Ｎ−カルバミルバリン、Ｄ−Ｎ−
カルバミルロイシン、Ｄ−Ｎ−カルバミルフェニルグリ
シン、Ｄ−Ｎ−カルバミル−(４−ヒドロキシフェニル)
グリシン、Ｄ−Ｎ−カルバミル−(２−チエニル)グリシ
ン、Ｄ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンなどが挙げら
れる。一般式中のＲとしては、置換アルキル基の場合の
置換基としてはフェニル基、インドリル基、アルキルチ
オ基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基など
がある。
となるＮ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸化合物の例と
しては、Ｄ−Ｎ−カルバミルアラニン、Ｄ−Ｎ−カルバ
ミルメチオニン、Ｄ−Ｎ−カルバミルバリン、Ｄ−Ｎ−
カルバミルロイシン、Ｄ−Ｎ−カルバミルフェニルグリ
シン、Ｄ−Ｎ−カルバミル−(４−ヒドロキシフェニル)
グリシン、Ｄ−Ｎ−カルバミル−(２−チエニル)グリシ
ン、Ｄ−Ｎ−カルバミルフェニルアラニンなどが挙げら
れる。一般式中のＲとしては、置換アルキル基の場合の
置換基としてはフェニル基、インドリル基、アルキルチ
オ基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基など
がある。
【００３１】前述したような微生物酵素による脱カルバ
ミル反応によって生成したＤ−α−アミノ酸類の単離
は、濃縮、中和、イオン交換樹脂処理などの公知の方法
により行うことができる。すなわち、Ｄ−フェニルグリ
シン、Ｄ−(４−ヒドロキシフェニル)グリシン、Ｄ−ロ
イシンやＤ−フエニルアラニンなどの比較的疎水性のＤ
−α−アミノ酸類の場合は、酸性またはアルカリ性での
不溶物を除去後、濃縮、中和等により目的のＤ−α−ア
ミノ酸を沈澱として得ることができる。また、Ｄ−チエ
ニルグリシン、Ｄ−セリンやＤ−アラニンなどのように
比較的親水性である場合には、イオン交換樹脂により目
的物を吸着させ、これをアンモニア水等で溶出し、つい
で中和し濃縮することにより目的物を取得することがで
きる。
ミル反応によって生成したＤ−α−アミノ酸類の単離
は、濃縮、中和、イオン交換樹脂処理などの公知の方法
により行うことができる。すなわち、Ｄ−フェニルグリ
シン、Ｄ−(４−ヒドロキシフェニル)グリシン、Ｄ−ロ
イシンやＤ−フエニルアラニンなどの比較的疎水性のＤ
−α−アミノ酸類の場合は、酸性またはアルカリ性での
不溶物を除去後、濃縮、中和等により目的のＤ−α−ア
ミノ酸を沈澱として得ることができる。また、Ｄ−チエ
ニルグリシン、Ｄ−セリンやＤ−アラニンなどのように
比較的親水性である場合には、イオン交換樹脂により目
的物を吸着させ、これをアンモニア水等で溶出し、つい
で中和し濃縮することにより目的物を取得することがで
きる。
【００３２】ところで、これらデカルバミラーゼの基質
となるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸化合物は、多種の
種属の微生物の培養液、菌体、菌体処理物または菌体か
ら抽出した酵素を５−置換ヒダントイン類に作用させ
て、製造することができる。このような製造方法は、特
開昭５３−４４６９０号公報、特開昭５３−６９８８４
号公報、特開昭５３−９１１８９号公報、特開昭５３−
１３３６８８号公報、特開昭５４−８４０８６号公報お
よび特開昭５５−７００１号公報等に記述されている。
これらのＤ−カルバミル−α−アミノ酸類を、本発明の
方法によって対応する光学活性のＤ−α−アミノ酸類に
変換する。
となるＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸化合物は、多種の
種属の微生物の培養液、菌体、菌体処理物または菌体か
ら抽出した酵素を５−置換ヒダントイン類に作用させ
て、製造することができる。このような製造方法は、特
開昭５３−４４６９０号公報、特開昭５３−６９８８４
号公報、特開昭５３−９１１８９号公報、特開昭５３−
１３３６８８号公報、特開昭５４−８４０８６号公報お
よび特開昭５５−７００１号公報等に記述されている。
これらのＤ−カルバミル−α−アミノ酸類を、本発明の
方法によって対応する光学活性のＤ−α−アミノ酸類に
変換する。
【００３３】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
する。実施例１ 土壌試料（採取地名：日本各地より採取）を、２mlの培
地Ａ（１g／l ＫＨ2ＰＯ4、１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．
３g／l ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１g／l酵母エキス、
１g／l ＮＨ4Ｃl、１．５g／l 炭素源として用い以下
に記載の化合物（pＨ７．０））、または培地Ｂ（１g／
l ＫＨ2ＰＯ4、１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．３g／l Ｍg
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５g／lグルコース、０．１g／l酵
母エキス、１．５g／l窒素源として用いる以下に記載の
化合物（pＨ７．０））に接種し、２８℃で好気的に振
盪培養し、同様の培地に継植して微生物の増殖が認めら
れるまで培養した。その後、平板培地（２％寒天を含む
同様の培地）に広げ、２８℃で２〜６日培養して微生物
を分離した。
する。実施例１ 土壌試料（採取地名：日本各地より採取）を、２mlの培
地Ａ（１g／l ＫＨ2ＰＯ4、１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．
３g／l ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．１g／l酵母エキス、
１g／l ＮＨ4Ｃl、１．５g／l 炭素源として用い以下
に記載の化合物（pＨ７．０））、または培地Ｂ（１g／
l ＫＨ2ＰＯ4、１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．３g／l Ｍg
ＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５g／lグルコース、０．１g／l酵
母エキス、１．５g／l窒素源として用いる以下に記載の
化合物（pＨ７．０））に接種し、２８℃で好気的に振
盪培養し、同様の培地に継植して微生物の増殖が認めら
れるまで培養した。その後、平板培地（２％寒天を含む
同様の培地）に広げ、２８℃で２〜６日培養して微生物
を分離した。
【００３４】炭素源または窒素源として用いる化合物 Ｎ−カルバミル−Ｄ−p−ヒドロキシフェニルグリシン
(Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ) Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルグリシン(Ｃ−Ｄ−ＰＧ) Ｎ−カルバミル−Ｄ−アラニン(Ｃ−Ｄ−Ａla) ＤＬ−５−メチルヒダントイン(ＤＬ−Ａla−hyd) ＤＬ−５−フェニルヒダントイン(ＤＬ−ＰＧ−hyd) ＤＬ−５−p−ヒドロキシフェニルヒダントイン(ＤＬ−
ＨＰＧ−hyd) シトルリン フェニルウレア カルバミン酸−n−ブチルエステル
(Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ) Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェニルグリシン(Ｃ−Ｄ−ＰＧ) Ｎ−カルバミル−Ｄ−アラニン(Ｃ−Ｄ−Ａla) ＤＬ−５−メチルヒダントイン(ＤＬ−Ａla−hyd) ＤＬ−５−フェニルヒダントイン(ＤＬ−ＰＧ−hyd) ＤＬ−５−p−ヒドロキシフェニルヒダントイン(ＤＬ−
ＨＰＧ−hyd) シトルリン フェニルウレア カルバミン酸−n−ブチルエステル
【００３５】それぞれの平板培地上の株を１００μlの
反応液（３５mＭ Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ、２００mＭリン酸カ
リウム緩衝液（pＨ７．０）に懸濁し、２８℃で１〜３
日間反応させた後、薄層クロマトグラフィーによりカル
バミルＤ−ＨＰＧ及びＤ−ＨＰＧの分析を行なった。薄
層クロマトグラフィーは、メルク社製６０Ｆ254プレー
トを使用し、ブタノール:酢酸:水,３:３:１(v／v／v)で
展開し、紫外線ランプ(２５４nm)またはp−(ジメチルア
ミノ)シナムアルデヒドとニンヒドリンのスプレーによ
って検出した。その結果、１８６８株が上記の炭素源ま
たは窒素源化合物を資化する微生物として分離でき、そ
の内３７株がＤ−ＨＰＧを生産しており、その１６株が
良好なＤ−ＨＰＧ生産性（２mＭ以上のＤ−ＨＰＧを生
産）を示した。
反応液（３５mＭ Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ、２００mＭリン酸カ
リウム緩衝液（pＨ７．０）に懸濁し、２８℃で１〜３
日間反応させた後、薄層クロマトグラフィーによりカル
バミルＤ−ＨＰＧ及びＤ−ＨＰＧの分析を行なった。薄
層クロマトグラフィーは、メルク社製６０Ｆ254プレー
トを使用し、ブタノール:酢酸:水,３:３:１(v／v／v)で
展開し、紫外線ランプ(２５４nm)またはp−(ジメチルア
ミノ)シナムアルデヒドとニンヒドリンのスプレーによ
って検出した。その結果、１８６８株が上記の炭素源ま
たは窒素源化合物を資化する微生物として分離でき、そ
の内３７株がＤ−ＨＰＧを生産しており、その１６株が
良好なＤ−ＨＰＧ生産性（２mＭ以上のＤ−ＨＰＧを生
産）を示した。
【００３６】実施例２ 実施例１で得られた１６株のデカルバミラーゼ生産株に
ついては、２次スクリーニングの為に、１mlの培地Ｃ
（１．５g／l Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ、１g／l ＫＨ2ＰＯ4、
１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．３g／l ＭgＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、３g／l酵母エキス、３g／l肉エキス、１０g／lグ
リセロール、２g／lポリペプトン（pＨ７．０））によ
り、２８℃で３日間培養した。培養液１mlを遠心分離
し、菌体を実施例で使用したのと同じ反応液１００μl
に懸濁し、３０℃または５０℃で２４時間反応させて、
生成したＤ−ＨＰＧの定量を行なった。
ついては、２次スクリーニングの為に、１mlの培地Ｃ
（１．５g／l Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ、１g／l ＫＨ2ＰＯ4、
１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．３g／l ＭgＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、３g／l酵母エキス、３g／l肉エキス、１０g／lグ
リセロール、２g／lポリペプトン（pＨ７．０））によ
り、２８℃で３日間培養した。培養液１mlを遠心分離
し、菌体を実施例で使用したのと同じ反応液１００μl
に懸濁し、３０℃または５０℃で２４時間反応させて、
生成したＤ−ＨＰＧの定量を行なった。
【００３７】Ｄ−ＨＰＧの定量は、コスモシル（Ｃosmo
sil）５Ｃ１８カラム（φ４．６×２５０mm、ナカライ
テスク社製）を用い、水:アセトニトリル:リン酸（９
５:５:０．０１(v／v／v)）を溶離液として、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離し、２５
４nmの吸光度を測定することにより行なった。その結果
を図１に示す。
sil）５Ｃ１８カラム（φ４．６×２５０mm、ナカライ
テスク社製）を用い、水:アセトニトリル:リン酸（９
５:５:０．０１(v／v／v)）を溶離液として、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分離し、２５
４nmの吸光度を測定することにより行なった。その結果
を図１に示す。
【００３８】１６株のうちの３株、Ｅ２０６a、Ｅ２２
２ＣおよびＥ２１５は、Ｃ−Ｄ−Ａlaを単一炭素源とし
て生育し、３０℃で高い活性を示した。Ｅ２２２Ｃで
は、３０℃で３０．８mＭのＤ−ＨＰＧが生成していた
が、５０℃では３．５mＭのＤ−ＨＰＧしか生成してい
なかった。また他の３株、Ａ１７p−１、Ａ１７p−３お
よびＡ１７p−４は、Ｃ−Ｄ−ＨＰＧを単一炭素源とし
て生育し、５０℃で高い活性を示した。Ａ１７p−４で
は、５０℃で２８．８mＭのＤ−ＨＰＧが生成していた
が、３０℃では２．５mＭのＤ−ＨＰＧしか生成してい
なかった。
２ＣおよびＥ２１５は、Ｃ−Ｄ−Ａlaを単一炭素源とし
て生育し、３０℃で高い活性を示した。Ｅ２２２Ｃで
は、３０℃で３０．８mＭのＤ−ＨＰＧが生成していた
が、５０℃では３．５mＭのＤ−ＨＰＧしか生成してい
なかった。また他の３株、Ａ１７p−１、Ａ１７p−３お
よびＡ１７p−４は、Ｃ−Ｄ−ＨＰＧを単一炭素源とし
て生育し、５０℃で高い活性を示した。Ａ１７p−４で
は、５０℃で２８．８mＭのＤ−ＨＰＧが生成していた
が、３０℃では２．５mＭのＤ−ＨＰＧしか生成してい
なかった。
【００３９】実施例３ 得られたデカルバミラーゼの基質特異性 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃおよびブラストバクターsp．
Ａ１７p−４が生産するデカルバミラーゼの基質特異性
を調べるため、実施例２に記載の培地Ｃを用い、２８℃
で、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃを１日間、またはブラス
トバクターsp．Ａ１７Ｐ−４を７日間振とう培養した。
培養液３mlを遠心分離し、この菌体を３００μlの反応
液（２００mＭリン酸カリウム緩衝液、１％(w／v)の種
々の反応基質）に懸濁し、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃで
は３０℃で、ブラストバクターsp．Ａ１７Ｐ−４では５
０℃でそれぞれ２４時間反応させた。
Ａ１７p−４が生産するデカルバミラーゼの基質特異性
を調べるため、実施例２に記載の培地Ｃを用い、２８℃
で、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃを１日間、またはブラス
トバクターsp．Ａ１７Ｐ−４を７日間振とう培養した。
培養液３mlを遠心分離し、この菌体を３００μlの反応
液（２００mＭリン酸カリウム緩衝液、１％(w／v)の種
々の反応基質）に懸濁し、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃで
は３０℃で、ブラストバクターsp．Ａ１７Ｐ−４では５
０℃でそれぞれ２４時間反応させた。
【００４０】表１に示すように、両菌体とも、脂肪族お
よび芳香族Ｄ−アミノ酸のＮ−カルバミル体に対する強
い加水分解活性を示したが、極性基を持つアミノ酸のＮ
−カルバミル体に対する活性は低かった。またコマモナ
スsp．Ｅ２２２Ｃではβ−ウレイドプロピオン酸を加水
分解でき、ブラストバクターsp．Ａ１７Ｐ−４ではヒダ
ントイナーゼ活性も有することがわかった。
よび芳香族Ｄ−アミノ酸のＮ−カルバミル体に対する強
い加水分解活性を示したが、極性基を持つアミノ酸のＮ
−カルバミル体に対する活性は低かった。またコマモナ
スsp．Ｅ２２２Ｃではβ−ウレイドプロピオン酸を加水
分解でき、ブラストバクターsp．Ａ１７Ｐ−４ではヒダ
ントイナーゼ活性も有することがわかった。
【００４１】
【表１】
【００４２】実施例４ コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ株デカルバミラーゼの生産増
強物質 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ株を培養する際に、デカルバ
ミラーゼ生産を増加させる酵素生産増加物質の探索を行
なった。栄養培地である培地Ｄ（１g／l ＫＨ2ＰＯ4、
１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．３g／l ＭgＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、３g／l酵母エキス、３g／l肉エキス、１０g／lグ
リセロール、２g／lポリペプトン（pＨ７．０））に、
図２に示す化合物を０．１５％(w／v)の濃度で添加し、
菌を植えて２８℃で２日間振盪培養した。
強物質 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ株を培養する際に、デカルバ
ミラーゼ生産を増加させる酵素生産増加物質の探索を行
なった。栄養培地である培地Ｄ（１g／l ＫＨ2ＰＯ4、
１g／l Ｋ2ＨＰＯ4、０．３g／l ＭgＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ、３g／l酵母エキス、３g／l肉エキス、１０g／lグ
リセロール、２g／lポリペプトン（pＨ７．０））に、
図２に示す化合物を０．１５％(w／v)の濃度で添加し、
菌を植えて２８℃で２日間振盪培養した。
【００４３】この培養液１mlを遠心分離し、菌体を１０
０μlの反応液（２００mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ
７．０）、３５mＭ Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ）に懸濁し、３０
℃で２４時間反応させ、生成したＤ−ＨＰＧを、実施例
２に示す方法に従い、ＨＰＬＣにより定量した。その結
果、図２に示す様に、尿素、β−ウレイドプロピオン
酸、Ｄ−フェニルグリシン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−メ
チオニンにより活性が増強されることがわかった。
０μlの反応液（２００mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ
７．０）、３５mＭ Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ）に懸濁し、３０
℃で２４時間反応させ、生成したＤ−ＨＰＧを、実施例
２に示す方法に従い、ＨＰＬＣにより定量した。その結
果、図２に示す様に、尿素、β−ウレイドプロピオン
酸、Ｄ−フェニルグリシン、Ｎ−カルバミル−ＤＬ−メ
チオニンにより活性が増強されることがわかった。
【００４４】実施例５ コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃが生産するデカルバミラーゼ
の精製 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃを２８℃にて、β−ウレイド
プロピオン酸（０．１５％(w／v)を添加した実施例４に
記載の培地Ｄで３日間振盪培養し、合計３．６lの培地
を遠心分離して菌体を分離した。この菌体を１０mＭリ
ン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）１００mlに懸濁し、
超音波によって破砕し、遠心分離によって残渣を除い
た。この粗酵素液に硫安を添加しつつ、飽和濃度の２０
％から４０％までの濃度での硫安沈澱画分を遠心分離に
よって分離し、上記緩衝液に溶解させた。
の精製 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃを２８℃にて、β−ウレイド
プロピオン酸（０．１５％(w／v)を添加した実施例４に
記載の培地Ｄで３日間振盪培養し、合計３．６lの培地
を遠心分離して菌体を分離した。この菌体を１０mＭリ
ン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）１００mlに懸濁し、
超音波によって破砕し、遠心分離によって残渣を除い
た。この粗酵素液に硫安を添加しつつ、飽和濃度の２０
％から４０％までの濃度での硫安沈澱画分を遠心分離に
よって分離し、上記緩衝液に溶解させた。
【００４５】この酵素液１７７mlを上記緩衝液１０lに
対して１２時間透析し、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓepha
cel）カラム（φ５×１５cm）に吸着させ、０〜１Ｍの
ＮaＣl直線型濃度勾配で溶出させ、活性画分を集めた。
この溶出液のＮaＣl濃度を４Ｍに合わせ、フェニル−セ
ファロース（Ｐhenyl−Ｓepharose）ＣＬ−４Ｂカラム
（φ１．５×１５cm）に吸着させ、４〜０ＭのＮaＣl直
線型濃度勾配で溶出させ、活性画分を集めてＹＭ−１０
膜（アミコン社）を用いて限外濾過により濃縮した。
対して１２時間透析し、ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓepha
cel）カラム（φ５×１５cm）に吸着させ、０〜１Ｍの
ＮaＣl直線型濃度勾配で溶出させ、活性画分を集めた。
この溶出液のＮaＣl濃度を４Ｍに合わせ、フェニル−セ
ファロース（Ｐhenyl−Ｓepharose）ＣＬ−４Ｂカラム
（φ１．５×１５cm）に吸着させ、４〜０ＭのＮaＣl直
線型濃度勾配で溶出させ、活性画分を集めてＹＭ−１０
膜（アミコン社）を用いて限外濾過により濃縮した。
【００４６】この濃縮液（５ml）を０．２Ｍ ＮaＣlを
含む上記緩衝液中、セファクリル（Ｓephacryl）Ｓ−２
００ＨＲカラム（φ１．８×８０cm）を用いてゲル濾過
し、活性画分を透析により脱塩した後、ヒドロキシアパ
タイトカラム（φ１．２×１０cm）に吸着させ、０〜１
Ｍのリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）の直線型濃度
勾配で溶出し、活性画分（８．５ml）を１０mＭリン酸
カリウム緩衝液（pＨ７．０）５００mlに対し、１２時
間透析した。これをモノ（Ｍono）Ｑ ＨＲ５／５カラ
ムに吸着させ、０〜１．０Ｍ ＮaＣlの直線型濃度勾配
で溶出させて、この活性画分（１．２ml）を精製酵素液
として分析に用いた。
含む上記緩衝液中、セファクリル（Ｓephacryl）Ｓ−２
００ＨＲカラム（φ１．８×８０cm）を用いてゲル濾過
し、活性画分を透析により脱塩した後、ヒドロキシアパ
タイトカラム（φ１．２×１０cm）に吸着させ、０〜１
Ｍのリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）の直線型濃度
勾配で溶出し、活性画分（８．５ml）を１０mＭリン酸
カリウム緩衝液（pＨ７．０）５００mlに対し、１２時
間透析した。これをモノ（Ｍono）Ｑ ＨＲ５／５カラ
ムに吸着させ、０〜１．０Ｍ ＮaＣlの直線型濃度勾配
で溶出させて、この活性画分（１．２ml）を精製酵素液
として分析に用いた。
【００４７】以上の精製操作により、表２に示す様に、
細胞破砕上清と比較して、比活性が１０８倍向上し、そ
の際の酵素活性回収率は約２％であった。またこの精製
酵素１０mgをキングとレムリーの方法［Ｋing，Ｊ.，Ｌ
aemmli，Ｕ.Ｋ.，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology）６２
巻、４６５−４７７(１９７１)］により１０％ポリアク
リルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に付したところ、図３に示す様に、分子量３
８,０００付近に単一バンドが得られた。
細胞破砕上清と比較して、比活性が１０８倍向上し、そ
の際の酵素活性回収率は約２％であった。またこの精製
酵素１０mgをキングとレムリーの方法［Ｋing，Ｊ.，Ｌ
aemmli，Ｕ.Ｋ.，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ
イオロジー（Ｊournal of Ｍolecular Ｂiology）６２
巻、４６５−４７７(１９７１)］により１０％ポリアク
リルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に付したところ、図３に示す様に、分子量３
８,０００付近に単一バンドが得られた。
【表２】
【００４８】また、セファデックス（Ｓephadex）Ｇ−
１５０カラム（φ１．５×８５cm）を用い、０．２Ｍ
ＮaＣlと０．１mＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含
む１０mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）でゲル濾
過を行なったところ、図４に示す様に、分子量１１１,
０００付近に溶出された。
１５０カラム（φ１．５×８５cm）を用い、０．２Ｍ
ＮaＣlと０．１mＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含
む１０mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）でゲル濾
過を行なったところ、図４に示す様に、分子量１１１,
０００付近に溶出された。
【００４９】実施例６ コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃデカルバミラーゼの性質 実施例５で得た酵素液を用い、コマモナスsp．Ｅ２２２
Ｃが産生するデカルバミラーゼの反応至適pＨおよび反
応至適温度を調べた。反応至適pＨは、以下の方法によ
って測定した。反応液（５００μl）の緩衝液（濃度２
００mＭ）として、pＨ４．２〜５．９では酢酸−塩酸緩
衝液、pＨ５．０〜８．８ではリン酸カリウム緩衝液、p
Ｈ７．６〜９．９ではトリス−塩酸緩衝液及びpＨ８．
９〜１１．１ではグリシン−ＮaＯＨ緩衝液をそれぞれ
用い、１０mＭのＮ−カルバミル−Ｄ−フエニルアラニ
ンと酵素液を添加したものを反応液として用い３０℃で
２０分間反応させ、５００μlエタノールを添加して反
応を停止させた。
Ｃが産生するデカルバミラーゼの反応至適pＨおよび反
応至適温度を調べた。反応至適pＨは、以下の方法によ
って測定した。反応液（５００μl）の緩衝液（濃度２
００mＭ）として、pＨ４．２〜５．９では酢酸−塩酸緩
衝液、pＨ５．０〜８．８ではリン酸カリウム緩衝液、p
Ｈ７．６〜９．９ではトリス−塩酸緩衝液及びpＨ８．
９〜１１．１ではグリシン−ＮaＯＨ緩衝液をそれぞれ
用い、１０mＭのＮ−カルバミル−Ｄ−フエニルアラニ
ンと酵素液を添加したものを反応液として用い３０℃で
２０分間反応させ、５００μlエタノールを添加して反
応を停止させた。
【００５０】生成したＤ−フエニルアラニンの定量は、
２００mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）、１．５
mＭ４−アミノアンチピリン、２．１mＭフェノール、
２．２５uパーオキシダーゼ（西洋わさび由来、カルザ
イム・ラボラトリー（ＣＡＬＺＹＭＥ Ｌab．）社製）
及び０．３７５単位のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグ
マ社製）を含む反応液に、上記酵素反応液の１部を添加
し（最終容量５００μl）、３７℃で６０分間反応させ
て５００nmの吸光度の増加を測定することによって行っ
た。
２００mＭリン酸カリウム緩衝液（pＨ７．０）、１．５
mＭ４−アミノアンチピリン、２．１mＭフェノール、
２．２５uパーオキシダーゼ（西洋わさび由来、カルザ
イム・ラボラトリー（ＣＡＬＺＹＭＥ Ｌab．）社製）
及び０．３７５単位のＤ−アミノ酸オキシダーゼ（シグ
マ社製）を含む反応液に、上記酵素反応液の１部を添加
し（最終容量５００μl）、３７℃で６０分間反応させ
て５００nmの吸光度の増加を測定することによって行っ
た。
【００５１】また、反応至適温度は、リン酸カリウム緩
衝液（pＨ７．０）を用いて上記と同様の反応液組成
で、１０℃〜８０℃で２０分間反応させ、生成したアン
モニアを、インドフェノール法［ボルター（Ｂollter，
Ｗ．Ｔ．）ら、アナリティカル・ケミストリー（Ａnaly
tical Ｃhimistry）３３巻、５９２−５９４（１９６
１））によって測定した。
衝液（pＨ７．０）を用いて上記と同様の反応液組成
で、１０℃〜８０℃で２０分間反応させ、生成したアン
モニアを、インドフェノール法［ボルター（Ｂollter，
Ｗ．Ｔ．）ら、アナリティカル・ケミストリー（Ａnaly
tical Ｃhimistry）３３巻、５９２−５９４（１９６
１））によって測定した。
【００５２】以上の結果を図５および図６に示す。コマ
モナスsp．Ｅ２２２Ｃのデカルバミラーゼでは反応至適
pＨがpＨ８〜９で、反応至適温度が４０℃であることが
わかる。
モナスsp．Ｅ２２２Ｃのデカルバミラーゼでは反応至適
pＨがpＨ８〜９で、反応至適温度が４０℃であることが
わかる。
【００５３】実施例７ コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ株デカルバミラーゼのアミノ
酸配列 実施例５で得た酵素液を用い、デカルバミラーゼ蛋白の
アミノ末端のアミノ配列の決定を行なった。酵素液をセ
ントリコン−１０マイクロセントレーター（アミコン社
製）を用いて脱塩し、パルス式液相プロテインシーケン
サーにチャージし、解析を行なったところ、デカルバミ
ラーゼ蛋白のアミノ末端の配列は
酸配列 実施例５で得た酵素液を用い、デカルバミラーゼ蛋白の
アミノ末端のアミノ配列の決定を行なった。酵素液をセ
ントリコン−１０マイクロセントレーター（アミコン社
製）を用いて脱塩し、パルス式液相プロテインシーケン
サーにチャージし、解析を行なったところ、デカルバミ
ラーゼ蛋白のアミノ末端の配列は
【００５４】
【化１０】 (２０番目及び２６番目のＡrgはピークが不明瞭で確定
できなかった。)であることがわかった。
できなかった。)であることがわかった。
【００５５】実施例８ ブラストバクターsp．Ａ１７p−４株デカルバミラーゼ
の生産増強物質 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４株を培養する際に、
デカルバミラーゼ生産を増加させる酵素生産増強物質の
探索を行なった。実施例４で用いたのと同じ培地Ｄに図
７に示す化合物を０．１５％(w／v)添加し、これに植菌
し、２８℃で３日間振盪培養した。実施例４に示した方
法で、反応温度のみを４０℃として生成したＤ−ＨＰＧ
をＨＰＬＣで定量したところ、図７に示す様に、ウラシ
ル、ジヒドロウラシルまたはβ−ウレイドプロピオン酸
を添加した場合、デカルバミラーゼの生産量が増加する
ことがわかった。
の生産増強物質 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４株を培養する際に、
デカルバミラーゼ生産を増加させる酵素生産増強物質の
探索を行なった。実施例４で用いたのと同じ培地Ｄに図
７に示す化合物を０．１５％(w／v)添加し、これに植菌
し、２８℃で３日間振盪培養した。実施例４に示した方
法で、反応温度のみを４０℃として生成したＤ−ＨＰＧ
をＨＰＬＣで定量したところ、図７に示す様に、ウラシ
ル、ジヒドロウラシルまたはβ−ウレイドプロピオン酸
を添加した場合、デカルバミラーゼの生産量が増加する
ことがわかった。
【００５６】さらに、金属イオンの添加効果を調べるた
め、培地Ｄに０．１５％(w／v)のウラシルを添加し、さ
らに図８に示す金属イオンを２mＭの濃度で添加し、こ
の培地に植菌し、２８℃で４日間振盪培養した。そして
生成したＤ−ＨＰＧを定量したところ、図８に示す様
に、Ｆe2+、Ｆe3+、Ｌi+、Ｃs+、Ｂe2+、Ｍg2+、Ｍ
n2+、Ｃo2+、Ａl3+等のイオンを添加することにより、
デカルバミラーゼの生産量が増加することがわかった。
め、培地Ｄに０．１５％(w／v)のウラシルを添加し、さ
らに図８に示す金属イオンを２mＭの濃度で添加し、こ
の培地に植菌し、２８℃で４日間振盪培養した。そして
生成したＤ−ＨＰＧを定量したところ、図８に示す様
に、Ｆe2+、Ｆe3+、Ｌi+、Ｃs+、Ｂe2+、Ｍg2+、Ｍ
n2+、Ｃo2+、Ａl3+等のイオンを添加することにより、
デカルバミラーゼの生産量が増加することがわかった。
【００５７】実施例９ ブラストバクターsp．Ａ１７p−４が生産するデカルバ
ミラーゼの精製 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４を実施例４で用いた
のと同じ培地Ｄに、０．１５％(w／v)のウラシルと２m
ＭのＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏを添加し、この培地に植菌し、
２８℃で７日間振盪培養した。合計４．８lの培養液を
遠心分離し、菌体を１０mＭリン酸カリウム緩衝液１２
０mlに懸濁し、直径０．２５mmのガラスビーズ［ダイノ
−ミル・ケイ・ディ・エル（Ｄyno−Ｍill ＫＤＬ）
（スイス）］を用いて、５℃で２０分間破砕し、遠心分
離によって残渣を除いた。この粗酵素液に硫安を添加し
つつ、飽和濃度の２０％から４０％までの濃度での硫安
沈澱画分を遠心分離によって分離し、上記緩衝液に溶解
させた。
ミラーゼの精製 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４を実施例４で用いた
のと同じ培地Ｄに、０．１５％(w／v)のウラシルと２m
ＭのＦeＳＯ4・７Ｈ2Ｏを添加し、この培地に植菌し、
２８℃で７日間振盪培養した。合計４．８lの培養液を
遠心分離し、菌体を１０mＭリン酸カリウム緩衝液１２
０mlに懸濁し、直径０．２５mmのガラスビーズ［ダイノ
−ミル・ケイ・ディ・エル（Ｄyno−Ｍill ＫＤＬ）
（スイス）］を用いて、５℃で２０分間破砕し、遠心分
離によって残渣を除いた。この粗酵素液に硫安を添加し
つつ、飽和濃度の２０％から４０％までの濃度での硫安
沈澱画分を遠心分離によって分離し、上記緩衝液に溶解
させた。
【００５８】この酵素液４１mlを５lの上記緩衝液に対
して１２時間透析し、実施例５に示す方法によってＤＥ
ＡＥ−セファセルカラムおよびフェニル−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラムによって精製を行ない、限外濾過によ
って濃縮した。この濃縮液（３ml）を０．２Ｍ ＮaＣl
を含む上記緩衝液中、セファデックスＧ−１５０カラム
(φ１．５×８０cm)を用いてゲル濾過し、活性画分を透
析により脱塩した後、実施例５に示す方法によってモノ
ＱＨＲ５／５カラムを用いて精製し、活性画分（２ml）
を精製酵素液として分析に用いた。以上の精製操作によ
り、表３に示す様に、細胞破砕上清と比較して、比活性
が３７倍向上し、その際の酵素活性回収率は２．３％で
あった。
して１２時間透析し、実施例５に示す方法によってＤＥ
ＡＥ−セファセルカラムおよびフェニル−セファロース
ＣＬ−６Ｂカラムによって精製を行ない、限外濾過によ
って濃縮した。この濃縮液（３ml）を０．２Ｍ ＮaＣl
を含む上記緩衝液中、セファデックスＧ−１５０カラム
(φ１．５×８０cm)を用いてゲル濾過し、活性画分を透
析により脱塩した後、実施例５に示す方法によってモノ
ＱＨＲ５／５カラムを用いて精製し、活性画分（２ml）
を精製酵素液として分析に用いた。以上の精製操作によ
り、表３に示す様に、細胞破砕上清と比較して、比活性
が３７倍向上し、その際の酵素活性回収率は２．３％で
あった。
【表３】
【００５９】またこの精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動に付したところ、図９に示す様に、分子
量３９,０００付近に単一バンドが得られた。また、実
施例５に示す方法によってセファデックスＧ−１５０カ
ラムによるゲル濾過を行なったところ、図１０に示す様
に、分子量１２０,０００付近に溶出された。
アミド電気泳動に付したところ、図９に示す様に、分子
量３９,０００付近に単一バンドが得られた。また、実
施例５に示す方法によってセファデックスＧ−１５０カ
ラムによるゲル濾過を行なったところ、図１０に示す様
に、分子量１２０,０００付近に溶出された。
【００６０】実施例１０ ブラストバクターsp．Ａ１７p−４デカルバミラーゼの
性質 実施例９で得た酵素液を用い、ブラストバクターsp．Ａ
１７p−４デカルバミラーゼの反応至適pＨ及び反応至適
温度を調べた。いずれの場合も、反応は実施例６に示す
方法に従って行った。これらの結果を図１１及び図１２
に示す。ブラストバクターsp．Ａ１７p−４デカルバミ
ラーゼの反応至適pＨは９であり、反応至適温度は５０
℃であることがわかった。
性質 実施例９で得た酵素液を用い、ブラストバクターsp．Ａ
１７p−４デカルバミラーゼの反応至適pＨ及び反応至適
温度を調べた。いずれの場合も、反応は実施例６に示す
方法に従って行った。これらの結果を図１１及び図１２
に示す。ブラストバクターsp．Ａ１７p−４デカルバミ
ラーゼの反応至適pＨは９であり、反応至適温度は５０
℃であることがわかった。
【００６１】実施例１１ ブラストバクターsp．Ａ１７p−４デカルバミラーゼの
アミノ酸配列 実施例９で得た酵素液を用い、デカルバミラーゼ蛋白の
アミノ末端アミノ酸配列の決定を実施例７と同様の方法
により行なったところ、デカルバミラーゼ蛋白のアミノ
末端のアミノ酸配列は、
アミノ酸配列 実施例９で得た酵素液を用い、デカルバミラーゼ蛋白の
アミノ末端アミノ酸配列の決定を実施例７と同様の方法
により行なったところ、デカルバミラーゼ蛋白のアミノ
末端のアミノ酸配列は、
【００６２】
【化１１】 (３８番目のＡrgはピークが不明瞭で確定できなかっ
た。)であることがわかった。
た。)であることがわかった。
【００６３】実施例１２ 表４のリゾビウム属及びブラディリゾビウム属の株７株
について、１mlの８０５液体培地（イーストエキス １g
/l、マンニトール ５g/l、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.７g/l、ＫＨ2
ＰＯ4 ０.１g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １g/l、Ｃ−Ｄ−
ＨＰＧ １g/l（ｐＨ７.０））に終濃度１g/lのＣ−Ｄ−
ＨＰＧ又はＣ−Ｄ−Ａlaを添加した培地に植菌し、３０
℃で２４時間振とう培養した。菌を遠心分離によって集
め、０.５mlの１％Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ又はＣ−Ｄ−Ａla、
０.１ＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）、０.１％トリ
トン Ｘ−１００に懸濁した。３７℃で振とうしながら
２４時間反応後、実施例１に示す方法によって薄層クロ
マトグラフィーによって分析した。表４に示すようにブ
ラディリゾビウム属の株に脱カルバミル活性が存在する
ことがわかった。
について、１mlの８０５液体培地（イーストエキス １g
/l、マンニトール ５g/l、Ｋ2ＨＰＯ4 ０.７g/l、ＫＨ2
ＰＯ4 ０.１g/l、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １g/l、Ｃ−Ｄ−
ＨＰＧ １g/l（ｐＨ７.０））に終濃度１g/lのＣ−Ｄ−
ＨＰＧ又はＣ−Ｄ−Ａlaを添加した培地に植菌し、３０
℃で２４時間振とう培養した。菌を遠心分離によって集
め、０.５mlの１％Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ又はＣ−Ｄ−Ａla、
０.１ＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７.０）、０.１％トリ
トン Ｘ−１００に懸濁した。３７℃で振とうしながら
２４時間反応後、実施例１に示す方法によって薄層クロ
マトグラフィーによって分析した。表４に示すようにブ
ラディリゾビウム属の株に脱カルバミル活性が存在する
ことがわかった。
【００６４】
【表４】 菌株名 デカルバミラーゼ活性 リゾビウム・ロティ ＋＋ (Rhizobium loti) IFO 14779 リゾビウム・メリロティ ＋＋ (Rhizobium meliloti) IFO 14782 リゾビウム・フレディイ ＋＋ (Rhizobium fredii) IFO 14780 リゾビウム・カレガエ ＋＋ (Rhizobium galegae) IFO 14965 リゾビウム・フアクィイ ＋ (Rhizobium huakuii) IFO 15243 ブラディリゾビウム・ジャポニカム ＋ (Bradyrhizobium japonicum) IFO 14783 ブラディリゾビウム sp. ＋ (Bradyrhizobium sp.) IFO 15003
【００６５】実施例１３ 実施例１に示す方法によって、土壌よりさらにスクリー
ニングを行った。スクリーニングを、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−ロイシン（Ｃ−Ｄ−Ｌeu）、Ｎ−カルバミル−Ｄ−
アラニン（Ｃ−Ｄ−Ａla）、Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェ
ニルグリシン（Ｃ−Ｄ−ＰＧ）又はＤＬ−５−メチルヒ
ダントイン（ＤＬ−Ａla−hyd）を炭素源又は窒素源と
して用いて行った。生育した菌のうち、９株につきＣ−
Ｄ−ＡlaとＣ−Ｄ−ＨＰＧを用い、実施例１２と同様に
脱カルバミル活性を調べた。結果は、表５に示すよう
に、Ｃ−Ｄ−ＨＰＧに対しより活性の高い菌株とＣ−Ｄ
−Ａlaに対しより活性の高い菌株とがあった。
ニングを行った。スクリーニングを、Ｎ−カルバミル−
Ｄ−ロイシン（Ｃ−Ｄ−Ｌeu）、Ｎ−カルバミル−Ｄ−
アラニン（Ｃ−Ｄ−Ａla）、Ｎ−カルバミル−Ｄ−フェ
ニルグリシン（Ｃ−Ｄ−ＰＧ）又はＤＬ−５−メチルヒ
ダントイン（ＤＬ−Ａla−hyd）を炭素源又は窒素源と
して用いて行った。生育した菌のうち、９株につきＣ−
Ｄ−ＡlaとＣ−Ｄ−ＨＰＧを用い、実施例１２と同様に
脱カルバミル活性を調べた。結果は、表５に示すよう
に、Ｃ−Ｄ−ＨＰＧに対しより活性の高い菌株とＣ−Ｄ
−Ａlaに対しより活性の高い菌株とがあった。
【００６６】
【表５】 菌株名 生育基質 活性 リゾビウムsp．KNK1415 Ｃ−Ｄ−ＰＧ ＋＋＋（Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ) アルカリゲネス・キシロ ソキシダンス・subsp． デニトリフィカンス CL66-2a Ｃ−Ｄ−Ｌeu ＋＋ （Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ) CL67-1 Ｃ−Ｄ−Ｌeu ＋＋ （Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ) CL85-1 Ｃ−Ｄ−Ｌeu ＋ （Ｃ−Ｄ−ＨＰＧ) CA17-1 Ｃ−Ｄ−Ａla ＋ （Ｃ−Ｄ−Ａla) アルスロバクター sp． CA17-2 Ｃ−Ｄ−Ａla ＋＋ （Ｃ−Ｄ−Ａla) CA77-2 Ｃ−Ｄ−Ａla ＋＋ （Ｃ−Ｄ−Ａla) AH71-1 ＤＬ−Ａla−hyd ＋ （Ｃ−Ｄ−Ａla) AH57-1 ＤＬ−Ａla−hyd ＋＋ （Ｃ−Ｄ−Ａla)
【００６７】実施例１４ 実施例３で得られたリゾビウムsp．ＫＮＫ１４１５を１
０ｌのＳＥ培地（ショ糖 ２３ｇ／ｌ、酵母エキス ４
ｇ／ｌ、尿素 ２ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ／ｌ、Ｎａ
2ＨＰＯ4 ２ｇ／ｌ、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、
ＭnＣl2・４Ｈ2Ｏ ０.０１ｇ／ｌ（ｐＨ６.５））に植
菌し、３０℃で４０時間振とう培養した。遠心分離によ
って集菌し、０.９％食塩水で菌体を洗浄後、超音波に
より菌体を破砕し、残渣を遠心で除いた後、プロタミン
硫酸処理（０.１ｍｇ／ｍｇ蛋白）により除核酸した。
そして遠心した上清を５０℃、３０分間熱処理し、変性
した蛋白を遠心で除き、３０％飽和となる様に硫安を添
加した。沈でんを遠心分離によって集め、５００ｍｌの
２０ｍＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.５）、２mＭ ＤＴＴに
溶解し、同緩衝液に透析後、ＤＥＡＥセルロースカラム
に吸着させ、１０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７.
２）、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１mＭ ＤＴＴで溶出し
た。この溶出液をＹＭ−１０膜（アミコン社）を用いて
限外濾過による濃縮を行った。この酵素液をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって分析したとこ
ろ、約３５,０００付近にこのデカルバミラーゼは泳動
された。
０ｌのＳＥ培地（ショ糖 ２３ｇ／ｌ、酵母エキス ４
ｇ／ｌ、尿素 ２ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ／ｌ、Ｎａ
2ＨＰＯ4 ２ｇ／ｌ、ＭgＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １ｇ／ｌ、
ＭnＣl2・４Ｈ2Ｏ ０.０１ｇ／ｌ（ｐＨ６.５））に植
菌し、３０℃で４０時間振とう培養した。遠心分離によ
って集菌し、０.９％食塩水で菌体を洗浄後、超音波に
より菌体を破砕し、残渣を遠心で除いた後、プロタミン
硫酸処理（０.１ｍｇ／ｍｇ蛋白）により除核酸した。
そして遠心した上清を５０℃、３０分間熱処理し、変性
した蛋白を遠心で除き、３０％飽和となる様に硫安を添
加した。沈でんを遠心分離によって集め、５００ｍｌの
２０ｍＭ Ｔris・ＨＣl（pＨ７.５）、２mＭ ＤＴＴに
溶解し、同緩衝液に透析後、ＤＥＡＥセルロースカラム
に吸着させ、１０ｍＭ Ｎａ−リン酸緩衝液（ｐＨ７.
２）、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、１mＭ ＤＴＴで溶出し
た。この溶出液をＹＭ−１０膜（アミコン社）を用いて
限外濾過による濃縮を行った。この酵素液をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって分析したとこ
ろ、約３５,０００付近にこのデカルバミラーゼは泳動
された。
【００６８】実施例１５ 実施例１４で得られたデカルバミラーゼを分析したＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルよりデカルバミラーゼのバ
ンド部分のゲルを切り出し、溶出バッファー（５０ｍＭ
Ｔris・ＨＣl（pＨ７.５）、０.１％ＳＤＳ、０.１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮaＣl、５ｍＭ ＤＴＴ）
中でホモジナイズし、室温で溶出させた。この抽出液を
限外濾過によって濃縮し、逆相ＨＰＬＣカラム（ＡＰ−
３０３；ＹＭＣ社製）にチャージし、アセトニトリルの
濃度勾配により溶出させた。このデカルバミラーゼを含
む画分を気相プロテイン・シーケンサー（アプライド・
バイオシステム社製）にチャージし、解析したところ、
デカルバミラーゼのアミノ末端の配列は
Ｓ−ポリアクリルアミドゲルよりデカルバミラーゼのバ
ンド部分のゲルを切り出し、溶出バッファー（５０ｍＭ
Ｔris・ＨＣl（pＨ７.５）、０.１％ＳＤＳ、０.１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮaＣl、５ｍＭ ＤＴＴ）
中でホモジナイズし、室温で溶出させた。この抽出液を
限外濾過によって濃縮し、逆相ＨＰＬＣカラム（ＡＰ−
３０３；ＹＭＣ社製）にチャージし、アセトニトリルの
濃度勾配により溶出させた。このデカルバミラーゼを含
む画分を気相プロテイン・シーケンサー（アプライド・
バイオシステム社製）にチャージし、解析したところ、
デカルバミラーゼのアミノ末端の配列は
【化１２】 であることがわかった。
【００６９】
【発明の効果】抗生物質の中間原料等として重要なＤ−
α−アミノ酸類を製造する新規な脱カルバミル酵素を発
見したことにより、従来とは違った条件、例えばpＨ８
〜９での反応や５０℃での反応が行える様になり、効率
的にＤ−アミノ酸を製造することが可能となった。
α−アミノ酸類を製造する新規な脱カルバミル酵素を発
見したことにより、従来とは違った条件、例えばpＨ８
〜９での反応や５０℃での反応が行える様になり、効率
的にＤ−アミノ酸を製造することが可能となった。
【図１】 新規スクリーニングによって取得した株の５
０℃と３０℃での脱カルバミル反応の結果を示す。
０℃と３０℃での脱カルバミル反応の結果を示す。
【図２】 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃの培養時に添加し
た化合物のデカルバミラーゼの生産に及ぼす影響を示
す。
た化合物のデカルバミラーゼの生産に及ぼす影響を示
す。
【図３】 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃの精製デカルバミ
ラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析した結果を示す。
ラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分析した結果を示す。
【図４】 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃの精製デカルバミ
ラーゼを、セファデックスＧ−１５０カラムによって、
ゲル濾過した結果を示す。
ラーゼを、セファデックスＧ−１５０カラムによって、
ゲル濾過した結果を示す。
【図５】 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃの精製デカルバミ
ラーゼを用いて反応時のpＨの影響を調べた結果を示
す。
ラーゼを用いて反応時のpＨの影響を調べた結果を示
す。
【図６】 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃの精製デカルバミ
ラーゼを用いて、反応時の温度の影響を調べた結果を示
す。
ラーゼを用いて、反応時の温度の影響を調べた結果を示
す。
【図７】 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４の培養時
に添加した化合物のデカルバミラーゼ生産に及ぼす影響
を示す。
に添加した化合物のデカルバミラーゼ生産に及ぼす影響
を示す。
【図８】 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４の培養時
に添加した金属イオンのデカルバミラーゼ生産に及ぼす
影響を示す。
に添加した金属イオンのデカルバミラーゼ生産に及ぼす
影響を示す。
【図９】 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４の精製デ
カルバミラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析した結果を示す。
カルバミラーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分析した結果を示す。
【図１０】 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４精製デ
カルバミラーゼを、セファデックスＧ−１５０カラムに
よってゲル濾過した結果を示す。
カルバミラーゼを、セファデックスＧ−１５０カラムに
よってゲル濾過した結果を示す。
【図１１】 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４精製デ
カルバミラーゼを用いて、反応時のpＨの影響を調べた
結果を示す。
カルバミラーゼを用いて、反応時のpＨの影響を調べた
結果を示す。
【図１２】 ブラストバクターsp．Ａ１７p−４精製デ
カルバミラーゼを用いて、反応時の温度の影響を調べた
結果を示す。
カルバミラーゼを用いて、反応時の温度の影響を調べた
結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 山田 勇喜雄 兵庫県加古川市加古川町美乃利34−６ (72)発明者 難波 弘憲 兵庫県高砂市高砂町沖浜町２−63 光雲寮 (72)発明者 ▲高▼野 昌行 兵庫県明石市二見町東二見299−３−106 (72)発明者 ▲高▼橋 里美 兵庫県神戸市垂水区神和台１−13−13
Claims (16)
- 【請求項１】 一般式： 【化１】 ［式中、Ｒはフエニル基、水酸基で置換されたフエニル
基、置換または未置換アルキル基、もしくはチエニル基
を示す。］で表わされるＮ−カルバミル−Ｄ−α−アミ
ノ酸に、水性媒体中で、微生物の産生する酵素を作用さ
せ、 一般式： 【化２】 ［式中、Ｒは前記と同意義である。］で表わされるＤ−
α−アミノ酸を製造する方法において、 Ｎ−カルバミル−Ｄ−α−アミノ酸をＤ−α−アミノ酸
に変換する酵素デカルバミラーゼとして、コマモナス
（Ｃomamonas）属、ブラストバクター（Ｂlastobacte
r）属、アルカリゲネス（Ａlcaligenes）属、スポロサ
ルシナ（Ｓporosarcina）属、リゾビウム（Ｒhizobiu
m）属、ブラディリゾビウム（Ｂradyrhizobium）属また
はアルスロバクター（Ａrthrobacter）属に属する微生
物が産生することのできる酵素を用いることを特徴とす
るＤ−α−アミノ酸の製造法。 - 【請求項２】 該微生物が産生することのできるデカル
バミラーゼを、培養液、菌体、菌体破砕物、菌体抽出
物、菌体処理物、粗酵素、精製酵素固定化菌体または固
定化酵素として作用させる請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 該微生物が、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ
（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１１号）、ブラストバクターs
p．Ａ１７p−４（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４１０号）、アル
カリゲネスsp．Ｅ２１５（ＦＥＲＭ ＢＰ第４４０９
号）、スポロサルシナsp．ＮＣＡ２８−b（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ第４４０８号）、リゾビウムsp．ＫＮＫ１４１５（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ第４４１９号）、ブラディリゾビウム・ジ
ャポニカム（Ｂradyrhizobium japonicum）ＩＦＯ １４
７８３、ブラディリゾビウムsp．ＩＦＯ １５００３ま
たはアルスロバクターsp．ＣＡ１７−２（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ第４４２０号）である請求項１または２記載の製造
法。 - 【請求項４】 デカルバミラーゼの産生増強物質を添加
した培地で、該微生物を培養し、産生したデカルバミラ
ーゼを作用させる請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項５】 デカルバミラーゼ産生増強物質が、Ｄ−
アミノ酸、Ｎ−カルバミル−α−アミノ酸、５−置換ヒ
ダントイン類、ピリミジン代謝物または金属イオンであ
る請求項４記載の製造法。 - 【請求項６】 該微生物がコマモナス属の微生物であ
り、産生増強物質が尿素、β−ウレイドプロピオン酸、
Ｄ−フェニルグリシンまたはＮ−カルバミル−ＤＬ−メ
チオニンである請求項４記載の製造法。 - 【請求項７】 該微生物がブラストバクター属に属する
微生物であり、産生増強物質が、ウラシル、ジヒドロウ
ラシル、β−ウレイドプロピオン酸、Ｌi+、Ｃs+、Ｂ
e+、Ｍg2+、Ｍn2+、Ｆe2+、Ｆe3+、Ｃo2+またはＡl3+で
ある請求項４記載の製造法。 - 【請求項８】 水性媒体のpＨを６〜１１に保持する請
求項１記載の製造法。 - 【請求項９】 水性媒体のpＨを７．５〜９．５に保持
する請求項１記載の製造法。 - 【請求項１０】 ４０℃〜５０℃でデカルバミラーゼを
作用させる請求項１記載の製造法。 - 【請求項１１】 至適pＨが８〜９にあるデカルバミラ
ーゼ。 - 【請求項１２】 至適温度が４０℃〜５０℃にあるデカ
ルバミラーゼ。 - 【請求項１３】 コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃ、ブラスト
バクターsp．Ａ１７p−４またはリゾビウムsp．ＫＮＫ
１４１５が産生する請求項１１または１２記載のデカル
バミラーゼ。 - 【請求項１４】 該酵素のアミノ末端側のアミノ酸配列
が 【化３】 である、コマモナスsp．Ｅ２２２Ｃが産生する請求項１
３記載のデカルバミラーゼ。 - 【請求項１５】 該酵素のアミノ末端側のアミノ酸配列
が 【化４】 である、ブラストバクターsp．Ａ１７p−４が産生する
請求項１３記載のデカルバミラーゼ。 - 【請求項１６】 該酵素のアミノ末端側のアミノ酸配列
が、 【化５】 であるリゾビウムsp．ＫＮＫ１４１５が産生する請求項
１３記載のデカルバミラーゼ。
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|---|---|---|---|
| JP24916793A JP3415218B2 (ja) | 1992-10-05 | 1993-10-05 | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 |
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|---|---|---|---|
| JP4-265914 | 1992-10-05 | ||
| JP26591492 | 1992-10-05 | ||
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06233690A true JPH06233690A (ja) | 1994-08-23 |
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| JP24916793A Expired - Lifetime JP3415218B2 (ja) | 1992-10-05 | 1993-10-05 | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 |
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| JP (1) | JP3415218B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006080409A1 (ja) | 2005-01-31 | 2006-08-03 | Kaneka Corporation | ５－置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ－カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 |
-
1993
- 1993-10-05 JP JP24916793A patent/JP3415218B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|---|---|---|---|
| WO2006080409A1 (ja) | 2005-01-31 | 2006-08-03 | Kaneka Corporation | ５－置換ヒダントインラセマーゼ、これをコードするｄｎａ、組換えｄｎａ、形質転換された細胞、および、光学活性ｎ－カルバミルアミノ酸または光学活性アミノ酸の製造方法 |
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