JPH03127985A - Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 - Google Patents
Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法Info
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- JPH03127985A JPH03127985A JP1267919A JP26791989A JPH03127985A JP H03127985 A JPH03127985 A JP H03127985A JP 1267919 A JP1267919 A JP 1267919A JP 26791989 A JP26791989 A JP 26791989A JP H03127985 A JPH03127985 A JP H03127985A
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- dehydrogenase
- carnitine dehydrogenase
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、溶液中で安定なＬ−カルチニンデヒドロゲナ
ーゼおよびその製造法に関する。さらに詳しくは、臨床
生化学検査、食品検査、カルチニン製造などにおけるし
一カルチニンの測定あるいはアシルカルチニンより加水
分解により生成されるＬ−カルチニンの測定に利用され
る溶液中で安定なし一カルチニンデヒドロゲナーゼおよ
びその製造法に関する。
ーゼおよびその製造法に関する。さらに詳しくは、臨床
生化学検査、食品検査、カルチニン製造などにおけるし
一カルチニンの測定あるいはアシルカルチニンより加水
分解により生成されるＬ−カルチニンの測定に利用され
る溶液中で安定なし一カルチニンデヒドロゲナーゼおよ
びその製造法に関する。
Ｌ−カルチニンは、長鎖遊離脂肪酸が細胞内でβ酸化を
受ける際に前提となるξトコンドリア膜の通過を媒介す
る必須の物質とされており、その欠乏が起こると、脂質
代謝ばかりでなく種々の代謝にも異常が生じ得る。特に
カルチニンに依存度の高いエネルギー消費が活発で、ま
たカルチニンの生産能を欠く骨格筋や心筋に障害が出現
し易いとされている。
受ける際に前提となるξトコンドリア膜の通過を媒介す
る必須の物質とされており、その欠乏が起こると、脂質
代謝ばかりでなく種々の代謝にも異常が生じ得る。特に
カルチニンに依存度の高いエネルギー消費が活発で、ま
たカルチニンの生産能を欠く骨格筋や心筋に障害が出現
し易いとされている。
これまでカルニチン代謝の先天性異常による病態への関
心が主であったが、最近では、腎不全・透析患者などに
おける二次的カルニチン代謝異常も問題となっている。
心が主であったが、最近では、腎不全・透析患者などに
おける二次的カルニチン代謝異常も問題となっている。
また、筋・心筋疾患、透析患者など力ルチニン欠損が考
えられる病態に対し、薬剤としてカルニチンを投与する
試みもなされているるこのように、カルニチンは既に病
態の解析、治療など臨床的なレヘルにおけるアプローチ
が必要とされているが、まだ臨床分野での適当な定量法
が開発されていない。
えられる病態に対し、薬剤としてカルニチンを投与する
試みもなされているるこのように、カルニチンは既に病
態の解析、治療など臨床的なレヘルにおけるアプローチ
が必要とされているが、まだ臨床分野での適当な定量法
が開発されていない。
従来、Ｌ−カルニチンの測定法としては、Ｌ−カルニチ
ンおよびアセチルＣｏＡにカルニチンアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）を作用させ、遊離したＣ ｏ Ａ
Ｓ Ｈと５，５゛ −ジチオビス−２−三トロ安息香
酸（ＤＴＮＢ）との反応により生成するチオフェル−ト
イオンを比色定量する方法（ＤＴＮＢ法）（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、２３８．２５０９ （１９６３）、
Ｊ、Ｌｉｐ ｉｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、５．１８４〜
１８７ （１９６４） 、ＨＦ−床病理、３６ （１
１） 、１２９６〜１３０２ （１９８８））、Ｌ−
カルチニンおよび〔１Ｃ〕または〔３Ｈ〕標識アセチル
ＣｏＡにＣＡＴを作用させて放射標識アセチル−Ｌ−カ
ルニチンとＣｏ Ａ Ｓ Ｉ−Ｔを生成する反応におい
て放射活性を測定するラジオアイソトープ法（Ｃ１ｉｎ
、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ、 ３７．２３５〜２４３
（１９７２）、Ｊ、Ｌｉｐｉｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、 １７．２７７〜２８１ （１９７６）、日本栄養・
食糧学会誌、土±（５）、３８９〜３９５（１９８８）
〕、〕Ｌ−カルニチおよびＮＡＤにＬ−カルニチンデヒ
ロゲナーゼを作用させて３−デヒドロカルニチンとＮＡ
ＤＨを生成する反応において紫外部におけるＮ Ａ Ｄ
Ｈの増加を測定するカルニチンデヒドロゲナーゼ法（
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６，１９
６〜２０１ （１９６８）、同、１０．５６〜６０
（１９６９）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｚ、Ａｎａｌ
、Ｃｈｅｍ、、３２０ （３）２８５〜２８９ （
１９８５））、Ｌ−カルニチンおよびアセチルＣｏＡに
ＣＡＴを作用させ、生成したＣｏＡにＮ−（ｐ−（２−
ヘンズイミダヅリル）フェニル）−マレイミド（ＢＴＰ
Ｍ＞を作成させ、生成したＣｏＡ−ＢＩＰＭの蛍光強度
を測定する蛍光法〔厚生省神経病患研６１年度研報、３
１５〜３１８（１９８６））などが知られている。
ンおよびアセチルＣｏＡにカルニチンアセチルトランス
フェラーゼ（ＣＡＴ）を作用させ、遊離したＣ ｏ Ａ
Ｓ Ｈと５，５゛ −ジチオビス−２−三トロ安息香
酸（ＤＴＮＢ）との反応により生成するチオフェル−ト
イオンを比色定量する方法（ＤＴＮＢ法）（Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、２３８．２５０９ （１９６３）、
Ｊ、Ｌｉｐ ｉｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、５．１８４〜
１８７ （１９６４） 、ＨＦ−床病理、３６ （１
１） 、１２９６〜１３０２ （１９８８））、Ｌ−
カルチニンおよび〔１Ｃ〕または〔３Ｈ〕標識アセチル
ＣｏＡにＣＡＴを作用させて放射標識アセチル−Ｌ−カ
ルニチンとＣｏ Ａ Ｓ Ｉ−Ｔを生成する反応におい
て放射活性を測定するラジオアイソトープ法（Ｃ１ｉｎ
、 Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ、 ３７．２３５〜２４３
（１９７２）、Ｊ、Ｌｉｐｉｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、 １７．２７７〜２８１ （１９７６）、日本栄養・
食糧学会誌、土±（５）、３８９〜３９５（１９８８）
〕、〕Ｌ−カルニチおよびＮＡＤにＬ−カルニチンデヒ
ロゲナーゼを作用させて３−デヒドロカルニチンとＮＡ
ＤＨを生成する反応において紫外部におけるＮ Ａ Ｄ
Ｈの増加を測定するカルニチンデヒドロゲナーゼ法（
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６，１９
６〜２０１ （１９６８）、同、１０．５６〜６０
（１９６９）、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｚ、Ａｎａｌ
、Ｃｈｅｍ、、３２０ （３）２８５〜２８９ （
１９８５））、Ｌ−カルニチンおよびアセチルＣｏＡに
ＣＡＴを作用させ、生成したＣｏＡにＮ−（ｐ−（２−
ヘンズイミダヅリル）フェニル）−マレイミド（ＢＴＰ
Ｍ＞を作成させ、生成したＣｏＡ−ＢＩＰＭの蛍光強度
を測定する蛍光法〔厚生省神経病患研６１年度研報、３
１５〜３１８（１９８６））などが知られている。
従来、公知のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼとしては
、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ａ７２４４ （Ｎ
ＣＴＣ）ＣＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｂｉ。
、シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ａ７２４４ （Ｎ
ＣＴＣ）ＣＥｕｒｏｐｅａｎ Ｊ、Ｂｉ。
ｃｈｅｍ、 、 ６．１９６−２０１ （１９６８）
、同誌、１０．５６−６０ （１９６９））、シュー
ドモナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ ＩＦＰ２０６） （Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ、、１１６，２１３−２２０ （１９７８）
、Ｂ＋ｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａＡｃｔａ、、９５７．３３５−３３９ （１９８
８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
ＡＴＣＣ１７６３３［Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ’ Ｚ、Ａ
ｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、３２０．２８５−２８９ （１
９８５）〕、キサントモナス・トランスルッセンス（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）Ｔ
Ｆ○１３５５８ 〔Ａｇｒｉｃ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、
、５２．８５１ ８５２ （１９８８））などの細菌
により生産されることが知られている。
、同誌、１０．５６−６０ （１９６９））、シュー
ドモナス・プチダ（Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔ
ｉｄａ ＩＦＰ２０６） （Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ、、１１６，２１３−２２０ （１９７８）
、Ｂ＋ｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａＡｃｔａ、、９５７．３３５−３３９ （１９８
８））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ
ＡＴＣＣ１７６３３［Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ’ Ｚ、Ａ
ｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、３２０．２８５−２８９ （１
９８５）〕、キサントモナス・トランスルッセンス（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ）Ｔ
Ｆ○１３５５８ 〔Ａｇｒｉｃ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、
、５２．８５１ ８５２ （１９８８））などの細菌
により生産されることが知られている。
従来、臨床生化学検査では生化学試薬の殆どが凍結乾燥
品の形態で提供され、安定化が計られているが、最近で
は溶液における長期保存安定性も必要とされており、Ｌ
−カルニチンデヒドロゲナーゼを用いたＬ−カルニチン
測定試薬についても例外ではないと考えられる。一般に
、生化学試薬中で酵素は最も不安定とされる物質の１つ
であり、この不安定性が酵素を用いる分析の障害となっ
ている。
品の形態で提供され、安定化が計られているが、最近で
は溶液における長期保存安定性も必要とされており、Ｌ
−カルニチンデヒドロゲナーゼを用いたＬ−カルニチン
測定試薬についても例外ではないと考えられる。一般に
、生化学試薬中で酵素は最も不安定とされる物質の１つ
であり、この不安定性が酵素を用いる分析の障害となっ
ている。
前記のカルニチンデヒドロゲナーゼ法で用いる公知のＬ
−力ルニチンデヒドロゲナーゼとしては、前述の如（、
シュードモナス属またはキサントモナス属細菌由来の酵
素が挙げられるが、該酵素の溶液中における長期安定性
については何ら記載されておらず、それを測定すること
は出来なかった。Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉ
ｄａ ＩＦＰ２０６のＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼは３５℃で急激に失活することが記載されており ［
１３ｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ Ａｃｔａ、９５ｆｉ、３３５−３３９ （１９
８８））、酵素活性を３７℃で測定する場合、その酵素
活性測定中にさえ宕激に失活していることになり、実用
に耐えられる酵素とは考えられなかった。
−力ルニチンデヒドロゲナーゼとしては、前述の如（、
シュードモナス属またはキサントモナス属細菌由来の酵
素が挙げられるが、該酵素の溶液中における長期安定性
については何ら記載されておらず、それを測定すること
は出来なかった。Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉ
ｄａ ＩＦＰ２０６のＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼは３５℃で急激に失活することが記載されており ［
１３ｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａ Ａｃｔａ、９５ｆｉ、３３５−３３９ （１９
８８））、酵素活性を３７℃で測定する場合、その酵素
活性測定中にさえ宕激に失活していることになり、実用
に耐えられる酵素とは考えられなかった。
そこで、本発明者らは、公知のし一力ルニチンデヒドロ
ゲナーゼの）容液中における長＋ｇＩ安定性について確
認すべく、前記先行文献に記載のシュードモナス属細菌
およびキサントモナス属細菌を人手し、その菌株を培養
し、その培養物からＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼを
分離精製しようとするため、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ ＩＦＰ２０６は入手不可能であった
が、前記先行文献に記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＣＴＣＡ７２４４およびＸ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ＩＦ
○１３５５８を入手しさらにＡＴＣＣ，１Ｆ○および本
出願人の保存菌株からシュードモナス属菌株を入手し、
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産能についてスクリ
ーニングした結果、比較的安定な酵素を生産する菌株と
してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
ＩＦ○１３１３０を選択した。以上の３株をＥｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ６． １
９６２０１ （１９６８）、同誌、ユ、５６−６０
（１９６９）、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
５２．２４９−２５０ （１９８８）に記載の方法
に従って培養し、該培養物から分離精製して得られたＬ
カルニチンデヒドロゲナーゼを５０ｍＭトリス塩酸緩衝
ン夜（ｐＨ９，０）で１００／ｍＡになるように調製し
、５℃における２週間の水溶液中での経時安定性を検討
した。その結果、上記の３種類のＬカルニチンデヒドロ
ゲナーゼは、すべて２週問後には最初の活性の５０％以
下にまで失活しており、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇ＋ｎｏｓａＮＣＴＣＡ７２４４およびＩＦ
Ｏ１３］３０由来の酵素は３０″３Ａ以下にまで失活す
る。それ故、これら３菌株由来のＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼを用いたＬ−カルニチン測定試薬は安定性の
非常に悪い信頼性の低い試薬しか作成できないちのと推
察された。
ゲナーゼの）容液中における長＋ｇＩ安定性について確
認すべく、前記先行文献に記載のシュードモナス属細菌
およびキサントモナス属細菌を人手し、その菌株を培養
し、その培養物からＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼを
分離精製しようとするため、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ ＩＦＰ２０６は入手不可能であった
が、前記先行文献に記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＮＣＴＣＡ７２４４およびＸ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ ＩＦ
○１３５５８を入手しさらにＡＴＣＣ，１Ｆ○および本
出願人の保存菌株からシュードモナス属菌株を入手し、
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産能についてスクリ
ーニングした結果、比較的安定な酵素を生産する菌株と
してＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
ＩＦ○１３１３０を選択した。以上の３株をＥｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ６． １
９６２０１ （１９６８）、同誌、ユ、５６−６０
（１９６９）、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
５２．２４９−２５０ （１９８８）に記載の方法
に従って培養し、該培養物から分離精製して得られたＬ
カルニチンデヒドロゲナーゼを５０ｍＭトリス塩酸緩衝
ン夜（ｐＨ９，０）で１００／ｍＡになるように調製し
、５℃における２週間の水溶液中での経時安定性を検討
した。その結果、上記の３種類のＬカルニチンデヒドロ
ゲナーゼは、すべて２週問後には最初の活性の５０％以
下にまで失活しており、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇ＋ｎｏｓａＮＣＴＣＡ７２４４およびＩＦ
Ｏ１３］３０由来の酵素は３０″３Ａ以下にまで失活す
る。それ故、これら３菌株由来のＬ−カルニチンデヒド
ロゲナーゼを用いたＬ−カルニチン測定試薬は安定性の
非常に悪い信頼性の低い試薬しか作成できないちのと推
察された。
そこで、本発明者らは、５℃の緩衝液中で２週間保存の
後に最初の活性の５０％以上が残存している水溶液中で
長期安定性に優れたし一力ルニチンデヒドロゲナーゼを
広く自然界からスクリーニングすることに着目した。
後に最初の活性の５０％以上が残存している水溶液中で
長期安定性に優れたし一力ルニチンデヒドロゲナーゼを
広く自然界からスクリーニングすることに着目した。
上記着目点に基いて種々研究を続けた結果、奈良県五条
市のジャガイモ畑の土壌より分離したアルカリゲネス属
菌Ｎｏ、９８１菌株が目的とする性質を有するし一力ル
ニチンデヒドロゲナーゼを産生ずることを見出し、本発
明を完成したものである。
市のジャガイモ畑の土壌より分離したアルカリゲネス属
菌Ｎｏ、９８１菌株が目的とする性質を有するし一力ル
ニチンデヒドロゲナーゼを産生ずることを見出し、本発
明を完成したものである。
即ち、本発明は、約５°Ｃ以下のｐＨ６，５〜９゜５の
水または水溶液中で約１週間処理した後の活性が処理前
の活性の約７０％以上の値を保持している性質を有して
なる安定なＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼを提供する
ものである。また、本発明は、アルカリゲネス属に属す
るＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養
し、得られた培養物からし一力ルチニンデヒドロゲナー
ゼを採取することを特徴とするＬ−カルニチンデヒドロ
ゲナーゼの製造法を提供するものである。
水または水溶液中で約１週間処理した後の活性が処理前
の活性の約７０％以上の値を保持している性質を有して
なる安定なＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼを提供する
ものである。また、本発明は、アルカリゲネス属に属す
るＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産菌を培地に培養
し、得られた培養物からし一力ルチニンデヒドロゲナー
ゼを採取することを特徴とするＬ−カルニチンデヒドロ
ゲナーゼの製造法を提供するものである。
本り一カルチニ、ンデヒロゲナーゼ生産菌はアルカリゲ
ネス属に属するが、例えば本発明者らが分離したＮｏ、
９８１菌株は、本発明に最も有効に使用される菌株の一
例であって、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りであ
る。
ネス属に属するが、例えば本発明者らが分離したＮｏ、
９８１菌株は、本発明に最も有効に使用される菌株の一
例であって、本菌株の菌学的性質を示すと次の通りであ
る。
尚、本菌株の同定に当たっては、同定実験は医学細菌同
定の手引き（第２版） 、Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ
ｏ １ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （３巻）
に準じて行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍ
ａｎｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（８版）、Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、１ （１
９８４）、同誌Ｖｏ１．２ （１９８６）などと対比し
て同定を行った。
定の手引き（第２版） 、Ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ
ｏ １ｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （３巻）
に準じて行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍ
ａｎｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（８版）、Ｂｅｒｇｅｙ’
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ、１ （１
９８４）、同誌Ｖｏ１．２ （１９８６）などと対比し
て同定を行った。
（ａ）形態的特徴
普通寒天培地上、１８〜２４時間、２８〜３０°Ｃで培
養し、観察した所見は次の通りである。
養し、観察した所見は次の通りである。
端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で、単独
、二連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。
、二連たまに短連鎖になる。芽胞は形成せず。
大きさは０．４〜０．６Ｘ１．２〜２．５μｍで周毛で
運動する。多形性なし。
運動する。多形性なし。
（ｂｌ各培地における生育状態
各種培地上で、１８〜２４時間、２８〜３０℃で培養し
、覗察した所見は次の通りである。
、覗察した所見は次の通りである。
■普通寒天斜面培地
生育良好で線状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）に生育する。
湿潤で光沢を有する。黄土色を呈するが、可溶性色素は
産生しない。
産生しない。
■Ｖ通寒天平面培地
円型、丘状（ｃｏｎｖｅｘ）、金縁の集落を形成する。
表面は清らかで湿潤。黄土色ないし淡黄上包を呈する。
可溶性色素は産生しない。
■液体培地（ペプトン水）
生育良好で一様に混濁する。長時間（４０時間以上）培
養では菌膜を形成する。
養では菌膜を形成する。
■ＢＣＰミルク培地
４〜５日後、アルカリになる。
（Ｃ１生理的性質〔＋；陽性、（＋）；弱陽性、−；陰
性〕 ダラム染色 ＫＯＨ反応 カプセル形成 抗酸性染色 ○Ｆテスト （Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉ ○Ｆテスト （Ｎ源にＮ Ｈ４ＨＺ 好気での生育 嫌気での生育 生育温度 ４１゛Ｃ ３’／ ’Ｃ １５℃ 耐塩性 ０％ ５％ ７％ 生育ｐＨ４，６ ５，４ ８，９ ９，８ ゲラチンの分解 ｏｎ） Ｏ４ ） ＋ 変化なし く酸化） ＋ ＋ ＋ 澱粉の分解 カゼインの分解 エスクリンの分解 セルロースの分解 チロシンの分解 カフラーゼ産生 オキシダーゼ産生 ＬＶ反応 ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） インドール産生 硫化水素産生（酢酸鉛祇で検出） アセトイン産生（Ｋ２ＨＰＯ４） アセトイン産生（ＮａＣＩ ＭＲテスト 硝酸塩還元テスト ガス検出 Ｎｏ２−の検出 Ｎｏ３−の検出 シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 グルコースよりガスの産生 各種糖類より酸の産生 アドニトール Ｌ（＋）アラビノース セロビオース （＋） （＋） ゾルシトール メソ・エリスリトール フラクトース ガラクトース グルコース グリセリン イノシトール イヌリン ラクトース マルトース マンニトール マンノース メレジトース メリビオース ラフィノース Ｌ （＋）ラムノース Ｄ−リポース サリシン Ｌ−ソルボース ソルビトール （＋） 澱粉 サッカロース トレハロース ＋キシロース ポリ−β−ヒドロキシブチレート の蓄積 （ｄｌ炭素源の利用性 炭素源５ｇ、、ＮａＣ１５ｇ、Ｍｇ５Ｏａ ４７８ｚ
００．２ｇ、ＮＨ４Ｈ２Ｐ○ａ １．Ｏｇ、蒸留水１
１）を含む液体培地（ｐＨ７，０）での各炭素源の利用
性を試験した結果は次の通りである。
性〕 ダラム染色 ＫＯＨ反応 カプセル形成 抗酸性染色 ○Ｆテスト （Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉ ○Ｆテスト （Ｎ源にＮ Ｈ４ＨＺ 好気での生育 嫌気での生育 生育温度 ４１゛Ｃ ３’／ ’Ｃ １５℃ 耐塩性 ０％ ５％ ７％ 生育ｐＨ４，６ ５，４ ８，９ ９，８ ゲラチンの分解 ｏｎ） Ｏ４ ） ＋ 変化なし く酸化） ＋ ＋ ＋ 澱粉の分解 カゼインの分解 エスクリンの分解 セルロースの分解 チロシンの分解 カフラーゼ産生 オキシダーゼ産生 ＬＶ反応 ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ） インドール産生 硫化水素産生（酢酸鉛祇で検出） アセトイン産生（Ｋ２ＨＰＯ４） アセトイン産生（ＮａＣＩ ＭＲテスト 硝酸塩還元テスト ガス検出 Ｎｏ２−の検出 Ｎｏ３−の検出 シモンズ培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 クリステンセン培地での利用性 クエン酸塩 リンゴ酸塩 マレイン酸塩 マロン酸塩 プロピオン酸塩 グルコン酸塩 コハク酸塩 グルコースよりガスの産生 各種糖類より酸の産生 アドニトール Ｌ（＋）アラビノース セロビオース （＋） （＋） ゾルシトール メソ・エリスリトール フラクトース ガラクトース グルコース グリセリン イノシトール イヌリン ラクトース マルトース マンニトール マンノース メレジトース メリビオース ラフィノース Ｌ （＋）ラムノース Ｄ−リポース サリシン Ｌ−ソルボース ソルビトール （＋） 澱粉 サッカロース トレハロース ＋キシロース ポリ−β−ヒドロキシブチレート の蓄積 （ｄｌ炭素源の利用性 炭素源５ｇ、、ＮａＣ１５ｇ、Ｍｇ５Ｏａ ４７８ｚ
００．２ｇ、ＮＨ４Ｈ２Ｐ○ａ １．Ｏｇ、蒸留水１
１）を含む液体培地（ｐＨ７，０）での各炭素源の利用
性を試験した結果は次の通りである。
グルコース ＋Ｌ（＋）アラ
ビノース フラクトース ＋マンニトー
ル マンノース ＋グルコネー
ト ＋アセテート
＋アジペート ピメレート ＋スベレート
＋タートレート
十以上の通り、本菌株の主性状は、
ダラム陰性の桿状細菌で、周毛で運動、カタラーゼ、オ
キシダーゼを産生じ、ペプトンを含む培地（Ｈｕｇｈ−
Ｌｅｉｆｓｏｎ）ではグルコースより酸を産生じないが
、グルコースを酸化的に分解し、酸を産生ずる。芽胞は
形成せず、多形性なし。好気性である。
ビノース フラクトース ＋マンニトー
ル マンノース ＋グルコネー
ト ＋アセテート
＋アジペート ピメレート ＋スベレート
＋タートレート
十以上の通り、本菌株の主性状は、
ダラム陰性の桿状細菌で、周毛で運動、カタラーゼ、オ
キシダーゼを産生じ、ペプトンを含む培地（Ｈｕｇｈ−
Ｌｅｉｆｓｏｎ）ではグルコースより酸を産生じないが
、グルコースを酸化的に分解し、酸を産生ずる。芽胞は
形成せず、多形性なし。好気性である。
ダラム陰性桿菌で好気性、周毛で運動する菌属は、アル
カリゲネス属、クロモバクテリウム属およびフラボバク
テリウム属の３属である。クロモバクテリウム属は紫色
、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生ずるが、本
菌株は色素を産生しないことから判断してアルカリゲネ
ス属に属する菌株であることは明らかである。
カリゲネス属、クロモバクテリウム属およびフラボバク
テリウム属の３属である。クロモバクテリウム属は紫色
、フラボバクテリウム属は黄色の色素を産生ずるが、本
菌株は色素を産生しないことから判断してアルカリゲネ
ス属に属する菌株であることは明らかである。
そこで、本菌株がアルカリゲネス属のどの種に属するか
否かを同定するため、Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１ （１９８４）に記載
されている３菌種、即ちＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅ
ｃａｌｉｓ （以下、ｒＦＪと略記することがある）
、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓ ５ｕｂｓｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
（以下、ｒＤＪと略記することがある）およびＡｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ５
ｕｂｓｐ、ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ （以下、ｒＸ
Ｊと略記することがある）と対比した結果は、次の通り
である。
否かを同定するため、Ｂｅｒｇｅｙ’ ｓ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１ （１９８４）に記載
されている３菌種、即ちＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅ
ｃａｌｉｓ （以下、ｒＦＪと略記することがある）
、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ
ｎｓ ５ｕｂｓｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ
（以下、ｒＤＪと略記することがある）およびＡｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ５
ｕｂｓｐ、ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ （以下、ｒＸ
Ｊと略記することがある）と対比した結果は、次の通り
である。
尚、Ｆ、ＤおよびＸで示される「＋」は９０％以上の陽
性率、「−」は９０％以上が陰性率、ｒｄＪは「＋」で
も「−」のどちらでもないことを示す。
性率、「−」は９０％以上が陰性率、ｒｄＪは「＋」で
も「−」のどちらでもないことを示す。
ＦＤＸ 本菌
＋＋＋＋
オキシダーゼ産生
硝酸塩還元
亜硝酸塩還元 十
ゲラチンの分解
ＯＦ培地での酸産生
キシロース
グルコース
ペプトン不合培地での酸産生
＋＋＋
＋＋＋
＋
＋
キシロース ＋
グルーコース ＋ 十炭素源の
利用性 グルコース −−＋＋ Ｌ（＋）アラビノース フラクトース −−ｄ＋ マンニトール マンノース −−ｄ＋ グルコネート − ＋＋＋ アセテー） ＋＋＋＋ 以上対比した結果によれば、本菌株Ｎｏ、９８１の諸性
状はＡｌｃａｒｉｇｅｎｅｓ ５ｕｂｓｐ。
利用性 グルコース −−＋＋ Ｌ（＋）アラビノース フラクトース −−ｄ＋ マンニトール マンノース −−ｄ＋ グルコネート − ＋＋＋ アセテー） ＋＋＋＋ 以上対比した結果によれば、本菌株Ｎｏ、９８１の諸性
状はＡｌｃａｒｉｇｅｎｅｓ ５ｕｂｓｐ。
ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓと一致した点が多いが、ＯＦ
培地での酸産生能およびキシロースより酸を産生しない
点での性状が異なる。
培地での酸産生能およびキシロースより酸を産生しない
点での性状が異なる。
よって、本菌株を公知のものと区別するため、アルカリ
ゲネス・エスピー（Ａ １ ｃ ａ ｌ ｉ ｇ ｅ
ｎ ｅ ｓｓｐ、）Ｎｏ、９８１と命名し、工業技術院
工業技術研究所に受託番号微工研条寄第２５７０号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５７０）として寄託した。
ゲネス・エスピー（Ａ １ ｃ ａ ｌ ｉ ｇ ｅ
ｎ ｅ ｓｓｐ、）Ｎｏ、９８１と命名し、工業技術院
工業技術研究所に受託番号微工研条寄第２５７０号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２５７０）として寄託した。
本発明においては、先ずアルカリゲネス属に属するＬ−
カルニチンデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。
カルニチンデヒドロゲナーゼ生産菌が適当な培地に培養
される。
上記のＬ−カルニチンデヒロゲナーゼ生産菌としては、
前述のアルカリゲネス・エスピーＮｏ、９８１が挙げら
れるが、細菌の一般的性状として菌学士の性質は変異し
得るのであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外
線照射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−二１〜ロソグアニジン、エチルメ
タンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変
青し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、アルカ
リゲネス属に属し、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼを
生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用する
ことができる。
前述のアルカリゲネス・エスピーＮｏ、９８１が挙げら
れるが、細菌の一般的性状として菌学士の性質は変異し
得るのであるから、自然的にあるいは通常行われる紫外
線照射、放射線照射または変異誘導剤、例えばＮ−メチ
ル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−二１〜ロソグアニジン、エチルメ
タンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変
青し得る人工変異株は勿論、自然変異株も含め、アルカ
リゲネス属に属し、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼを
生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用する
ことができる。
上記の培養は、細菌の培養に一般に用いられる条件によ
って行うことができるが、本菌株の培養にあたっては、
Ｌ−カルニチンデヒロゲナーゼがカルニチンによって誘
導的に生成される誘導酵素である二から、カルニチンを
含む培地で培養することが好ましい。
って行うことができるが、本菌株の培養にあたっては、
Ｌ−カルニチンデヒロゲナーゼがカルニチンによって誘
導的に生成される誘導酵素である二から、カルニチンを
含む培地で培養することが好ましい。
培地としては、カルニチンを添加する以外に微生物が同
化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらには必要に応
し、無機塩などを含有させた栄養培地が使用される。
化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらには必要に応
し、無機塩などを含有させた栄養培地が使用される。
同化し得る炭素源としては、グルコース、フラクトース
、サッカロース、シュクロース、糖蜜などが単独または
組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、
例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカーなどが単独または組み合わせて用いられる
。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その他、鉄、マ
ンガンなどの種々の重金属塩などが使用される。上記以
外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒素源が使用
できることはいうまでもない。
、サッカロース、シュクロース、糖蜜などが単独または
組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、
例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチ
ープ・リカーなどが単独または組み合わせて用いられる
。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カル
シウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、その他、鉄、マ
ンガンなどの種々の重金属塩などが使用される。上記以
外に公知の同化し得る炭素源、消化し得る窒素源が使用
できることはいうまでもない。
培養は、通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培養温度はＬ−カルニチンデヒロゲナーゼ生産
菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得る
が、通常は１５〜３７°Ｃ１特に２８°Ｃ付近が好まし
い。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最
高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養すれ
ばよいが、通常は１〜３日間程度である。
件下で行うのがよく、工業的には深部通気攪拌培養が好
ましい。培養温度はＬ−カルニチンデヒロゲナーゼ生産
菌が発育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得る
が、通常は１５〜３７°Ｃ１特に２８°Ｃ付近が好まし
い。培養時間は培養条件によって異なるが、本酵素が最
高力価に達する時期を見計らって適当な時期に培養すれ
ばよいが、通常は１〜３日間程度である。
これらの培地組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、
通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条
件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節
、選択されることは言うまでもない。
通気性などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条
件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節
、選択されることは言うまでもない。
液体培養において発泡があるときは、シリコン油、植物
油、界面活性剤などの消泡剤が適宜使用される。
油、界面活性剤などの消泡剤が適宜使用される。
このようにして得られたＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた培養
物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、この
菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピーズ
処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やりゾチーム等
の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合
わせて、粗製のＬ−カルニチンデヒロゲナーゼ含有液が
得られる。
ゼは、主として菌体内に含有されるので、得られた培養
物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、この
菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピーズ
処理、凍結破砕処理等の機械的破壊手段やりゾチーム等
の酵素的破壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜組み合
わせて、粗製のＬ−カルニチンデヒロゲナーゼ含有液が
得られる。
次いで、この粗製のＬ−カルニチンデヒドロゲナゼ含有
液から公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いる
ことによりさらに精製されたＬ−カルニチンデヒドロゲ
ナーゼを得ることができる。例えば粗製のし一力ルニチ
ンデヒドロゲナーゼ含有液に、硫安、硫酸ナトリウム、
リン酸カリウム、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法
により本酵素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、
分子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳動法ある
いは超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応し
て精製すればよく、その精製手段としては、目的とする
し一力ルニチンデヒドロゲナーゼの性質を利用した手段
を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液
に溶解した後、必要に応して半透膜にて透析し、さらに
ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０
（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−）ヨパール（東洋曹
達社製）等のイオン交換樹脂や、セファデックス（、−
１００、Ｇ−７５、セファクリルＳ−２００等のゲル濾
過剤による分子篩クロマトを行えばよく、またこれらの
手段を適宜組み合わせて用いて精製すればよく、その後
必要に応して糖類、例えばマンニトール、サッカロース
、ソルビトール等、ア旦）酸、例えばグルタミン酸、グ
リシン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛血清アルブ
ミン等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理により精製
されたＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼの粉体を得るこ
とができる。
液から公知の蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用いる
ことによりさらに精製されたＬ−カルニチンデヒドロゲ
ナーゼを得ることができる。例えば粗製のし一力ルニチ
ンデヒドロゲナーゼ含有液に、硫安、硫酸ナトリウム、
リン酸カリウム、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法
により本酵素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、
分子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳動法ある
いは超遠心分析法を適宜組み合わせ用いて、必要に応し
て精製すればよく、その精製手段としては、目的とする
し一力ルニチンデヒドロゲナーゼの性質を利用した手段
を用いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液
に溶解した後、必要に応して半透膜にて透析し、さらに
ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡ
Ｅ−セファロース、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０
（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−）ヨパール（東洋曹
達社製）等のイオン交換樹脂や、セファデックス（、−
１００、Ｇ−７５、セファクリルＳ−２００等のゲル濾
過剤による分子篩クロマトを行えばよく、またこれらの
手段を適宜組み合わせて用いて精製すればよく、その後
必要に応して糖類、例えばマンニトール、サッカロース
、ソルビトール等、ア旦）酸、例えばグルタミン酸、グ
リシン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛血清アルブ
ミン等の安定剤を添加し、凍結乾燥等の処理により精製
されたＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼの粉体を得るこ
とができる。
以上の如くして得られたＬ−カルニチンデヒドロゲナー
ゼの性状は以下の通りである。
ゼの性状は以下の通りである。
（１）酵素作用
下記式に示すように、Ｌ−カルニチンおよびＮＡＤから
３−デヒドロカルニチンおよびＮＡＤＨを生成する反応
を触媒する。
３−デヒドロカルニチンおよびＮＡＤＨを生成する反応
を触媒する。
○○ＣＣＨ２
ＨＣＨ２
（ＣＨ３
＋ＮＡＤ“
○Ｈ
カルニチン
○○ＣＣＨ２ＣＣＨ２
○
（ＣＨ。
＋ Ｎ Ａ Ｄ Ｈ＋ Ｈ”
デヒドロカルニチン
（２）基質特異性
カルニチン
００％
コリン
グリシンヘタイン
グルコース
リジン
（３）分子量
００ ±６
トーソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ （０，７５Ｘ
６０Ｃｍ）による値、溶出液；０．２ＭＮａＣ１含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） 、標準品はオリエ
ンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使用。
６０Ｃｍ）による値、溶出液；０．２ＭＮａＣ１含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０） 、標準品はオリエ
ンタル酵母社製の次の分子量マーカーを使用。
Ｍ、Ｗ、１２，４００ シトクロムＣＭ、Ｗ、３２
，０００ アゾニレイトキナーゼＭ、Ｗ、６７．０
００ エノラーゼＭ、Ｗ、１４２，０００ ラク
テートデヒドロゲナーゼ Ｍ、Ｗ、２９０，０００ グルタメートデヒドロゲナ
ーゼ （４）等電点 ｐＨ５，３±０．６ キャリアアンフオライトを用いる焦点電気泳動法により
４°Ｃ１７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画
し、各両分の酵素活性を測定した。
，０００ アゾニレイトキナーゼＭ、Ｗ、６７．０
００ エノラーゼＭ、Ｗ、１４２，０００ ラク
テートデヒドロゲナーゼ Ｍ、Ｗ、２９０，０００ グルタメートデヒドロゲナ
ーゼ （４）等電点 ｐＨ５，３±０．６ キャリアアンフオライトを用いる焦点電気泳動法により
４°Ｃ１７００Ｖの定電圧で４０時間通電した後、分画
し、各両分の酵素活性を測定した。
（５） Ｋ ｍ値
１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）、５Ｕジア
フオラーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％ＮＢＴ （
和光純薬工業社製）、１％Ｔｗｅｅｎ８０ （和光純
薬工業社製）、５０ｍＭ Ｌ−力ルニチン を含む反応液中でＮＡＤ”の濃度を変化させて、ＮＡＤ
”に対するＫｍ値を測定した結果では、０．１４１ｍＭ
という値を示した。
フオラーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％ＮＢＴ （
和光純薬工業社製）、１％Ｔｗｅｅｎ８０ （和光純
薬工業社製）、５０ｍＭ Ｌ−力ルニチン を含む反応液中でＮＡＤ”の濃度を変化させて、ＮＡＤ
”に対するＫｍ値を測定した結果では、０．１４１ｍＭ
という値を示した。
一方、前記反応液中で５０ｍＭ Ｌ−力ルニチンの代
わりに１ｍＭ ＮＡＤ”を添加し、Ｌ−カルニチンの
濃度を変化させてＬ−カルニチンに対するＫｍ値を測定
した結果では、９．３ｍＭという値を示した。
わりに１ｍＭ ＮＡＤ”を添加し、Ｌ−カルニチンの
濃度を変化させてＬ−カルニチンに対するＫｍ値を測定
した結果では、９．３ｍＭという値を示した。
（６）熱安定性
本酵素液（１，０００／ｍｆｆ）を２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）で調製し、１時間の加熱処理後、
その残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した
結果は、第１図に示される通りであって、酵素活性は少
なくとも４５°Ｃまでは安定であった。
緩衝液（ｐＨ８，０）で調製し、１時間の加熱処理後、
その残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した
結果は、第１図に示される通りであって、酵素活性は少
なくとも４５°Ｃまでは安定であった。
（７）至適温度
１００ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）を用い、後
記の酵素活性測定法に従い、３５．４０．４５．５０．
５５および６０゛Ｃの各温度で１０分間反応後、０．Ｉ
Ｎ塩ｐ ２ｍ Ｉ！で反応を停止し、波長５５０ｎｍで
吸光度を測定した相対値の結果は、第２図に示す通りで
あって、５０℃付近で最大の活性を有している。
記の酵素活性測定法に従い、３５．４０．４５．５０．
５５および６０゛Ｃの各温度で１０分間反応後、０．Ｉ
Ｎ塩ｐ ２ｍ Ｉ！で反応を停止し、波長５５０ｎｍで
吸光度を測定した相対値の結果は、第２図に示す通りで
あって、５０℃付近で最大の活性を有している。
（８） ｐ Ｈ安定性
本酵素（ＩＵ／ｍｌを４０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５，
６〜６．０、−ム−）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８
．○、−〇−）、トリス塩諜緩衝液（ｐＨ９，０〜１０
．Ｏｌ−・−）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩１
Ｊｉ？（ｉ （ｐ Ｈ９、０〜１０．０、−△−）の各
緩衝液で調製し、４５℃で３０分間加熱処理した後、そ
の残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した結
果は、第３図に示す通りであって、ｐＨ８，０〜９．
Ｃ１）範囲で９５％以上の活性を保持している。
６〜６．０、−ム−）、リン酸緩衝液（ｐＨ６，０〜８
．○、−〇−）、トリス塩諜緩衝液（ｐＨ９，０〜１０
．Ｏｌ−・−）およびグリシン−水酸化ナトリウム緩１
Ｊｉ？（ｉ （ｐ Ｈ９、０〜１０．０、−△−）の各
緩衝液で調製し、４５℃で３０分間加熱処理した後、そ
の残存活性を後記の酵素活性測定法に従って測定した結
果は、第３図に示す通りであって、ｐＨ８，０〜９．
Ｃ１）範囲で９５％以上の活性を保持している。
（９）至適ＰＨ
後記の酵素活性測定法に従い、反応液中の１００ｍＭト
リス塩酸緩衝液に換えて１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５〜７．５、−〇−）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０〜９．０、−・−）およびグリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９０〜１０．０、−△−）の各緩衝
液を用い、３７℃で１０分間反応の後に、０．ＩＮ塩酸
で反応を停止し、波長５５０ｎｍの吸光度測定した相対
値の結果は第４図に示す通りであって、ｐＨ９，０付近
で最大の活性を示す。
リス塩酸緩衝液に換えて１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，５〜７．５、−〇−）、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０〜９．０、−・−）およびグリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９０〜１０．０、−△−）の各緩衝
液を用い、３７℃で１０分間反応の後に、０．ＩＮ塩酸
で反応を停止し、波長５５０ｎｍの吸光度測定した相対
値の結果は第４図に示す通りであって、ｐＨ９，０付近
で最大の活性を示す。
αＯ水溶液中における長期保存安定性
シュードモナス・アエルギノーサＩＦ○１３１３０ （
−〇−）、シュードモナス・アエルギノーサＮＣＴＣＡ
７２４４ （−ム一）、キサントモナス・トランスルッ
センスＩＦ○１３５５８ （−口−）および本発明の
アルカリゲネス・エスピーＮｏ、９８１ （−ロー）
の４株の培養物より分離精製して得られたＬ−カルニチ
ンデヒドロゲナーゼならびに本発明のＬ−カルニチンデ
ヒドロゲナーゼに０．０５ｍＭ ＮＡＤ“を添加した
もの（−ｍ−）を用いて、５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ９，０）中でＩＯＵ／ｍＡになるようニ調製し、５
℃における２週間の保存安定性を測定した。
−〇−）、シュードモナス・アエルギノーサＮＣＴＣＡ
７２４４ （−ム一）、キサントモナス・トランスルッ
センスＩＦ○１３５５８ （−口−）および本発明の
アルカリゲネス・エスピーＮｏ、９８１ （−ロー）
の４株の培養物より分離精製して得られたＬ−カルニチ
ンデヒドロゲナーゼならびに本発明のＬ−カルニチンデ
ヒドロゲナーゼに０．０５ｍＭ ＮＡＤ“を添加した
もの（−ｍ−）を用いて、５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ９，０）中でＩＯＵ／ｍＡになるようニ調製し、５
℃における２週間の保存安定性を測定した。
その結果は第５図に示す通りであって、前記３株のＬ−
カルニチンデヒドロゲナーゼ産生公知属菌より得られた
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼは、１週間後の残存活
性が５３〜４０％、２週間後には残存活性が４５％以下
になっている。特にシュードモナス・アエルギノーサｆ
ＦＯ１３１３０由来の酵素は２１％と特に安定性が悪い
ものであった。これに対し、本発明のＬ−カルニチンデ
ヒドロゲナーゼは、１週間後の残存活性が９６％で、２
週間後の残存活性は８２％であり、Ｌ−力ルニチンデヒ
ドロゲナーゼ産生公知属菌由来の酵素より格段に安定性
の良い性質を有している。また、この保存安定性試験に
おいて０．０５ｍＭのＮＡＤ”を共存させた時には、そ
の残存活性が１週間後では９９．７％、２週間後では９
５．１％とより安定性が良くなっており、ＮＡＤ”の安
定性効果があることが分かった。
カルニチンデヒドロゲナーゼ産生公知属菌より得られた
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼは、１週間後の残存活
性が５３〜４０％、２週間後には残存活性が４５％以下
になっている。特にシュードモナス・アエルギノーサｆ
ＦＯ１３１３０由来の酵素は２１％と特に安定性が悪い
ものであった。これに対し、本発明のＬ−カルニチンデ
ヒドロゲナーゼは、１週間後の残存活性が９６％で、２
週間後の残存活性は８２％であり、Ｌ−力ルニチンデヒ
ドロゲナーゼ産生公知属菌由来の酵素より格段に安定性
の良い性質を有している。また、この保存安定性試験に
おいて０．０５ｍＭのＮＡＤ”を共存させた時には、そ
の残存活性が１週間後では９９．７％、２週間後では９
５．１％とより安定性が良くなっており、ＮＡＤ”の安
定性効果があることが分かった。
０υＬ−カルニチンデヒロゲナーゼの酵素活性測定法の
反応液組成 ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ１４９．０）、１ｍＭ
ＮＡＤ” ５Ｕジアフオラーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％Ｎ
ＢＴ （和光純薬工業社製）、１００ｍＭ塩化カリウム ０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオ
レエート（和光純薬工業社製）、１００ｍＭ Ｌ−力
ルニチン（シグマ社製）、■酔素活性測定 上記の反応液１ｍｊ２を小試験管に入れ、３７“Ｃで５
分間インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０
．０２ｍｊ２を添加して攪拌し、反応を開始する。正確
に１０分間反応の後に、Ｏ，ＩＮ塩酸２゜０ｍ６を添加
して攪拌し、反応を停止して、Ａ、５゜ｎｍを測定して
吸光度Ａ１を求める。上記反応液よりＬ−カルニチンを
除いた反応液を用いて同様の測定を行い、その吸光度Ａ
Ｏを求める。
反応液組成 ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ１４９．０）、１ｍＭ
ＮＡＤ” ５Ｕジアフオラーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％Ｎ
ＢＴ （和光純薬工業社製）、１００ｍＭ塩化カリウム ０．５％ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオ
レエート（和光純薬工業社製）、１００ｍＭ Ｌ−力
ルニチン（シグマ社製）、■酔素活性測定 上記の反応液１ｍｊ２を小試験管に入れ、３７“Ｃで５
分間インキュベートした後に、適当に希釈した酵素液０
．０２ｍｊ２を添加して攪拌し、反応を開始する。正確
に１０分間反応の後に、Ｏ，ＩＮ塩酸２゜０ｍ６を添加
して攪拌し、反応を停止して、Ａ、５゜ｎｍを測定して
吸光度Ａ１を求める。上記反応液よりＬ−カルニチンを
除いた反応液を用いて同様の測定を行い、その吸光度Ａ
Ｏを求める。
■計算式
％式％
〔発明の効果〕
本発明のアルカリゲネス・スピーシーズＮＯ４９８１由
来のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼは、その水溶液中
における長期安定性は、残存活性が１週間後では９６％
、２週間後では８０％以上を有し、Ｌ−カルニチンデヒ
ドロゲナーゼ産生公知属菌由来の酵素よりも水溶液中の
保存安定性が極めて優れており、安定性に優れたＬ−カ
ルニチン測定試薬を調製することが可能である。また本
発明の酵素は分離精製中における失活も少なく、精製も
容易であるので、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの製
法として有利な製造法を提供できる。
来のＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼは、その水溶液中
における長期安定性は、残存活性が１週間後では９６％
、２週間後では８０％以上を有し、Ｌ−カルニチンデヒ
ドロゲナーゼ産生公知属菌由来の酵素よりも水溶液中の
保存安定性が極めて優れており、安定性に優れたＬ−カ
ルニチン測定試薬を調製することが可能である。また本
発明の酵素は分離精製中における失活も少なく、精製も
容易であるので、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼの製
法として有利な製造法を提供できる。
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明を限定するものではない。
れにより本発明を限定するものではない。
実施例 １
アルカリゲネス・エスピーＮｏ、９８１の培養ＤＬ−塩
化力ルニチン（シグマ社製）３％、ＫＨ２ｐｏ、０．２
％、Ｋ２ＨＰＯ４０，４％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４’ ７Ｈ
２００，０５％、Ｆ ｅ ＳＯ４・７ Ｈｚ ００゜０
０２％、ＭｎＳＯ４・ｎＨｚ○０．００１％を含む液体
培地（ｐＨ７，０）１００ｍ１ｔを５００ｍＡ容三角フ
ラスコに分注し、１２０℃で２０分間加熱滅菌した後、
これにアルカリゲネス・エスピーＮｏ。
化力ルニチン（シグマ社製）３％、ＫＨ２ｐｏ、０．２
％、Ｋ２ＨＰＯ４０，４％、Ｍ ｇ Ｓ Ｏ４’ ７Ｈ
２００，０５％、Ｆ ｅ ＳＯ４・７ Ｈｚ ００゜０
０２％、ＭｎＳＯ４・ｎＨｚ○０．００１％を含む液体
培地（ｐＨ７，０）１００ｍ１ｔを５００ｍＡ容三角フ
ラスコに分注し、１２０℃で２０分間加熱滅菌した後、
これにアルカリゲネス・エスピーＮｏ。
９８１の１白金耳を接種し、２８℃で１２Ｏｒ、ｐ、ｍ
、の振とう培養器で４０時間培養して種母９５ｍ１ （
酵素活性１．２Ｕ／ｍ／）を得た。
、の振とう培養器で４０時間培養して種母９５ｍ１ （
酵素活性１．２Ｕ／ｍ／）を得た。
一方、ＤＬ−塩化カルニチン（シグマ社製）３％、酵母
エキス（極東製薬社製）０．１％、ＫＺＨＰＯ，０，０
５４％、ＫＨ２ＰＯ４０，７４６％、Ｍｇ Ｓ Ｏａ
・７ Ｈｚ Ｏ０，０５％、ＣａＣＥｚ ・２Ｈ２
００，００２％、ＦｅＳＯ４−，７Ｈ２００，００２％
、Ｍ ｎ Ｓ Ｏａ ・ｎ Ｈｚ○０．００２％およ
びデイスフオームＣＢ４４２（日本油脂社製）１ｍ７ｆ
／ｌ−を含む液体培地（ｐＨ７，０）２０Ｉ！を、３０
６容ジャーファーメンタ−に仕込み、加熱滅菌した後、
これに前記で得た種母９０ｍｌ！を移植し、培養温度２
８℃、通気量２０７！／分、内圧０．４ｋｇ／ｃｍ”
、 ７％拌速度２０Ｏｒ、ｐ、ｍ、 、培養時間２７時
間の培養条件で通気攪拌培養し、培養物１９１（酵素活
性３．ＯＵ／ｍｌ）を得た。
エキス（極東製薬社製）０．１％、ＫＺＨＰＯ，０，０
５４％、ＫＨ２ＰＯ４０，７４６％、Ｍｇ Ｓ Ｏａ
・７ Ｈｚ Ｏ０，０５％、ＣａＣＥｚ ・２Ｈ２
００，００２％、ＦｅＳＯ４−，７Ｈ２００，００２％
、Ｍ ｎ Ｓ Ｏａ ・ｎ Ｈｚ○０．００２％およ
びデイスフオームＣＢ４４２（日本油脂社製）１ｍ７ｆ
／ｌ−を含む液体培地（ｐＨ７，０）２０Ｉ！を、３０
６容ジャーファーメンタ−に仕込み、加熱滅菌した後、
これに前記で得た種母９０ｍｌ！を移植し、培養温度２
８℃、通気量２０７！／分、内圧０．４ｋｇ／ｃｍ”
、 ７％拌速度２０Ｏｒ、ｐ、ｍ、 、培養時間２７時
間の培養条件で通気攪拌培養し、培養物１９１（酵素活
性３．ＯＵ／ｍｌ）を得た。
実施例 ２
酵素の分離精製
実施例１で得た培養物１９Ａを遠心分離で集菌し、これ
に０．１％リゾチームおよび１５ｍＭエチレンジアミン
四酢酸ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を含む４０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５Ｉｌを加え、３
７℃で１時間可溶化処理した。処理液を遠心分離して沈
澱物を除去し、上清４５００ｍ１ （比活性１０．３Ｕ
／ｍｆｆ）を得た。コノ上清に硫安１１００ｇを溶解し
、生した沈澱物を遠心分離して除去し、得られた上清に
再び硫安７００ｇを溶解した。この処理液を遠心分離し
て得た沈澱物４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
５００ｍ／で溶解した溶液（比活性８４．ＩＵ／ｍＪ）
を４゜ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）ＩＯＡに対
して透析した。透析して得た酵素液を４０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝化したＤＥＡＥセファロ
ースＣＬ−６Ｂ （ファルマシア社Ｍ）２００ｍｊ２の
カラムに通し、Ｏ，ＬＭ ＫＣＩを含む４０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝？＆ （ｐＨ８，０）１ ＆を流した後、次
いで０．３Ｍ ＫＣＩを含む４０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で溶出し、酵素液３０Ｑｍｌ （比活
性１２０．５Ｕ／ｍ１）を得た。得られた酵素液を４０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）ＩＯＡに対して透
析した。透析して得た酵素液を４０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液で緩衝化したハイトロキシルアパタイト （Ｋ ＯＫ
Ｅ Ｎ社製）Ｌｏｏｍβのカラムに通し、４０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８０）２００ｍｌを流した後、２
ｍＭリン酸緩衝ン夜（ｐＨ７，０）１００ｍＡで溶出し
、酵素液１００ｍ１（比活性３３１Ｕ／ｍｔｌ）を得た
。得られた酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）５１に対して透析し、酵素液９５ｍＡ’ （比活性３
３１ Ｕ／ｍ１、回収率６７．８％）を得た。
に０．１％リゾチームおよび１５ｍＭエチレンジアミン
四酢酸ジナトリウム塩（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を含む４０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）５Ｉｌを加え、３
７℃で１時間可溶化処理した。処理液を遠心分離して沈
澱物を除去し、上清４５００ｍ１ （比活性１０．３Ｕ
／ｍｆｆ）を得た。コノ上清に硫安１１００ｇを溶解し
、生した沈澱物を遠心分離して除去し、得られた上清に
再び硫安７００ｇを溶解した。この処理液を遠心分離し
て得た沈澱物４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
５００ｍ／で溶解した溶液（比活性８４．ＩＵ／ｍＪ）
を４゜ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）ＩＯＡに対
して透析した。透析して得た酵素液を４０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）で緩衝化したＤＥＡＥセファロ
ースＣＬ−６Ｂ （ファルマシア社Ｍ）２００ｍｊ２の
カラムに通し、Ｏ，ＬＭ ＫＣＩを含む４０ｍＭトリ
ス塩酸緩衝？＆ （ｐＨ８，０）１ ＆を流した後、次
いで０．３Ｍ ＫＣＩを含む４０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）で溶出し、酵素液３０Ｑｍｌ （比活
性１２０．５Ｕ／ｍ１）を得た。得られた酵素液を４０
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８゜０）ＩＯＡに対して透
析した。透析して得た酵素液を４０ｍＭ）リス塩酸緩衝
液で緩衝化したハイトロキシルアパタイト （Ｋ ＯＫ
Ｅ Ｎ社製）Ｌｏｏｍβのカラムに通し、４０ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８０）２００ｍｌを流した後、２
ｍＭリン酸緩衝ン夜（ｐＨ７，０）１００ｍＡで溶出し
、酵素液１００ｍ１（比活性３３１Ｕ／ｍｔｌ）を得た
。得られた酵素液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５
）５１に対して透析し、酵素液９５ｍＡ’ （比活性３
３１ Ｕ／ｍ１、回収率６７．８％）を得た。
本精製り一カルニチンデヒドロゲナーゼ中のＮＡＤＨオ
キシダーゼ活性はＯ，ＯＯＯＩ Ｕ／ｍ１以下であった
。
キシダーゼ活性はＯ，ＯＯＯＩ Ｕ／ｍ１以下であった
。
第１図は本発明のし一力ルニチンデヒドロゲナーゼの熱
安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲線、
第３図はそのｐＨ安定性を示す曲線、第４図はその至適
ｐＨを示す曲線、第５図はＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼ産生公知属菌由来のＬ−力ルニチンデヒドロゲナー
ゼと本発明のＬ−力ルニチンデヒドロゲナーゼの水溶液
中における保存安定性を示す曲線である。 （０Ｃ） ５ ０ ５ ０ ５ ０ （０Ｃ） 第３ 図 Ｈ ｐ日 手続補正書 平底２年 ８月１７日 ２゜ ３゜ ４゜ 平底 １年 特許願 第２６７９１、 発明の名称 り一カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名称 東
洋醸造株式会社
安定性を示す曲線、第２図はその至適温度を示す曲線、
第３図はそのｐＨ安定性を示す曲線、第４図はその至適
ｐＨを示す曲線、第５図はＬ−カルニチンデヒドロゲナ
ーゼ産生公知属菌由来のＬ−力ルニチンデヒドロゲナー
ゼと本発明のＬ−力ルニチンデヒドロゲナーゼの水溶液
中における保存安定性を示す曲線である。 （０Ｃ） ５ ０ ５ ０ ５ ０ （０Ｃ） 第３ 図 Ｈ ｐ日 手続補正書 平底２年 ８月１７日 ２゜ ３゜ ４゜ 平底 １年 特許願 第２６７９１、 発明の名称 り一カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名称 東
洋醸造株式会社
Claims (4)
- （１）、約５℃以下のｐＨ６．５〜９．５の水または水
溶液中で約１週間処理した後の活性が処理前の活性の約
７０％以上の値を保持している性質を有してなる安定な
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼ。 - （２）、Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼがアルカリゲ
ネス属に属するＬ−カルニチンデヒドロゲナーゼ生産菌
より産生される酵素である請求項１記載のＬ−カルニチ
ンデヒドロゲナーゼ。 - （３）、アルカリゲネス属に属するＬ−カルニチンデヒ
ロゲナーゼ生産菌を培地に培養し、得られた培養物から
Ｌ−カルニチンデヒドロゲナーゼを採取することを特徴
とするＬ−カルチニンデヒドロゲナーゼの製造法。 - （４）、Ｌ−カルチニンデヒロゲナーゼ生産菌がアルカ
リゲネス・エスピーＮｏ．９８１（微工研条寄第２５７
０号）である請求項３記載の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1267919A JP3059735B2 (ja) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
| DE4032287A DE4032287A1 (de) | 1989-10-13 | 1990-10-11 | L-carnitin-dehydrogenase und verfahren zu ihrer herstellung |
| FR909012616A FR2653135B1 (fr) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | L-carnitine deshydrogenase stable et procede pour sa production. |
| IT02172890A IT1243739B (it) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | L-carnitina deidrogenasi e procedimento per la sua produzione. |
| US07/596,994 US5173416A (en) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | L-carnitine dehydrogenase from alcalgenes |
| US07/726,200 US5156966A (en) | 1989-10-13 | 1991-07-05 | L-carnitine dehydrogenase and process for its production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1267919A JP3059735B2 (ja) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03127985A true JPH03127985A (ja) | 1991-05-31 |
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Family
ID=17451442
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1267919A Expired - Lifetime JP3059735B2 (ja) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | Ｌ―カルニチンデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3059735B2 (ja) |
| DE (1) | DE4032287A1 (ja) |
| FR (1) | FR2653135B1 (ja) |
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| AUPR144700A0 (en) * | 2000-11-14 | 2000-12-07 | Dunbar, Kenneth Barrie | Device to assist propulsion of hand propelled vehicles |
| US7407778B2 (en) | 2002-02-07 | 2008-08-05 | Pettegrew Jay W | Compounds, compositions and methods for treating neuropsychiatric disorders |
| US7700074B2 (en) * | 2002-02-07 | 2010-04-20 | Pettegrew Jay W | Method and system for diagnosis of neuropsychiatric disorders including chronic alcoholism |
| US7815894B2 (en) * | 2003-05-29 | 2010-10-19 | Jay W. Pettegrew | Compounds, compositions and methods for medical imaging of neuropsychiatric disorders |
| US20060257842A1 (en) * | 2003-05-29 | 2006-11-16 | Pettegrew Jay W | Cryopreservation media and molecules |
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|---|---|---|---|---|
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| JPS5817590B2 (ja) * | 1977-10-13 | 1983-04-08 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ−リンゴ酸脱水素酸素の製造法 |
| JPS588835B2 (ja) * | 1979-08-02 | 1983-02-17 | 田辺製薬株式会社 | ウロキナ−ゼの加熱安定化法 |
| JPS5889183A (ja) * | 1981-11-19 | 1983-05-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Ｎａｄ（ｐ）依存性コレステロ−ル脱水素酵素の製造法 |
| JPS5889200A (ja) * | 1981-11-19 | 1983-05-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Ｎａｄ依存性コレステロール脱水素酵素を使用するコレステロールの定量法およびその定量用試薬 |
| JPS5914788A (ja) * | 1982-07-15 | 1984-01-25 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | Ｌ−α−グリセロ−ル−３−リン酸オキシダ−ゼの安定化法 |
| DD228974A3 (de) * | 1983-03-23 | 1985-10-23 | Univ Leipzig | Verfahren zur herstellung von carnitindehydrogenase |
| US4542098A (en) * | 1983-05-06 | 1985-09-17 | Institut Francais Du Petrole | Production of glucose dehydrogenase and use of the resultant enzyme in the enzymatic synthesis of L-carnitine |
| JPS6078581A (ja) * | 1983-10-04 | 1985-05-04 | Seiwa Kasei Kk | 液状カタラ−ゼの安定法 |
| US4642286A (en) * | 1984-05-07 | 1987-02-10 | Moldowan Mervin J | Composition and method for ethanol determination |
| US4650758A (en) * | 1984-09-21 | 1987-03-17 | Cetus Corporation | Stabilization of enzymes useful in the production of glucosone and other enzymatic processes |
| FR2596756B1 (fr) * | 1986-04-04 | 1988-07-22 | Elf Aquitaine | Procede de purification de la carnitine |
| SU1449581A1 (ru) * | 1987-04-30 | 1989-01-07 | Институт биохимии им.А.Н.Баха | Штамм бактерий ALcaLIGeNeS paRaDoxUS - продуцент катехол-1,2-оксигеназы |
| FR2623520B1 (fr) * | 1987-11-23 | 1990-04-20 | Sanofi Sa | Procede enzymatique continu de preparation de la l-carnitine |
-
1989
- 1989-10-13 JP JP1267919A patent/JP3059735B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-11 DE DE4032287A patent/DE4032287A1/de active Granted
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- 1990-10-12 FR FR909012616A patent/FR2653135B1/fr not_active Expired - Fee Related
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1991
- 1991-07-05 US US07/726,200 patent/US5156966A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
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| IT1243739B (it) | 1994-06-21 |
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