JPH0623763B2 - モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 - Google Patents
モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤Info
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- JPH0623763B2 JPH0623763B2 JP60026532A JP2653285A JPH0623763B2 JP H0623763 B2 JPH0623763 B2 JP H0623763B2 JP 60026532 A JP60026532 A JP 60026532A JP 2653285 A JP2653285 A JP 2653285A JP H0623763 B2 JPH0623763 B2 JP H0623763B2
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- antigen
- liver
- mouse
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体を
含む酵素免疫反応を利用した急性肝炎および肝硬変の診
断剤に関するものである。
含む酵素免疫反応を利用した急性肝炎および肝硬変の診
断剤に関するものである。
多くの肝疾患においては肝細胞膜成分が血液中に存在
し、さらに病態によってはこれらの細胞膜成分が抗原と
なって体内に抗体が産生されることがある。
し、さらに病態によってはこれらの細胞膜成分が抗原と
なって体内に抗体が産生されることがある。
従って肝組織由来の抗原や、この抗原に対する抗体のレ
ベルは種々の肝疾患のマーカーとなりうる。モノクロー
ナル抗体はこのような肝組織由来の抗原（Human Liber
Specific Antigen,HLSA）のレベルの測定、ひいては肝
疾患の診断に利用される。
ベルは種々の肝疾患のマーカーとなりうる。モノクロー
ナル抗体はこのような肝組織由来の抗原（Human Liber
Specific Antigen,HLSA）のレベルの測定、ひいては肝
疾患の診断に利用される。
従来肝疾患の診断にはALT（アラニンアミノ転移酵素、A
ST（アスパラギン酸アミノ転移酵素）等肝臓に存在する
酵素の活性を測定する方法等が用いられていた。これら
の方法によって肝機能や肝疾患について種々の情報を得
ることができるが必ずしも肝機能に特有のものではなく
正確な測定や診断のためにはさらに他の情報を得る手段
が求められていた。
ST（アスパラギン酸アミノ転移酵素）等肝臓に存在する
酵素の活性を測定する方法等が用いられていた。これら
の方法によって肝機能や肝疾患について種々の情報を得
ることができるが必ずしも肝機能に特有のものではなく
正確な測定や診断のためにはさらに他の情報を得る手段
が求められていた。
本発明者等は鋭意研究の結果、ヒト肝細胞抗原に対する
モノクローナル抗体を得ることに成功し、これを利用す
ることによって肝疾患の診断が可能なことを知った。
モノクローナル抗体を得ることに成功し、これを利用す
ることによって肝疾患の診断が可能なことを知った。
本発明によれば、マウスをヒト肝細胞抗原で免疫して得
られる脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを通常の方法
で融合し、ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体
を産生する能力を有する融合細胞を、培地で培養するか
またはマウス腹腔内に移植して腹水癌化することにより
培養液中または腹水中に該モノクローナル抗体を生成蓄
積させ、該培養液または腹水中から採取されたモノクロ
ーナル抗体を含む酵素免疫反応を利用する急性肝炎およ
び肝硬変の診断剤が提供される。なおここにいう肝硬変
は肝癌を合併した疾患をも含めた意味である。
られる脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを通常の方法
で融合し、ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体
を産生する能力を有する融合細胞を、培地で培養するか
またはマウス腹腔内に移植して腹水癌化することにより
培養液中または腹水中に該モノクローナル抗体を生成蓄
積させ、該培養液または腹水中から採取されたモノクロ
ーナル抗体を含む酵素免疫反応を利用する急性肝炎およ
び肝硬変の診断剤が提供される。なおここにいう肝硬変
は肝癌を合併した疾患をも含めた意味である。
本発明の肝疾患診断剤となるヒト肝細胞抗原に対するモ
ノクローナル抗体は、次の如くして製造される。
ノクローナル抗体は、次の如くして製造される。
(1) ヒト肝細胞抗原の調製 ヒト肝臓組織（正常肝）の破砕物をシュクロース水溶液
で抽出し、抽出物を超遠心にかけ、上清をゲル過処理
する。ゲル過は好ましくはセファレックスＧ−１００
（米国、ファルマシア社製）カラムを用い、Ｔris −Ｈ
Ｃｌ，Ｎa Ｃｌ，ＥＤＴＡからなる緩衝液で溶出し、溶
出液の第１ピーク分画をセファロース（米国ファルマシ
ア社製）６Ｂカラムにかけ、上記の緩衝液で溶出する。
溶出液の第１ピーク画分から抗原物質が得られる（以下
これをＨＬＳＡＬと称する）。
で抽出し、抽出物を超遠心にかけ、上清をゲル過処理
する。ゲル過は好ましくはセファレックスＧ−１００
（米国、ファルマシア社製）カラムを用い、Ｔris −Ｈ
Ｃｌ，Ｎa Ｃｌ，ＥＤＴＡからなる緩衝液で溶出し、溶
出液の第１ピーク分画をセファロース（米国ファルマシ
ア社製）６Ｂカラムにかけ、上記の緩衝液で溶出する。
溶出液の第１ピーク画分から抗原物質が得られる（以下
これをＨＬＳＡＬと称する）。
(2) 免疫化動物細胞の調製 マウスをヒト肝細胞抗原で免疫し、その動物から脾細胞
を採取する。免疫化はそれ自体公知の方法によって実施
される。
を採取する。免疫化はそれ自体公知の方法によって実施
される。
(3) 融合細胞の作成 上記免疫化脾細胞とマウスミエローマ細胞とを常法に従
って融合させる。融合細胞はヒポキサンチン−アミノプ
リラン−チミジン（ＨＡＴ）培地中で選択培養する。ラ
ジオイムアッセイ（ＲＩＡ）により抗体を産生している
細胞群を選別し、クローニングを行ない、ヒト肝細胞抗
原に特異的なモノクローナル抗体を産生する融合細胞Ｈ
−２株を得る。
って融合させる。融合細胞はヒポキサンチン−アミノプ
リラン−チミジン（ＨＡＴ）培地中で選択培養する。ラ
ジオイムアッセイ（ＲＩＡ）により抗体を産生している
細胞群を選別し、クローニングを行ない、ヒト肝細胞抗
原に特異的なモノクローナル抗体を産生する融合細胞Ｈ
−２株を得る。
(4) モノクローナル抗体の調製 融合細胞Ｈ−２株を培地で培層するかまたはマウス腹腔
内に移植して腹水癌化することにより培養液中または腹
水中にモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養液また
は腹水中から常法によりモノクローナル抗体を採取す
る。
内に移植して腹水癌化することにより培養液中または腹
水中にモノクローナル抗体を生成蓄積させ、培養液また
は腹水中から常法によりモノクローナル抗体を採取す
る。
このようにして得られる融合細胞Ｈ−２株は次の特性を
有する。
有する。
（由 来） マウスミエローマ細胞（ＳＰ２−ＮＳ１）とマウス脾臓
細胞との融合細胞である。
細胞との融合細胞である。
（形 態） マウスミエローマ細胞とほゞ同様の形態を示す。
（機 能） 免疫グロブリンＩｇＧ2bを定常的に産生する。
（増殖性） ミエローマ細胞とほゞ同様の増殖性を示す。たとえば、
７２時間で約１０倍に増殖する。
７２時間で約１０倍に増殖する。
（保存性） −８０℃以下で長期間保存可能である。
（最適増殖条件） ｐＨ 7.2、温度３７℃ （培 地） ＰＲＭＩ １６４０（米国、ギブコ社製）に１０％の
牛胎児血清を含ませたのもの。
牛胎児血清を含ませたのもの。
上記融合細胞Ｈ−２株は昭和６０年２月１２日に工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託申請された（寄託受託
拒否通知書，６０微寄文第１９２号） 本発明のヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体は
ヒト肝臓に存在する抗原とのみ反応し、ヒトの他の臓器
や他の動物の肝臓に存在する抗原とは反応しない。従っ
て各種ヒト肝疾患の病態診断剤として使用される。ま
た、本発明の診断剤は従来の肝機能検査の１つであるＡ
ＬＴの検査結果とは相互関係を有しないので、全く異な
った面から、肝疾患の診断をすることができる。
術院微生物工業技術研究所に寄託申請された（寄託受託
拒否通知書，６０微寄文第１９２号） 本発明のヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体は
ヒト肝臓に存在する抗原とのみ反応し、ヒトの他の臓器
や他の動物の肝臓に存在する抗原とは反応しない。従っ
て各種ヒト肝疾患の病態診断剤として使用される。ま
た、本発明の診断剤は従来の肝機能検査の１つであるＡ
ＬＴの検査結果とは相互関係を有しないので、全く異な
った面から、肝疾患の診断をすることができる。
本発明のＨ−２モノクローナル抗体を用いて肝疾患を診
断する場合は、常法により、好ましくはサンドイッチ法
により患者血清中のヒト肝細胞抗原を測定する。例え
ば、Ｈ−２モノクローナル抗体を固相化し、検体抗原を
反応させ、家ウサギから調製した抗体血清を反応させ、
さらにペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ免疫グロブリ
ンを反応させ、Ｏ−フェニルジアミンおよび過酸化水素
を反応させ、４９０nmの吸光度を測定する。
断する場合は、常法により、好ましくはサンドイッチ法
により患者血清中のヒト肝細胞抗原を測定する。例え
ば、Ｈ−２モノクローナル抗体を固相化し、検体抗原を
反応させ、家ウサギから調製した抗体血清を反応させ、
さらにペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ免疫グロブリ
ンを反応させ、Ｏ−フェニルジアミンおよび過酸化水素
を反応させ、４９０nmの吸光度を測定する。
次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明する。
参考例１ 融合細胞の調整 (1)ヒト肝細胞抗原の調整 ヒトの正常肝組織を2.5%シュクロースでホモジナイズ
し、 100,000ｇの超遠心にかける１時間後得られ、上清
を、セファデックスＧ−１００のカラムにかける。溶出
には、 0.1Ｍ Ｔris −ＨＣｌ（ｐＨ 8.0）、 0.2Ｍ
Ｎa Ｃｌ、 0.1ＭＥＤＴＡ緩衝液を用いた。得られた第
１ピークの分画をセファロース６Ｂカラムにかけ、同様
の緩衝液で溶出された第１ピークを集めて、以下に用い
る抗原物質とした。
し、 100,000ｇの超遠心にかける１時間後得られ、上清
を、セファデックスＧ−１００のカラムにかける。溶出
には、 0.1Ｍ Ｔris −ＨＣｌ（ｐＨ 8.0）、 0.2Ｍ
Ｎa Ｃｌ、 0.1ＭＥＤＴＡ緩衝液を用いた。得られた第
１ピークの分画をセファロース６Ｂカラムにかけ、同様
の緩衝液で溶出された第１ピークを集めて、以下に用い
る抗原物質とした。
抗原物質の精製の詳細については、 Ｍc Ｆarlaneらの方法（Ｐunfication and Ｃharacteri
zation of human liver−specificmembrane lipoprotei
n（ＬＳＰ），（ＣlinicalＥxperimental Ｉmmunology
２７，３８１〜３９０（１９７７））に準じて行なっ
た。
zation of human liver−specificmembrane lipoprotei
n（ＬＳＰ），（ＣlinicalＥxperimental Ｉmmunology
２７，３８１〜３９０（１９７７））に準じて行なっ
た。
(2) 融合のための脾臓細胞の調製 Ｂalb ／c マウス（５週令、♀）にフロインド完全アジ
ニバントに溶解させた１６０μｇの抗原物質を皮下およ
び腹腔内に半分ずつ注射する。１カ月後同様に皮下投与
を行ない、さらに１カ月後同様に注射した。最終投与の
４日後に脾臓をとり出し、脾細胞を血清不含の培養液
（ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製） 7.5ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ 7.2で緩衝）中に浮遊させた。
ニバントに溶解させた１６０μｇの抗原物質を皮下およ
び腹腔内に半分ずつ注射する。１カ月後同様に皮下投与
を行ない、さらに１カ月後同様に注射した。最終投与の
４日後に脾臓をとり出し、脾細胞を血清不含の培養液
（ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ社製） 7.5ｍＭ ＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ 7.2で緩衝）中に浮遊させた。
(3) 細胞融合のためのミエローマ細胞の調製 マウスミエローマ細胞（ＳＰＺ−ＮＳ１）は１０％牛胎
児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地に継代した。
ＳＰ２／ＮＳ１のミエローマ細胞の発育は、５％の炭酸
ガスを含む気流を流した炭酸ガスインキュベーターに２
３７℃で継代培養を行った。この細胞は選択的にヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン培地中で阻害され
ることを確認した。
児血清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地に継代した。
ＳＰ２／ＮＳ１のミエローマ細胞の発育は、５％の炭酸
ガスを含む気流を流した炭酸ガスインキュベーターに２
３７℃で継代培養を行った。この細胞は選択的にヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン培地中で阻害され
ることを確認した。
(4) 融合細胞の作製 マウスミエローマ細胞（ＳＰＺ−ＮＳＩ）のＲＰＭＩ浮
遊液（２×１０７個）を用意し、前記の脾細胞浮遊液
（７×１０７個）と混合した後４００×ｇで５分間遠心
分離して上清を除き両細胞の混合した沈澱を採取した。
沈澱に５０％（重量／容量）ポリエチレングリコール溶
液１mlを３７℃、１分間にわたってゆるく撹拌しながら
加えて、両細胞を融合させた。その後、牛胎児血清を含
まない１５mlのＲＰＭＩ １６４０培地を徐々に加えて
反応を停止させ、ＲＰＨＩ １６４０で２〜３回洗浄
（４００×ｇ、５分間）し、融合細胞を得た。
遊液（２×１０７個）を用意し、前記の脾細胞浮遊液
（７×１０７個）と混合した後４００×ｇで５分間遠心
分離して上清を除き両細胞の混合した沈澱を採取した。
沈澱に５０％（重量／容量）ポリエチレングリコール溶
液１mlを３７℃、１分間にわたってゆるく撹拌しながら
加えて、両細胞を融合させた。その後、牛胎児血清を含
まない１５mlのＲＰＭＩ １６４０培地を徐々に加えて
反応を停止させ、ＲＰＨＩ １６４０で２〜３回洗浄
（４００×ｇ、５分間）し、融合細胞を得た。
上記の融合細胞を牛胎児血清１５％を添加したＲＰＭＩ
１６４０培地に浮遊させて、２×１０６個／mlの細胞
を含む懸濁液とし、その 0.1mlずつを９６穴の組織培養
プレートに入れ９５％空気／５％炭酸ガスの気流中で炭
酸ガスインキュベーターを用いて、３７℃で２４時間培
養した後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
（ＨＡＴ）選択培地 0.1mlずつを加えて培養を行った、
その後、培養２，３，５日目に数回ＨＡＴ培地の交換を
行いながら培養を続け、１０日目以後はＨＴ培地で数回
培養液の交換を行い、１４日目に各培養液上清を取り抗
体を産生している細胞群をラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）で選びだした。選別は希釈法を用い、１ウェルあた
り１個の融合細胞が含まれるようにして増殖させた。得
られたクローンを幾度か希釈して培養をくり返し、クロ
ーニングを行った。こうしてヒト肝細胞抗原に特異的な
モノクローナル抗体を産生する融合細胞Ｈ−２株を得
た。
１６４０培地に浮遊させて、２×１０６個／mlの細胞
を含む懸濁液とし、その 0.1mlずつを９６穴の組織培養
プレートに入れ９５％空気／５％炭酸ガスの気流中で炭
酸ガスインキュベーターを用いて、３７℃で２４時間培
養した後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン
（ＨＡＴ）選択培地 0.1mlずつを加えて培養を行った、
その後、培養２，３，５日目に数回ＨＡＴ培地の交換を
行いながら培養を続け、１０日目以後はＨＴ培地で数回
培養液の交換を行い、１４日目に各培養液上清を取り抗
体を産生している細胞群をラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）で選びだした。選別は希釈法を用い、１ウェルあた
り１個の融合細胞が含まれるようにして増殖させた。得
られたクローンを幾度か希釈して培養をくり返し、クロ
ーニングを行った。こうしてヒト肝細胞抗原に特異的な
モノクローナル抗体を産生する融合細胞Ｈ−２株を得
た。
以上の操作はＫh1er とＭilstein （１９７５）ら
（Ｋh1er,Ｇ and Ｍilstein,Ｃ．Ｎature,２５６，４
９５（１９７５）により確立された常法に従って行っ
た。
（Ｋh1er,Ｇ and Ｍilstein,Ｃ．Ｎature,２５６，４
９５（１９７５）により確立された常法に従って行っ
た。
参考例２ モノクローナル抗体の調製 (1) プロテインＡによるＨ−２モノクローナル抗体の精
製 Ｂalb ／c マウス（６〜８週令・雌性）にプリステーン
（サメ由来の鉱油）を１匹あたり 0.5ml腹腔内投与して
１週間後、約１０６〜１０７個の抗体産生細胞Ｈ−２株
をマウス腹腔内に移植し、１〜２週間後に貯溜した腹水
を採取した。腹水を硫安分画法により分画して０〜５０
％分画の沈澱を集め 0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ 8.0）に
溶解し、透析した。透析物の上清はｐＨ 8.0の 0.1Ｍリ
ン酸緩衝液で平衡させたＰroteinＡ−ＳepharoseＣＬ−
４Ｂカラム（米国、ファルマシア社製）に吸着させ、
0.1Ｈ酢酸と 0.14Ｍ Ｎa Ｃｌの混合物を用いて溶出さ
せた。溶出後トリス粉末にて中性に調製し、 0.1Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ 7.4）で十分に透析してＨ−２モノクロ
ーナル抗体を得た。
製 Ｂalb ／c マウス（６〜８週令・雌性）にプリステーン
（サメ由来の鉱油）を１匹あたり 0.5ml腹腔内投与して
１週間後、約１０６〜１０７個の抗体産生細胞Ｈ−２株
をマウス腹腔内に移植し、１〜２週間後に貯溜した腹水
を採取した。腹水を硫安分画法により分画して０〜５０
％分画の沈澱を集め 0.1Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ 8.0）に
溶解し、透析した。透析物の上清はｐＨ 8.0の 0.1Ｍリ
ン酸緩衝液で平衡させたＰroteinＡ−ＳepharoseＣＬ−
４Ｂカラム（米国、ファルマシア社製）に吸着させ、
0.1Ｈ酢酸と 0.14Ｍ Ｎa Ｃｌの混合物を用いて溶出さ
せた。溶出後トリス粉末にて中性に調製し、 0.1Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ 7.4）で十分に透析してＨ−２モノクロ
ーナル抗体を得た。
(2) Ｈ−２モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
およびサブクラスの同定 ハイブリド細胞の培養液についてＲＩＡ法で免疫グロブ
リン（Ｉｇ）の存在について分析した。８μｇ／mlの抗
原液で抗原をプレートに固相化して１０％牛胎児血清を
含むリン酸緩衝液で洗い、次に 1.5％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液を加えて、室温で一晩放
置した。次にハイブリド細胞を培養した培養液を加えて
３７℃４５分インキュベートした。洗浄後家兎より得た
抗血清（抗マウスＩｇＧ１，Ｇ2a，Ｇ2b，Ｇ３，Ｉｇ
Ｍ，ＩｇＡ）を別々に加えて３７℃４５分インキュベー
トし、洗浄後 125Ｉ標識プロテインＡを加えてさらに３
７℃４５分インキュベートして洗浄後ガンマシンチレー
ション計数器で分析した。結果を第１図に示す。１分間
当りのカウント（cpm ）は抗体の存在または不存在を示
す。第１図に示すように上記実施例で得られたＨ−２モ
ノクローナル抗体はＩｇＧ2bに属する免疫グロブリンで
ある。
およびサブクラスの同定 ハイブリド細胞の培養液についてＲＩＡ法で免疫グロブ
リン（Ｉｇ）の存在について分析した。８μｇ／mlの抗
原液で抗原をプレートに固相化して１０％牛胎児血清を
含むリン酸緩衝液で洗い、次に 1.5％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液を加えて、室温で一晩放
置した。次にハイブリド細胞を培養した培養液を加えて
３７℃４５分インキュベートした。洗浄後家兎より得た
抗血清（抗マウスＩｇＧ１，Ｇ2a，Ｇ2b，Ｇ３，Ｉｇ
Ｍ，ＩｇＡ）を別々に加えて３７℃４５分インキュベー
トし、洗浄後 125Ｉ標識プロテインＡを加えてさらに３
７℃４５分インキュベートして洗浄後ガンマシンチレー
ション計数器で分析した。結果を第１図に示す。１分間
当りのカウント（cpm ）は抗体の存在または不存在を示
す。第１図に示すように上記実施例で得られたＨ−２モ
ノクローナル抗体はＩｇＧ2bに属する免疫グロブリンで
ある。
(3) Ｈ−２モノクローナル抗体の種および臓器特異性 ヒトから得られた臓器、肝臓、腎臓、甲状線、筋肉、心
臓、膵臓、胆のう、胃、空腸、結腸を用いて、前記と同
様の方法で抗原物質を調製した。これらの抗原物質とＨ
−２モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ（Ｅnzyme
Ｌinked Ｉmmunosorbent Ａssay、酸素免疫測定法）に
てＨ−２モノクローナル抗体に対応する抗原の種および
臓器特異性を検討した。
臓、膵臓、胆のう、胃、空腸、結腸を用いて、前記と同
様の方法で抗原物質を調製した。これらの抗原物質とＨ
−２モノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡ（Ｅnzyme
Ｌinked Ｉmmunosorbent Ａssay、酸素免疫測定法）に
てＨ−２モノクローナル抗体に対応する抗原の種および
臓器特異性を検討した。
上記抗原物質５μｇ／mlをプレートに固相化して３７℃
で１時間洗浄し、２０％牛胎児血清を含むリン酸緩衝液
を加えて室温で一晩放置した。次にＨ−２モノクローナ
ル抗体を加えて３７℃４５分インキュベートした。洗浄
後ペルオキシダーゼ標識した抗マウス免疫グロブリンを
加えて３７℃で２時間インキュベートして、洗浄後Ｏ−
フェニルジアミンおよび過酸化水素を加えて、常法に従
って４９０nmの吸光度を測定した。結果を第２図に示
す。ヒトの各臓器について調べた結果、第２図に示した
ようにＨ−２モノクローナル抗体は、肝臓に特異的に存
する抗原とのみ反応することが認められた。またヒト以
外のラット、および家兎の肝臓についても同様に検討し
たところ、Ｈ−２モノクローナル抗体はヒトのみに反応
してラットおよび家兎とは反応しなかった。これらのこ
とから本発明により得られたＨ−２モノクローナル抗体
はヒトの肝臓とのみ存在する抗原に対するモノクローナ
ル抗体である。
で１時間洗浄し、２０％牛胎児血清を含むリン酸緩衝液
を加えて室温で一晩放置した。次にＨ−２モノクローナ
ル抗体を加えて３７℃４５分インキュベートした。洗浄
後ペルオキシダーゼ標識した抗マウス免疫グロブリンを
加えて３７℃で２時間インキュベートして、洗浄後Ｏ−
フェニルジアミンおよび過酸化水素を加えて、常法に従
って４９０nmの吸光度を測定した。結果を第２図に示
す。ヒトの各臓器について調べた結果、第２図に示した
ようにＨ−２モノクローナル抗体は、肝臓に特異的に存
する抗原とのみ反応することが認められた。またヒト以
外のラット、および家兎の肝臓についても同様に検討し
たところ、Ｈ−２モノクローナル抗体はヒトのみに反応
してラットおよび家兎とは反応しなかった。これらのこ
とから本発明により得られたＨ−２モノクローナル抗体
はヒトの肝臓とのみ存在する抗原に対するモノクローナ
ル抗体である。
実施例 肝疾患の診断 (1) 抗血清の調製 １６０μｇのＬＳＰ preparationと等量の完全フロイン
トアジュバンドで懸濁液を調製し、家兎の前足および背
部皮下に注射した。３週間後等量のＬＳＰ preparation
を静脈内注射した。さらに１，２週間後にそれぞれ同様
に静脈内に投与し、最終投与後３日目に頚動脈より全採
血を行い、血清を得た。
トアジュバンドで懸濁液を調製し、家兎の前足および背
部皮下に注射した。３週間後等量のＬＳＰ preparation
を静脈内注射した。さらに１，２週間後にそれぞれ同様
に静脈内に投与し、最終投与後３日目に頚動脈より全採
血を行い、血清を得た。
(2) 診 断 肝疾患患者血中に出現するＨＬＳＡ１（ＨumanＬiver
Ｓpecific Ａntigen １）抗原の検出と病態との関連を
知るために、Ｈ−２モノクローナル抗体を用いてサンド
イッチ法によりＨＬＳＡ１抗原量を測定した。
Ｓpecific Ａntigen １）抗原の検出と病態との関連を
知るために、Ｈ−２モノクローナル抗体を用いてサンド
イッチ法によりＨＬＳＡ１抗原量を測定した。
９６穴の組織培養プレートにＨ−２モノクローナル抗体
（１０μｇ／ml）を加えて３７℃１時間インキュベート
し、次に洗浄後２％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝
液（ｐＨ 7.4）を加える。３７℃１０分間放置後洗浄し
てヒト肝より得た抗原物質を４０，２０，１０，５，２
５， 1.25 μｇ／mlの各濃度で加えて、３７℃２時間イ
ンキュベートした。インキュベート後洗浄して、家兎か
ら調製した抗ＬＳＰ血清を２０００倍希釈して加えた。
３７℃４５分間インキュベート後ペルオキシダーゼ標識
した抗ウサギ免疫グロブリンを20,000倍希釈して加え３
７℃２時間インキュベートして洗浄後、Ｏ−フェニルジ
アミンおよび過酸化水素をＥＬＩＳＡの常法に従って加
えて、４９０nmの吸光度を測定した。
（１０μｇ／ml）を加えて３７℃１時間インキュベート
し、次に洗浄後２％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝
液（ｐＨ 7.4）を加える。３７℃１０分間放置後洗浄し
てヒト肝より得た抗原物質を４０，２０，１０，５，２
５， 1.25 μｇ／mlの各濃度で加えて、３７℃２時間イ
ンキュベートした。インキュベート後洗浄して、家兎か
ら調製した抗ＬＳＰ血清を２０００倍希釈して加えた。
３７℃４５分間インキュベート後ペルオキシダーゼ標識
した抗ウサギ免疫グロブリンを20,000倍希釈して加え３
７℃２時間インキュベートして洗浄後、Ｏ−フェニルジ
アミンおよび過酸化水素をＥＬＩＳＡの常法に従って加
えて、４９０nmの吸光度を測定した。
まず標準曲線を得るために上記ＬＳＰ抗原物質で調べた
結果を第３図に示す。第３図のように 1.25 μｇ／mlか
ら２０μｇ／mlの濃度において、直線関係がえられる標
準曲線をえた。
結果を第３図に示す。第３図のように 1.25 μｇ／mlか
ら２０μｇ／mlの濃度において、直線関係がえられる標
準曲線をえた。
次に肝疾患患者への適用のために、前記サンドイッチ法
において患者血清を１００倍から４００倍希釈に検討し
た。その結果、第１表に示した如く、患者血清中に極め
て高い値でＨＬＳＡ１抗原が検出された。Ｗilcoxon ra
nk sum test およびＳtudent ｔ−testの結果慢性非活
動性肝炎は健常コントロールと比して有意な差は認めら
れなかったが、他の肝疾患では高く、急性肝炎、肝硬変
に肝癌が合併した疾患、肝硬変、慢性活動性肝炎の順に
高く、急性肝炎では健常コントロールに比して６倍以上
高くＨＬＳＡ１抗原が見出された。さらにＨＬＳＡ１抗
原の出現頻度は急性肝炎では８／８例、肝硬変＋肝癌の
４／４例、肝硬変の８／１０例、慢性活動性肝炎の１５
／２５例の血中に検出された。さらに従来の肝機能検査
法であるＡＬＴ，ＡＳＴのうちのＡＬＴとの相関関係を
直線回帰法で調べたところ、ＨＬＳＡ１抗原とＡＬＴと
は相関関係がなかった。このことから本発明により、得
られた結果は従来の肝機能検査の一つであるＡＬＴ以外
をマーカーに肝疾患を調べていることとなり本発明のモ
ノクローナル抗体が全く新しい肝機能検査の手段となる
ことを示すものである。
において患者血清を１００倍から４００倍希釈に検討し
た。その結果、第１表に示した如く、患者血清中に極め
て高い値でＨＬＳＡ１抗原が検出された。Ｗilcoxon ra
nk sum test およびＳtudent ｔ−testの結果慢性非活
動性肝炎は健常コントロールと比して有意な差は認めら
れなかったが、他の肝疾患では高く、急性肝炎、肝硬変
に肝癌が合併した疾患、肝硬変、慢性活動性肝炎の順に
高く、急性肝炎では健常コントロールに比して６倍以上
高くＨＬＳＡ１抗原が見出された。さらにＨＬＳＡ１抗
原の出現頻度は急性肝炎では８／８例、肝硬変＋肝癌の
４／４例、肝硬変の８／１０例、慢性活動性肝炎の１５
／２５例の血中に検出された。さらに従来の肝機能検査
法であるＡＬＴ，ＡＳＴのうちのＡＬＴとの相関関係を
直線回帰法で調べたところ、ＨＬＳＡ１抗原とＡＬＴと
は相関関係がなかった。このことから本発明により、得
られた結果は従来の肝機能検査の一つであるＡＬＴ以外
をマーカーに肝疾患を調べていることとなり本発明のモ
ノクローナル抗体が全く新しい肝機能検査の手段となる
ことを示すものである。
第１図はＨ−２モノクローナル抗体の免疫グロブリン
（Ｉg ）クラスおよびサブクラスの分析結果を示すグラ
フである。第２図はＨ−２モノクローナル抗体のヒト臓
器特異性および種特異性を示すグラフである。第３図は
ＬＳＰ抗原物質を用いて作成した抗原物質濃度標準曲線
を示す。
（Ｉg ）クラスおよびサブクラスの分析結果を示すグラ
フである。第２図はＨ−２モノクローナル抗体のヒト臓
器特異性および種特異性を示すグラフである。第３図は
ＬＳＰ抗原物質を用いて作成した抗原物質濃度標準曲線
を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】マウスをヒト肝細胞抗原で免疫して得られ
る脾細胞とマウスミエローマ細胞とを通常の方法で融合
し、ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体を産生
する能力を有する融合細胞を培地で培養するかまたはマ
ウス腹腔内に移植して腹水癌化することにより培養液中
または腹水中に該モノクローナル抗体を生成蓄積させ、
該培養液または腹水中より採取されたモノクローナル抗
体を含む酵素免疫反応を利用する急性肝炎または肝硬変
の診断剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60026532A JPH0623763B2 (ja) | 1985-02-15 | 1985-02-15 | モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60026532A JPH0623763B2 (ja) | 1985-02-15 | 1985-02-15 | モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61189299A JPS61189299A (ja) | 1986-08-22 |
| JPH0623763B2 true JPH0623763B2 (ja) | 1994-03-30 |
Family
ID=12196094
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60026532A Expired - Lifetime JPH0623763B2 (ja) | 1985-02-15 | 1985-02-15 | モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0623763B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6357596A (ja) * | 1986-08-29 | 1988-03-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 |
| EP1496066A4 (en) | 2002-03-25 | 2006-09-13 | Japan Science & Tech Agency | ANTIBODY RECOGNIZING PROLIFERATIVE HUMAN LIVER CELLS, PROLIFERATIVE HUMAN LIVER CELLS, AND FUNCTIONAL HUMAN LIVER CELLS |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58183629A (ja) * | 1982-04-21 | 1983-10-26 | Eisai Co Ltd | 非ａ非ｂ型肝炎関連モノクロナ−ル抗体および診断薬 |
| JPS59205327A (ja) * | 1983-03-11 | 1984-11-20 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | ヒト膀胱及び尿管がんに対するモノクロ−ナル抗体及び方法 |
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
| JPS59216298A (ja) * | 1983-05-25 | 1984-12-06 | 三菱電機株式会社 | 通報装置 |
| JPS6144900A (ja) * | 1984-08-08 | 1986-03-04 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体及び癌抗原検出用試薬 |
| JPS61183300A (ja) * | 1985-02-08 | 1986-08-15 | Green Cross Corp:The | モノクロ−ナル抗体 |
-
1985
- 1985-02-15 JP JP60026532A patent/JPH0623763B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61189299A (ja) | 1986-08-22 |
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