JPS6144900A - モノクロ−ナル抗体及び癌抗原検出用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 癌研究の究極の目標は、抗癌、制癌作用を示す物質の探
索と、癌の早期発見、即ち早期診断法の確立にあるとい
える。従来、癌に関して種々の薬剤、治療法、試薬が開
発されているが、これらはいずれも癌細胞ばかりでなく
、王宮組織、正常細胞にも影響を与え、如何に有効な薬
剤とはいえ、その副作用のために使用が著しく制限され
ているのが現状である。

免疫反応（抗原−抗体反応）ば、非常に特異性が高いも
のであるが、従来のポリクローン抗体ではいかに吸収操
作を繰り返しても、例えばリンパ球間のサブセットのよ
うな、非常にマイナーな抗原決定基によって区別される
ものを認識することは困難であった。、Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎらによって開発されたモノクローナル抗体（Ｋ６ｈｌ
ｅｒ、　ｃ、　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｃ，：　Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５　（１９７５
）　）は、この壁を打ち破るものであり、癌細胞上の癌
特異抗原、あるいは癌関連抗原を特異的に認識するモノ
クローナル抗体を得ることにより、正常組織へのダメー
ジを与えずに癌細胞のみを特異的に排除できるものと期
待される。また、モノクローナル抗体を用いた診断薬あ
るいは検査試薬は、正常血清成分に対する交差反応がな
く、感度良く、癌関連抗原、癌特異抗原を検出できるも
のと思われる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、特定の癌抗原に対して特異的に反応するモノ
クローナル抗体を提供するものである。

さらに本発明は、上記特定症に対する抗原検出用試薬を
提供するものである。

〔本発明の構成〕 本発明は、膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原に対して
特異的に反応するモノクローナル抗体よりなるものであ
る。

また、本発明は、上記モノクローナル抗体を凝集素とす
る膵臓癌、大腸癌及び膵臓癌から選ばれる少なくとも一
種の検出用試薬よりなるものである。

本発明のモノクローナル抗体は、下記特性を有する癌関
連抗原と特異的に反応するものである。

＋１）膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌患者血清中に存在する
。

（２１）ｆｉ蛋白である。

（３）ゲル濾過によって分子量を測定したところ、７０
万〜１５０万である。

なお、分子量は既知の蛋白質との比較によって決定した
。

＋４１０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）の溶媒に溶
解した時、２２１〜２２２ｎｍ及び２６２〜２６４ｎｍ
に極大吸収を示す。

（５）少なくとも、Ｃｏ１ｏ−２０１、ＴＥ−１〜４　
、ＮＰＣ−１２、ＭＫＮ−４５の株化癌細胞の培養土清
中に放出される。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄細胞と
の間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッド
をクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有する
特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクローン
を選択することによって製造される。その操作は、免疫
用細胞として下記細胞を使用する以外は、従来既知の方
法に準ずればよい。

抗体産生細胞は、例えば株化癌細胞より得られる抗原に
よって免疫させた動物からの牌細胞、リンパ節細胞、Ｂ
＝リンパ球である。株化癌細胞としては、結腸癌、膵臓
癌、大腸癌等の株化癌細胞などが例示される。

免疫させる動物としては、マウス、ラット、馬、ヤギ、
ウサギなどが例示される。

抗体産生細胞は、例えば次のようにして製造される。即
ち、例えば株化癌細胞を超音波処理等で破壊し、遠心分
１ｉ１）１（例、１０，０００〜２０．０００　Ｇ、１
０〜６０分）を行って細胞抽出液を得、この上清を分子
１）０万〜２００万の物質の分離が可能なゲル濾過担体
（例、セファデックス、セファクリル、セファロース、
バイオゲル等）を使用して分子篩し、高分子画分と低分
子画分とに分離する。かくして得られた分子量が約７０
万〜１５０万の高分子画分は、例えばＦｒｅｕｎｄ　Ｃ
ｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔと混和後、動物の免
疫用として使用する。免疫は、動物の皮下あるいは筋肉
内に週２〜３回注射すること、あるいは週１〜２回、３
〜７週間投与することによって行われる。最終免疫より
約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。

骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のも
のが使用される。抗体産生細胞と骨髄細胞とは同種動物
由来のものであることが好ましい。

細胞融合は、例えばＧ、　Ｋ６ｈｌｅｒ　（Ｎａｔｕｒ
ｅ　麗山。

４９５　　（１９７５）　）に記載の方法又はこれに準
する方法によって行われる。この際、４５％ポリエチレ
ングリコール（平均分子量４，０００）を用いて３０〜
４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させることによ
って行われる。

細胞融合によって得られた細胞はクローニングに付され
る。すなわち、当該細胞を、例えはマイカロブレート中
で培養し、増殖の見られたウェルの培養土清中の抗体価
を、例えば酵素抗体法などによって測定し、さらに例え
ば限界希釈法によってクローニングを行ってクローンを
得る。このクローンは、例えばあらかじめブリスタンを
投与したＢＡＬＢ／Ｃ腹腔内へ移植し、１０〜１４日後
にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。

なお、抗体価を測定するための酵素抗体法は、例えば次
のようにして実施される。すなわち、抗原（各種株化癌
細胞または部分精製癌関連抗原）をコートしたマイクロ
プレートに、検体を加え、−３７°Ｃで１時間反応させ
、洗浄後ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン
（Ｉ　ｇＧ＋　Ｉ　ｇＡ＋ＩｇＭ）ウサギ抗体を加え、
さらに３７℃で１時間反応させる。未反応の標識抗体を
洗浄後、〇−フェニレンジアミン液を加え、室温にて３
００分間反応せた後、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ
、４９０ｎｍの吸光度を測定する。

本発明の試薬は、前記した本発明のモノクローナル抗体
を凝集素とし、抗原−抗体反応によって膵臓癌、大腸癌
及び肝臓癌関連抗原を検出しうるものであればいかなる
態様でもよく、例えば抗体感作血球の態様にあ゛る試薬
（即ち、ＲＰＨＡ試薬）が好適なものとして例示される
。

ＲＰＨＡ試薬調製用に用いられる赤血球としては、従来
赤血球凝集反応用に用いられているものが使用でき、特
に動物を選ぶ必要はないが、安定でしかも感度の高い試
薬を得るためには、ヒツジ、ニワトリ、ヒトのＯ型光血
球等が望ましい。赤血球は、通常生理食塩水で十分洗浄
した後、ゲルタールアルデヒド、ホルマリン等で処理し
て安定化される。補助的にタンニン酸を用いることもで
きる。赤血球は５〜１５μｍ程度のものが好ましい。

かかる赤血球の抗原または抗体による感作は公知の方法
、例えば〔医学のあゆみ、７８．７５９（１９７０））
に記載の方法等によって実施することができる。

それには、赤血球と抗体とを緩衝液中で感作させるのが
よく、一般には赤血球浮遊液と抗体含有液を混合するこ
とにより行う。

本操作は、ｐ１）６．８〜８．５、温度２０〜６０℃で
行うのがよい。感作赤血球は凍結乾燥して、例えばバイ
アル中に、好ましくはナトリウムアジドなどの如き保存
剤を添加して、封入しておくことが好ましい。

当該試薬は、緩（ｈ液、例えば塩化ナトリウム加等張リ
ン酸緩衝液、ｐＨ７，２程度にて０．５％濃度となるよ
うに再溶解して測定に用いられる。

〔作用・効果〕

本発明のモノクローナル抗体は、膵臓癌、大腸癌及び肝
臓癌関連抗原と特異的に反応するものであるから、これ
ら癌に対する診断用試薬として有用であり、かつかかる
試薬はモノクローナル抗体、を使用するものであること
から、非常に高感度である。

実施例 免疫用癌関連抗原の調製： 株化結腸癌細胞（Ｃｏｌｏ−２０１株）を超音波処理法
で破壊し、遠心分離（１５，０ＯＯＧ、３０分）を行い
細胞抽出液を得た。この上清をセファロース４Ｂのカラ
ムを用い、ゲル濾過し、高分子画分と低分子画分とに分
離した。

分子量が約７０万〜１５０万の高分子画分を、Ｆｒｅｕ
ｎｄ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔと混和後、
マウスへ週１回、５週間免疫した。

最終免疫より４日後にマウス牌臓を取り出し、以下の細
胞融合に用いた。

細胞融合およびクローニング： 上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ　Ｉ　
　（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、　８１．１（１９７０）　）を４：１
の割合で混合し、Ｋ６ｈｌｅｎらの方法（Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　（Ａｃａｄｅｎｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ）　。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　３９１．　（１９７９）　）を一
部改変して、４５％ポリエヂレングリコール（平均分子
ｆｉ　４，０００）を用いて２分間反応させることによ
り細胞融合を行った。

本細胞をマイクロプレート中で培養し、増殖の見られた
ウェルの培養土清中の抗体価を酵素抗体法により測定し
、更に限界希釈法によりクローニングを行った。得られ
た２株のクローン（それぞれＫＭＯｌおよびＫＭＯ２と
名付ける）は、予めプリスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃ
の腹腔内へそれぞれ移植し、１０〜１４日後にモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水を採取した。

酵素抗体法： 抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原）をコ
ートしたマイクロプレートに検体を加え、３７“Ｃで１
時間反応させ、洗浄後ベルオキソダーゼ標識抗マウス免
疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ＋　Ｉ　ｇＡ＋ＩｇＭ）ウサギ
抗体を加え、更に３７℃で１時間反応させた。未反応の
標識抗体を洗浄後、０−フェニレンジアミン液を加え、
室温にて３０分間反応させた後、２Ｍ硫酸を加えて反応
を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。

抗体感作血球（ＲＰＨＡ試薬）の調製：モノクローナル
抗体（ＫＭＯ１及びＫＭＯ２）を含むマウス腹水から、
硫安分画法（４５％飽和）にてＩｇＧを精製した。この
精製抗体をそれぞれ今井らの方法〔医学のあゆみ、川、
７５９　　（１９７１）　）に準じてヒツジ赤血球に感
作し、未感作の抗体を十分洗浄除去した後、少量ずつ分
注し、凍結乾燥した。この感作血球をＡｎｔｉｈｅｂｓ
ｃｅｌｌ”（■ミドリ十字）に添付のリン酸緩衝液を用
いて０．５％濃度になるように再熔解し、測定に供した
。この再溶解した感作血球は４℃で保存する限り約２週
間は安定であった。

実験例１ 各種癌患者より得られた癌組織およびその周辺の正常細
胞の凍結切片を用い、本発明モノクローナル抗体ＫＭＯ
１及びＫＭＯ２の反応性を、ペルオキシダーゼ標識抗体
を用いたＡｖｒａｍｅａｓ　らの方法ＣＢｉｏｃｈｉｍ
ｉｅ、　５４．８３７　（１９７２）　）に準した酵素
抗体法にて測定した。

ＫＭＯ１及びＫＭＯ２のモノクローナル抗体は、いずれ
も直腸正常部組織とは反応しなかった。しかし、膵正常
部導管、肝癌組織、膵癌組織および直腸癌組織とは両抗
体とも反応した。

実験例２ ＫＭＯｌ及びＫＭＯ２のモノクローナル抗体を感作して
得たＲＰＨＡ試薬２種（ＫＭＯ１試薬及びＫＭＯ２試薬
）の特異性をみるため、株化癌細胞の培養上清との反応
性を検討し、その結果を第１表に示した。両ＲＰＨＡ試
薬はＣｏ１ｏ−２０１の培養上清と最も強く反応し、Ｔ
Ｉ！−３やＫＡＴＯ−■の培養上清とは中程度に、その
他ＴＥ−１、ＴＥ−２、ＮＲＣ−１２およびＭＫＮ−４
５の培養上清とも弱く反応することが判った。また、両
ＲＰＨＡ試薬の反応性に殆ど差はみられなかった。

実験例３ 各種癌患者血清につき、本発明試薬によって測定した結
果を第２表に示す。尚、対照として既存のＣＡ１９−９
（ミドリ十字社製）およびＣＥＡ（ミドリ十字社製）を
使用して測定した結果も第２表に示した。

〔以下余白〕

手続補正書印釦 昭和５９年１）月２０日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌関連抗原に対して特異
   的に反応するモノクローナル抗体。
2. （２）次の特性を有する癌関連抗原に対して特異的反応
   性を有する特許請求の範囲第（１）項記載のモノクロー
   ナル抗体： ［１］糖蛋白質である。 ［２］分子量が約７０万〜１５０万。 ［３］０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）の溶媒に熔解
   した時、２２１〜２２２ｎｍおよび２６２〜２６４ｎｍ
   に極大吸収を持つ。 ［４］膵臓癌、大腸癌及び肝臓癌患者の血清中に存在す
   る。 ［５］少なくとも、Ｃｏｌｏ−２０１、ＴＥ−１〜４、
   ＮＲＣ−１２、ＭＫＮ−４５の株化癌細胞の培養上清中
   に放出される。
3. （３）特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項記載の
   モノクローナル抗体を凝集素とする膵臓癌、大腸癌及び
   肝臓癌から選ばれる少なくとも一種の検出用試薬。