JPH06242109A - コラーゲンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 コラーゲン、特にヒトIV型コラーゲンをサン
ドイッチ法で測定するに際し、前記検体を摂氏３９〜６
０度で処理することを特徴とするコラーゲンの測定方
法。 【効果】 抗体とコラーゲンとの反応性を向上させるこ
とが可能となり、コラーゲンの測定感度が大幅に上昇す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はコラーゲンの測定方法、
特に免疫反応を用いたコラーゲンの測定方法の改良に関
する。

【０００２】

【従来の技術】血清中に存在する各種コラーゲンを測定
すると、健常人における測定値と比較して各種疾患者の
測定値が有意に高く、疾患の診断の予知に有効であるこ
とが知られており、コラーゲン測定の意義が高まってい
る。従来、血中ヒトIII型コラーゲンＮ末端ペプチド、
ヒトIV型コラーゲンＮ末端ペプチド７−Ｓドメイン及び
同Ｃ末端ペプチドＮＣ１ドメインの各ポリクローナル抗
体を用いて放射性免疫学的測定を行ったという報告がな
されている(Rohdeら、Eur.J.Clin.Invest.,9,451-459.1
979,Hogemannら、Clin,Chim.Acta,144,1-10,1984、Schup
panら、J.Clin.Invest.78.244-248.1986)。

【０００３】一方、各種病理組織について、モノクロー
ナル抗体を用いて組織化学的に疾患の解析を行うことが
検討されており、例えば血中ヒトIV型コラーゲンについ
て、２種のモノクロナール抗体を用いて酵素免疫学的測
定を行ったという報告がなされている(Obaraら、Clin,C
him.Acta,181,293-303,1989)。このように、血清中に存
在する各種コラーゲンの測定が疾患の診断に用いられつ
つある。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、正常人
検体の測定値の平均値に対する原発性肝癌疾患者の検体
の測定値の平均値は約４倍、また肝硬変患者の検体測定
値の平均値は約３倍と、差が小さく、且つ測定値が患者
間で大きく異なることにより正常値との比較だけでは診
断の判断が困難な場合があることが知られており、より
疾患の程度を感度良く反映する測定方法の開発が期待さ
れていた。

【０００５】本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされ
たものであり、その目的は肝疾患の判断が容易なコラー
ゲンの測定方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者らが鋭意検討した結果、予めまたは免疫反応
中に検体を熱処理することによって、血中ヒトIV型コラ
ーゲンが変化して抗体との反応性が亢進することを見出
し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本出願の請求項１記載のコラー
ゲンの測定方法は、コラーゲンに対するモノクローナル
抗体を用い、検体中のコラーゲンと結合させることによ
り、検体中のコラーゲンを測定するコラーゲンの測定方
法において、前記検体を摂氏３９〜６０度で処理するこ
とを特徴とする。

【０００８】また、測定対象のコラーゲンはヒトIV型コ
ラーゲンであることが好適である（請求項２）。

【０００９】また、固相担体に結合させる抗体及び標識
を付与する抗体としてコラーゲンに対するモノクローナ
ル抗体を用い、検体中のコラーゲンを前記固相側抗体及
び標識抗体によりサンドイッチ状に保持し、固相と液相
を分離し、固相または液相中の標識物質を測定すること
により検体中のコラーゲンを測定するコラーゲンの測定
方法において、前記検体を摂氏３９〜６０度で処理する
ことが好適である（請求項３）。

【００１０】以下、本発明の構成を詳述する。本発明に
かかる測定方法において、固相担体に結合させる抗体及
び各種標識を付与する抗体は、抗体含有物を硫安分画
後、プロテインＡアフィニティーカラムにより精製した
ＩｇＧ画分を一般に用いるが、不純物の少ない抗体含有
物の場合にはプロテインＡアフィニティーカラムにより
精製したＩｇＧ画分を用いることもできる。また、本発
明にかかる測定方法において、使用するモノクロナール
抗体は、それら抗体における特異的結合部分Ｆ（ａ
ｂ'）₂、あるいはＦａｂ'そのものを使用する態様も含
まれるものである。また、本発明におけるIV型コラーゲ
ンとは、ヒト基底膜関連コラーゲンであり、コラーゲン
複合体である血管基底膜コラーゲン複合体を含む。ま
た、本発明において検体の熱処理温度は摂氏３９度以上
であることが必要であり、一方温度が摂氏６５度を越え
ると抗体との反応性が低下するため、摂氏４０〜５５度
好ましくは４５〜５０度程度が望ましい。

【００１１】

【作用】本発明の作用については必ずしも明確ではない
が、高温処理によりコラーゲンの構造に変化が生じ、抗
体との反応性が向上するものと考えられる。

【００１２】

【実施例】温度の影響 本発明にかかる測定方法において、検体の熱処理温度
と、コラーゲン及び抗体間の反応性との関係を図１，
２，３に示す。すなわち、通常検体はその変性を防止す
るため低温下に保存されることが多く、また、測定は酵
素活性等の生体反応性が最も高いと考えられる摂氏３７
度程度で行なわれるのが一般的である。しかし、本発明
者らがさらに検討を進めたところ、検体をあらかじめ熱
処理すること（方法は実施例２…参照、但し温度は摂氏
３７〜６５度である）、及び免疫反応中に熱処理するこ
と（方法は実施例３…参照、但し温度は摂氏３０〜５６
度である）により、コラーゲンと抗体との反応性が向上
し、より正確なコラーゲン測定が可能となることを見出
した。図１，２，３に結果を示す。処理温度が摂氏３９
度から急激に測定感度が向上し、摂氏６０度程度まで該
感度が維持されることが判る。

【００１３】なお、温度が高すぎると抗体との反応性が
低下するため、摂氏４０〜５５度好ましくは４５〜５０
度が望ましい。また、熱処理は検体を希釈した後行なう
のが望ましいが、免疫反応前の処理、あるいは免疫反応
中の処理のいずれでもよい。免疫反応前に高温処理を行
うことでも測定感度が向上することから、単に化学反応
が温度上昇に伴って早くなるのではなく、コラーゲンの
構造変化により免疫反応性が向上することが示唆され
る。

【００１４】実施例１ 抗ヒトIV型コラーゲンに対する
モノクローナル抗体の作製 （ａ）抗原−ペプシン可溶化ヒトIV型コラーゲンの調製 新鮮なヒト胎盤２７５０ｇを裁断し洗浄、ポジトロンホ
モジナイザーでホモジネートした後、冷凍遠心（１０，
０００×ｇ，４０分間）して、沈殿物を集め０．０２Ｍ
リン酸ナトリウム液に懸濁後、冷凍遠心を３回繰返し
た。得られた沈殿物を０．５Ｍの酢酸４ｌに懸濁し、塩
酸でｐＨ３とし、ペプシンを加え摂氏４度で７日間反応
させた。遠心（１０，０００×ｇ，１時間）して上澄み
を集め、ペプシンを失活させるためにトリスと水酸化ナ
トリウムを加えてｐＨ８．５に調製し、２日間放置し
た。中和後塩化ナトリウムを４Ｍになるように加え、さ
らに氷酢酸を加えてｐＨ３とし、一晩放置した。遠心後
（１０，０００×ｇ，１時間）上澄みを回収し、沈殿に
０．５Ｍ酢酸を加えて５時間攪拌した。遠心後（１０，
０００×ｇ，１時間）上澄みに塩化ナトリウムを１．２
Ｍになるように加え、一晩放置した。遠心後（１０，０
００×ｇ，１時間）沈殿を集め、０．５Ｍ酢酸を加えて
溶かし、溶けている部分（上澄み）のみを集める。上澄
みを水に対して透析し、遠心によって沈殿を除いた。得
られた上澄みにトリス−塩化ナトリウム溶液を加えてい
き、最終的にトリスが０．１Ｍ、塩化ナトリウムが１．
０Ｍになるようにした。溶けていない部分は遠心で除
き、上澄みを０．００５Ｍトリス−１．５Ｍ塩化ナトリ
ウムに対して塩析した。遠心により沈殿物を集め、０．
０５Ｍトリス−１．５Ｍ塩化ナトリウムに溶解した。こ
れをフォスフォセルロースカラムクロマトグラフィーで
精製し、２３５mgのヒトIV型コラーゲンを得た。

【００１５】（ｂ）免疫した脾細胞の調製 ヒトIV型コラーゲン１００μｇを含む０．１mlのリン酸
緩衝液を調製し、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内注射を行
った。一週間後に同様の処置で２回目の免疫を行った。
１回目と２回目の免疫時にはＢＡＣＴＯ−Ａｄｊｕｖａ
ｎｔ（ＤＩＦＣＯ社製）を０．１mlづつ同時に腹腔内注
射した。さらに１週間後、上記ヒトIV型コラーゲン溶液
で追加免疫を行った。最終追加免疫後、７２時間目にこ
のマウスより脾臓を無菌的に抽出し、はさみで切片とし
てメッシュを通してリンパ球の懸濁液を得た。赤血球の
混在を除くために溶血用バッファーに浮遊後１５００ｒ
ｐｍで５分間遠沈させ、ＲＰＭＩ−１６４０培養液で２
回洗浄した。一方融合細胞としてのマウスミエローマ細
胞（ＳＰ２／０）は、融合の前々日より１０％牛胎児血
清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液中で１０
％ＣＯ₂、３７度の条件で増殖させた。脾細胞１００×
１０⁶個と、ミエローマ細胞１００×１０⁶個を含む培養
液を混合し、１５００ｒｐｍで３０分間遠心後、上清を
捨て、５０％ポリエチレングリコール４０００（メルク
社製）１mlを１滴づつ滴下しながらゆっくりと細胞をほ
ぐした。１分後、ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培養液
を１mlゆっくりと滴下しながら細胞を混合させ、同様の
操作を１分間繰返した。さらにＦＣＳを含むＲＰＨＩ−
１６４０培養液７mlを３分間かけてゆっくりと遠心管を
回転させながら加えた。この時点で培養液をさらに加
え、２００×１０⁶個の細胞が５０mlの培養液に含まれ
るように調製し、この細胞懸濁液０．１mlづつを９６穴
マイクロプレートに分注し、１０％ＣＯ₂下で摂氏３７
度（１００％相対湿度）で培養した。なお、マイクロプ
レートには予めマウスの貪食細胞を１０⁴個／ウェルの
割合で加えておき、またウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６
４０培養液には分注時にすでにＨＡＴ（ヒポキサンチ
ン、アミノブテリン、チミジン）を含むものを用いた。
この改良法によると少なくとも５日間まで培養液を換え
る必要がなく、バクテリアの混在の危険も少なくするこ
とができ、５日前後までにはハイブリドーマのコロニー
が認められた。１０〜２５日後にこの培養液上清を０．
２mlとり目的抗体のスクリーニングに用いた。スクリー
ニングはコラーゲン実験法（講談社４９６頁）の方法に
従った。すなわち、ヒトIV型コラーゲンの１００μg/m
l、リン酸緩衝溶液を塩化ビニル製マイクロプレートの
各ウェルに１滴づつ加え、一晩摂氏４度で放置した。ヒ
トIV型コラーゲン溶液を除去した後に１０％ウシ血清−
リン酸緩衝溶液をピペットで３滴各ウェルに加え、１時
間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除去した
後、各ハイブリドーマコロニーの上清を１滴づつ別々の
所定のウェルに加えた。１時間反応させた後、上清を除
去しリン酸緩衝溶液で３回洗浄した。

【００１６】二次抗体としてＦＩＴＣ（フルオレッセン
イソチオシアネート）で標識した抗マウスＩｇＧ（Ｆ
（ＡＢ）₂フラグメント）溶液を加え、３０分間放置
し、二次抗体溶液を除去して充分洗浄した。上記検体上
清の中から蛍光を発するものを選び、これに対応するハ
イブリドーマ３種を得、これらハイブリドーマを制限希
釈法によりクローニングした。まず、ハイブリドーマが
１ウェルあたり０．３個、１．０個、３個となるように
培養液で希釈した。このとき、１ウェルあたり１００万
個の胸腺細胞を加えて正確に希釈できるようにした。マ
イクロプレートは摂氏３７度で１０％ＣＯ₂ １００％
相対湿度の条件で培養した。５日目に検鏡し、１ウェル
中に１個のコロニーを含むものをチェックしておき、２
週間成育したところで同様の制限希釈を繰り返した。こ
の操作を３回繰り返して最終的に１種類のコロニーを選
択し、該コロニーを通常の培養器にうつしかえ、それぞ
れ５mlの培養液で５×１０⁶個／mlになるまで培養し
た。コロニーの培養液を遠心管に移し、１５００rpmで
５分間遠沈させ、上清と細胞を分離し、細胞にはＲＰＭ
Ｉ−１６４０培養液をあらたに０．５ml加えゆっくり懸
濁させた。この細胞懸濁液に４．５mlのＦＣＳを含むＲ
ＰＭＩ−１６４０培養液を加え継代培養した。すなわ
ち、細胞１×１０⁶個を、５mlのウシ血清を含むＲＰＭ
Ｉ培養液に懸濁させ、５％ＣＯ₂ 摂氏３７度 １００
％相対湿度の条件で培養する。６０時間後５×１０⁶個
に増殖し、この操作で１代の培養となる。この細胞を遠
心分離機で培養液と分離し、新しい培養液を加えて希釈
する。１×１０⁶個／mlに希釈された細胞培養液１mlに
４mlの培養液を加えるという操作で継代培養される。１
０代継代培養された５０mlの培養液から遠心分離により
５×１０⁷個の細胞を得、５ｌの培養液に懸濁させた。
これを回転培養ビン１０本に分注し、５％ＣＯ₂ 摂氏
３７度 １００％相対湿度１rpmの条件で５日間培養し
た。５×１０⁶／mlに達した培養液から遠心分離で細胞
を除き、吸引濾過し、濾液に硫酸アンモニウムを加え４
５％として沈殿物を得た。沈殿物はさらにプロテインＡ
により精製した。計１５ｌの培養液から７３mgの抗ヒト
IV型コラーゲンモノクローナル抗体を粉末として得た。
この抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗体はＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドであ
り、ＪＫ１９９と名付けた

【００１７】又、同方法により計１５ｌの培養液から９
２mgの抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル抗体を粉末
として得た。この抗ヒトIV型コラーゲンモノクローナル
抗体は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単
一のバンドであり、ＪＫ１３２と名付けた。

【００１８】（ｃ）ＪＫ１９９抗体及びＪＫ１３２抗体
の免疫グロブリンサブクラス ＪＫ１９９抗体及びＪＫ１３２抗体の免疫グロブリンサ
ブクラスはオクタロニー二重免疫拡散法により行い、両
抗体ともにＩｇＧ２ａであると判明した。

【００１９】（ｄ）ＪＫ１９９抗体及びＪＫ１３２抗体
の反応特異性 各種抗原を１μg/mlになるようにリン酸緩衝液に溶解
し、これらの溶液を０．１ml正確に塩化ビニル製マイク
ロプレートの各ウェルに滴下し摂氏４度で一晩放置し
た。抗原溶液を除去した後、１０％ウシ胎児血清を０．
５ml各ウェルに加え、１時間ブロッキングした。ブロッ
キング溶液を除去した後、１０μg/mlに調整したＪＫ１
９９ ０．１mlを各ウェルに滴下し、１時間反応させ
た。リン酸緩衝液でよく洗浄した後、二次抗体としてペ
ルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ
社製）を０．２mlづつ各ウェルに加え、１時間反応させ
た。二次抗体溶液を除いた後、リン酸緩衝液で４回洗浄
し、０．００１％過酸化水素を含む基質溶液を０．１ml
各ウェルに加えた。基質溶液はｏ−フェニレンジアミン
を使用直前に０．１Ｍクエン酸−０．２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ４．８）に溶解し、０．４mg/mlとしたものを用
いた。１０分後、各ウェルに２０μｌの８Ｍ硫酸溶液を
加え反応を停止させ、マイクロプレート光度計で４９２
nmの吸光度を測定した。結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】 ──────────────────────────────────── ＳＰ２／０ ＪＫ１９９ ＪＫ１３２ ──────────────────────────────────── ヒトＩ型コラーゲン ０．０１ ０．０７ ０．０３ ヒトIII型コラーゲン ０．０１ ０．０７ ０．０２ ヒトＶ型コラーゲン ０．０１ ０．０９ ０．０４ ヒトIV型コラーゲン ０．０３ １．２８ １．０７ ウシIV型コラーゲン ０．０４ ０．０５ ０．０７ ヒトフィブロネクチン ０．０１ ０．０２ ０．０３ マウスラミニン ０．０８ ０．０７ ０．０７ ヒトラミニン ０．１０ ０．０９ ０．１０ ──────────────────────────────────── ＊数値は使用したリン酸緩衝液の４９２nmの吸光度を
０．００とした場合の各サンプルの吸光度 ＊ＳＰ２／０は対照としてミエローマ細胞の培養液をサ
ンプルとしたもの

【００２１】表１から明らかなようにＪＫ１９９及びＪ
Ｋ１３２はヒト基底膜由来のコラーゲン画分であるIV型
コラーゲンを特異的に認識し、他の型のコラーゲン画
分、すなわちヒトＩ型コラーゲン画分、ヒトIII型コラ
ーゲン画分や、ウシIV型コラーゲン画分は認識せず、ヒ
トフィブロネクチン、ヒトラミニン、マウスラミニンも
認識しなかった。

【００２２】実施例２ 熱処理血清を用いたヒトＩＶ型
コラーゲンの定量 次に熱処理した血清を用いるヒトIV型コラーゲンの定量
方法について説明する。なお、本実施例においてはいわ
ゆる３ステップのサンドイッチ法を用いた。すなわち、
図４（Ａ）に示すように、ウェル壁１０に抗体１２を結
合させる。この抗体に対し、検体中のコラーゲン１４を
結合させ、さらにビオチン化抗体１６をコラーゲン１４
に結合させる（図４（Ｂ））。そして、固相と液相を分
離し、固相のビオチン化抗体１６にアビジン−ＰＯＤ１
８を結合させ（図４（Ｃ））、アビジン−ＰＯＤ１８の
酵素活性部位により化学反応を進行させ、その化学反応
量によりコラーゲン量を測定するものである（図４
（Ｄ））。次に、このサンドイッチ法の詳細を説明す
る。

【００２３】（ａ）ビオチン標識モノクローナル抗体の
調製法 実施例１(b)で得られた精製モノクロナール抗体（ＪＫ
１３２）を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に１mg/ml
となるように溶解させた。この溶液１mlに対して、Ｎ−
ヒドロキシサクシイミドビオチンを１mg/mlの濃度にジ
メチルスルオキサイドに溶解させた溶液を０．０６ml加
え、攪拌しながら室温で４時間反応させた。反応液をリ
ン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）に対して十分に透析
後、冷蔵又は凍結保存した。

【００２４】（ｂ）血清の熱処理法 標準試料として実施例１(a)で得られた精製ペプシン可
溶化ヒトIV型コラーゲンを、ゼラチン水解物４．５％及
びヘパリンナトリウム１０００U/mlを含むリン酸緩衝生
理食塩液（ｐＨ７．４ ＧＨ緩衝液）で１０００ng/ml
に調整し、これを段階希釈したものを各試験管あたりそ
れぞれ７０μｌ用い、それぞれの試験管に更に正常者血
清より調整した標準血清を各試験管あたり７０μｌ、Ｇ
Ｈ緩衝液を各試験管あたりそれぞれ１４０μｌ加えた。
一方、血清試料として正常者（ＮＯＲ）、肝癌（ＨＣ
Ｃ）、肝硬変（ＬＣ）、慢性肝炎（ＣＨ）の患者のそれ
ぞれの血清を各試験管あたりそれぞれ７０μｌ用い、そ
れぞれの試験管にさらにＧＨ緩衝液を各試験管あたり２
１０μｌ加えた。これらの溶液を４５度の水浴中に１時
間静置した（表２参照）。

【００２５】

【表２】

【００２６】（ｃ）固相担体としてポリスチレン製マイ
クロプレート（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
製）を用いた３段階サンドイッチ法 実施例１(b)で得られたヒトIV型コラーゲンに対する精
製モノクローナル抗体（ＪＫ１９９）をリン酸緩衝生理
食塩液（ｐＨ７．４）に溶解し、その濃度を１４．５μ
g/mlに調製した。この抗体溶液を固体担体としてのポリ
スチレン製マイクロプレートにコートするために１ウェ
ル当り１００μｌ添加し、摂氏３７度、２４時間処理後
ブロックエース（大日本製薬）をリン酸緩衝生理食塩液
（ｐＨ７．４）で１／４希釈したブロッキング緩衝液を
１ウェル当たり３５０μｌ添加し、摂氏３７度、１時間
処理してブロックし、よく水分を切った後に冷凍保存す
る。使用時に予め室温に戻してアッセイに使用する（図
４（Ａ））。

【００２７】次に、熱処理した試料を１ウェル当り１０
０μｌ添加し、摂氏３７度、２時間インキュベーション
（免疫反応）後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸
緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４ 洗浄緩衝液）にて洗浄す
る。そして、実施例２(a)で得られたビオチン化したヒ
トIV型コラーゲンに対する精製モノクローナル抗体（ビ
オチン化ＪＫ１３２）を０．２μg/ml、マウスＩｇＧを
２μg/ml含む洗浄緩衝液（ビオチン化抗体液）を１ウェ
ル当り１００μｌ添加し、摂氏３７度、１時間インキュ
ベーション（免疫反応）後、洗浄緩衝液にて洗浄する
（図４（Ｂ））。

【００２８】次にアビジン化西洋ワサビ由来ペルオキシ
ダーゼ(Vector Laboratories)を０．５μg/ml含む洗浄
緩衝液(av-POV液)を１ウェル当り１００μｌ添加し、摂
氏３７度、０．５時間インキュベーション（免疫反応）
後、洗浄緩衝液にて洗浄する（図４（Ｃ））。次に2,2'
-azino-di[3-ethyl-benzthiazoline] sulfonate(ABTS)
を基質とするペルオキシダーゼ基質システム(Kirkegaar
d & Perry Laboratories)を１ウェル当り１００μｌ添
加し、室温にて３０分間インキュベーション（発色反
応）後、マイクロプレートリーダーで波長４０５nmの吸
光度を測定し、盲検と試料の吸光度の差を求める（図４
（Ｄ））。標準試料より作成した検量線より検体の吸光
度に相当するIV型コラーゲン量を求めた（表３参照）。

【００２９】図５にペプシン可溶化コラーゲンの検量線
を示した。同図より明らかなごとく、定量感度は０．３
９１ng/0.1mlであり、定量範囲は０．３９１〜１２５ng
/0.1mlであった。また、同一検体を測定した時の同時再
現性及び日差再現性はいずれも良好な結果が得られた。

【００３０】

【表３】 測定条件 ──────────────────────────────────── 検体 検量線標準液 ──────────────────────────────────── 熱処理サンプル １００μｌ １００μｌ 抗体結合マイクロプレート ２ウェル ２ウェル 第１次免疫反応 混和後３７度２時間静置 洗浄 洗浄緩衝液３５０μｌで３回洗浄 ビオチン化抗体液 １００μｌ １００μｌ 第２次免疫反応 混和後３７度１時間静置 洗浄 洗浄緩衝液３５０μｌで３回洗浄 ａｖ−ＰＯＤ液 １００μｌ １００μｌ 洗浄 洗浄緩衝液３５０μｌで３回洗浄 基質液 １００μｌ １００μｌ 発色反応 室温で３０分静置 比色 波長４０５nmで吸光度測定 ────────────────────────────────────

【００３１】また、図６に表２に示した血清中のヒトIV
型コラーゲンの測定結果を示した。同図より明らかなよ
うに、血中ヒトIV型コラーゲンを定量すると、肝線維化
の程度を反映する測定値の上昇が認められた。

【００３２】実施例３ 熱処理法によるヒトIV型コラー
ゲンの定量 次に免疫反応中に熱処理をするヒトIV型コラーゲンの定
量方法について説明する。なお、本実施例においてはい
わゆる１ステップのサンドイッチ法を用いた。すなわ
ち、図７（Ａ）に示すようにウェル壁１０にアビジン１
２を介して結合したビオチン化抗体とＰＯＤ−抗体１８
を、検体中のコラーゲン１６に同時に反応させる。つい
で、固相と液相を分離し、固相上のビオチン化抗体１４
に対し、検体中のコラーゲン１６を結合させ、さらにＰ
ＯＤ−抗体１８をコラーゲン１６に結合させた複合体を
得る（図７（Ｂ））。そして、ＰＯＤ−抗体１８の酵素
活性部位により化学反応を進行させ、その化学反応量よ
りコラーゲン量を測定するものである（図７（Ｃ））。
次に、このサンドイツチ法の詳細を説明する。

【００３３】（ａ）ビオチン抗体（ビオチン−Ｆａ
ｂ’）の調製 モノクローナル抗体（ＪＫ１９９；１０ｍｇ／２ｍｌ）
液を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）にて透析し、こ
れにペプシン溶液（ベーリンガー・マンハイム社製；２
０ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ酢酸緩衝液；５０μｌ）を加
え、３７℃で６０分間反応させた。反応液を遠心分離
し、上清をセファクリル−Ｓ−２００カラム（直径１．
５ｃｍ×５０ｃｍ，溶出液：０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐ
Ｈ６．０）にかけ、Ｆ（ａｂ’）₂分画を得た。このＦ
（ａｂ’）₂分画にジチオスレイトールを濃度が２０ミ
リモル／ｌになるように加え、３７℃で１時間反応させ
た。反応液を遠心分離し、上清をセファクリル−Ｓ−２
００カラム（直径１．５ｃｍ×５０ｃｍ，溶出液：０．
１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ６．０）にかけ、Ｆａｂ’分画
を得た。Anal.Biochem.149,529〜536(1985)記載の方法
に従い、３−（Ｎ−マレイミドブチリル）−ビオシチン
（ＭＢＢ）を合成し、Ｆａｂ’（１．６６mg/１．３m
l）にＭＢＢ溶液（０．５mg/ml ０．１Mリン酸緩衝液
ｐＨ６．０ ０．５ml）を加え、室温で２時間反応さ
せた。反応液を遠心分離し、上清をセファデックス−Ｇ
−２５カラム（直径１．５cm×３０cm、溶出液：０．１
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０）にかけ、ビオチン−Ｆａ
ｂ’を得た。

【００３４】（ｂ）固相の調製 ＢＳＡ（オリエンタル社製、Ｆ−Ｖ；３０ｍｇ）を０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，０．１ｍｌ）に溶解
し、これにＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン溶液（ピアス社製、
１６．８ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ
７．０；１ｍｌ）を加え、３０℃で１時間反応させた。
反応液を遠心分離し、上清をセファデックス−Ｇ−２５
カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ，溶出液：５０ｍＭ
炭酸緩衝液ｐＨ９．６）にかけ、ビオチン−ＢＳＡ分画
を得た。上記工程で得たビオチン−ＢＳＡを５０ｍＭ炭
酸緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、ビオチン−ＢＳＡ濃
度を１０μｇ／ｍｌに調製した。この液（１５０μｌ）
をプレート（ヌンク社製，イムノプレートＩ，９６穴）
のウェルに分注し、室温にて１時間反応させて固定化し
た。ウェルを生理食塩水で数回洗浄した後、ブロック溶
液（０．５％ＢＳＡ；３００μｌ）をウェルに分注し、
室温にて１時間静置した。次いで、ウェルを生理食塩水
で数回洗浄後、アビジン溶液（ベクター社製，アビジン
Ｄ，５０μｇ／ｍｌ ０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ７．
０；１５０μｌ）をウェルに分注し、室温にて２時間反
応させた。ウェルを生理食塩水で数回洗浄した後、前記
（ａ）で調製したビオチン−Ｆａｂ’液［１．６μｇ／
ｍｌ（１０ｍＭ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０ ０．１５
Ｍ ＮａＣｌ，０．５％ＢＳＡ）；１５０μｌ］を加
え、室温にて１夜（１８〜２２時間）反応させ処理し、
固相を得た。

【００３５】（ｃ）ＰＯＤ−Ｆａｂ’の調製 モノクローナル抗体（ＪＫ１３２）を用い、前記（ａ）
のＪＫ１９９と同様の方法でＦａｂ’を得た（但し、ペ
プシン消化の時間を３０分とした）。ＰＯＤ（ベーリン
ガー・マンハイム社製；６ｍｇ）を０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０； ０．８ｍｌ）に溶解し、これにＮ−
（γ−マレイミドブチリルオキシ）サクシンイミド（同
仁化学（株）製）液（８０ｍｇ／ｍｌ Ｎ，Ｎ’ジメチ
ルホルムアミド；５０μｌ）を加え、３０℃で１時間反
応させた。反応液を遠心分離し、上清をセファデックス
−Ｇ−２５カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ，溶出
液：０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ６．０）にかけ、ＰＯ
Ｄ−マレイミド分画を得た。Ｆａｂ’（１ｍｇ）に対し
てＰＯＤ−マレイミド（１ｍｇ）を加え、冷所にて２０
時間反応させた。反応液を遠心分離し、上清をセファク
リル−Ｓ−２００カラム（直径１．５ｃｍｘ５０ｃｍ，
溶出液：０．１Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ６．５）にかけ、
ＰＯＤ−Ｆａｂ’分画を得た。

【００３６】（ｄ）IV型コラーゲンの定量法 IV型コラーゲン（シグマ社製）をIV型コラーゲンを含ま
ないヒト血清に溶解し、コラーゲン濃度０〜１０００ｎ
ｇ／ｍｌの試料を調製した。固相のウェルに試料２０μ
ｌを入れ、さらに、酵素標識抗体液［ＰＯＤ−Ｆａｂ’
（約２０ＩＵ）に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０，０．３Ｍ塩化ナトリウム，０．５％ＢＳＡ含有）を
加え、全量を１０ｍｌとしたもの；１００μｌ］を加
え、４５℃で３時間加温した。反応後、反応液を吸引除
去し、洗浄液（生理食塩水）を加え、洗浄液を吸引除去
した。この洗浄操作をさらに４回繰り返した。洗浄後、
基質液［ＡＢＴＳ１ｍｇ／ｍｌ，０．０１％過酸化水
素，０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ４．２；１５０μｌ］
を加え、３７℃で３０分間反応させた後、この液の吸光
度を４１５ｎｍ（主波長）及び６５０ｎｍ（副波長）又
は４０５ｎｍで測定し、検量線を作成した（図８）。

【００３７】この検量線を用いて、正常：２０例，慢性
肝炎：２０例，肝硬変：２１例の血中IV型コラーゲンを
同様の方法により測定し、疾患別分布について調べた。
結果を図９に示す。平均は正常対照者で１５ｎｇ／ｍ
ｌ、慢性肝炎で５５ｎｇ／ｍｌ、肝硬変で９３ｎｇ／ｍ
ｌと肝線維化の進行が進むに従い、IV型コラーゲンの値
が上昇した。

【００３８】図６及び図９に見られるように、本発明に
かかる方法で測定した肝疾患者血清中のヒトIV型コラー
ゲンの濃度の測定値は、正常人血清中の測定値よりも明
らかに高い値を示す。従って、本発明の測定方法を用い
れば、血中ヒトIV型コラーゲンの濃度を測定することに
より、患者に負担のかかるバイオプシーを実施すること
なく、肝疾患、特に肝線維化、肝癌及び肝転移消化器癌
を予知することができる。

【００３９】従来の肝機能判定法として用いられるＺＴ
Ｔ（硫酸亜鉛混濁反応）、ＧＯＴ（グルタミンオキザロ
酢酸トランスアミナーゼ）、ＧＰＴ（グルタミンピルビ
ン酸トランスアミナーゼ）、ＡＬＰ（アルカリフォスフ
ァターゼ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、γ−ＧＴＰ
（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）等の測定で
は、肝組織の線維化、肝癌及び肝転位消化器癌を判定す
ることが困難であることが知られており、本発明にかか
る測定方法により血中ヒトIV型コラーゲンの濃度を測定
することにより、この種の疾患の早期発見も可能となる
ことが期待される。本発明にかかる測定方法によりヒト
IV型コラーゲンの濃度測定に基づく肝組織の線維化、肝
癌及び肝転移消化器癌の診断を行うことができるので、
本発明は著しい有用性を有するものである。

【００４０】

【発明の効果】以上説明したように、本発明にかかるコ
ラーゲンの測定方法によれば、検体を摂氏３９〜６０度
で処理することとしたので、抗体とコラーゲンとの反応
性を向上させることが可能となり、コラーゲンの測定感
度が大幅に上昇する。また、測定対象のコラーゲンがヒ
トIV型コラーゲンであることで、特に肝疾患の診断を容
易にすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】，

【図２】，

【図３】検体を熱処理した場合の、抗体とコラーゲンの
反応性を示す説明図である。

【図４】実施例２で用いるコラーゲン測定方法の概念を
示す説明図である。

【図５】実施例２の方法によるコラーゲンの検量線図で
ある。

【図６】実施例２による疾患別ヒトIV型コラーゲンの血
中濃度の測定例の説明図である。

【図７】実施例３で用いるコラーゲン測定方法の概念を
示す説明図である。

【図８】実施例３にかかるコラーゲンの測定法によるコ
ラーゲンの検量線図である。

【図９】実施例３による疾患別IV型コラーゲンの血中濃
度の測定例の説明図である。

【手続補正書】

【提出日】平成６年４月２７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図９

【補正方法】削除

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 重喜 大阪府三島郡島本町若山台２丁目２番22− 202号 (72)発明者 藤尾 美恵子 大阪府茨木市新中条町10−５ サンフォレ スト新中条207

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コラーゲンに対するモノクローナル抗体
   を用い、検体中のコラーゲンと結合させることにより、
   該検体中のコラーゲンを測定するコラーゲンの測定方法
   において、前記検体を摂氏３９〜６０度で処理すること
   を特徴とするコラーゲンの測定方法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の方法において、測定対象
   のコラーゲンはヒトIV型コラーゲンであることを特徴と
   するコラーゲンの測定方法。
3. 【請求項３】 固相担体に結合させる抗体及び標識を付
   与する抗体としてコラーゲンに対するモノクローナル抗
   体を用い、検体中のコラーゲンと結合させることにより
   前記固相側抗体及び標識抗体によりサンドイッチ状に保
   持し、固相と液相を分離し、固相または液相中の標識物
   質を測定することにより検体中のコラーゲンを測定する
   コラーゲンの測定方法において、前記検体を摂氏３９〜
   ６０度で処理することを特徴とするコラーゲンの測定方
   法。