JPH0580053A - ヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法 - Google Patents

ヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法

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JPH0580053A
JPH0580053A JP3059135A JP5913591A JPH0580053A JP H0580053 A JPH0580053 A JP H0580053A JP 3059135 A JP3059135 A JP 3059135A JP 5913591 A JP5913591 A JP 5913591A JP H0580053 A JPH0580053 A JP H0580053A
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澤 志 朗 野
Katsumi Tsukasaki
崎 克 己 塚
Motoko Kawamoto
本 元 子 川
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 特殊な技術や機器を必要とせず、誰にでも簡
便に、しかも客観的に的確に子宮体癌細胞の検出を行な
うことが可能な方法の開発。 【構成】 検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜
細胞、子宮内膜組織またはそれらの破砕物を用い、該検
体を担体上の複数の領域に固相化し、子宮体癌細胞に特
異的に結合するＭＳＮ−１抗体に標識剤を結合させてな
る標識ＭＳＮ−１抗体およびヒト細胞に普遍的に存在す
るアクチンに対する抗体に標識剤を結合させてなる標識
抗アクチン抗体を固相化された検体と反応させ、検体と
未結合の標識ＭＳＮ−１抗体および標識抗アクチン抗体
を除去し、検体と結合した標識ＭＳＮ−１抗体および標
識抗アクチン抗体の各々について、標識剤の示す信号強
度を測定し、標識抗アクチン抗体中の標識剤の示す信号
強度ｘを基準として、標識ＭＳＮ−１抗体中の標識剤の
示す信号強度ｙを評価し、子宮体癌細胞の有無を測定す
るヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、子宮内膜細胞または子
宮内膜組織中の子宮体癌細胞を免疫化学的に検出する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、本邦における食生活の欧米化や国
民の長寿化に伴ない、子宮体癌は増加しつつあり、現在
では、全子宮癌中の１０〜２０％を占めるに至ってい
る。このような実情に鑑み、１９８７年６月より、老人
保健法に子宮体癌検診が導入され、子宮体癌の早期発見
を目指した体癌検診の普及が法律的にも進められていく
ことになった。現在、体癌検診は、主に子宮内膜細胞診
によって行なわれ、その有用性は高く評価されている。
しかし、細胞診には熟練した技術が必要であり、しか
も、体癌は腺癌であるため、従来の形態学的診断基準の
みでは、細胞標本の良性、悪性の判定に、時として困難
を伴なうのが現状である。それゆえ、集団検診やマスス
クリーニングに適用可能な、簡便な手法で、大量の検体
を短時間に検査することができ、かつ、より的確に判定
可能な方法が望まれた。
【０００３】ところで、特異性の高いモノクローナル抗
体を用いた免疫組織化学的染色法は、広く一般的に行な
われており、腫瘍細胞に対して特異的に反応するモノク
ローナル抗体を使用する方法は、細胞標本の良性、悪性
のより的確な判定に有用であると考えられた。そこで、
野澤らは、子宮体癌細胞に高い反応性を有するモノクロ
ーナル抗体（抗体番号：ＭＳＮ−１）を作製（日本産婦
人科学会雑誌、３９巻、５５９頁、１９８７年参照）
し、子宮体癌患者及び正常人の子宮内腔より採取した組
織を検体として免疫組織化学的染色を行なったところ、
子宮体癌患者の９０％以上が陽性となり、正常人からの
検体ではほとんど染色されなかった（Nozawa S. et.a
l., American Journal of Obsterics and Gynecology,
161, p.1079,1989）。しかし、免疫組織化学的染色の場
合には、判定基準が主観的とならざるをえず、しかも、
時に偽陽性という判定がなされるので、さらに改良され
た方法の開発が望まれた。
【０００４】そこで、前記モノクローナル抗体（抗体番
号：ＭＳＮ−１）の性質を調べたところ、本抗体は、子
宮体癌細胞に含まれる中性糖脂質の糖鎖を認識してお
り、その反応部位は、少なくとも細胞表面に存在してい
ることが示唆されたので、本抗体のフローサイトメトリ
ーへの応用を検討した。その結果、正常細胞と腫瘍細胞
とを識別できる可能性が示唆された。フローサイトメト
リーは、データの客観性が高いので、本抗体を用いるフ
ローサイトメトリーによる子宮体癌の診断は有用と考え
られた（American Journal of Obsterics and Gynecolo
gy, 161, p.1079,1989）。しかし、この方法は、手技が
煩雑で、使用する機械も高価であり、しかも多くの検体
を短時間で検査するには不向きであった。
【０００５】上記のような子宮体癌の診断に特有の問題
に加え、次のような問題もある。すなわち、一般に、血
中の特定物質、例えば腫瘍マーカーを測定し、その測定
結果から、陽性・陰性を判定する場合や、その測定値が
正常値の範囲内であるか否かを判定する場合、カットオ
フ値あるいは基準値を設け、それに基づいて判定を行な
っている。これは、健常人や良性疾患患者でも、腫瘍マ
ーカーの血中濃度が高くなることがあるため、測定値が
高くても必ずしも癌であると判定できない偽陽性例が存
在するためである。このような現象が生じる原因は、種
々考えられ、例えば、使用する抗体の特異性の問題や、
検体中の干渉成分による非特異的な反応などの関与が挙
げられる。
【０００６】そして、この問題は、前記モノクローナル
抗体（抗体番号：ＭＳＮ−１）を用いた子宮体癌の診断
にもあてはまることが明らかとなった。すなわち、一部
の健常者あるいは良性の子宮内膜疾患の患者から採取し
た子宮内膜細胞に、該モノクローナル抗体が僅かではあ
るが反応することがあり、また、標識物質等の非特異的
な担体等への吸着も予想され、従って、標識物質中の標
識剤の示す信号強度が大きいにもかかわらず、検体中に
子宮体癌細胞が存在しない例が極く希ではあるが認めら
れた。
【０００７】カットオフ値は、一般に、健常者、良性疾
患患者と癌患者の測定値の分布から、統計学的な手段を
用いて設定したり、あるいは、臨床上の有用性から判断
して設定している。子宮内腔より採取した子宮内膜細胞
から子宮体癌細胞を検出する場合も、やはりカットオフ
値に相当するものの設定が必要である。しかし、子宮内
腔より細胞や組織を一定量採取することは困難であるた
め、個々の検体により、担体に固相化される細胞や組織
の量は、大きく異なることになる。従って、単純に、担
体に結合した標識物質中の標識剤の示す信号強度のみで
カットオフ値を設定することはできない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の従来
技術に鑑みてなされたものであり、子宮体癌細胞に対し
特異性の高い免疫反応性を有するモノクローナル抗体を
用い、検体中の子宮体癌細胞の有無を判定するための免
疫化学的測定法であって、検体中の２種の物質を同時に
測定し、それらの測定値の相対的な評価を行なうことに
より、検体中の子宮体癌細胞の有無を簡便にしかも的確
に判定することのできるヒト子宮体癌細胞の免疫化学的
検出方法の提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の子
宮体癌診断における問題点に鑑み、これらの問題点を解
決する、すなわち、特殊な技術や機器を必要とせず、誰
にでも簡便に、しかも客観的に的確に子宮体癌細胞の検
出を行なうことが可能な方法を開発すべく研究を重ね
た。特に、カットオフ値をより的確に設定できる方法に
ついて、鋭意研究した。
【００１０】そして、まず、子宮体癌細胞の直接的検出
には、子宮体癌細胞と高い反応性を有するモノクローナ
ル抗体（例えば抗体番号ＭＳＮ−１）を用い、担体に不
溶化した被検検体である子宮内膜細胞と該抗体とを反応
させると共に、公知の標識剤を利用することとした。
【００１１】次に、細胞診の結果判定をより的確にする
には、カットオフ値のより的確な設定が重要であるの
で、そのための手段について検討した。具体的には、検
体中に含まれる全細胞数（あるいはその指標）を測定
し、単位細胞数に対する抗子宮体癌細胞抗体により検出
される細胞数（あるいはその指標）の比率を求め、その
比率についてカットオフ値を設定することを検討した。
【００１２】検体中に含まれる全細胞数の直接的測定方
法としては、血球計算盤やコールターカウンターなどに
よる方法が考えられるが、子宮内腔より採取される検体
中の細胞数は微量であるので、このような方法による測
定は困難である。また、細胞破砕物あるいは可溶化物の
蛋白量を検体中に含まれる全細胞数の指標とすることが
考えられるが、蛋白量の測定は煩雑であるので、集団検
診やマススクリーニングで大量にしかも迅速に検体を測
定するには、より簡便な方法が必要である。
【００１３】このような経緯から、検体中に含まれる細
胞数もしくは細胞破砕物の相当量の指標として、全ての
ヒト細胞に共通にほぼ一定量存在する物質の量を採用す
ることを考え、そのような物質の量の測定を、前記した
子宮体癌細胞の直接的検出と同様に免疫化学的に行なっ
た。その結果、全てのヒト細胞に共通にほぼ一定量存在
する物質の量は、検体中に含まれる細胞数もしくは細胞
破砕物の相当量の指標となることが確認された。
【００１４】以上の知見から、子宮体癌細胞と高い反応
性を有するモノクローナル抗体（例えば抗体番号ＭＳＮ
−１）を用い、検体中に含まれる該抗体と結合する細胞
あるいは抗原の相当量を免疫化学的に測定すると共に、
全てのヒト細胞に共通にほぼ一定量存在する物質の量を
免疫化学的に測定し、得られた測定値を比較するか、あ
るいは、測定値の比率を求め、その比較結果から、ある
いはその比率について設定されたカットオフ値を基準と
して、検体が子宮体癌細胞を含むか否かを判定すること
ができ、しかも、その方法は、特殊な技術や機器を必要
とせず、誰にでも簡便に、しかも客観的に的確に、子宮
体癌細胞を検出できる方法であることを見出し、本発明
を完成するに到ったものである。
【００１５】すなわち、本発明第一の態様は、ヒト子宮
体癌細胞に対して特異性の高い免疫反応性を有するモノ
クローナル抗体を用いる子宮体癌細胞の検出方法であっ
て、 ａ）検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜細胞お
よび／または子宮内膜組織、あるいはそれらの破砕物を
調製する工程、 ｂ）該検体を、担体上の複数の領域あるいは複数の担体
に所定量固相化する工程、 ｃ）前記モノクローナル抗体に標識剤を直接または間接
に結合させてなる標識モノクローナル抗体およびヒト細
胞に普遍的に存在する物質Ａと反応する物質Ｂに標識剤
を直接または間接に結合させてなる標識物質Ｂを、各
々、前記担体上の検体が固相化された異なる領域に添加
して固相化された検体と反応させる工程、 ｄ）前記担体を洗浄することにより、検体と結合しなか
った前記標識モノクローナル抗体および前記標識物質Ｂ
を除去する工程、および、 ｅ）検体と結合した前記標識モノクローナル抗体および
前記標識物質Ｂの各々について、前記標識剤の示す信号
強度を測定する工程、 を有し、前記標識物質Ｂ中の標識剤の示す信号強度ｘを
基準として、前記標識モノクローナル抗体中の標識剤の
示す信号強度ｙを評価し、検体中の子宮体癌細胞の有無
を判定することを特徴とするヒト子宮体癌細胞の免疫化
学的検出方法である。なお、以下の記載において、この
方法をＩ法ということがある。
【００１６】また、本発明第二の態様は、ヒト子宮体癌
細胞に対して特異性の高い免疫反応性を有するモノクロ
ーナル抗体を用いる子宮体癌細胞の検出方法であって、 ａ）検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜細胞お
よび／または子宮内膜組織、あるいはそれらの破砕物を
調製する工程、 ｂ）該検体を、担体上の複数の領域あるいは複数の担体
に所定量固相化する工程、 ｃ）前記モノクローナル抗体およびヒト細胞に普遍的に
存在する物質Ａと反応する物質Ｂを、各々、前記担体上
の検体が固相化された異なる領域に添加して固相化され
た検体と反応させる工程、 ｄ）前記モノクローナル抗体と反応する物質Ｃに標識剤
を直接または間接に結合させてなる標識物質Ｃおよび前
記物質Ｂと反応する物質Ｄに標識剤を直接または間接に
結合させてなる標識物質Ｄを、各々、前記モノクローナ
ル抗体または前記物質Ｂと反応させる工程、 ｅ）前記担体を洗浄することにより、検体と直接または
間接に結合しなかった、前記モノクローナル抗体、前記
物質Ｂ、前記標識物質Ｃおよび前記標識物質Ｄを除去す
る工程、および、 ｆ）検体と間接に結合した前記標識物質Ｃおよび前記標
識物質Ｄの各々について、前記標識剤の示す信号強度を
測定する工程、 を有し、前記標識物質Ｄ中の標識剤の示す信号強度ｘを
基準として、前記標識物質Ｃ中の標識剤の示す信号強度
ｙを評価し、検体中の子宮体癌細胞の有無を判定するこ
とを特徴とするヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法
である。なお、以下の記載において、この方法をII法と
いうことがある。
【００１７】以下に、本発明の構成を詳細に説明する。
はじめに、本発明に関係する各種の物質等について説明
する。
【００１８】本発明において用いる、ヒト子宮体癌細胞
に対して特異性の高い免疫反応性を有するモノクローナ
ル抗体は、特に限定されるものではないが、野澤らによ
り、「日本産婦人科学会雑誌、３９巻、５５９頁、１９
８７年」で報告されたモノクローナル抗体ＭＳＮ−１、
あるいは、長谷川らにより、「第８回ヒト細胞研究会大
会（第８回ヒト細胞研究会大会抄録集、３巻増補、６７
頁、１９９０年参照のこと）」にて発表されたモノクロ
ーナル抗体ＭＳＮ−３が好ましい。
【００１９】モノクローナル抗体ＭＳＮ−１（以下、Ｍ
ＳＮ−１という）は、下記の如くして得られたものであ
る。すなわち、まず、子宮体部分化型腺癌由来細胞株Ｓ
ＮＧ−IIを、２週間間隔で３回Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹
腔内に投与し、最終投与後３日目に脾細胞を取り、ミエ
ローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株）とを細胞融合させ
た。得られたハイブリドーマをクローニングし、正常子
宮内膜との反応性と子宮体癌の組織切片との反応性を指
標にして、子宮体癌の組織とのみ高率に反応する抗体を
産生するハイブリドーマを選択した。このハイブリドー
マを培養し、モノクローナル抗体を含有する培養液を回
収し、その培養液を６０％飽和硫酸アンモニウムで塩析
後、ウルトロゲルＡｃＡ２２（ＩＢＦバイオテクニクス
社）にてゲル濾過クロマトグラフィーを行ない、ＭＳＮ
−１を精製した。ＭＳＮ−１の免疫グロブリンサブクラ
スは、アガロースゲルを用いた免疫拡散法により、Ｉｇ
Ｍであることが確認された。
【００２０】なお、本件発明者は、ＭＳＮ−１を産生す
るハイブリドーマを、１９９１年３月２２日付で寄託し
ている［微工研菌寄第１２１２６号(FERMP-12126)］。
【００２１】このようにして得られたＭＳＮ−１につい
て、子宮内膜の種々の病変組織との反応性を、ホルマリ
ン固定切片を用いた免疫組織化学的染色法で検討したと
ころ、正常内膜では、ごく希に内膜腺のluminal surfac
e が僅かに染色されるにすぎなかったが、子宮体癌の内
膜では、９０％以上の症例が染色され、また、高分化型
腺癌の方が低分化型腺癌よりも陽性率が高く、ＭＳＮ−
１の反応性は、子宮体癌の分化度が増すにつれ上昇する
ことが確認された。また、子宮体癌のいわゆる前癌病変
と考えられている内膜増殖症では、その形態学的異型性
が増すにつれ、染色陽性率も高値を示す傾向がみられ、
ＭＳＮ−１が認識する抗原は、子宮内膜の癌化にともな
い増加してくることが示唆された。さらに、ＭＳＮ−１
が認識する抗原は、子宮体癌細胞に含まれる中性糖脂質
であることが確認された（Iwamori M. et. al., J. Bio
chem.,105, p.718,1989 ）。
【００２２】一方、モノクローナル抗体ＭＳＮ−３（以
下、ＭＳＮ−３という）は、下記の如くして作製された
ものである。すなわち、免疫原として子宮体部低分化型
腺癌由来細胞株ＨＥＣ−１０８を用い、ＭＳＮ−１作製
時と同様の方法でＢａｌｂ／ｃマウスに免疫し、その脾
細胞とミエローマ細胞（ＳＰ−２）とを細胞融合した。
得られたハイブリドーマをクローニングし、子宮体癌細
胞株、低分化型（分化度Ｇ３）および中分化型（分化度
Ｇ２）体癌組織と高率に反応する抗体を産生するハイブ
リドーマを選択した。このハイブリドーマを培養してモ
ノクローナル抗体を含有する培養上清を回収し、５０％
硫酸アンモニウムで塩析後、プロテインＡーセルロファ
イン（生化学工業株式会社）カラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーでＭＳＮ−３を精製した。ＭＳ
Ｎ−３の免疫グロブリンサブクラスはＩｇＧ1 であっ
た。また、ＭＳＮ−３の体癌組織に対する反応性を免疫
組織学化的染色法で検討したところ、分化度のより低い
部分に一致して強い反応性を示し、本抗体が、ＭＳＮ−
１とは異なり、低分化型腺癌細胞の表面抗原を認識して
いることが示唆された（第８回ヒト細胞研究会大会抄録
集、３巻増補、６７頁、１９９０年）。
【００２３】なお、本件発明者は、ＭＳＮ−３を産生す
るハイブリドーマを、１９９１年３月２２日付で寄託し
ている［微工研菌寄第１２１２５号(FERMP-12125)］。
【００２４】本発明において測定されるヒト細胞に普遍
的に存在する物質Ａとは、細胞内含有量が多く、免疫反
応によって測定することが可能であり、様々な方法で検
体が処理された場合にも比較的安定である物質である。
具体的には、アクチン、ミオシン、チューブリンなどの
細胞骨格を形成する物質や、クロマチン、ヒストン、核
マトリックス、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核内物質、β2 ー
ミクログロブリンなどの細胞膜成分などが挙げられる。
なかでも、アクチンが好ましい。
【００２５】本発明において用いられる、ヒト細胞に普
遍的に存在する物質Ａと反応する物質Ｂとは、例えば、
物質Ａに対する抗体であり、また、物質ＡがＤＮＡ、Ｒ
ＮＡなどの核酸である場合には、それに対する抗体の
他、それに相補的な配列を有する核酸も含まれる。
【００２６】なお、物質Ｂが抗体である場合、それは、
ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であ
ってもよい。また、物質Ｂが抗体である場合、その作製
は、適切な免疫原を用い、「免疫実験操作法Ｉ〜IX」
（免疫学会編、１９８０年）等に記載の公知方法に従え
ばよい。あるいは、市販の抗体を使用することもでき
る。
【００２７】物質Ｂが相補的な配列を有する核酸である
場合は、化学的に、あるいは、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって合
成したり、ヒト細胞から、「ＤＮＡプローブII、 新技
術と展開」（高橋豊三著、シーエムシー社、１９９０
年）等に記載の公知方法に従い、核酸プローブを作製す
ればよい。
【００２８】前記ヒト子宮体癌細胞に対して特異性の高
い免疫反応性を有するモノクローナル抗体と反応する物
質Ｃとは、例えば該モノクローナル抗体に対する抗体
（いわゆる第二抗体）等であり、より具体的には、抗イ
ムノグロブリン抗体、プロテインＡ等である。物質Ｃが
いわゆる第二抗体である場合、それは、ポリクローナル
抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、ま
た、その作製は、適切な免疫原を用い、「免疫実験操作
法Ｉ〜IX」（免疫学会編、１９８０年）等に記載の公知
方法に従えばよい。あるいは、市販の抗体を使用するこ
ともできる。
【００２９】前記物質Ｂと反応する物質Ｄとは、例え
ば、物質Ｂが抗体である場合には、それに対する抗体
（いわゆる第二抗体）等であり、より具体的には、抗イ
ムノグロブリン抗体、プロテインＡ等である。また、物
質Ｂが核酸である場合には、それに相補的な配列を有す
る核酸であって、かつ、物質Ｂの塩基配列のうちの物質
Ａと相補的でない部分と結合する核酸、あるいは、ＤＮ
Ａ−ＤＮＡ複合体、ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体、ＲＮＡ−Ｒ
ＮＡ複合体に対する抗体、さらには、物質Ｂがスルフォ
ン基、ジニトロフェニル基、ジゴキシゲニン等が結合し
てなる物質である場合には、物質Ｂのそのような部分に
対する抗体等である。
【００３０】なお、物質Ｄとして、物質Ｂに相補的な配
列を有する核酸を用いる場合は、物質Ｂとして、物質Ａ
と相補的な塩基配列部分と、物質Ａと相補的でない塩基
配列部分とを含むものを用いる必要がある。
【００３１】物質Ｄが抗体である場合、それは、ポリク
ローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても
よく、また、その作製は、適切な免疫原を用い、「免疫
実験操作法Ｉ〜IX」（免疫学会編、１９８０年）等に記
載の公知方法に従えばよい。あるいは、市販の抗体を使
用することもできる。
【００３２】また、物質Ｄが物質Ｂと相補的な配列を有
する核酸である場合は、化学的に、あるいは、ＰＣＲ法
によって合成したり、ヒト細胞から、「ＤＮＡプローブ
II、新技術と展開」（高橋豊三著、シーエムシー社、１
９９０年）等に記載の公知方法に従い、核酸プローブを
作製すればよい。
【００３３】このように、物質Ｃと物質Ｄとは、両者が
共にいわゆる第二抗体である場合は、同じ物質であって
もよい。
【００３４】なお、前記プロテインＡとは、抗体ではな
いが、イムノグロブリンのＦｃ部分と特異的に反応する
性質を有することが知られている物質であり、従って、
本発明において、物質Ｃあるいは物質Ｄとして使用でき
るのである。
【００３５】本発明に用いる標識剤としては、酵素、化
学発光物質、蛍光物質、放射性同位体などが例示され
る。より具体的には、酵素としては、西洋わさびペルオ
キシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、βーガラクト
シダーゼ、ルシフェラーゼ、グルコースー６ーリン酸脱
水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、グルコース脱水素酵素（ＧＤ
Ｈ）等、化学発光物質としては、ルミノール、イソルミ
ノール、アクリジニウムエステル類、ジオキセタン類
等、蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネ
ート、ウンベリフェロン、希土類金属キレート等、さら
には、放射性同位体としては、125 Ｉ、14Ｃ等が挙げら
れる。
【００３６】本発明では、これらの標識剤は、前記ヒト
子宮体癌細胞に対して特異性の高い免疫反応性を有する
モノクローナル抗体、前記物質Ｂ、前記物質Ｃ、前記物
質Ｄに直接または間接に結合せられて用いられる。な
お、該モノクローナル抗体に結合せられる標識剤と該物
質Ｂに結合せられる標識剤とは同じものであることが望
ましく、該物質Ｃに結合せられる標識剤と該物質Ｄに結
合せられる標識剤とは同じものであることが望ましい。
【００３７】標識剤を直接結合する場合は、これらの標
識剤に、前記ヒト子宮体癌細胞に対して特異性の高い免
疫反応性を有するモノクローナル抗体、前記物質Ｂ、前
記物質Ｃ、前記物質Ｄと結合可能な官能基を導入してお
くことが望ましい。また、間接的に結合する場合には、
標識剤と、前記ヒト子宮体癌細胞に対して特異性の高い
免疫反応性を有するモノクローナル抗体、前記物質Ｂ、
前記物質Ｃ、前記物質Ｄとの間に、アビヂンとビオチ
ン、ＢＳＡ等を介在させる。
【００３８】標識剤と、前記ヒト子宮体癌細胞に対して
特異性の高い免疫反応性を有するモノクローナル抗体、
前記物質Ｂ、前記物質Ｃ、前記物質Ｄとの結合は、「酵
素免疫測定法（第３版）」（石川栄治他編、医学書院、
１９８７年）、「免疫実験操作法Ｉ〜IX」（免疫学会
編、１９８０年）、「ＤＮＡプローブII、 新技術と展
開」（高橋豊三著、シーエムシー社、１９９０年）等に
記載の公知の方法に従えばよく、また、それらの方法を
適宜改変して用いてもよい。なお、前記したアビヂンと
ビオチンを介在させる方法（ＡＢＣ法）は、「Hsu, S.
et. al., J. Histochem. Cytochem., 29, p.577, 1981
」に詳しい。
【００３９】本発明で用いる検体は、子宮内腔より採取
した細胞、組織またはそれらの破砕物である。子宮内腔
より採取した検体は、そのままでも使用できるが、組織
のように固形成分が混入する場合には、トリプシンやコ
ラゲナーゼなどの酵素により細胞を分散させたり、超音
波により細胞を分散あるいは破砕して検体とすることも
できる。また、界面活性剤や有機溶媒により可溶化して
検体とすることもできる。
【００４０】なお、標識剤としてペルオキシダーゼを使
用する場合であって、検体中に大量の赤血球が混入して
いる場合は、赤血球に含まれるペルオキシダーゼによ
り、非特異的な反応が生じることがある。従って、この
ような場合には、検体を塩化アンモニウムのような溶血
剤で処理して溶血するか、検体を過剰の過酸化水素など
で処理して赤血球由来のペルオキシダーゼ活性を非可逆
的に阻害した後、使用することが好ましい。
【００４１】検体の採取方法は、臨床で一般的に行なわ
れている方法でよく、例えば、内膜吸引チューブによる
吸引法や、エンドサイト（三共株式会社）、エンドサー
チ（アンネ株式会社）あるいは内膜ブラシなどによる擦
過法で行なえばよい。
【００４２】本発明において、担体は、子宮内膜細胞、
組織あるいはそれらの破砕物が、物理的または化学的に
結合し、不溶化（固相化）され得る物質であればいずれ
でもよい。具体的には、ポリエチレン、ポリスチレン、
ポリプロピレン、ガラス、ニトロセルロース、ナイロン
などの材質の、プレート、チューブ、ビーズ、膜などを
挙げることができる。
【００４３】次に、子宮体癌細胞の免疫化学的検出法に
ついて、具体的に説明する。まず、本発明第一の態様の
方法（Ｉ法）を説明する。
【００４４】本発明第一の態様の方法には、 ａ）検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜細胞お
よび／または子宮内膜組織、あるいはそれらの破砕物を
調製する工程、 ｂ）該検体を、担体上の複数の領域あるいは複数の担体
に所定量固相化する工程、 ｃ）抗子宮体癌細胞モノクローナル抗体に標識剤を直接
または間接に結合させてなる標識モノクローナル抗体お
よびヒト細胞に普遍的に存在する物質Ａと反応する物質
Ｂに標識剤を直接または間接に結合させてなる標識物質
Ｂを、各々、前記担体上の検体が固相化された異なる領
域に添加して固相化された検体と反応させる工程、 ｄ）前記担体を洗浄することにより、検体と結合しなか
った前記標識モノクローナル抗体および前記標識物質Ｂ
を除去する工程、および、 ｅ）検体と結合した前記標識モノクローナル抗体および
前記標識物質Ｂの各々について、前記標識剤の示す信号
強度を測定する工程、 がある。
【００４５】検体として、子宮内腔より採取した子宮内
膜細胞および／または子宮内膜組織、あるいはそれらの
破砕物を調製する工程は、前記の方法で採取した検体に
つき、前記したように、そのままで、あるいは、必要に
より、各種の処理を行なって、検体として使用できるよ
うにする工程である。
【００４６】検体を、担体上の複数の領域あるいは複数
の担体に所定量固相化する工程は、物理的吸着、化学的
結合などの方法により行なわれる。なお、ここで、複数
の領域に固相化するとは、担体としてプレートや膜を使
用する場合に、同一担体上の複数の領域に同量の検体を
固相化することであり、複数の担体に固相化するとは、
担体としてチューブやビーズを使用する場合に、２個以
上の担体を用意し、各々に同量の検体を固相化すること
である。
【００４７】本発明では、一種類の検体について、抗子
宮体癌細胞抗体を用いた測定と、ヒト細胞に普遍的に存
在する物質Ａと反応する抗体（物質Ｂ）を用いた測定と
を行ない、その結果を比較するため、検体が固相化され
た複数の領域、あるいは、検体が固相化された複数の担
体が必要なのである。本発明では、同一担体上の複数の
領域に検体を固相化する、すなわち、同一担体上に、抗
子宮体癌細胞抗体を用いた測定の反応領域と、前記物質
Ｂを用いた測定の反応領域とが存在するようにした方
が、両者の反応条件を一定にすることができるので好ま
しい。
【００４８】なお、ここで言う複数の領域とは、マイク
ロタイタープレートを例にとるならば、個々のウエルに
相当するものであり、膜やスライドグラスのような平板
で言うならば、個々の反応液が混じり合わない程度に離
れた領域あるいは混じり合わないように境界で囲まれた
領域である。すなわち、他の領域での反応に影響されず
に独立して反応を行なえる領域を言う。
【００４９】固相化について具体的に述べると、例え
ば、検体の一定量を直接担体上の所定の領域に塗布し、
風乾燥させてもよいし、あるいは、検体を、生理食塩
水、リン酸緩衝生理食塩水などの適当な緩衝液に浮遊さ
せ、その一定量を担体上の所定の領域に添加後、４〜６
０℃で０．５〜２４時間、好ましくは３７〜６０℃で
０．５〜２時間インキュベートして物理的に吸着させて
もよい。あるいは、検体をメタノールなどの溶媒に浮遊
させ、その一定量を担体上の所定の領域に添加後、２０
〜１００℃、好ましくは５０〜９０℃で乾固させてもよ
い。しかしながら、検体を固相化する方法は、これに限
定されるものではなく、洗浄操作などの通常の測定操作
によって担体上から検体が実質的に脱離しないように担
体上に検体を固定化する手段全てを含む。
【００５０】次の、前記モノクローナル抗体に標識剤を
直接または間接に結合させてなる標識モノクローナル抗
体およびヒト細胞に普遍的に存在する物質Ａと反応する
物質Ｂに標識剤を直接または間接に結合させてなる標識
物質Ｂを、各々、前記担体上の検体が固相化された異な
る領域に添加して固相化された検体と反応させる工程
は、適切な条件下で行なうことが望ましい。すなわち、
抗原抗体反応の場合は、約４〜３７℃で０．５〜２４時
間程度行なうのがよく、約２０〜３７℃で０．５〜２時
間程度行なうのが更によく、物質Ｂが核酸である場合の
物質Ａとの反応は、２０〜６５℃で２〜２４時間程度行
なうのがよい。なお、後者の場合、温度、時間等の反応
条件は、物質Ｂの塩基数に応じて適切に選択される。
【００５１】前記担体を洗浄することにより、検体と結
合しなかった前記標識モノクローナル抗体および前記標
識物質Ｂを除去する工程は、通常は、水、生理食塩水、
ｐＨを中性付近に調整した緩衝液（リン酸緩衝液、トリ
スー塩酸緩衝液等）、あるいはそれらの液にツゥイーン
２０等の界面活性剤を添加した液等を用いて行なわれ
る。なお、物質Ｂが核酸である場合は、検体と結合しな
かった前記標識物質Ｂを除去する工程は、一般的に使用
されているＳＳＣ（ＳｔａｎｄａｒｄＳａｌｉｎｅ Ｃ
ｉｔｒａｔｅ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５
Ｍクエン酸ナトリウム）溶液等を用いて担体を洗浄する
ことによって行なうとよい。
【００５２】検体と結合した前記標識モノクローナル抗
体および前記標識物質Ｂの各々について、前記標識剤の
示す信号強度を測定する工程は、標識剤の種類に応じ、
以下のように行なわれる。すなわち、標識剤が酵素であ
る場合には酵素活性を、蛍光物質である場合には蛍光強
度を、化学発光物質である場合には発光強度を、放射性
同位体である場合には放射活性を測定するのであるが、
このような測定は、吸光度計、反射率計、蛍光光度計、
発光光度計、シンチレーションカウンターなどの測定機
器を用いて物理的に定量的に、あるいは、定性的に行な
われる。
【００５３】なお、標識剤が酵素である場合の酵素活性
の測定において用いられる基質は、酵素の存在量に対応
して反応が定量的に進行し、生成された生成物の量、ま
たは基質の減少量もしくは残存量が、容易に測定し得る
ものでありさえすれば良い。例えば、標識剤がペルオキ
シダーゼの場合、基質としては、テトラメチルベンジジ
ンーＨ2 ０2 、οーフェニレンジアミンーＨ2 Ｏ2 、５
ーアミノサリチル酸ーＨ2 Ｏ2 などが用いられ、アルカ
リフォスファターゼの場合は、５ーブロモー４ークロロ
ー３ーインドリルーフォスフェートのトルイジン塩など
が用いられ、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｐ−ニト
ロフェニルーβーＤ−ガラクトピラノシドなどが用いら
れる。
【００５４】肉眼により、定性的に、検体に結合した標
識物質中の標識剤の量を判定できるという利点を考慮す
れば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ等の酵素を標識剤として含む標識
物質を用い、酵素反応の結果増加する物質を、色によっ
て判定する測定系が好ましい。
【００５５】本発明第一の態様の方法では、上記の工程
を上記の順序で行なった後、得られた二つの測定結果か
ら、検体中の子宮体癌細胞の有無を判定する。すなわ
ち、一方の領域の検体に結合した前記標識物質Ｂ中の標
識剤の示す信号強度ｘを基準として、他方の領域の検体
に結合した前記標識モノクローナル抗体中の標識剤の示
す信号強度ｙを評価し、検体中の子宮体癌細胞の有無を
判定する。
【００５６】より具体的に述べると、（１）検体に結合
した前記標識物質Ｂ中の標識剤の示す信号強度ｘに対す
る検体に結合した前記標識モノクローナル抗体中の標識
剤の示す信号強度ｙの比率を求め、予め決められた基準
となる比率（カットオフ値）以上を示す検体を子宮体癌
細胞の存在が陽性であると判定する方法、（２）検体に
結合した前記標識物質Ｂ中の標識剤の示す信号強度ｘよ
りも、検体に結合した前記標識モノクローナル抗体中の
標識剤の示す信号強度ｙの方が大である場合を子宮体癌
細胞の存在が陽性であると判定する方法、等がある。
【００５７】なお、前者の場合、基準となる比率（カッ
トオフ値）は、健常者、良性疾患患者および癌患者から
採取された検体について、前記の工程によって前記信号
強度ｘおよび前記信号強度ｙを測定し、該信号強度ｘに
対する該信号強度ｙの比率を算出し、その比率の分布か
ら統計学的な手段を用いて設定すればよい。あるいは、
臨床上の有用性から適宜設定してもよい。
【００５８】また、後者の一例としては、標識剤として
酵素を使用し、酵素反応の結果として発色を伴なう測定
系を設定した場合であって、判定を肉眼で定性的に行な
うことができる方法があげられる。すなわち、先に述べ
た基準となる比率が約１になるように、検体量や、検体
に添加する前記標識物質Ｂ、前記標識モノクローナル抗
体各々の量を決めておき、前記標識物質Ｂの量に相当す
る呈色（信号強度ｘ）を基準にして、前記標識モノクロ
ーナル抗体の量に相当する呈色（信号強度ｙ）を肉眼に
て比較判定し、該標識モノクローナル抗体の量に相当す
る呈色（信号強度ｙ）が基準の呈色（信号強度ｘ）以上
の時、子宮体癌細胞の存在が陽性であると判定するもの
である。
【００５９】本発明第一の態様において、前記標識物質
Ｂの量は、検体中に含まれる全細胞数のひとつの指標で
ある。図１に、子宮内膜細胞を含む検体を本発明第一の
態様の方法で測定したときの、検体に結合した前記標識
物質Ｂの量を示す信号強度ｘ（測定波長４９０ｎｍにお
ける吸光度）と、同一検体を０．１Ｎ水酸化ナトリウム
溶液にて可溶化し、Ｌｏｗｒｙらの方法（Lowry O. H.
et. al., J. Biol. Chem., 193, p.265, 1951)に準じて
測定した蛋白量との相関を示した。なお、その際に、前
記標識物質Ｂとして、西洋わさびペルオキシダーゼ標識
抗アクチン抗体を用いた。また、酵素基質は、οーフェ
ニレンジアミンーＨ2 Ｏ2 を用いた。直線回帰式はＹ＝
０．０７Ｘ＋０．０８、相関係数はｒ＝０．９７であ
り、すなわち、前記標識物質Ｂの量は、検体中の蛋白量
に比例し、該標識物質Ｂの量は、検体中に含まれる全細
胞数のひとつの指標となりうることが示唆された。
【００６０】次に、本発明第二の態様の方法（II法）を
説明する。本発明第二の態様の方法には、 ａ）検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜細胞お
よび／または子宮内膜組織、あるいはそれらの破砕物を
調製する工程、 ｂ）該検体を、担体上の複数の領域あるいは複数の担体
に所定量固相化する工程、 ｃ）抗子宮体癌細胞モノクローナル抗体およびヒト細胞
に普遍的に存在する物質Ａと反応する物質Ｂを、各々、
前記担体上の検体が固相化された異なる領域に添加して
固相化された検体と反応させる工程、 ｄ）前記モノクローナル抗体と反応する物質Ｃに標識剤
を直接または間接に結合させてなる標識物質Ｃおよび前
記物質Ｂと反応する物質Ｄに標識剤を直接または間接に
結合させてなる標識物質Ｄを、各々、前記モノクローナ
ル抗体または前記物質Ｂと反応させる工程、 ｅ）前記担体を洗浄することにより、検体と直接または
間接に結合しなかった、前記モノクローナル抗体、前記
物質Ｂ、前記標識物質Ｃおよび前記標識物質Ｄを除去す
る工程、および、 ｆ）検体と間接に結合した前記標識物質Ｃおよび前記標
識物質Ｄの各々について、前記標識剤の示す信号強度を
測定する工程、 がある。
【００６１】前記ａ）工程およびｂ）工程は、前記本発
明第一の態様の方法の場合と同様であるので、説明は省
略する。
【００６２】次の、抗子宮体癌細胞モノクローナル抗体
およびヒト細胞に普遍的に存在する物質Ａと反応する物
質Ｂを、各々、前記担体上の検体が固相化された異なる
領域に添加して固相化された検体と反応させる工程は、
適切な条件下で行なうことが望ましい。すなわち、抗原
抗体反応の場合は、約４〜３７℃で０．５〜２４時間程
度行なうのがよく、約２０〜３７℃で０．５〜２時間程
度行なうのが更によく、物質Ｂが核酸である場合の物質
Ａとの反応は、２０〜６５℃で２〜２４時間程度行なう
のがよい。なお、後者の場合、温度、時間等の反応条件
は、物質Ｂの塩基数に応じて適切に選択される。
【００６３】また、前記モノクローナル抗体と反応する
物質Ｃに標識剤を直接または間接に結合させてなる標識
物質Ｃおよび前記物質Ｂと反応する物質Ｄに標識剤を直
接または間接に結合させてなる標識物質Ｄを、各々、前
記モノクローナル抗体または前記物質Ｂと反応させる工
程も同様に、適切な条件下で行なうことが望ましい。す
なわち、抗原抗体反応の場合は、約４〜３７℃で０．５
〜２４時間程度行なうのがよく、約２０〜３７℃で０．
５〜２時間程度行なうのが更によく、物質Ｄが核酸であ
る場合の物質Ｂとの反応は、２０〜６５℃で２〜２４時
間程度行なうのがよい。なお、後者の場合、温度、時間
等の反応条件は、物質Ｄの塩基数に応じて適切に選択さ
れる。
【００６４】前記担体を洗浄することにより、検体と直
接または間接に結合しなかった、前記モノクローナル抗
体、前記物質Ｂ、前記標識物質Ｃおよび前記標識物質Ｄ
を除去する工程は、通常は、水、生理食塩水、ｐＨを中
性付近に調整した緩衝液（リン酸緩衝液、トリスー塩酸
緩衝液等）、あるいは、それらの液にツゥイーン２０等
の界面活性剤を添加した液等を用いて行なわれる。な
お、物質Ｂ、物質Ｄが核酸である場合は、検体と結合し
なかった前記物質Ｂ、該物質Ｂと結合しなかった前記標
識物質Ｄを除去する工程は、一般的に使用されているＳ
ＳＣ溶液等を用いて担体を洗浄することによって行なう
とよい。
【００６５】本発明第二の態様においては、この洗浄工
程は、一工程として行なってもよいが、通常は、検体と
直接結合しなかった前記モノクローナル抗体および前記
物質Ｂを除去する工程と、検体と、前記モノクローナル
抗体あるいは前記物質Ｂを介して間接に結合しなかった
前記標識物質Ｃおよび前記標識物質Ｄを除去する工程の
二工程に分かれる。
【００６６】検体と間接に結合した前記標識物質Ｃおよ
び前記標識物質Ｄの各々について、前記標識剤の示す信
号強度を測定する工程は、先の、本発明第一の態様につ
いての説明中における信号強度の測定に関する説明と同
様であり、標識剤の種類に応じて行なわれる。
【００６７】本発明第二の態様の方法では、上記の工程
を行なった後、得られた二つの測定結果から、検体中の
子宮体癌細胞の有無を判定する。
【００６８】なお、本発明第二の態様の方法では、上記
の工程は、必ずしも上記の順序で行なう必要はない。前
記したように、ｅ）工程（洗浄工程）を二工程とし、前
記ｃ）工程の後と、前記ｄ）工程の後に行なってもよ
い。あるいは、前記ａ）工程、前記ｂ）工程の後に、前
記ｄ）工程を行なって前記モノクローナル抗体と前記標
識物質Ｃとの複合体および前記物質Ｂと前記標識物質Ｄ
との複合体を形成せしめ、その後、前記ｃ）工程を行な
ってもよい。
【００６９】また、得られた二つの測定結果から、検体
中の子宮体癌細胞の有無を判定するための具体的方法等
は、本発明第一の態様の方法の場合と同様である。
【００７０】本発明は、以上の通りである。なお、本発
明は、子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法であるが、適
当なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得
られさえすれば、子宮頸癌細胞の免疫化学的検出や、喀
啖中の肺癌細胞の免疫化学的検出にも適用可能である。
【００７１】
【実施例】以下に、実施例により本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は、これら実施例により何等限定さ
れるものではない。
【００７２】（実施例１） 酵素免疫測定法による検体
の測定（その１） （１）検体の調製及び固相化 エンドサ−チ（アンネ株式会社）を用い、擦過法により
子宮内膜細胞を採取した。これを生理食塩水２ｍｌに懸
濁し、ＣＤ５０ＳＲ型遠心機（トミ−精工株式会社製）
にて１５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行ない、上
清を除き、沈殿物をメタノ−ル５００μｌに懸濁し、細
胞懸濁液とした。検体に著しく血液が混入している場合
は、遠心分離を行ない、上清を取り除いた後、０．８％
塩化アンモニウム／０．１％炭酸水素カリウム／０．０
０３７％エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム溶液（ｐ
Ｈ７．２）を１ｍｌ加え、１分間静置して溶血処理し、
ＭＣ１５０型遠心機（トミ−精工株式会社製）にて２０
００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行ない、上清を除き、
その沈殿物をメタノ−ル５００μｌに懸濁し、細胞懸濁
液とした。次に、細胞懸濁液を、超音波細胞破砕器（大
岳製作所株式会社製）にて、氷冷しながら５秒間ずつ３
回処理した。検体の固相化は、上記細胞懸濁液を、メタ
ノ−ルにて１０、２０、あるいは４０容量倍に希釈した
後、それらを、９６ウェルマイクロタイタ−プレ−ト
（日本インタ−メッド株式会社製）に、各々４ウェルず
つ、５０μｌ／ウェル添加し、該タイタ−プレ−トをオ
−ブン（東洋製作所株式会社製）に入れて８０℃で１０
分間加熱し、溶媒を蒸発乾固させることによって行なっ
た。なお、該タイタ−プレ−トは、加熱後氷水中で１０
分間以上冷却した。次に、固相化された検体中に混入す
る赤血球由来のペルオキシダーゼ活性を阻害するため、
０．３％過酸化水素水を１００μｌ／ウェル添加し、室
温に３０分間、静置した。その後、イオン交換水にて３
回洗浄した。
【００７３】（２）酵素免疫測定法による測定 モノクローナル抗体ＭＳＮ−１（以下、ＭＳＮ−１と略
記）２μｇ／ｍｌ溶液、モノクローナル抗アクチン抗体
（クラス：ＩｇＭ、アドバンス社、以下、抗アクチン抗
体と略記）１００倍希釈溶液、および、西洋わさびペル
オキシダ−ゼ（以下、ＨＲＰＯと略記）を結合したヤギ
抗マウスＩｇＭ抗体（ＴＡＧＯ社）５００倍希釈溶液
を、５％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記）／７
６ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．４）（以下、Ｐ
ＢＳと略記）を用いて調製した。ＨＲＰＯ結合ヤギ抗マ
ウスＩｇＭ抗体とＭＳＮ−１溶液または抗アクチン抗体
溶液とを等量混合し、（１）にて作製したマイクロタイ
タ−プレ−トの各ウェルに、いずれかの前記等量混合し
て得られた溶液を、１００μl ／ウェル添加した。２５
℃にて１．５時間反応させた後、マイクロタイタ−プレ
−トの各ウェルを０．００５％ポリエキシエチレン（２
０）ソルビタンラウレ−ト／０．９％塩化ナトリウム溶
液にて５回、その後イオン交換水にて２回洗浄した。洗
浄後、０．０２７％過酸化水素水／０．３％ｏ−フェニ
レンジアミン／マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を
１００μｌ／ウェル添加し、２５℃にて１０分間反応さ
せた。１Ｎ塩酸を１００μｌ／ウエル添加することによ
って反応を停止させ、反応液の呈色強度を、ＮＪ−２０
００型マイクロプレ−トリ−ダ−（日本インタ−メッド
株式会社）により、測定波長４９０ｎｍ、対照波長６２
０ｎｍで測定した。
【００７４】正常子宮内膜細胞５例と子宮体癌細胞２例
を検体として測定した結果を図２に示した。同図中、ａ
〜ｅは正常子宮内膜細胞の例、ｆおよびｇは子宮体癌細
胞の例である。ＭＳＮ−１を用いた測定では、子宮体癌
細胞において、固相化した検体量に応じた吸光度の上昇
がみられたが、正常子宮内膜細胞においても、低値なが
ら吸光度の上昇が見られた。ＭＳＮ−１を用いた測定に
おける検体量に応じた吸光度の上昇は、測定される吸光
度が、担体に固相化される検体の量に応じて変動するこ
とを示しており、すなわち、吸光度が高いだけで陽性と
判定することは困難であることを示唆するものである。
しかし、図２から明らかなように、抗アクチン抗体を用
いた測定による吸光度を基準として、ＭＳＮ−１を用い
た測定における吸光度を判定すれば、陽性と陰性とを、
的確に判定することができる。
【００７５】（実施例２）測定値の評価方法の比較 健常人１４例、子宮良性疾患患者５例、子宮体癌患者４
例より採取した子宮内膜細胞を検体として用い、実施例
１の方法に従って測定した。抗アクチン抗体を用いた測
定の測定値（吸光度）をｘ、ＭＳＮ−１を用いた測定の
測定値（吸光度）をｙとした。また、同じ検体につい
て、蛋白定量を行なった。すなわち、実施例１（１）の
方法に従って調製した細胞懸濁液のメタノール希釈液５
０μl にＰＢＳ５０μｌを加えたものを蛋白定量用検
体、ＰＢＳで０〜１６００μｇ／ｍｌに調製したＢＳＡ
溶液５０μｌにメタノ−ル５０μｌを加えたものを蛋白
定量用標準品とし、それらを０．１Ｎ水酸化ナトリウム
溶液中で３０℃にて３０分間加温して可溶化し、Ｌｏｗ
ｒｙらの方法（既出）に準じて測定し、蛋白定量用標準
品の吸光度より検量線を描き、検体の蛋白濃度をＢＳＡ
換算で求めた。そして、検体の蛋白濃度（mg/ml ）をｚ
とした。
【００７６】陽性・陰性の判定をするため、固相化の際
の細胞懸濁液のメタノールによる希釈倍率が２０倍の健
常人１４例のｙ値、あるいは、ｚ値あたりのｙ値の比率
（ｙ／ｚ）、ｘ値あたりのｙ値の比率（ｙ／ｘ）の各々
の平均値＋２ＳＤ（標準偏差）を求めてカットオフ値と
した。設定されたカットオフ値は、各々、０．３５、
１．５０、１．１０であった。図３（ａ）にはｙ値の、
図３（ｂ）にはｙ／ｚ値の、図３（ｃ）にはｙ／ｘ値の
疾患別の分布を示し、表１には、設定されたカットオフ
値に基づいて判定された陽性率を示した。同図および表
１から明らかなように、検体の蛋白量あるいは抗アクチ
ン抗体を用いて測定した測定値を基準として判定した場
合には、ｙ値（ＭＳＮー１の結合）のみで判定した場合
に比べ、健常人及び子宮良性疾患患者の偽陽性率は低く
なった。特に、本発明方法である抗アクチン抗体を用い
て測定した測定値を基準として判定した場合（ｙ／ｘ
値）には、子宮良性疾患患者の偽陽性率が一段と低くな
り、本発明の有用性が証明された。
【００７７】 表１ 判定の方法別の陽性率 ────────────────────────────── 判 定 方 法 ─────────────────────── ｙ ｙ／ｚ ｙ／ｘ ─────────────────────────────── 健常人 １４．３％ ０％ ０％ （２／１４） （０／１４） （０／１４） 子宮体癌 １００％ １００％ １００％ （４／４） （４／４） （４／４） 子宮良性疾患 ８０．０％ ４０．０％ ２０．０％ （４／５） （２／５） （１／５） ─────────────────────────────── ＊（ ）内は例数である
【００７８】（実施例３）酸素免疫測定法による検体の
測定（その２） ＭＳＮ−１および抗アクチン抗体の各々に、Nakane P.
K. らの方法（Nakane P.K. et.al., Histochem. Cytoch
em., 22, p.1084, 1974) に準じ、ＨＲＰＯを結合し
た。５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて、ＨＲＰＯ標識ＭＳＮ−１
は３０００倍、ＨＲＰＯ標識抗アクチン抗体は２００倍
に希釈し、それらを、実施例１（１）の方法で検体を不
溶化したマイクロタイタープレートに、一検体あたり各
２ウェルづつ、１００μｌ／ウェル添加した。２５℃に
て１．５時間反応させた後、マイクロタイタ−プレ−ト
の各ウェルを０．００５％ポリエキシエチレン（２０）
ソルビタンラウレ−ト／０．９％塩化ナトリウム溶液に
て５回、その後イオン交換水にて２回洗浄した。洗浄
後、０．０２７％過酸化水素水／０．３％ｏ−フェニレ
ンジアミン／マッキルベイン緩衝液（ｐＨ５．０）を１
００μｌ／ウェル添加し、２５℃にて１０分間反応させ
た。１Ｎ塩酸を１００μｌ／ウエル添加することによっ
て反応を停止させ、反応液の呈色強度を、ＮＪ−２００
０型マイクロプレ−トリ−ダ−（日本インタ−メッド株
式会社）により、測定波長４９０ｎｍ、対照波長６２０
ｎｍで測定した。
【００７９】酸素を直接標識したＭＳＮ−１および抗ア
クチン抗体を用いた本法（Ｉ法）と、先に示した酵素標
識した第二抗体を用いた実施例１（２）の酵素免疫測定
法（II法）にて、同一検体を測定し、図４にそれらの測
定値（ｙ／ｘ値）間の相関を示した。相関係数はｒ＝
０．９２であり、両者の測定値には高い相関があった。
【００８０】
【発明の効果】本発明の子宮体癌細胞の免疫化学的検出
方法により得られる効果をまとめると、以下のようにな
る。本発明によれば、陽性・陰性の判定が主観的な基準
によらなければならなかった従来の細胞診に比較して、
データの客観性が高い。しかも、熟練した技術者に限ら
ず、特別な訓練を受けていない人でも、簡便に測定を実
施できる。また、本発明では、抗子宮体癌細胞抗体を用
いる測定と同一の方法、条件で、ヒト細胞に普遍的に存
在する物質の量を測定し、それを検体中の全細胞数ある
いは細胞破砕物の相当量の指標とするので、非特異的な
反応等による判定誤差を修正することができ、その結
果、より的確に子宮体癌細胞を検出することができるよ
うになった。さらに、本発明は、大量の検体を短時間に
検査することができ、測定の自動化も可能なため、集団
検診やマススクリーニングでの子宮体癌診断をより容易
にするものであるということができ、これは、社会的欲
求に応えるものである。
【００８１】
【図面の簡単な説明】
【図１】 検体の蛋白量と、検体を抗アクチン抗体を用
いて測定した結果との相関図である。
【図２】 正常子宮内膜細胞５例と子宮体癌細胞２例を
検体として、本発明の方法で測定を行なった結果を示す
グラフである。
【図３】 健常人１４例、子宮良性疾患患者５例、子宮
体癌患者４例より採取した子宮内膜細胞を検体として用
いた場合における、疾患別の測定値の分布を示したグラ
フである。
【図４】 酵素を直接標識したＭＳＮー１および抗アク
チン抗体を用いた測定法（Ｉ法）によって検体を測定し
た結果と、酵素標識した第二抗体を用いた測定法（II
法）によって検体を測定した結果との相関を示す図であ
る。

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒト子宮体癌細胞に対して特異性の高い
    免疫反応性を有するモノクローナル抗体を用いる子宮体
    癌細胞の検出方法であって、 ａ）検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜細胞お
    よび／または子宮内膜組織、あるいはそれらの破砕物を
    調製する工程、 ｂ）該検体を、担体上の複数の領域あるいは複数の担体
    に所定量固相化する工程、 ｃ）前記モノクローナル抗体に標識剤を直接または間接
    に結合させてなる標識モノクローナル抗体およびヒト細
    胞に普遍的に存在する物質Ａと反応する物質Ｂに標識剤
    を直接または間接に結合させてなる標識物質Ｂを、各
    々、前記担体上の検体が固相化された異なる領域に添加
    して固相化された検体と反応させる工程、 ｄ）前記担体を洗浄することにより、検体と結合しなか
    った前記標識モノクローナル抗体および前記標識物質Ｂ
    を除去する工程、および、 ｅ）検体と結合した前記標識モノクローナル抗体および
    前記標識物質Ｂの各々について、前記標識剤の示す信号
    強度を測定する工程、 を有し、前記標識物質Ｂ中の標識剤の示す信号強度ｘを
    基準として、前記標識モノクローナル抗体中の標識剤の
    示す信号強度ｙを評価し、検体中の子宮体癌細胞の有無
    を判定することを特徴とするヒト子宮体癌細胞の免疫化
    学的検出方法。
  2. 【請求項２】 ヒト子宮体癌細胞に対して特異性の高い
    免疫反応性を有するモノクローナル抗体を用いる子宮体
    癌細胞の検出方法であって、 ａ）検体として、子宮内腔より採取した子宮内膜細胞お
    よび／または子宮内膜組織、あるいはそれらの破砕物を
    調製する工程、 ｂ）該検体を、担体上の複数の領域あるいは複数の担体
    に所定量固相化する工程、 ｃ）前記モノクローナル抗体およびヒト細胞に普遍的に
    存在する物質Ａと反応する物質Ｂを、各々、前記担体上
    の検体が固相化された異なる領域に添加して固相化され
    た検体と反応させる工程、 ｄ）前記モノクローナル抗体と反応する物質Ｃに標識剤
    を直接または間接に結合させてなる標識物質Ｃおよび前
    記物質Ｂと反応する物質Ｄに標識剤を直接または間接に
    結合させてなる標識物質Ｄを、各々、前記モノクローナ
    ル抗体または前記物質Ｂと反応させる工程、 ｅ）前記担体を洗浄することにより、検体と直接または
    間接に結合しなかった、前記モノクローナル抗体、前記
    物質Ｂ、前記標識物質Ｃおよび前記標識物質Ｄを除去す
    る工程、および、 ｆ）検体と間接に結合した前記標識物質Ｃおよび前記標
    識物質Ｄの各々について、前記標識剤の示す信号強度を
    測定する工程、 を有し、前記標識物質Ｄ中の標識剤の示す信号強度ｘを
    基準として、前記標識物質Ｃ中の標識剤の示す信号強度
    ｙを評価し、検体中の子宮体癌細胞の有無を判定するこ
    とを特徴とするヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方
    法。
  3. 【請求項３】 前記信号強度ｘに対する前記信号強度ｙ
    の比率を求め、一定の比率以上の検体を陽性とする請求
    項１または２に記載のヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検
    出方法。
  4. 【請求項４】 前記ヒト細胞に普遍的に存在する物質Ａ
    がアクチンである請求項１〜３のいずれかに記載のヒト
    子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法。
  5. 【請求項５】 前記標識剤が酵素であり、前記信号強度
    の測定が、酵素反応の結果により増加する物質が示す信
    号強度の測定である請求項１〜４のいずれかに記載のヒ
    ト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法。
  6. 【請求項６】 前記標識剤が化学発光物質、蛍光物質あ
    るいはラジオアイソトープである請求項１〜４のいずれ
    かに記載のヒト子宮体癌細胞の免疫化学的検出方法。
  7. 【請求項７】 前記検体中の子宮体癌細胞の有無の判定
    が肉眼的に定性的に行なわれる請求項５に記載のヒト子
    宮体癌細胞の免疫化学的検出方法。
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