JPH0625069B2

JPH0625069B2 - Ｂ型肝炎ワクチン製造方法

Info

Publication number: JPH0625069B2
Application number: JP57012494A
Authority: JP
Inventors: ジエシンタ・スケリー; コリン・ロナルド・ハワード; エアリ−・ジエイ・ズツカ−マン
Original assignee: BURITEITSUSHU TEKUNOROJII GURUUPU Ltd
Current assignee: BURITEITSUSHU TEKUNOROJII GURUUPU Ltd
Priority date: 1981-01-29
Filing date: 1982-01-28
Publication date: 1994-04-06
Anticipated expiration: 2009-04-06
Also published as: US4554157A; US4666713A; JPS57144227A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＢ型肝炎ワクチンに係る。特に、Ｂ型肝炎表面
抗原断片からＢ型肝炎ワクチンを製造する方法に係る。

ウイルス性肝炎は世界中の国々で主要な公衆保健問題と
なつている。この肝炎の感染は少なくとも４種の異なる
ウイルスによつて生ずる。これらのウイルスのうち、Ａ
型肝炎ウイルス及びＢ型肝炎ウイルスは既に同定され且
つ特徴が知られている。第三の肝炎の形態は最近になつ
て認められ、Ａ型及びＢ型肝炎ウイルスとは異なり又互
いに異なる２種のウイルスによつて生起すると信じられ
ている。Ｂ型肝炎は世界中のあらゆる分野の医療に影響
を及ぼしている。このウイルスは長期間に亘つて存続す
るために、例えば輸血などで重要な問題を生起する。Ｂ
型肝炎ウイルスは皮膚を介して直接に伝染するので可能
な伝染経路は多様である。

抗Ｂ型肝炎感染ワクチンの必要性は長年の間叫ばれてい
るが、組織培養を繰り返し行なつて病原ウイルスを弱毒
化するという伝統的方法では、人工的な条件下でこの特
殊なウイルスを生育させるのが困難なため、有効なワク
チンは製造されない。これに代わつて限界はあるがワク
チン製造にある程度成功したものは、Ｂ型肝炎表面抗原
を単離して単独で使用するものである。この表面抗原
は、本質的に、通常直径22ｎｍの球状タンパクであるウ
イルスの被覆タンパクである。実験ワクチンはＢ型肝炎
ウイルスの健康保菌者（キヤリヤー）の血漿から製造し
ていた。このようなワクチンは、保護性表面抗体を産生
し得、チンパンジーテスト及び限られた臨床試験で保護
し得ることが知見された。

血漿から製造されるウイルスワクチンを使用することに
関連した実際上の問題の一つは次のようなものである。
即ち、所望の保護性抗体の産生を誘発する所望の抗原性
物質を含有することの他に、血漿由来ワクチンは種々の
他の抗原性物質を含有し、これが全て他の抗体の産生を
誘発し得、更にこのような不純物抗原性物質が存在する
と好ましくない副作用を生起することがあるのである。

これら不純物抗原性物質に関連して生起する問題を回避
するために、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）をポリペプチ
ド断片に分解してこの表面抗原を改質することが試みら
れて来た。HBsAgの断片化は、基本的にHBsAgをpH７．３
の緩衝液の存在下37℃で一夜非イオン性洗浄剤トリトン
Ｘ-１００（Triton Ｘ-１００）と共にインキユベート
することにより行なわれていた。その後断片化したHBsA
gをセフアロース（Sepharose）カラムに通し種々の断片
を夫々分離し、その結果得られた断片の分子量は沈降法
により決定され、免疫特性も検討された。これらのテス
トにより、得られたペプチド断片のうち２つが有意なＢ
型肝炎表面抗原活性を有していることが示された。これ
らは、分子量約２８，０００のグリコポリペプチド断片
と分子量約２３，０００のポリペプチド断片であつた。
このHBsAgの断片化の詳細についてはSkelly, Howard及
びZuckerman, J.Gen.Virology（１９７９）４４,６７９
−６８９に記載されている。

上述の如くして得られた分子量２８，０００のグリコポ
リペプチド断片及び分子量２３，０００のポリペプチド
断片の免疫原性をこれら由来のHBsAgと比較するため数
々のテストが行なわれたが、当時はHBsAgの分裂に用い
られる洗浄剤を全て完全に除去する方法で満足なものが
なく、その結果上述のSkelly et alの論文に記載の方法
で得られた断片は臨床上許容し得るワクチンの製造には
適さないものであつた。

本発明者等は、HBsAgの洗浄剤分裂で得られる免疫原性
活性断片から洗浄剤の全ての痕跡を実質的に除去し得、
従つて臨床上有用なワクチンを製造し得る方法を知見し
た。

即ち、本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス感染ワクチンの調
製に適し且つ洗浄剤を含有しないタンパク画分の製造方
法を提供し、該方法は、Ｂ型肝炎表面抗原を非イオン性
洗浄剤で処理して分子量約２８，０００の免疫原性グリ
コポリペプチド断片及び分子量約２３，０００の免疫原
性ポリペプチド断片を含有するポリペプチド混合物を形
成し、ポリペプチド混合物を分子量約２８，０００のグ
リコポリペプチド及び分子量約２３，０００のポリペプ
チドの変性を回避するpHに緩衝した水溶液の頂部に重層
し（この水性緩衝液は少なくとも２０％（重量／容量、
以下Ｗ／Ｖとする）乃至６５％（Ｗ／Ｖ）以下好ましく
は５０％（Ｗ／Ｖ）以下の濃度勾配でシヨ糖を含有して
いる）、この重層した緩衝液を遠心し、得られる緩衝液
の上部から実質的に洗浄剤を含有せず且つ分子量約２
８，０００のグリコポリペプチド及び分子量約２３，０
００のポリペプチドのミセルを含有している水性画分を
回収することからなる。

本発明方法は、あらゆる起源例えばヒト又はチンパンジ
ーのＢ型肝炎表面抗原に関して使用し得る。

表面抗原の処理に使用する洗浄剤は、通常トリトン（Tr
iton）類の如きアルキルアリールポリエーテルアルコー
ルである。

本発明方法に於いて好ましく使用し得る水性緩衝液は２
０−５０％（Ｗ／Ｖ）又は２０−６０％（Ｗ／Ｖ）の直
線シヨ糖勾配を有する。これは、シヨ糖濃度が２０％
（Ｗ／Ｖ）−５０％（Ｗ／Ｖ）又は６０％（Ｗ／Ｖ）の
範囲に亘つて直線的に増加するような水性緩衝液を用い
ることにより、分子量約２８，０００の免疫原性活性グ
リコポリペプチド（以後gp２８とする）及び分子量約２
３，０００のポリペプチド（以後ｐ２３とする）から洗
浄剤を実質的に完全に分離し得るという知見に基づくも
のである。シヨ糖勾配法によりgp２８及びｐ２３からミ
セルを生成することも可能になる。このように実質的に
洗浄剤を含有しない水性物は臨床的観点から公知の洗浄
剤含有物質の問題を回避し、更に、Ｂ型肝炎表面抗原全
体を含有する血漿由来物質の使用に関連した副作用の問
題も回避する。

本発明方法で使用する水性緩衝液は水性媒体のpHをgp２
８及びｐ２３の変性を回避する値に維持する。免疫原性
的に最も活性な物質に関して、pHの範囲は約４乃至８で
あり、約７．０乃至７．５のpHで満足のいく結果が得ら
れた。リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びエチレン
ジアミン四酢酸をベースとするpH７．４のいわゆるTNE
バツフアが本発明に適していることが知見された。

本発明方法では、重層されたシヨ糖勾配を遠心し、所望
のgp２８及びｐ２３断片から洗浄剤を分離する。遠心の
正確なスピードは臨界的なものではないが、合理的な時
間で分離するためには約４０ｇ乃至２５０，０００ｇの
力に相当するスピードが好都合であり、通常は少なくと
も２００，０００ｇの力に相当するスピードで行なう。

遠心の時間も臨界的なものではないが、遠心の回転スピ
ードに依存する。通常、約６時間以内で所望の免疫原性
物質と洗浄剤が適度に分離される。できるだけ完全に洗
浄剤を除去するには、通常６時間より長く遠心をする
が、実用的には通常２４時間又は４８時間までで遠心す
る。

一様な結果を得るには、遠心操作の間の温度を制御する
ことが望ましいが、分離に特に臨界的な温度はない。あ
る場合には、室温よりやや低い温度で操作することが望
ましいが、通常周囲の室温以上に温度を上げても効果は
ない。実際には通常4゜乃至２０℃の範囲で操作する
が、２０℃以上又は４℃以下でも操作できる。

本発明方法によると、洗浄剤を含有せず、臨床用ワクチ
ンとして適した、gp２８及びｐ２３のミセルを含有する
水性物質が製造される。本発明者等の知る限り、本発明
で得られるこのような洗浄剤を含有しない水性物質は新
規である。gp２８及びｐ２３のミセルを含有し洗浄剤を
含有しない水性溶液に加えて、細胞系の如き他のあらゆ
る起源から誘導されるか又は遺伝子操作若しくは化学合
成によって誘導されるＢ型肝炎表面抗原と免疫原性の点
で類似する他の物質を含有し洗浄剤を含有しない水溶液
も本発明の態様である。

洗浄剤を含有しないgp２８及びｐ２３断片は、それ自体
公知の方法で臨床用ワクチンに調製し得る。例えば、こ
の免疫原性物質は１mlあたり免疫原性物質約５乃至５０
μｇを含有し且つピロゲンを含有しない水性キヤリー中
に処方できる。このような水性ワクチンは又水酸化アル
ミニウム又は有機アジユバントの１つの如き通常のワク
チンアジユバントと混合して用いてもよい。

本発明で得られた洗浄剤を含有しないgp２８及びｐ２３
断片を含有するワクチンはin vitro試験並びにモルモツ
ト、マウス及びチンパンジーによるin vivo試験の両方
で有効であることが知見された。チンパンジーテストに
よると、本発明のワクチンは、チンパンジーで高抗体力
価を生ずるのみならず、免疫チンパンジーに病原ウイル
スを導入したときに許容し得る限度の保護を与えること
が判明した。

以下に実施例を例示して本発明を説明する。

実施例１感染チンパンジーの血漿から得たＢ型肝炎表面抗原をSk
elly et al（１９７８）Ｊ．Gen. Virol.４１４４７−
４５７に記載の方法で２０乃至２５ｎｍの粒子の形状に
精製した。得られたHBsAgを、Skelly et al.,J.Gen.Vir
ol.（１９７９）４４，６７９−６８９の記載に準じ
て、最終濃度が夫々２％（Ｗ／Ｖ）及び０．５ＭのTrit
on Ｘ−１００及びNaClの存在下３７℃で一夜インキユ
ベートして分裂した。溶解した物質を、１ＭCaCl₂及びM
nCl₂を含む完全分裂緩衝液で平衡したコンカナバリンＡ
セフアロース（Con -A-Sepharose）カラムに通した。カ
ラムに担持された断片はα−メチル−マンノシドで溶出
した。これは、分子量約２８，０００のグリコポリペプ
チド（gp２８）及び分子量約２３，０００のポリペプチ
ド（ｐ２３）であることを確認した。

次いでgp２８及びｐ２３物質をシヨ糖直線勾配の頂部に
重層して洗浄剤から分離した。用いた水性緩衝液は、ｐ
Ｈ７．４のPNEバツフア（０．０５Ｍtris HCl,０．１４
ＭNaCl及び０．００１Ｍエチレンジアミン四酢酸）であ
つた。この水性緩衝液のシヨ糖直線濃度勾配は２０％
（Ｗ／Ｖ）乃至５０％（Ｗ／Ｖ）に調整した。次いで洗
浄剤を含有するｇｐ２８及びｐ２３のサンプルをシヨ糖
含有緩衝液の頂部に導入し、この液体をベツクマン（Be
ckman）ＳＷ４０遠心機にかけ２２０，０００ｇ，４℃
で２４時間遠心した。チユーブの頂部から画分０．５ml
を収集し、ポリペプチドの位置をガンマスペクトロメト
リー（gamma spectrometry）でモニターした。１２５Ｉ
で標識されたポリペプチドを用いるテストにより勾配の
約2/3の地点にピークがあることが判つた。然し、緩衝
液が工程を通じて２％Tritonを含有している対照実験に
於いては、放射活性は勾配の頂部に滞まつていた。この
ことは、即ち、洗浄剤を含有しないシヨ糖勾配を使用す
ることによりｇｐ２８及びｐ２３物質を洗浄剤から有効
に分離できることを示している。放射活性ピークが勾配
の2/3の地点にあるという事実は、本発明で洗浄剤を含
有しないシヨ糖勾配を使用した場合、ｇｐ２８及びｐ２
３物質が再会合して洗浄剤を含有する出発物質中の免疫
原性物質に比べて大きい沈降係数を有するポリペプチド
ミセルを形成することを示している。１．１乃至１．４
グラム／cm³の濃度の塩化セシウムの直線勾配が確保さ
れている上述のタイプの水性緩衝液中にTritonを含有し
ないｇｐ２８及びｐ２３のサンプルを導入した。このも
のを同じBeckman遠心分離機中２２，０００ｇ，４℃で
２４時間遠心し、その後管頂部から画分０．５mlを回収
した。アベ（Ａｂｂ）タイプの屈折計を用いて浮遊密
度を決定したところ、浮遊密度は１．２５ｇ／mlであつ
た。比較のために示すと、インタクト（intact）なHBsA
g粒子は密度１．１９ｇ／mlであつた。電子顕微鏡観察
によると、ｇｐ２８及びｐ２３のミセルは多形性且つ綿
状であり、平均直径は１２０ｎｍであつた。このミセル
はanti-HBsにより急速に凝集した。ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により、ｇｐ２８とｐ２３の双方がミセ
ル中に洗浄剤溶液中と同じ比率で存在することが示され
た。このことは、即ち、このミセルがポリペプチドの一
方又は他方から優先的に形成されるのではないことを示
している。

血清学的活性物質の回復ｇｐ２８及びｐ２３、Triton分裂後のHBsAg並びにCon-A
-Sepharoseからの溶出液について特異的HBsAg活性を逆
受動型赤血球凝集反応（reverse passive haemagglutin
ation, RPHA ）によつてモニターした。HBsAg１０mgを
分裂した実験に於いては、Con-A-Sephroseカラムからは
３．４mgが回収され、シヨ糖勾配からは２．５mgのタン
パクが回収された。即ち、最初に存在していたｇｐ２８
及びｐ２３の７３％の量が回収された。タンパク１mgあ
たりRPHAタイターは、シヨ糖勾配で形成されたタンパク
ミセルでは２．２×１０³，Sepharoseからの溶出液では
3.7×10⁵，Triton分裂後のHBsAgでは９．９×１０⁵であ
つた。

ｇｐ２８及びｐ２３のミセルの免疫原性本発明で得られたミセル及びこのミセルの由来であるイ
ンタクトな２２ｎｍHBsAg粒子の免疫原性をマウス効能
（potency）テストを用いて比較した。２つの供試製剤
は先ずｐＨ６．６の０．１Ｍフオスフエート（phosphat
e）バツフア(PBS)に対して透折した後最終濃度を１mlあ
たりタンパク２００μｇとした。このフオスフエードバ
ツフア中で各サンプル６mlに対して２％リン酸アルミニ
ウム懸濁液１mlを加え、この懸濁液を一夜混合してタン
パクを吸着させた。その後このリン酸アルミニウムを遠
心してPBSで一回洗浄した。上澄のタンパク及び逆受動型
赤血球凝集反応による血清学的活性の測定によると、９
５％以上の抗原がリン酸アルミニウムに吸着していた。
その後沈澱をPBS中に再び懸濁し、最終リン酸アルミニ
ウム濃度を０．０４％とした。その後この懸濁液をPBS
中０．４％リン酸アルミニウムで近似的に希釈して接種
物の容量及びリン酸アルミニウム含量を全ての抗原投与
量に対して同一とした。一回の投与は、マウス６匹から
なる一群に、インタントな２２ｎｍ粒子又はｇｐ２８若
しくはｐ２３物質のミセルを１００μ中２０，１０又
は５μｇ腹腔内注射した。２回のブースター投与は隔週
で与えた。これらのマウスは最後の接種後１１日で出血
し、血清中の抗体タイターを決定した。

添附図にanti-HBsのプロテインＡ−ラジオイムノアツセ
イの結果を示す。これは、本発明のミセル製剤（図中黒
丸で示す）又はインタクトな２２ｎｍ粒子HBsAg製剤
（図中白丸で示す）を３回１０μｇずつ投与したマウス
の血清中で測定したものである。この血清は、先ず０．
５％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有するリン酸緩衝
生理食塩水（phosphate buffer saline,PBS）中に１：
１０で希釈し、次いで２倍希釈液を¹²⁵I-HBsAg（インタ
クト２５ｎｍ粒子，１０μ，２４，０００cpm）と混
合し、室温で一夜インキユベートした。その後プロテイ
ンA Sepharose（PBS-BSA中５％）を加え、室温で１時間
激しく振盪した。このSepharoseを低速遠心でペレツト
にし、ベレツトと上澄みを計数前に分離した。添附図中
の点は、６個の血清サンプルから沈澱した免疫複合体
（immune complexes）と関連して１分間あたりの平均計
数値を示す。垂直な線分は標準偏差を示す。

添附図に示されるように、供試投与レベルでミセル製剤
を投与した全てのマウスで、共通の高い抗原レベルが観
察された。ミセル製剤の他の投与レベルでも同様な高い
抗原レベルが観察された。

実施例２持続感染チンパンジー血清から実施例１に記載のSkelly
et al（１９７８）の方法で２２ｎｍ粒子として表面抗
原を単離し、Skelly et al（１９７９）の方法をやや変
えた実施例１に記載の方法で実質的に分裂した。ｐＨ
７．３の０．０１Ｍ−tris-HClバツフアは最終濃度２％
（Ｗ／Ｖ）のTriton Ｘ−１００を含有しており、Conca
navalin A Sepharoseの平衡用に使用した緩衝液中には
１ｍＭＣａＣｌ_２及び１ｍＭ−ＭｎＣｌ_２を補足して
おいた。懸濁液を６０分間回転子上でおだやかに混合し
次いで１×１０cmカラムに充填し、緩衝液で洗浄して、
固定されなかった物質を除去した。固定された物質は、
２％ＴＸ−１００，０．５ＭNaCl及び５％α−メチル−
Ｄ−マンノシド（α−mm）を含有するｐＨ７．３の０．
０１Ｍ−tris-HClで溶出した。次いでピーク画分をTNE
バツフア（０．５Ｍtris-HCl，ｐＨ７．４，０．１４Ｍ
NaCl,０．００１ＭEDTA）中の２０−６０％（Ｗ／Ｖ）
直線シヨ糖勾配上で220,000g，１５℃，２４時間Beckma
n ＳＷ４０ローターで遠心した。所望のｇｐ２８及びｐ
２３画分のシヨ糖勾配中の位置を実施例１に説明したよ
うに同定し、ミセル形態のｇｐ２８及びｐ２３のTriton
を含有しないサンプルを回収した。

浮遊密度を実施例１に記載したように測定したところ、
１．２２ｇ／mlであつた。末分画表面抗原の浮遊密度は
１．１９ｇ／mlであつた。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、ミセルがｇ
ｐ２８及びｐ２３ポリペプチドを末分画表面抗原と本質
的に同じ割合で含有することが示された。電子顕微鏡に
より、ミセルはほぼ球形で１４０−２５０ｎｍの直径で
あることが示された。２００以上の粒子を測定したとこ
ろ、平均直径は１８０ｎｍであつた。

特異的Ｂ型肝炎表面抗原活性を、逆受動型赤血球凝集反
応（RPHA）又はラジオイムノアツセイ（RIA ）のいずれ
かによつて洗浄剤除去ステツプを通じてモニターしたと
ころ、検出した血清学的活性は、Triton分裂後又はそれ
に続くCon- A Sepharoseからの溶出のいずれに於いても
失なわれなかつた。おそらくは、原粒子に存在していた
新たな免疫反応性成分が除去された結果として、特異活
性の増加が認められた。更にミセル製剤中には少なくと
も７０％の元の抗原性が保持されていた。このミセル製
剤はマウス効能アツセイ試験並びにチンパンジー安全性
及び保護テストに於いて世界保健機構の要求に合致して
いる。

実施例３ヒトキヤリヤー血清からSkelly et al（１９７８）の手
順によつて回収した表面抗原２２ｎｍ粒子を用いる以外
は実施例２に記載の手順を繰り返した。浮遊密度が１．
２４ｇ／mlである以外は実施例２で得られたミセルと実
質的に類似のミセル生成物を得た。このミセルはチンパ
ンジー由来物質に比べてやや大きかつた（平均径２００
ｎｍ）。

【図面の簡単な説明】

添附図面は、本発明ミセル製剤（黒丸）及びインタクト
HBsAg製剤（白丸）のラジオイムノアツセイの結果を示
す図である。

フロントページの続き (72)発明者エアリ−・ジエイ・ズツカ−マンイギリス国ロンドン・ダブリユ・シ−１イ −７エイチ・テイ−・ケツペル・ストリ− ト・ロンドン・スク−ル・オブ・ハイジ− ン・アンド・トロピカル・メデイスン（番地なし) (56)参考文献特開昭53−133628（ＪＰ，Ａ) 特開昭51−133414（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．44，（1979），Ｐ. 679−689 ｇｅｎ.

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｂ型肝炎ウィルス感染に対するワクチンを
作製するのに適したタンパク画分の製造方法であって、非イオン性洗浄剤および免疫原性ポリペプチドを含む水
性調製物を導入して、前記ポリペプチドの変性を回避す
るpHに緩衝されており少なくとも20％（重量／容量）か
ら65％（重量／容量）以下までの濃度勾配のショ糖を含
有する水溶液の頂部に層を形成し、この層を形成した緩
衝液を遠心し、前記免疫原性ポリペプチドのミセルを含
有し洗浄剤を実質的に含まない免疫原性の水性画分を緩
衝液から回収することからなっており、前記免疫原性ポリペプチドは、Ｂ型肝炎表面抗原を担持
する直径20〜25ｎｍの血清由来粒子を非イオン性洗浄剤
で処理した後アフィニティークロマトグラフィーにかけ
て得られた分子量約23,000のものであるか、または免疫
学的には前記血清由来粒子から得られたものに類似して
いるが化学合成によって得られたかもしくは遺伝子工学
的に処理した宿主細胞から得られたものであることを特徴とする、タンパク画分の製造方法。
【請求項２】Ｂ型肝炎表面抗原を担持する直径20〜25ｎ
ｍの血清由来粒子を非イオン性洗浄剤で処理した後アフ
ィニティークロマトグラフィーにかけて、分子量約28,0
00の免疫原性グリコポリペプチド(gp28)および分子量約
23,000の免疫原性ポリペプチド(p23) を含む調製物を生
成せしめることからなる、Ｂ型肝炎ウィルス感染に対す
るワクチンを作製するのに適したタンパク画分の製造方
法であって、gp28および p23ならびに洗浄剤を含む前記
調製物を導入して、gp28および p23の変性を回避するpH
に緩衝されており少なくとも20％（重量／容量）から65
％（重量／容量）以下までの濃度勾配のショ糖を含有す
る水溶液の頂部に層を形成し、この層を形成した緩衝液
を遠心し、gp28および p23のミセルを含有し洗浄剤を実
質的に含まない免疫原性の水性画分を緩衝液から回収す
ることを特徴とする、前記製造方法。
【請求項３】ショ糖の濃度勾配が少なくとも20％（重量
／容量）から50％（重量／容量）までであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項または第２項に記載の方
法。
【請求項４】ショ糖の濃度勾配が、20％から50％まで、
または20％から60％まで増加する直線勾配である（％は
重量／容量）ことを特徴とする特許請求の範囲第１項ま
たは第２項に記載の方法。
【請求項５】洗浄剤を含有するポリペプチド混合物を、
ショ糖を含有する水性緩衝液の頂部に層として導入し、
この層を形成した緩衝液を40〜250,000gの力に相当する
スピードで遠心することを特徴とする特許請求の範囲第
１項〜第４項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】遠心を 4〜20℃で少なくとも６時間実施す
ることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の方
法。
【請求項７】洗浄剤を含まないミセルを遠心した緩衝液
から回収し、ピロゲンを含まない水性媒質中に配合する
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第６項のいず
れかに記載の方法。