JPH0789951B2 - 遺伝子発現産物の精製法 - Google Patents
遺伝子発現産物の精製法Info
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- JPH0789951B2 JPH0789951B2 JP61143413A JP14341386A JPH0789951B2 JP H0789951 B2 JPH0789951 B2 JP H0789951B2 JP 61143413 A JP61143413 A JP 61143413A JP 14341386 A JP14341386 A JP 14341386A JP H0789951 B2 JPH0789951 B2 JP H0789951B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、遺伝子発現産物中に混入する菌体由来のアレ
ルゲンを除去するための精製法に関するものである。更
に詳しくは、組換えDNA技術等により得られる形質転換
体を用いて有用物質を生産し、かかる有用物質を単離精
製するとき、必然的に夾雑物ないしは不純物として混入
する形質転換体由来のアレルゲンを、アレルゲン検出の
公知の常法によっては検出できない程度に高度に除去す
るための精製法に関する。本発明の精製法は、微生物及
び細胞培養を用いて生産される有用物質のうち、特に、
人体に直接使用される医薬品並びに医薬部外品の有効成
分の製造に有用である。例えば、ワクチン抗原、医薬用
酵素、歯磨剤用酵素、化粧品用蛋白質等の製造におい
て、本発明の精製法は極めて有効に用いることができ
る。
ルゲンを除去するための精製法に関するものである。更
に詳しくは、組換えDNA技術等により得られる形質転換
体を用いて有用物質を生産し、かかる有用物質を単離精
製するとき、必然的に夾雑物ないしは不純物として混入
する形質転換体由来のアレルゲンを、アレルゲン検出の
公知の常法によっては検出できない程度に高度に除去す
るための精製法に関する。本発明の精製法は、微生物及
び細胞培養を用いて生産される有用物質のうち、特に、
人体に直接使用される医薬品並びに医薬部外品の有効成
分の製造に有用である。例えば、ワクチン抗原、医薬用
酵素、歯磨剤用酵素、化粧品用蛋白質等の製造におい
て、本発明の精製法は極めて有効に用いることができ
る。
［従来の技術］ 生体に抗原が接種されたり、吸入される等により、抗原
刺激が加えられると、生体はその抗原に対し特異的に反
応する抗体を産生する。かかる生体に再度、同一抗原が
移入されると、生体内では抗原抗体反応が生じ、異物と
しての抗原は破壊される−−これが、いわゆる感染症の
防御機構として知られている免疫現象である。ところ
が、かかる免疫現象とは全く正反対の局所炎症、急激な
ショック症状等の異常反応ないしは過敏反応が上記の抗
原移入により生じることがある。これは、アレルギー反
応またはアナフィラキシーと呼ばれている。現在、アレ
ルギー反応は、症状、発現機序等の相異によりＩ〜IV型
の四つの型に大別されている。これらのうち、特に、Ｉ
型アレルギーは、即時型アレルギーまたはアナフィラキ
シーといわれ、主要なアレルギー反応として知られてい
る。また、ヒトのＩ型アレルギーは、通常、免疫グロブ
リンＥ（IgE）抗体により惹起されることも知られてい
る。例えば、抗原としてのアレルゲンによる刺激を受け
るとヒトの体内では該アレルゲンに対するIgE抗体が産
生され保有される。かかる感作された状態下のヒトに再
度、同一のアレルゲンが導入されると、上記IgE抗体と
該アレルゲンとの間で生ずる抗原抗体反応が引き金とな
って、アレルギー反応が惹起される。アレルゲンの起源
またはアレルゲンになり得る物質としては、例えば、花
粉、昆虫、動物の皮屑、カビ、微生物由来物質、食物、
薬物、化学物質等が知られている。かかるアレルゲンに
対する生体のIgE抗体の保有状況は、一般に、受身皮膚
アナフィラキシー（PCA）反応により測定されている。
刺激が加えられると、生体はその抗原に対し特異的に反
応する抗体を産生する。かかる生体に再度、同一抗原が
移入されると、生体内では抗原抗体反応が生じ、異物と
しての抗原は破壊される−−これが、いわゆる感染症の
防御機構として知られている免疫現象である。ところ
が、かかる免疫現象とは全く正反対の局所炎症、急激な
ショック症状等の異常反応ないしは過敏反応が上記の抗
原移入により生じることがある。これは、アレルギー反
応またはアナフィラキシーと呼ばれている。現在、アレ
ルギー反応は、症状、発現機序等の相異によりＩ〜IV型
の四つの型に大別されている。これらのうち、特に、Ｉ
型アレルギーは、即時型アレルギーまたはアナフィラキ
シーといわれ、主要なアレルギー反応として知られてい
る。また、ヒトのＩ型アレルギーは、通常、免疫グロブ
リンＥ（IgE）抗体により惹起されることも知られてい
る。例えば、抗原としてのアレルゲンによる刺激を受け
るとヒトの体内では該アレルゲンに対するIgE抗体が産
生され保有される。かかる感作された状態下のヒトに再
度、同一のアレルゲンが導入されると、上記IgE抗体と
該アレルゲンとの間で生ずる抗原抗体反応が引き金とな
って、アレルギー反応が惹起される。アレルゲンの起源
またはアレルゲンになり得る物質としては、例えば、花
粉、昆虫、動物の皮屑、カビ、微生物由来物質、食物、
薬物、化学物質等が知られている。かかるアレルゲンに
対する生体のIgE抗体の保有状況は、一般に、受身皮膚
アナフィラキシー（PCA）反応により測定されている。
［発明が解決しようとする問題点］ 人体に直接用いるワクチン等の注射薬における夾雑物ま
たは不純物としてのアレルゲンの混入は、安全性を保証
すべき医薬品への信頼を大きく損なう。しかしならが、
ワクチン等の生物学的製剤の製造では、その製品が兼備
すべき有効性、安全性並びに均質性に関する未解決の要
素並びに制約があまりにも多数存在するため、アレルゲ
ンの除去のみを指標かつ目的とした高度精製技術は、未
だ完成されていない。
たは不純物としてのアレルゲンの混入は、安全性を保証
すべき医薬品への信頼を大きく損なう。しかしならが、
ワクチン等の生物学的製剤の製造では、その製品が兼備
すべき有効性、安全性並びに均質性に関する未解決の要
素並びに制約があまりにも多数存在するため、アレルゲ
ンの除去のみを指標かつ目的とした高度精製技術は、未
だ完成されていない。
近年、ポリエチレングリコール、プルラン、デキストラ
ン、ポリアミン、脂肪酸、尿素、グルタルアルデヒド、
ホルマリン等を用いて種々のアレルゲンを修飾すること
により、かかるアレルゲンが有するIgE抗体産生誘導能
を低減させようとする試みがなされてはいるが、未だ基
礎研究の段階にある。
ン、ポリアミン、脂肪酸、尿素、グルタルアルデヒド、
ホルマリン等を用いて種々のアレルゲンを修飾すること
により、かかるアレルゲンが有するIgE抗体産生誘導能
を低減させようとする試みがなされてはいるが、未だ基
礎研究の段階にある。
更に、ここ10数年来、遺伝子工学の急速な進歩により、
微生物や体細胞の形質転換体が作成され、その培養物か
ら有用物質を生産する技術が盛んに開拓されているた
め、かかる形質転換体由来のアレルゲンがあらゆる製品
中に混入する確率が益々高くなりつつある。しかしなが
ら、かかる遺伝子工学の分野においても、遺伝子発現産
物中に混入するアルゲンの除去を目的とした高度精製技
術は重要視されていない傾向にある。モノクロナール抗
体を用いるアフィニティクロマトグラフィー、大型電気
泳動装置等が開発されてはいるが、これらは、形質転換
体由来のアレルゲン除去の観点からは十分には機能して
いない。
微生物や体細胞の形質転換体が作成され、その培養物か
ら有用物質を生産する技術が盛んに開拓されているた
め、かかる形質転換体由来のアレルゲンがあらゆる製品
中に混入する確率が益々高くなりつつある。しかしなが
ら、かかる遺伝子工学の分野においても、遺伝子発現産
物中に混入するアルゲンの除去を目的とした高度精製技
術は重要視されていない傾向にある。モノクロナール抗
体を用いるアフィニティクロマトグラフィー、大型電気
泳動装置等が開発されてはいるが、これらは、形質転換
体由来のアレルゲン除去の観点からは十分には機能して
いない。
従って、生物学的製剤の製造技術を含む遺伝子工学の分
野では、有用物質を生産する形質転換体由来のアレルゲ
ンの除去を目的とした高度精製技術の確立は急務の課題
である。
野では、有用物質を生産する形質転換体由来のアレルゲ
ンの除去を目的とした高度精製技術の確立は急務の課題
である。
［問題を解決するための手段及び作用］ 本発明者らは、前記課題を解決するため、鋭意研究を重
ねた結果、珪酸による吸脱着処理、活性炭による処理、
密度勾配遠心法及び平衡密度勾配遠心法を順次組合せた
精製法により、組換え遺伝子技術により作成された形質
転換体の培養物中の遺伝子発現産物を極めて高純度に精
製できることを見出した。即ち、該形質転換体由来のア
レルゲンがPCA反応では検出できない程度にまで除去さ
れた遺伝子発現産物の製造に成功した。同時に、上記精
製法により、かかる遺伝子発現産物を安定かつ大量に高
度精製できることを見出した。本発明者らは、これらの
知見に基づき本発明を完成した。
ねた結果、珪酸による吸脱着処理、活性炭による処理、
密度勾配遠心法及び平衡密度勾配遠心法を順次組合せた
精製法により、組換え遺伝子技術により作成された形質
転換体の培養物中の遺伝子発現産物を極めて高純度に精
製できることを見出した。即ち、該形質転換体由来のア
レルゲンがPCA反応では検出できない程度にまで除去さ
れた遺伝子発現産物の製造に成功した。同時に、上記精
製法により、かかる遺伝子発現産物を安定かつ大量に高
度精製できることを見出した。本発明者らは、これらの
知見に基づき本発明を完成した。
本発明によれば、（１）珪酸による吸脱着処理、（２）
活性炭による不純物の吸着除去処理、（３）少なくとも
２回の密度勾配遠心法による分画、及び（４）少なくと
も２回の平衡密度勾配遠心法による分画を含むことを特
徴とする遺伝子発現産物の精製法が提供される。同時
に、本発明は、上記形質転換体由来のアレルゲンのみな
らず、自然界に存する微生物並びに体細胞由来のアルゲ
ンをも除去する精製法を提供するものである。
活性炭による不純物の吸着除去処理、（３）少なくとも
２回の密度勾配遠心法による分画、及び（４）少なくと
も２回の平衡密度勾配遠心法による分画を含むことを特
徴とする遺伝子発現産物の精製法が提供される。同時
に、本発明は、上記形質転換体由来のアレルゲンのみな
らず、自然界に存する微生物並びに体細胞由来のアルゲ
ンをも除去する精製法を提供するものである。
本発明の精製法が適用される遺伝子発現産物とは、遺伝
子発現の一次産物並びに二次産物を意味する、例えば、
一次産物としては、蛋白質性のウイルス抗原、酵素、ホ
ルモン、インターフェロン並びにその他の生理活性物
質、二次産物としては、非蛋白質性の高分子生理活性物
質を上げることができる。
子発現の一次産物並びに二次産物を意味する、例えば、
一次産物としては、蛋白質性のウイルス抗原、酵素、ホ
ルモン、インターフェロン並びにその他の生理活性物
質、二次産物としては、非蛋白質性の高分子生理活性物
質を上げることができる。
上記遺伝子発現産物が細胞外へ分泌される場合には、細
胞培養の外液を抽出液とし、細胞外へ分泌されない場合
には細胞を集めて破砕し、破砕された細胞の残渣を除去
することにより抽出液を調製する。細胞の破砕には、公
知の常法、例えば、酵素による消化処理、浸透圧による
破壊処理、超音波、種々のホモジナイザー等を用いるこ
とができるが、加圧式ホモジナイザーの使用が望まし
い。このようにして得られた遺伝子発現産物の抽出液を
以下の工程に供する。
胞培養の外液を抽出液とし、細胞外へ分泌されない場合
には細胞を集めて破砕し、破砕された細胞の残渣を除去
することにより抽出液を調製する。細胞の破砕には、公
知の常法、例えば、酵素による消化処理、浸透圧による
破壊処理、超音波、種々のホモジナイザー等を用いるこ
とができるが、加圧式ホモジナイザーの使用が望まし
い。このようにして得られた遺伝子発現産物の抽出液を
以下の工程に供する。
（Ｉ）珪酸による吸脱着処理−−上記抽出液に珪酸を添
加し、撹拌することにより遺伝子発現産物を珪酸に吸着
させ上清液を除去する。次に、得られた珪酸を洗浄後、
適当な溶出液を添加撹拌して、珪酸画分を該珪酸から溶
出させる。珪酸と溶出液とを遠心分離等により分離して
溶出液を得る。珪酸は、市販のもの、例えば、精製カラ
ムクロマトグラフィー用の粉末等が使用できる。該抽出
液に対し、約0.1〜10（W/V）％になるよう珪酸を添加す
る。また、撹拌は通常10〜30℃で10〜100分間行う。ま
た、本工程は通常のカラムクロマトグラフィーの手法に
よっても行うことができる。遺伝子発現産物の珪酸への
吸脱着は、PH、イオン強度等の差を利用して行うことが
できる。（II）活性炭による不純物の吸着除去処理−−
前記工程（Ｉ）で得られる溶出液を濃縮器を用いて濃縮
すると共に、基礎溶液を交換してもよい。得られた溶液
に活性炭を該溶液に対し、0.1〜10（W/V）％になるよう
添加した後、通常、10〜30℃で５〜30分間撹拌する。所
望の遺伝子発現産物は活性炭に吸着されずに不純物が吸
着されるので、撹拌後、遠心等により活性炭を分離除去
し、上清液を採取する。活性炭としては、市販のもの、
例えば、粉末状の製品等を使用できる。本工程は、通常
の公知のカラムクロマトグラフィーの手法によっても行
うことができる。得られた上清液は塩酸溶液等を用いて
酸処理を行う。例えば、塩酸溶液を上記上清液に滴下
し、pHを約4.0〜6.5に下げることにより不純物を沈殿さ
せ、これを遠心等により分離除去する。一方、その上清
液を採取し、アルカリ溶液を滴下してかかる上清液のpH
を約7.0〜9.0に修正する。このようにして得た上清液
は、必要に応じて、常用されている別種の吸脱着剤、例
えばアルミナ、セライト等による追加の吸脱着処理に供
してもよい。上清液は通常の公知の方法で濃縮する。
加し、撹拌することにより遺伝子発現産物を珪酸に吸着
させ上清液を除去する。次に、得られた珪酸を洗浄後、
適当な溶出液を添加撹拌して、珪酸画分を該珪酸から溶
出させる。珪酸と溶出液とを遠心分離等により分離して
溶出液を得る。珪酸は、市販のもの、例えば、精製カラ
ムクロマトグラフィー用の粉末等が使用できる。該抽出
液に対し、約0.1〜10（W/V）％になるよう珪酸を添加す
る。また、撹拌は通常10〜30℃で10〜100分間行う。ま
た、本工程は通常のカラムクロマトグラフィーの手法に
よっても行うことができる。遺伝子発現産物の珪酸への
吸脱着は、PH、イオン強度等の差を利用して行うことが
できる。（II）活性炭による不純物の吸着除去処理−−
前記工程（Ｉ）で得られる溶出液を濃縮器を用いて濃縮
すると共に、基礎溶液を交換してもよい。得られた溶液
に活性炭を該溶液に対し、0.1〜10（W/V）％になるよう
添加した後、通常、10〜30℃で５〜30分間撹拌する。所
望の遺伝子発現産物は活性炭に吸着されずに不純物が吸
着されるので、撹拌後、遠心等により活性炭を分離除去
し、上清液を採取する。活性炭としては、市販のもの、
例えば、粉末状の製品等を使用できる。本工程は、通常
の公知のカラムクロマトグラフィーの手法によっても行
うことができる。得られた上清液は塩酸溶液等を用いて
酸処理を行う。例えば、塩酸溶液を上記上清液に滴下
し、pHを約4.0〜6.5に下げることにより不純物を沈殿さ
せ、これを遠心等により分離除去する。一方、その上清
液を採取し、アルカリ溶液を滴下してかかる上清液のpH
を約7.0〜9.0に修正する。このようにして得た上清液
は、必要に応じて、常用されている別種の吸脱着剤、例
えばアルミナ、セライト等による追加の吸脱着処理に供
してもよい。上清液は通常の公知の方法で濃縮する。
（III）密度勾配遠心による分画−−前記工程（II）で
得られた濃縮液を通常の公知の密度勾配遠心法による分
画に供する。この工程での密度勾配は、密度が連続的に
傾斜した直線状であっても、また、密度が異なる２以上
の担体溶媒の重層からなる不連続な段階状のものであっ
ても使用できる。密度勾配カラムを調製する物質とし
て、蔗糖、ドイトリウムオキサイド、ディオドン、フィ
コール、臭化カリウム、ポリビニールピロリドン、セシ
ウムクロライド等、公知公用の物質を用いることができ
るが、経済性及び使用の容易性の観点から蔗糖の使用が
望ましい。この工程での遠心による分画は、２回以上、
同一に調製された密度勾配カラムを用いて行うか、また
は、調製の異なる密度勾配カラムを適宜、用いて行う。
調製を変えて密度勾配遠心を行う場合は、前に用いた調
製カラムの濃度勾配の濃度範囲よりもせま狭い濃度範囲
を有する濃度勾配の調製カラムを用いて遠心分離を行
う。尚、調製カラムの濃度勾配の濃度範囲は、遺伝子発
現産物の種類や夾雑物などの種類によって異なるが、初
回の密度勾配遠心分離において通常上限濃度が約40〜60
（W/W）％下限濃度が約５〜20（W/W）％の範囲で行うこ
とができる。また、遠心条件としては通常約20,000〜4
0,000rpmで約２〜30時間の遠心条件で行うことができ
る。
得られた濃縮液を通常の公知の密度勾配遠心法による分
画に供する。この工程での密度勾配は、密度が連続的に
傾斜した直線状であっても、また、密度が異なる２以上
の担体溶媒の重層からなる不連続な段階状のものであっ
ても使用できる。密度勾配カラムを調製する物質とし
て、蔗糖、ドイトリウムオキサイド、ディオドン、フィ
コール、臭化カリウム、ポリビニールピロリドン、セシ
ウムクロライド等、公知公用の物質を用いることができ
るが、経済性及び使用の容易性の観点から蔗糖の使用が
望ましい。この工程での遠心による分画は、２回以上、
同一に調製された密度勾配カラムを用いて行うか、また
は、調製の異なる密度勾配カラムを適宜、用いて行う。
調製を変えて密度勾配遠心を行う場合は、前に用いた調
製カラムの濃度勾配の濃度範囲よりもせま狭い濃度範囲
を有する濃度勾配の調製カラムを用いて遠心分離を行
う。尚、調製カラムの濃度勾配の濃度範囲は、遺伝子発
現産物の種類や夾雑物などの種類によって異なるが、初
回の密度勾配遠心分離において通常上限濃度が約40〜60
（W/W）％下限濃度が約５〜20（W/W）％の範囲で行うこ
とができる。また、遠心条件としては通常約20,000〜4
0,000rpmで約２〜30時間の遠心条件で行うことができ
る。
この工程において遠心分離を行うことにより得られる画
分の中から所望の遺伝子発現産物を含む画分を集め、通
常の公知の方法によって濃縮、透析、濾過などを行った
後、次の遠心分離に供する。このようにして最終的に得
られた画分を下記の平衡密度勾配遠心に供する。
分の中から所望の遺伝子発現産物を含む画分を集め、通
常の公知の方法によって濃縮、透析、濾過などを行った
後、次の遠心分離に供する。このようにして最終的に得
られた画分を下記の平衡密度勾配遠心に供する。
（IV）平衡密度勾配遠心による分画−−前記工程（II
I）で得られる画分を通常の公知の平衡密度勾配法によ
る分画に供する。この工程での遠心分離は、単一密度の
担体溶媒の一層、または、密度が異なる２以上の担体溶
媒の重層からなるカラムを用いることができる。カラム
を調製する物質としては、上記工程（III）に記載のも
のと同じものを用いることができるが、この工程での分
画には、経済性及び産業廃棄物として無害の観点から、
臭化カリウムの使用が望ましい。この工程における遠心
分離による分画は２回以上同一に調製されたカラムを用
いて行うか、または、調製の異なるカラムを適宜、用い
て行うことができる。カラムの調製を変えて遠心分離を
行う場合は、前に用いたカラムの密度よりも低い密度を
有する調製カラムを用いて遠心分離を行う。尚、調製カ
ラムの密度は、遺伝子発現産物の種類や夾雑物などの種
類によって異なるが、初回の平衡密度勾配遠心分離にお
いて通常10〜50（W/W）％で行うことができる。また、
遠心条件としては通常約30,000〜60,000rpmで約30〜80
時間の遠心条件で行うことができる。この工程において
遠心分離を行うことにより得られる画分の中から所望の
発現産物を含む画分を集め、通常の公知の方法によって
濃縮、透析、濾過などを行った後、次の遠心分離に供す
る。このようにして、最終的に高純度に精製された遺伝
子発現産物を得ることができる。
I）で得られる画分を通常の公知の平衡密度勾配法によ
る分画に供する。この工程での遠心分離は、単一密度の
担体溶媒の一層、または、密度が異なる２以上の担体溶
媒の重層からなるカラムを用いることができる。カラム
を調製する物質としては、上記工程（III）に記載のも
のと同じものを用いることができるが、この工程での分
画には、経済性及び産業廃棄物として無害の観点から、
臭化カリウムの使用が望ましい。この工程における遠心
分離による分画は２回以上同一に調製されたカラムを用
いて行うか、または、調製の異なるカラムを適宜、用い
て行うことができる。カラムの調製を変えて遠心分離を
行う場合は、前に用いたカラムの密度よりも低い密度を
有する調製カラムを用いて遠心分離を行う。尚、調製カ
ラムの密度は、遺伝子発現産物の種類や夾雑物などの種
類によって異なるが、初回の平衡密度勾配遠心分離にお
いて通常10〜50（W/W）％で行うことができる。また、
遠心条件としては通常約30,000〜60,000rpmで約30〜80
時間の遠心条件で行うことができる。この工程において
遠心分離を行うことにより得られる画分の中から所望の
発現産物を含む画分を集め、通常の公知の方法によって
濃縮、透析、濾過などを行った後、次の遠心分離に供す
る。このようにして、最終的に高純度に精製された遺伝
子発現産物を得ることができる。
本発明の精製法では、多種多様に存在する公知の精製技
術の中から、精製の各工程に適した技術が上述の如く選
択使用され、かつ、選択された諸技術の組合せによっ
て、アレルゲンを除去するという所期の目的を達成でき
るものである。尚、本発明の精製法の各工程において
は、目的とする遺伝子発現産物の種類等によって温度、
圧力、PH、濃度、イオン濃度等の物理化学的因子の選
定；細胞破砕剤、細胞消化剤、沈殿剤、可溶化剤、吸脱
着剤、支持体、分散剤等の精製用試薬の選定；及び遠
心、濾過、電気泳動、ホモジナイズ等の精製用機器装置
などを適宜選択することができる。
術の中から、精製の各工程に適した技術が上述の如く選
択使用され、かつ、選択された諸技術の組合せによっ
て、アレルゲンを除去するという所期の目的を達成でき
るものである。尚、本発明の精製法の各工程において
は、目的とする遺伝子発現産物の種類等によって温度、
圧力、PH、濃度、イオン濃度等の物理化学的因子の選
定；細胞破砕剤、細胞消化剤、沈殿剤、可溶化剤、吸脱
着剤、支持体、分散剤等の精製用試薬の選定；及び遠
心、濾過、電気泳動、ホモジナイズ等の精製用機器装置
などを適宜選択することができる。
次に、本発明を実施例により説明するが、本発明は以下
の実施例に限定されるものではない。
の実施例に限定されるものではない。
尚、実施例１〜６に記載の各精製工程下でのHBs抗原の
検出と測定は、参考例２に記載と同一の方法で行った。
検出と測定は、参考例２に記載と同一の方法で行った。
参考例１ Ｂ型肝炎ウイルスDNAを有するプラスミドpM1B11が移入
されている大腸菌X1776/pM1B11（微工研条寄第1081号）
からpM1B11をフェノールで抽出する。かかるpM1B11より
制限酵素XhoI,BamHIを用いてＢ型肝炎ウイルス表面抗原
遺伝子（以下、「HBs抗原」という）を含む領域を切り
出し、これを酵母の抑制性酸性フォスファーゼ遺伝子PH
05（Kenji A.,et al.,Nucleic Acid Desearch,10,1
741,1982）領域の下流にT4DNAリガーゼを用いて連係し
た後、pBR325のBamHIサイトにクローニングし、HBs遺伝
子を発現するプラスミドを得る。かかるプラスミドを用
いて酵母Saccharomycescerevisiae SHY4（ATCC NO.44
772）を形質転換し、形質転換体酵母を得た。
されている大腸菌X1776/pM1B11（微工研条寄第1081号）
からpM1B11をフェノールで抽出する。かかるpM1B11より
制限酵素XhoI,BamHIを用いてＢ型肝炎ウイルス表面抗原
遺伝子（以下、「HBs抗原」という）を含む領域を切り
出し、これを酵母の抑制性酸性フォスファーゼ遺伝子PH
05（Kenji A.,et al.,Nucleic Acid Desearch,10,1
741,1982）領域の下流にT4DNAリガーゼを用いて連係し
た後、pBR325のBamHIサイトにクローニングし、HBs遺伝
子を発現するプラスミドを得る。かかるプラスミドを用
いて酵母Saccharomycescerevisiae SHY4（ATCC NO.44
772）を形質転換し、形質転換体酵母を得た。
実施例１ 参考例１で得られた形質転換体酵母を第１リン酸カリ1.
5g/lを含む完全合成培地バルクホルダー培地（Burkhold
er,P.R,etal,Am.J.Botany,30,206,1943.各々20ug/mlの
ウラシル,L−トリプトファン,L−ヒスチジンを含む）を
用いて、30℃で24時間培養して得られた酵母菌体の培養
液を遠心（12,000g,10分）し、集菌する。含水の生菌体
50gを取り、500mlのM/10リン酸緩衝液（pH9.0）に該菌
体を浮遊した後、上記と同様に遠心し、菌体を洗浄す
る。該菌体の洗浄を２回行う。
5g/lを含む完全合成培地バルクホルダー培地（Burkhold
er,P.R,etal,Am.J.Botany,30,206,1943.各々20ug/mlの
ウラシル,L−トリプトファン,L−ヒスチジンを含む）を
用いて、30℃で24時間培養して得られた酵母菌体の培養
液を遠心（12,000g,10分）し、集菌する。含水の生菌体
50gを取り、500mlのM/10リン酸緩衝液（pH9.0）に該菌
体を浮遊した後、上記と同様に遠心し、菌体を洗浄す
る。該菌体の洗浄を２回行う。
実施例２ 実施例１で得た洗浄菌体を500mlのM/100リン酸緩衝液
（pH9.0）に再浮遊した後、これを高圧ホモジナイザー
（米国ゴーリン社製;8,000〜10,000PSi）処理し、菌体
を破壊する。次いで、遠心（12,000g,20分）し、上清液
を集め、HBs抗原の粗抽出液とする。
（pH9.0）に再浮遊した後、これを高圧ホモジナイザー
（米国ゴーリン社製;8,000〜10,000PSi）処理し、菌体
を破壊する。次いで、遠心（12,000g,20分）し、上清液
を集め、HBs抗原の粗抽出液とする。
実施例３ 実施例２で得た粗抽出液に、塩化ナトリウムを最終濃度
0.2モルになるよう添加混合する。次いで、珪酸を２（W
/V）％になるよう添加した後、室温で30分間撹拌し、珪
酸にHBs抗原を吸着させる。かかる珪酸を、遠心（5,000
g,10分）により集めた後、これに250mlの炭酸緩衝液（p
H10）を加えて室温で40分間撹拌し、HBs抗原を珪酸から
遊離させる。遠心（5,000g,10分）により珪酸を分離
し、上清液を採取する。
0.2モルになるよう添加混合する。次いで、珪酸を２（W
/V）％になるよう添加した後、室温で30分間撹拌し、珪
酸にHBs抗原を吸着させる。かかる珪酸を、遠心（5,000
g,10分）により集めた後、これに250mlの炭酸緩衝液（p
H10）を加えて室温で40分間撹拌し、HBs抗原を珪酸から
遊離させる。遠心（5,000g,10分）により珪酸を分離
し、上清液を採取する。
実施例４ 実施例３で得た上清液に活性炭を１（W/V）％になるよ
う添加した後、室温で10分間撹拌する。次いで、活性炭
除去のため、遠心（10,000g,10分）した後、上清液を採
取する。該上清液に0.02N塩酸を滴下し、pHを6.0に調整
後、10℃,30分間撹拌し酸沈澱物を形成させる。酸沈澱
物を除去するため、遠心（10,000g,10分）処理し、上清
液を採取する。次いで、該上清液に0.02N水酸化ナトリ
ウムを滴下し、pH8.0に調整後、限外濾過器（米国ミリ
ポァ社製）にて濃縮し、25mlのBHs抗原濃縮液を得る。
う添加した後、室温で10分間撹拌する。次いで、活性炭
除去のため、遠心（10,000g,10分）した後、上清液を採
取する。該上清液に0.02N塩酸を滴下し、pHを6.0に調整
後、10℃,30分間撹拌し酸沈澱物を形成させる。酸沈澱
物を除去するため、遠心（10,000g,10分）処理し、上清
液を採取する。次いで、該上清液に0.02N水酸化ナトリ
ウムを滴下し、pH8.0に調整後、限外濾過器（米国ミリ
ポァ社製）にて濃縮し、25mlのBHs抗原濃縮液を得る。
実施例５ 実施例４で得た濃縮液を20−30（W/W）％蔗糖密度勾配
遠心（日立工機製;RPZ−35Tゾーナルローター,30,000rp
m,18時間）し、HBs抗原画分を採取した後、該画分をM/2
00リン酸緩衝液（pH9.0）に対し24時間透析し蔗糖を除
去する。上記操作を再度行う。
遠心（日立工機製;RPZ−35Tゾーナルローター,30,000rp
m,18時間）し、HBs抗原画分を採取した後、該画分をM/2
00リン酸緩衝液（pH9.0）に対し24時間透析し蔗糖を除
去する。上記操作を再度行う。
実施例６ 実施例５で得たHBs画分10mlを、40（W/W）％臭化ナトリ
ウム含有のM/200リン酸緩衝液40mlに添加混合後、平衡
密度勾配遠心（日立工機製;RP−50T−２ローター,45,00
0rpm,48時間）し、HBs抗原画分を採取する。該画分をM/
200リン酸緩衝液（pH9.0）に対し、24時間透析し、臭化
カリウムを除去する。上記操作を再度行い、高度精製の
HBs抗原を得た。
ウム含有のM/200リン酸緩衝液40mlに添加混合後、平衡
密度勾配遠心（日立工機製;RP−50T−２ローター,45,00
0rpm,48時間）し、HBs抗原画分を採取する。該画分をM/
200リン酸緩衝液（pH9.0）に対し、24時間透析し、臭化
カリウムを除去する。上記操作を再度行い、高度精製の
HBs抗原を得た。
実施例７ SDS−PAGEキット（第１化学製品）を用いて、実施例６
で得たHBs抗原の純度試験を行う。精製HBs抗原液を20％
グリセロール、0.1M−トリス（PH6.8）、２％SDS、0.00
4％ブロムフェノールブルー,10％2MEを含有する緩衝液
で２倍階段希釈したものをゲルにアプライし、泳動す
る。次いで、泳動後銀染色を行い、不純物とHBs抗原の
バンドの染色限界の希釈倍数の比から純度を算出する。
その結果、本発明によるHBs抗原の純度は99.5％以上で
あった。
で得たHBs抗原の純度試験を行う。精製HBs抗原液を20％
グリセロール、0.1M−トリス（PH6.8）、２％SDS、0.00
4％ブロムフェノールブルー,10％2MEを含有する緩衝液
で２倍階段希釈したものをゲルにアプライし、泳動す
る。次いで、泳動後銀染色を行い、不純物とHBs抗原の
バンドの染色限界の希釈倍数の比から純度を算出する。
その結果、本発明によるHBs抗原の純度は99.5％以上で
あった。
実施例８ 実施例６で得たHBs抗原をマウスに接種し、抗HBs免疫マ
ウス血清を作成する。一方、実施例２と同様にして得た
酵母菌体抽出液をマウスに接種し、抗酵母免疫マウス血
清を作成する。次いで、抗酵母免疫マウス血清を対照と
して抗HBs免疫マウス（BALB/c,5週令♀）血清中の酵母
に対するIgE抗体の含量を受身皮膚アナフィラキシー（P
CA）反応で測定する。該PCA反応は、上記各免疫血清を
２倍階段希釈した後、SW♀ラットの背部皮内に0.1ml接
種し、その24時間後に1mg蛋白窒素酵母抽出液及び0.5
（W/V）％エバンスブルーを尾静脈から静注し、その30
分後に上記接種部位に青色斑点が出現する（陽性）か否
か（陰性）を判定して行う。その結果、第１表に示す通
り、実施例６で得たBHs抗原は酵母菌体由来のアレルゲ
ンが除去されていた。
ウス血清を作成する。一方、実施例２と同様にして得た
酵母菌体抽出液をマウスに接種し、抗酵母免疫マウス血
清を作成する。次いで、抗酵母免疫マウス血清を対照と
して抗HBs免疫マウス（BALB/c,5週令♀）血清中の酵母
に対するIgE抗体の含量を受身皮膚アナフィラキシー（P
CA）反応で測定する。該PCA反応は、上記各免疫血清を
２倍階段希釈した後、SW♀ラットの背部皮内に0.1ml接
種し、その24時間後に1mg蛋白窒素酵母抽出液及び0.5
（W/V）％エバンスブルーを尾静脈から静注し、その30
分後に上記接種部位に青色斑点が出現する（陽性）か否
か（陰性）を判定して行う。その結果、第１表に示す通
り、実施例６で得たBHs抗原は酵母菌体由来のアレルゲ
ンが除去されていた。
実施例９ 日本脳炎ウイルスV3蛋白遺伝子を有するラスミドpS22が
移入されている大腸菌JM83/pS22（微工研条寄第1047
号）から、pS22をフェノールで抽出する。次いで、pS22
のMluIサイトをXhoIに置換した後、SphIサイトにユニバ
ーサルターミネーター（Pharmacia製）を挿入し、プラ
スミドpS22XSを作製する。該pS22XSから、制限酵素XhoI
及びSalIを用いて日本脳炎ウイルスV3蛋白遺伝子を含む
領域を切り出し、以下これを用いて参考例１の記載に従
つて、酵母のPH05プロモーターの下流に連係の後、YEp1
3のXhoIサイトにクローニングし、日本脳炎ウイルスV3
蛋白遺伝子を発現するプラスミドを作製する。次いで、
これをS.serevisiae SHY4株に移入することにより、形
質転換体酵母を得る。この形質転換体酵母の培養液につ
いて、実施例１〜７と実質的に同様の操作を行い、酵母
菌体由来のアレルゲンが除去された純度が99.5％以上の
V3抗原を得た。
移入されている大腸菌JM83/pS22（微工研条寄第1047
号）から、pS22をフェノールで抽出する。次いで、pS22
のMluIサイトをXhoIに置換した後、SphIサイトにユニバ
ーサルターミネーター（Pharmacia製）を挿入し、プラ
スミドpS22XSを作製する。該pS22XSから、制限酵素XhoI
及びSalIを用いて日本脳炎ウイルスV3蛋白遺伝子を含む
領域を切り出し、以下これを用いて参考例１の記載に従
つて、酵母のPH05プロモーターの下流に連係の後、YEp1
3のXhoIサイトにクローニングし、日本脳炎ウイルスV3
蛋白遺伝子を発現するプラスミドを作製する。次いで、
これをS.serevisiae SHY4株に移入することにより、形
質転換体酵母を得る。この形質転換体酵母の培養液につ
いて、実施例１〜７と実質的に同様の操作を行い、酵母
菌体由来のアレルゲンが除去された純度が99.5％以上の
V3抗原を得た。
実施例10 ムタナーゼ産生菌Pseudomonas属SK−01株（微工研条寄
第９号）空DNAを抽出し（Experiment with Gene Fusio
n,pp.137−139,Cold Spring Harver Laboratory,1984発
行）、制限酵素EcoRIにより部分分解を行いDNA断片を得
る。これを市販の発現ベクター、プラスミドpYEJ001（T
h Molecular Biology Catalog,p.67,Pharmacia P−L Bi
ochemicals社、1985発行）に連係した後、大腸菌K12株H
B101（ATCC No.35673）に移入し、Cm（クロラムフェニ
コール）感受性のロコニーを選別する。次いで、該コロ
ニーからムタナーゼ産生のクローンを選択して、形質転
換体大腸菌株K12HB10/pYEJM01を得る。この形質転換さ
れたムタナーゼ産生の大腸菌株の培養液について、実施
例１〜７と実質的に同様の操作を行い、大腸菌体由来の
アレルゲンが除去された純度が99.5％以上のV3抗原を得
た。
第９号）空DNAを抽出し（Experiment with Gene Fusio
n,pp.137−139,Cold Spring Harver Laboratory,1984発
行）、制限酵素EcoRIにより部分分解を行いDNA断片を得
る。これを市販の発現ベクター、プラスミドpYEJ001（T
h Molecular Biology Catalog,p.67,Pharmacia P−L Bi
ochemicals社、1985発行）に連係した後、大腸菌K12株H
B101（ATCC No.35673）に移入し、Cm（クロラムフェニ
コール）感受性のロコニーを選別する。次いで、該コロ
ニーからムタナーゼ産生のクローンを選択して、形質転
換体大腸菌株K12HB10/pYEJM01を得る。この形質転換さ
れたムタナーゼ産生の大腸菌株の培養液について、実施
例１〜７と実質的に同様の操作を行い、大腸菌体由来の
アレルゲンが除去された純度が99.5％以上のV3抗原を得
た。
実施例11 実施例10で得られたムタナーゼ産生の形質転換体大腸菌
株から、pYEJM01をフェノールで抽出する。これに制限
酵素EcoRIを作用させてムタナーゼ遺伝子DNAを切り出
す。一方、市販の発現ベクター、プラスミドpPL608（AT
CC No.37108）を制限酵素Hind IIIで切断した後、これ
にムタナーゼ遺伝子DNA断片を、リンカー及びT4リガー
ゼを用いて連係する。次いで、これを枯草菌BR151（ATC
C No.33677）に移入した後、ムタナーゼを産生するクロ
ーンを選択し、形質転換体枯草菌体BR151/pPLM01を得
る。この形質転換されたムタナーゼ産生の枯草菌株の培
養液について、実施例１〜７と実質的に同様の操作を行
い、枯草菌体由来のアレルゲンが除去された純度が99.5
％以上のV3抗原を得た。
株から、pYEJM01をフェノールで抽出する。これに制限
酵素EcoRIを作用させてムタナーゼ遺伝子DNAを切り出
す。一方、市販の発現ベクター、プラスミドpPL608（AT
CC No.37108）を制限酵素Hind IIIで切断した後、これ
にムタナーゼ遺伝子DNA断片を、リンカー及びT4リガー
ゼを用いて連係する。次いで、これを枯草菌BR151（ATC
C No.33677）に移入した後、ムタナーゼを産生するクロ
ーンを選択し、形質転換体枯草菌体BR151/pPLM01を得
る。この形質転換されたムタナーゼ産生の枯草菌株の培
養液について、実施例１〜７と実質的に同様の操作を行
い、枯草菌体由来のアレルゲンが除去された純度が99.5
％以上のV3抗原を得た。
参考例２ 実施例６で得たHBs抗原の抗原価をラジオイムノアッセ
イで行う。該HBs抗原を２倍段階希釈し、HBs抗体吸着の
ビーズ（アボット社製,Auslia IIキット）と室温で一昼
夜反応させる。次いで125I標識抗体（アボット社製,Aus
lia IIキット）を加えて45℃で１時間保温し、シンチレ
ーションカウンターでcpmを測定する。抗原価は、抗原
対照のcpmとの平衡線検定法により算出する。その結
果、本発明のHBs抗原価は、10.44μg/mlであり、優れた
抗原性のあることが判明した。
イで行う。該HBs抗原を２倍段階希釈し、HBs抗体吸着の
ビーズ（アボット社製,Auslia IIキット）と室温で一昼
夜反応させる。次いで125I標識抗体（アボット社製,Aus
lia IIキット）を加えて45℃で１時間保温し、シンチレ
ーションカウンターでcpmを測定する。抗原価は、抗原
対照のcpmとの平衡線検定法により算出する。その結
果、本発明のHBs抗原価は、10.44μg/mlであり、優れた
抗原性のあることが判明した。
参考例３ 実施例６で得たHBs抗原を用いて公定の「生物学的製剤
基準（厚生省告示第159号）」に定められた沈降Ｂ型肝
炎ワクチン製剤基準に準拠してワクチンの調製及びにマ
ウスカ価試験を行う。生理的食塩水を用いて上記精製抗
原40μg/ml及び水酸化アルミ0.4mg/mlを調製後、かかる
両液を等量混合し、アルミ沈降Ｂ型肝炎ワクチンを作成
する。該ワクチンについて、上記製剤基準に定められた
各種試験を行い、その適格性を確認した後、マウスカ価
試験を行う。該ワクチンを生後５週令のBALB/cマウス10
匹の背部にそれぞれ1mlずつ皮下接種する。接種から５
週間後に採血し、血中抗体価を受身赤血球凝集反応によ
り測定する。参照品として用いた国立予防研究所交付の
力価試験用「参考沈降Ｂ型肝炎ワクチン」との相対力価
を求める。その結果、参照品1.0に対する本発明の相対
力価は1.76であり、優れた免疫原性のあることが判明し
た。
基準（厚生省告示第159号）」に定められた沈降Ｂ型肝
炎ワクチン製剤基準に準拠してワクチンの調製及びにマ
ウスカ価試験を行う。生理的食塩水を用いて上記精製抗
原40μg/ml及び水酸化アルミ0.4mg/mlを調製後、かかる
両液を等量混合し、アルミ沈降Ｂ型肝炎ワクチンを作成
する。該ワクチンについて、上記製剤基準に定められた
各種試験を行い、その適格性を確認した後、マウスカ価
試験を行う。該ワクチンを生後５週令のBALB/cマウス10
匹の背部にそれぞれ1mlずつ皮下接種する。接種から５
週間後に採血し、血中抗体価を受身赤血球凝集反応によ
り測定する。参照品として用いた国立予防研究所交付の
力価試験用「参考沈降Ｂ型肝炎ワクチン」との相対力価
を求める。その結果、参照品1.0に対する本発明の相対
力価は1.76であり、優れた免疫原性のあることが判明し
た。
［発明の効果］ 本発明の精製方法によれば、組換えDNA技術で用いる宿
主由来のアレルゲンが除去された高純度の遺伝子発現産
物が得られる。従って、生物学的製剤を含む医薬品、及
び歯磨剤等を含む医薬品外部品として使用される遺伝子
発現産物の、安全性と信頼性が極めて高まるため、本発
明は高品質の上記製品の提供を可能にする。
主由来のアレルゲンが除去された高純度の遺伝子発現産
物が得られる。従って、生物学的製剤を含む医薬品、及
び歯磨剤等を含む医薬品外部品として使用される遺伝子
発現産物の、安全性と信頼性が極めて高まるため、本発
明は高品質の上記製品の提供を可能にする。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/36 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 9/00 １０１ 15/09 (72)発明者 高延 壮男 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 (72)発明者 高久 慶典 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 (56)参考文献 特開 昭60−258127（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−159792（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．18 Ｐ．5294〜5299（1979)
Claims (1)
- 【請求項１】組換え遺伝子による形質転換体の培養物中
のアレルゲンを、次の（１）〜（４）からなる各工程の
順に精製除去することを特徴とする組換え遺伝子発現産
物の精製法： （１）培養物の粗抽出液に対し、下限濃度0.1（W/V）％
から上限濃度10（W/V）％の範囲以内になるよう珪酸を
添加して撹拌し、組換え遺伝子発現産物を珪酸に吸着さ
せた後、これを溶出せる； （２）工程（１）で得た溶出液に対し、下限濃度0.1（W
/V）％から上限濃度10（W/V）％の範囲以内になるよう
活性炭を添加して撹拌し、不純物を活性炭に吸着させた
後、その活性炭を除去して上清液を採取し、次に、この
上清液のpHを下限4.0、上限6.5の範囲以内に調整し形成
させた酸沈殿物を除去し、その上清液を採取して濃縮す
る； （３）工程（２）で得た濃縮液を、下限濃度５（W/W）
％、上限濃度60（W/W）％、濃度差が下限10（W/W）％か
ら上限50（W/W）％の範囲以内の蔗糖密度勾配遠心分離
し、遺伝子発現産物の分画を採取した後、更に少なくと
も１回、この遠心分離を反復し、組換え遺伝子発現産物
の分画を採取する；及び （４）工程（３）で得た最終分画を、下限濃度10（W/
W）％から上限濃度50（W/W）％の範囲以内の臭化カリウ
ム平衡密度勾配遠心分離し、遺伝子発現産物の分画を採
取した後、更に少なくとも１回、この遠心分離を反復
し、組換え遺伝子発現産物の分画を採取する。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61143413A JPH0789951B2 (ja) | 1986-06-18 | 1986-06-18 | 遺伝子発現産物の精製法 |
| US07/061,503 US4902783A (en) | 1986-06-18 | 1987-06-15 | Method for purifying a gene-expression product produced by recombinant DNA technique |
| CA000539861A CA1276899C (en) | 1986-06-18 | 1987-06-17 | Method for purifying a gene-expression product produced by recombinant dna technique |
| FR878708470A FR2600341B1 (fr) | 1986-06-18 | 1987-06-17 | Procede de purification d'un produit d'expression genetique obtenu par technique d'adn recombinant |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61143413A JPH0789951B2 (ja) | 1986-06-18 | 1986-06-18 | 遺伝子発現産物の精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63297A JPS63297A (ja) | 1988-01-05 |
| JPH0789951B2 true JPH0789951B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=15338189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61143413A Expired - Lifetime JPH0789951B2 (ja) | 1986-06-18 | 1986-06-18 | 遺伝子発現産物の精製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4902783A (ja) |
| JP (1) | JPH0789951B2 (ja) |
| CA (1) | CA1276899C (ja) |
| FR (1) | FR2600341B1 (ja) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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