JPH0625146B2 - 新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 - Google Patents
新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法Info
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- JPH0625146B2 JPH0625146B2 JP60068315A JP6831585A JPH0625146B2 JP H0625146 B2 JPH0625146 B2 JP H0625146B2 JP 60068315 A JP60068315 A JP 60068315A JP 6831585 A JP6831585 A JP 6831585A JP H0625146 B2 JPH0625146 B2 JP H0625146B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の利用分野〕 本発明は、新規なイミダゾール誘導体、及び該化合物を
発色成分として用いる酸化性物質の定量方法並びにペル
オキシダーゼ様物質の定量方法に関する。
発色成分として用いる酸化性物質の定量方法並びにペル
オキシダーゼ様物質の定量方法に関する。
生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、H2O2生成酵
素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当す
るH2O2を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色
成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、こ
れを比色定量することにより目的成分量を求める方法
が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつあ
る。例えば、コレステロール−コレステロールオキシダ
ーゼ、トリグリセライド−リポプロテインリパーゼ−グ
リセーロルオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組合
せで発生するH2O2を、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光
度を測定することにより目的成分量を求める方法であ
る。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性
呈色試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピ
リンと、フェノール系化合物又はN,N−ジ置換アニリン
系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系
化合物との組合せ試薬、2,2′−アジノビス（３−エチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、
トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、
ｏ−トリジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体、ｏ−フ
ェニレンジアミン等が挙げられる。しかしながら、これ
ら従来から用いられている被酸化性呈色試薬は、ジフェ
ニルアミン誘導体を除いていずれもその呈色波長が700n
m以下であり、ビリルビン、ヘモグロビン等の血清成分
の影響を受け易く（尿中成分測定時には尿中の色素体の
影響を受け易い）、又、４−アミノアンチピリンとの組
合せ試薬やトリフェニルメタン系ロイコ色素の一部を除
いて、いずれも色原体の安定性が低い等の問題点を有す
る。一方、比較的色原体の安定性が良く、又呈色波長が
比較的長波長側にある色原体として染料前駆体（ロイコ
色素）のトリアリルイミダゾール誘導体が開示されてい
る（特公昭５７−５５１９号公報、特公昭５７−２６１
１８号公報、特開昭５８−４５５５７号公報、米国特許
第３２９７７１０号明細書等）。
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、H2O2生成酵
素、例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当す
るH2O2を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及び発色
成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、こ
れを比色定量することにより目的成分量を求める方法
が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増加しつつあ
る。例えば、コレステロール−コレステロールオキシダ
ーゼ、トリグリセライド−リポプロテインリパーゼ−グ
リセーロルオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組合
せで発生するH2O2を、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、被
酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈色の吸光
度を測定することにより目的成分量を求める方法であ
る。この方法に於て用いられる発色成分である被酸化性
呈色試薬の代表的なものとしては、４−アミノアンチピ
リンと、フェノール系化合物又はN,N−ジ置換アニリン
系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベ
ンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系
化合物との組合せ試薬、2,2′−アジノビス（３−エチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、
トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、
ｏ−トリジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体、ｏ−フ
ェニレンジアミン等が挙げられる。しかしながら、これ
ら従来から用いられている被酸化性呈色試薬は、ジフェ
ニルアミン誘導体を除いていずれもその呈色波長が700n
m以下であり、ビリルビン、ヘモグロビン等の血清成分
の影響を受け易く（尿中成分測定時には尿中の色素体の
影響を受け易い）、又、４−アミノアンチピリンとの組
合せ試薬やトリフェニルメタン系ロイコ色素の一部を除
いて、いずれも色原体の安定性が低い等の問題点を有す
る。一方、比較的色原体の安定性が良く、又呈色波長が
比較的長波長側にある色原体として染料前駆体（ロイコ
色素）のトリアリルイミダゾール誘導体が開示されてい
る（特公昭５７−５５１９号公報、特公昭５７−２６１
１８号公報、特開昭５８−４５５５７号公報、米国特許
第３２９７７１０号明細書等）。
しかしながら、これら既存のトリアリルイミダゾール誘
導体は、いずれもそのフェニル基の一つに-OH基を有
し、 となることにより呈色するものであって、その呈色波長
はいずれも依然として700nm以下である。従って、これ
らのトリアリルイミダゾール誘導体にしても、血液や尿
など生体試料中の微量成分の測定に於ける発色成分とし
て用いて未だ充分満足のいくものであるとは云えない。
導体は、いずれもそのフェニル基の一つに-OH基を有
し、 となることにより呈色するものであって、その呈色波長
はいずれも依然として700nm以下である。従って、これ
らのトリアリルイミダゾール誘導体にしても、血液や尿
など生体試料中の微量成分の測定に於ける発色成分とし
て用いて未だ充分満足のいくものであるとは云えない。
本発明の目的は、上記した如き従来法の問題点を解決し
た、極大吸収波長が700nm以上で、且つ色原体が安定で
ある新規な被酸化性呈色試薬の開発と該化合物を発色成
分として用いることにより、ヘモグロビン、ビリルビン
等有色の共存物質の影響を回避した、精度の高い生体試
料中の微量成分の測定法を実現することにある。
た、極大吸収波長が700nm以上で、且つ色原体が安定で
ある新規な被酸化性呈色試薬の開発と該化合物を発色成
分として用いることにより、ヘモグロビン、ビリルビン
等有色の共存物質の影響を回避した、精度の高い生体試
料中の微量成分の測定法を実現することにある。
本発明は、下記一般式〔Ｉ〕 ［式中、Ｒ１は低級アルキル基，低級アルコキシ基，ハ
ロゲン原子，ニトロ基，置換基を有していてもよいアミ
ノ基，-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。），-COOH
基又は-COOM2基（但し、Ｍ２はアルカリ金属イオン又は
アンモニウムイオンを表わす。）を置換基として有して
いてもよいフェニル基又はアラルキル基を表わし、
Ｒ２，Ｒ３は夫々独立して、少くともそのオルト位又は
パラ位のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基
で置換された置換フェニル基を表わし、Ｒ４はアルキル
置換カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフ
ェニル置換カルバモイル基を表わす。］ で示されるイミダゾール誘導体及び該化合物を発色成分
として用いる酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様物質
の定量法である。
ロゲン原子，ニトロ基，置換基を有していてもよいアミ
ノ基，-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。），-COOH
基又は-COOM2基（但し、Ｍ２はアルカリ金属イオン又は
アンモニウムイオンを表わす。）を置換基として有して
いてもよいフェニル基又はアラルキル基を表わし、
Ｒ２，Ｒ３は夫々独立して、少くともそのオルト位又は
パラ位のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基
で置換された置換フェニル基を表わし、Ｒ４はアルキル
置換カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフ
ェニル置換カルバモイル基を表わす。］ で示されるイミダゾール誘導体及び該化合物を発色成分
として用いる酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様物質
の定量法である。
即ち、本発明は上記一般式〔Ｉ〕で示されるイミダゾー
ル誘導体が、いずれもその呈色波長が700nm以上の長波
長側にあり、しかも、色原体として極めて安定であるこ
とを本発明者らが初めて見出し、これを血清や尿など生
体試料中の微量成分の測定に於ける発色成分として用い
ることにより、上記した本発明の目的を達成し得ること
を見出して本発明を完成するに到ったものである。
ル誘導体が、いずれもその呈色波長が700nm以上の長波
長側にあり、しかも、色原体として極めて安定であるこ
とを本発明者らが初めて見出し、これを血清や尿など生
体試料中の微量成分の測定に於ける発色成分として用い
ることにより、上記した本発明の目的を達成し得ること
を見出して本発明を完成するに到ったものである。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明のイミダゾール誘導体に
於て、Ｒ１で表わされる置換基を有していてもよいフェ
ニル基の置換基としては、例えば、メチル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基，ペンチル基等炭素数１〜５
の低級アルキル基（直鎖状、分枝状のいずれにしても
可。）、例えばメトキシ基，エトキシ基，プロポキシ
基，ブトキシ基等炭素数１〜４の低級アルコキシ基（直
鎖状、分枝状のいずれにても可。）塩素，臭素，弗素，
沃素等のハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、例えばメ
チル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の低級アル
キル基又は例えば-C2H4OH基，-C3H6OH基，-C2H4NHSO2CH
3基，-C2H4NHCOCH3基，-C2H4SO3H基（又は-C2H4SO3Na基
等），-C3H6SO3H基（又は-C3H6SO3Na基等）， （又は 等）等の置換低級アルキル基等で置換されたアミノ基、
-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はナトリウム、カリ
ウム、リチウム等のアルカリ金属イオン又はアンモニウ
ムイオンを表わす。）、-COOH基又は-COOM2基（但し、
Ｍ２はナトリウム，カリウム，リチウム等のアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。）等が挙げ
られるが、水酸基はこれに含まれない。又、Ｒ１で表わ
されるアラルキル基としては、例えばベンジル基、フェ
ネチル基、フェニルプロピル基等が挙げられる。Ｒ２，
Ｒ３で表わされる、少なくともそのオルト位又はパラ位
のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基で置換
された置換フェニル基に於ける置換アミノ基の置換基と
しては、例えば、メチル基，エチル基，プロピル基，ブ
チル基等の低級アルキル基、-C2H4OH基，-C3H6OH基，-C
2H4NHSO2CH3基，-C2H4NHCOCH3基，-C2H4SO3H基（又は-C
2H4SO3Na基等），-C3H6SO3H基（又は-C3H6SO3Na基
等）， （又は 基等）等の置換低級アルキル基等が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。又、Ｒ２，Ｒ３に於ける
アミノ基又は置換アミノ基以外の置換基としては、例え
ば、メチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の低
級アルキル基、メトキシ基，エトキシ基，プロポキシ基
等の低級アルコキシ基、塩素，臭素，弗素，沃素等のハ
ロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、ス
ルホン基等が挙げられるが、水酸基はこれに含まれな
い。又、Ｒ４で表わされるアルキル置換カルバモイル基
としては、例えばＮ−メチルカルバモイル基，Ｎ−エチ
ルカルバモイル基，Ｎ−イソプロピルカルバモイル基，
N,N−ジメチルカルバモイル基，N,N−ジエチルカルバモ
イル基，N,N−ジイソプロピルカルバモイル基等の低級
アルキル置換カルバモイル基が挙げられ、置換基を有し
ていてもよいフェニル置換カルバモイル基の置換基とし
ては、例えば、メチル基，エチル基，プロピル基等の低
級アルキル基、例えばメトキシ基，エトキシ基等の低級
アルコキシ基、塩素，臭素等のハロゲン原子等が挙げら
れ、これらの置換基を有していてもよいフェニル基で置
換したカルバモイル基が用いられる。又、Ｎ−アルキル
−Ｎ−フェニル−カルバモイル基も同様に用い得ること
は云うまでもない。
於て、Ｒ１で表わされる置換基を有していてもよいフェ
ニル基の置換基としては、例えば、メチル基，エチル
基，プロピル基，ブチル基，ペンチル基等炭素数１〜５
の低級アルキル基（直鎖状、分枝状のいずれにしても
可。）、例えばメトキシ基，エトキシ基，プロポキシ
基，ブトキシ基等炭素数１〜４の低級アルコキシ基（直
鎖状、分枝状のいずれにても可。）塩素，臭素，弗素，
沃素等のハロゲン原子、ニトロ基、アミノ基、例えばメ
チル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の低級アル
キル基又は例えば-C2H4OH基，-C3H6OH基，-C2H4NHSO2CH
3基，-C2H4NHCOCH3基，-C2H4SO3H基（又は-C2H4SO3Na基
等），-C3H6SO3H基（又は-C3H6SO3Na基等）， （又は 等）等の置換低級アルキル基等で置換されたアミノ基、
-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はナトリウム、カリ
ウム、リチウム等のアルカリ金属イオン又はアンモニウ
ムイオンを表わす。）、-COOH基又は-COOM2基（但し、
Ｍ２はナトリウム，カリウム，リチウム等のアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。）等が挙げ
られるが、水酸基はこれに含まれない。又、Ｒ１で表わ
されるアラルキル基としては、例えばベンジル基、フェ
ネチル基、フェニルプロピル基等が挙げられる。Ｒ２，
Ｒ３で表わされる、少なくともそのオルト位又はパラ位
のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基で置換
された置換フェニル基に於ける置換アミノ基の置換基と
しては、例えば、メチル基，エチル基，プロピル基，ブ
チル基等の低級アルキル基、-C2H4OH基，-C3H6OH基，-C
2H4NHSO2CH3基，-C2H4NHCOCH3基，-C2H4SO3H基（又は-C
2H4SO3Na基等），-C3H6SO3H基（又は-C3H6SO3Na基
等）， （又は 基等）等の置換低級アルキル基等が挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。又、Ｒ２，Ｒ３に於ける
アミノ基又は置換アミノ基以外の置換基としては、例え
ば、メチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基等の低
級アルキル基、メトキシ基，エトキシ基，プロポキシ基
等の低級アルコキシ基、塩素，臭素，弗素，沃素等のハ
ロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、ス
ルホン基等が挙げられるが、水酸基はこれに含まれな
い。又、Ｒ４で表わされるアルキル置換カルバモイル基
としては、例えばＮ−メチルカルバモイル基，Ｎ−エチ
ルカルバモイル基，Ｎ−イソプロピルカルバモイル基，
N,N−ジメチルカルバモイル基，N,N−ジエチルカルバモ
イル基，N,N−ジイソプロピルカルバモイル基等の低級
アルキル置換カルバモイル基が挙げられ、置換基を有し
ていてもよいフェニル置換カルバモイル基の置換基とし
ては、例えば、メチル基，エチル基，プロピル基等の低
級アルキル基、例えばメトキシ基，エトキシ基等の低級
アルコキシ基、塩素，臭素等のハロゲン原子等が挙げら
れ、これらの置換基を有していてもよいフェニル基で置
換したカルバモイル基が用いられる。又、Ｎ−アルキル
−Ｎ−フェニル−カルバモイル基も同様に用い得ること
は云うまでもない。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明のイミダゾール誘導体
は、例えば一般式〔Ｉ〕に於て、 （但し、 は前記、置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、
Ｘ１はその他の置換基を表わす。） （但し、 は前記、置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、
Ｘ２はその他の置換基を表わす。） とした場合、酸化により次の如き構造の染料を生成す
る。
は、例えば一般式〔Ｉ〕に於て、 （但し、 は前記、置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、
Ｘ１はその他の置換基を表わす。） （但し、 は前記、置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、
Ｘ２はその他の置換基を表わす。） とした場合、酸化により次の如き構造の染料を生成す
る。
又、一般式〔Ｉ〕に於て、 （但し、 は置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、Ｘ３は
その他の置換基を表わす。） （但し、 は置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、Ｘ１は
その他の置換基を表わす。） （但し、 は置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、Ｘ２は
その他の置換基を表わす。） とした場合は酸化により次の如き構造の染料を生成す
る。
その他の置換基を表わす。） （但し、 は置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、Ｘ１は
その他の置換基を表わす。） （但し、 は置換基を有していてもよいアミノ基を表わし、Ｘ２は
その他の置換基を表わす。） とした場合は酸化により次の如き構造の染料を生成す
る。
即ち、いずれにしても、Ｒ４で表わされるアルキル置換
カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフェニ
ル置換カルバモイル基は、酸化反応の際にイミダゾール
基より外れて、例えば過酸化水素で酸化した場合にはRN
HCOOHとなり、酸化により生成した色素とは全く別の存
在となる。即ち、Ｒ４で表わされるアルキル置換カルバ
モイル基、又は置換基を有していてもよいフェニル置換
カルバモイル基は、色原体の安定化（ブランクの安定
化）にのみ関与し、発色には何ら影響を与えない。
カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフェニ
ル置換カルバモイル基は、酸化反応の際にイミダゾール
基より外れて、例えば過酸化水素で酸化した場合にはRN
HCOOHとなり、酸化により生成した色素とは全く別の存
在となる。即ち、Ｒ４で表わされるアルキル置換カルバ
モイル基、又は置換基を有していてもよいフェニル置換
カルバモイル基は、色原体の安定化（ブランクの安定
化）にのみ関与し、発色には何ら影響を与えない。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明のイミダゾール誘導体が
酸化されて生成する上記〔II〕又は〔III〕で示される
色素はいずれも、既存のトリアリルイミダゾール誘導体
に於て が になることにより生ずる色素よりもその呈色波長が更に
長波長側にシフトし、極大吸収波長はいずれも700nm以
上となる。
酸化されて生成する上記〔II〕又は〔III〕で示される
色素はいずれも、既存のトリアリルイミダゾール誘導体
に於て が になることにより生ずる色素よりもその呈色波長が更に
長波長側にシフトし、極大吸収波長はいずれも700nm以
上となる。
表１に、一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物の具体例
数例と、その呈色時の極大吸収波長を示すが、本発明化
合物はこれらに限定されるものではない。
数例と、その呈色時の極大吸収波長を示すが、本発明化
合物はこれらに限定されるものではない。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物は、公知の方法に
より容易に合成することができる。即ち、例えば、Orga
nic Syntheses Vol.5,111頁1973年に記載の方法に準じ
て、式〔IV〕で示されるエタンジオンを合成し、 （式中、Ｒ２，Ｒ３は前記と同じ。） 次いで、これを例えば米国特許第３２９７７１０号明細
書に記載の方法に準じてR1-CHO（Ｒ１は前記と同じ）な
るアルデヒド類及び酢酸アンモンと、酢酸溶媒中数時間
加熱（要すれば還流）反応させれば式〔Ｖ〕で示される
イミダゾール誘導体が得られるから、 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は前記と同じ。） 得られたイミダゾール誘導体を適当な溶媒の存在下、室
温乃至溶媒の沸点でイソシアン酸アルキル（又はイソシ
アン酸フェニル）と数時間乃至十数時間反応させれば、
目的物が収率よく得られる。要すればこれを、適当な精
製方法、例えば再結晶、カラムクロマトグラフィー等に
より精製すれば精製品が容易に得られる。
より容易に合成することができる。即ち、例えば、Orga
nic Syntheses Vol.5,111頁1973年に記載の方法に準じ
て、式〔IV〕で示されるエタンジオンを合成し、 （式中、Ｒ２，Ｒ３は前記と同じ。） 次いで、これを例えば米国特許第３２９７７１０号明細
書に記載の方法に準じてR1-CHO（Ｒ１は前記と同じ）な
るアルデヒド類及び酢酸アンモンと、酢酸溶媒中数時間
加熱（要すれば還流）反応させれば式〔Ｖ〕で示される
イミダゾール誘導体が得られるから、 （式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３は前記と同じ。） 得られたイミダゾール誘導体を適当な溶媒の存在下、室
温乃至溶媒の沸点でイソシアン酸アルキル（又はイソシ
アン酸フェニル）と数時間乃至十数時間反応させれば、
目的物が収率よく得られる。要すればこれを、適当な精
製方法、例えば再結晶、カラムクロマトグラフィー等に
より精製すれば精製品が容易に得られる。
本発明のイミダゾール誘導体は、酸化性物質の定量やペ
ルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色成分として有
効に用い得るが、とりわけ酵素反応により生成した過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、その
呈色を比色定量することにより行う生体試料中の微量成
分の定量に於ける発色成分として特に有効に使用し得
る。
ルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色成分として有
効に用い得るが、とりわけ酵素反応により生成した過酸
化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、その
呈色を比色定量することにより行う生体試料中の微量成
分の定量に於ける発色成分として特に有効に使用し得
る。
即ち、本発明の酸化性物質の定量法は、基質、又は酵素
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基
質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用し得
る。
反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ、生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基
質又は酵素活性の定量法として特に効果的に使用し得
る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂
質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コ
リンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定され
るものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を
定量することによって測定が可能な生体成分は全て定量
可能である。
しては、例えば、コレステロール、グルコース、グリセ
リン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂
質、胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コ
リンエステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定され
るものではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を
定量することによって測定が可能な生体成分は全て定量
可能である。
本発明の方法による生体成分の定量に於て、過酸化水素
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に
特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシ
ダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、一種若しくは要
すれば二種以上組合せて用いられる。又、その使用量は
目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシダ
ーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵素
反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用量
は被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の定量
法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜選択す
ればよい。又、本発明による過酸化水素の定量に於て用
いられるペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に
特に限定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシ
ダーゼ又はペルオキシダーゼ様物質が、一種若しくは要
すれば二種以上組合せて用いられる。又、その使用量は
目的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量は、通常、pH4.0〜1
0.0、より好ましくはpH6.0〜8.0で実施される。用いら
れる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸
塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グッド（Good's）緩衝液な
どが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
0.0、より好ましくはpH6.0〜8.0で実施される。用いら
れる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸
塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グッド（Good's）緩衝液な
どが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
本発明のイミダゾール誘導体は、過酸化水素等酸化性物
質の定量に有効に用い得るが、又、これと過酸化水素と
を組み合せることによりペルオキシダーゼ様物質の定量
を行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様物質とし
ては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロビンそ
の他のヘム化合物が挙げられる。
質の定量に有効に用い得るが、又、これと過酸化水素と
を組み合せることによりペルオキシダーゼ様物質の定量
を行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様物質とし
ては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロビンそ
の他のヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明のイミダゾール誘導体は、例えば、ペルオ
キシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法にも応
用可能であり、又、血清中のヘモグロビンを過酸化水素
若しくは過硼素酸ナトリウムのような酸化性物質を用い
て測定する場合などにも有効に使用し得る。
キシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法にも応
用可能であり、又、血清中のヘモグロビンを過酸化水素
若しくは過硼素酸ナトリウムのような酸化性物質を用い
て測定する場合などにも有効に使用し得る。
以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何ら制約を受けるものではない。
何ら制約を受けるものではない。
実施例１． ２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカル
バモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）イミダゾール〔本発明化合物(2)〕の合成 （ｉ）１，２−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）エ
タン−１，２−ジオンの合成 無水塩化アルミニウム6.7ｇに二硫化炭素20mlを加え氷
冷下、N,N−ジエチルアニリン20ｇを滴下した。さらに
撹拌下、氷冷しながらオキザリルクロリド1.5ｇを滴下
し、60分間撹拌反応させた。反応後、水50ml及びクロロ
ホルム100mlを加え、分液して得たクロロホルム層を減
圧濃縮して結晶を析出せしめた。析出した結晶を取し
酢酸エチルから再結晶して黄色の目的物5.0ｇを得た。
バモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）イミダゾール〔本発明化合物(2)〕の合成 （ｉ）１，２−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）エ
タン−１，２−ジオンの合成 無水塩化アルミニウム6.7ｇに二硫化炭素20mlを加え氷
冷下、N,N−ジエチルアニリン20ｇを滴下した。さらに
撹拌下、氷冷しながらオキザリルクロリド1.5ｇを滴下
し、60分間撹拌反応させた。反応後、水50ml及びクロロ
ホルム100mlを加え、分液して得たクロロホルム層を減
圧濃縮して結晶を析出せしめた。析出した結晶を取し
酢酸エチルから再結晶して黄色の目的物5.0ｇを得た。
（ii）２−（４−カルボキシフェニル）−４，５−ビス
（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールの合成 （ｉ）で得た１，２−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）エタン−１，２−ジオン1.5ｇとｐ−カルボキシベ
ンズアルデヒド0.7ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを酢酸30m
l中で２時間加熱還流して反応させた。冷却後、水60ml
を加え氷冷下アンモニア水で中和したところ結晶が析出
した。析出した結晶を取、水洗、乾燥後、ヘキサンで
処理し白色の目的化合物1.1ｇを得た。
（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾールの合成 （ｉ）で得た１，２−ビス（４−ジエチルアミノフェニ
ル）エタン−１，２−ジオン1.5ｇとｐ−カルボキシベ
ンズアルデヒド0.7ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを酢酸30m
l中で２時間加熱還流して反応させた。冷却後、水60ml
を加え氷冷下アンモニア水で中和したところ結晶が析出
した。析出した結晶を取、水洗、乾燥後、ヘキサンで
処理し白色の目的化合物1.1ｇを得た。
（iii）２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メ
チルカルバモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノ
フェニル）イミダゾールの合成 （ii）で得た２−（４−カルボキシフェニル）−４，５
−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール1.
1ｇをクロロホルム50mlに溶解し、撹拌下、イソシアン
酸メチル５mlを加え室温で12時間放置した。次いで、メ
タノール50mlを加え反応を停止後濃縮した。濃縮物を、
クロロホルムを溶離液に用いたシリカゲルカラムで精製
し、目的物（殆白色粉末）980mgを得た。
チルカルバモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノ
フェニル）イミダゾールの合成 （ii）で得た２−（４−カルボキシフェニル）−４，５
−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール1.
1ｇをクロロホルム50mlに溶解し、撹拌下、イソシアン
酸メチル５mlを加え室温で12時間放置した。次いで、メ
タノール50mlを加え反応を停止後濃縮した。濃縮物を、
クロロホルムを溶離液に用いたシリカゲルカラムで精製
し、目的物（殆白色粉末）980mgを得た。
ＮＭＲ（CDCl3，ＴＭＳ）ppm：1.2(12H,t,CH3-C-）、1.
9(1H,s, 2.7(3H,s,-N-CH3)、3.6(8H,q.C-CH2-)、7.1〜7.7(12H,b
road,フェニル水素)、11.8(1H,s,-COOH) 実施例２． ２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−
３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチ
ル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール〔本発
明化合物(10)〕の合成 （ｉ）１，２−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノ
フェニル）エタン−１，２−ジオンの合成 無水塩化アルミニウム6.7ｇに二硫化炭素20mlを加え氷
冷下、３−メチル−N,N−ジエチルアニリン22ｇを滴下
した。さらに撹拌下、氷冷しながらオキザリルクロリド
1.5ｇを滴下し、60分間撹拌反応させた。反応後、水50m
l及びクロロホルム100mlを加え、分液して得たクロロホ
ルム層を減圧濃縮して結晶を析出せしめた。析出した結
晶を取し酢酸エチルから再結晶して黄色の目的物5.4
ｇを得た。
9(1H,s, 2.7(3H,s,-N-CH3)、3.6(8H,q.C-CH2-)、7.1〜7.7(12H,b
road,フェニル水素)、11.8(1H,s,-COOH) 実施例２． ２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−
３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチ
ル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール〔本発
明化合物(10)〕の合成 （ｉ）１，２−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノ
フェニル）エタン−１，２−ジオンの合成 無水塩化アルミニウム6.7ｇに二硫化炭素20mlを加え氷
冷下、３−メチル−N,N−ジエチルアニリン22ｇを滴下
した。さらに撹拌下、氷冷しながらオキザリルクロリド
1.5ｇを滴下し、60分間撹拌反応させた。反応後、水50m
l及びクロロホルム100mlを加え、分液して得たクロロホ
ルム層を減圧濃縮して結晶を析出せしめた。析出した結
晶を取し酢酸エチルから再結晶して黄色の目的物5.4
ｇを得た。
（ii）２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニ
ル）−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノ
フェニル）イミダゾールの合成 （ｉ）で得た１，２−ビス（２−メチル−４−ジエチル
アミノフェニル）エタン−１，２−ジオン1.5ｇと３−
メトキシ−４−ジエチルアミノベンズアルデヒド1.0
ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを酢酸30ml中で２時間加熱還
流して反応させた。冷却後、水60mlを加え氷冷下アンモ
ニア水で中和したところ結晶が析出した。析出した結晶
を取、水洗、乾燥後、ヘキサンで処理し白色の目的化
合物0.6ｇを得た。
ル）−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノ
フェニル）イミダゾールの合成 （ｉ）で得た１，２−ビス（２−メチル−４−ジエチル
アミノフェニル）エタン−１，２−ジオン1.5ｇと３−
メトキシ−４−ジエチルアミノベンズアルデヒド1.0
ｇ、酢酸アンモニウム５ｇを酢酸30ml中で２時間加熱還
流して反応させた。冷却後、水60mlを加え氷冷下アンモ
ニア水で中和したところ結晶が析出した。析出した結晶
を取、水洗、乾燥後、ヘキサンで処理し白色の目的化
合物0.6ｇを得た。
（iii）２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェ
ニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス
（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾ
ールの合成 （ii）で得た２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノ
フェニル）−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチル
アミノフェニル）イミダゾール0.6ｇをクロロホルム50m
lに溶解し、撹拌下、イソシアン酸メチル５mlを加え室
温で12時間放置した。次いで、メタノール50ｍを加え
反応を停止後濃縮した。濃縮物を、クロロホルムを溶離
液に用いたシリカゲルカラムで精製し、目的物（殆白色
粉末）570mgを得た。
ニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス
（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾ
ールの合成 （ii）で得た２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノ
フェニル）−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチル
アミノフェニル）イミダゾール0.6ｇをクロロホルム50m
lに溶解し、撹拌下、イソシアン酸メチル５mlを加え室
温で12時間放置した。次いで、メタノール50ｍを加え
反応を停止後濃縮した。濃縮物を、クロロホルムを溶離
液に用いたシリカゲルカラムで精製し、目的物（殆白色
粉末）570mgを得た。
実施例３〜１０ 実施例１又は実施例２と同様の方法により表２(1)〜表
２(2)に記載の本発明化合物を合成した。その構造式と
物性データを表２(1)〜表２(2)に併せて示す。
２(2)に記載の本発明化合物を合成した。その構造式と
物性データを表２(1)〜表２(2)に併せて示す。
実施例１１ 尿酸の定量 (1)試薬 50mmol/lＭＥＳ〔２−（Ｎ−モリホリノ）エ
タンスルホン酸〕緩衝液（pH6.5）にウリカーゼ100U/
l、ペルオキシダーゼ2,000U/l、本発明化合物(2)100μm
ol/lの濃度になるように溶解し調製した。
タンスルホン酸〕緩衝液（pH6.5）にウリカーゼ100U/
l、ペルオキシダーゼ2,000U/l、本発明化合物(2)100μm
ol/lの濃度になるように溶解し調製した。
(2)試料 尿酸を蒸留水で10,7.5,5,2.5mg/dlになるよう
に溶解し調製した。
に溶解し調製した。
(3)測定操作 各試料液及び蒸留水各50μｌに試薬3.0ml
を加え、37℃で５分間加温し740nmの吸光度を盲検を対
照に測定した。
を加え、37℃で５分間加温し740nmの吸光度を盲検を対
照に測定した。
第１図に尿酸濃度と吸光度との関係を示す。第１図より
明らかな如く、各尿酸濃度に対してプロットした吸光度
を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良好な
定量性を示している。
明らかな如く、各尿酸濃度に対してプロットした吸光度
を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量線は良好な
定量性を示している。
実施例１２ 過酸化水素の定量 (1)試薬 50mmol/lリン酸緩衝液（pH7.0）にペルオキシ
ダーゼ2,000U/l、本発明化合物(2)100μmol/lになるよ
うに溶解し調製した。
ダーゼ2,000U/l、本発明化合物(2)100μmol/lになるよ
うに溶解し調製した。
(2)試料 市販過酸化水素水を蒸留水で希釈し2.0,1.5,
1.0,0.5mmol/lになるように溶解し調製した。
1.0,0.5mmol/lになるように溶解し調製した。
(3)測定操作 各試料液及び蒸留水各20μｌに試薬3.0ml
を加え、37℃で３分間加温し740nmの吸光度を盲検を対
照に測定した。
を加え、37℃で３分間加温し740nmの吸光度を盲検を対
照に測定した。
第２図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示す。第２
図より明らかな如く、各過酸化水素濃度に対してプロッ
トした吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検
量線は良好な定量性を示している。
図より明らかな如く、各過酸化水素濃度に対してプロッ
トした吸光度を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検
量線は良好な定量性を示している。
以上述べた如く、本発明の新規イミダゾール誘導体は、
いずれもその呈色時の極大吸収波長が、700nm以上と長
波長側にある為、血清，尿等生体試料中の微量成分の定
量に於ける発色成分としてこれを用いた場合には、試料
中に共存する有色の妨害物質の影響を全く受けずに測定
を行うことができるという点、及びイミダゾール環の３
位のＮに置換カルバモイル基をつけたことにより色原体
として安定化されたイミダゾール誘導体となり得た点に
顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである。
いずれもその呈色時の極大吸収波長が、700nm以上と長
波長側にある為、血清，尿等生体試料中の微量成分の定
量に於ける発色成分としてこれを用いた場合には、試料
中に共存する有色の妨害物質の影響を全く受けずに測定
を行うことができるという点、及びイミダゾール環の３
位のＮに置換カルバモイル基をつけたことにより色原体
として安定化されたイミダゾール誘導体となり得た点に
顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである。
第１図は、実施例１１に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各尿酸濃度（mg/dl）について得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実施例１２に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（mmol/l）について得られた吸
光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。
横軸の各尿酸濃度（mg/dl）について得られた吸光度を
縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第２図は、実施例１２に於て得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（mmol/l）について得られた吸
光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−176572（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍ，Ａｂ，74（22）要約番号 119391Ｗ（1971) Ｃｈｅｍ，Ａｂ，72（17）要約番号 89636Ｕ（1970)
Claims (10)
- 【請求項１】下記一般式［Ｉ］ ［式中、Ｒ１は低級アルキル基，低級アルコキシ基，ハ
ロゲン原子，ニトロ基，置換基を有していてもよいアミ
ノ基，-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。），-COOH
基又は-COOM2基（但し、Ｍ２はアルカリ金属イオン又は
アンモニウムイオンを表わす。）を置換基として有して
いてもよいフェニル基又はアラルキル基を表わし、
Ｒ２，Ｒ３は夫々独立して、少くともそのオルト位又は
パラ位のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基
で置換された置換フェニル基を表わし、Ｒ４はアルキル
置換カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフ
ェニル置換カルバモイル基を表わす。］ で示されるイミダゾール誘導体。 - 【請求項２】下記一般式［Ｉ］ ［式中、Ｒ１は低級アルキル基，低級アルコキシ基，ハ
ロゲン原子，ニトロ基，置換基を有していてもよいアミ
ノ基，-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。），-COOH
基又は-COOM2基（但し、Ｍ２はアルカリ金属イオン又は
アンモニウムイオンを表わす。）を置換基として有して
いてもよいフェニル基又はアラルキル基を表わし、
Ｒ２，Ｒ３は夫々独立して、少くともそのオルト位又は
パラ位のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基
で置換された置換フェニル基を表わし、Ｒ４はアルキル
置換カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフ
ェニル置換カルバモイル基を表わす。］ で示されるイミダゾール誘導体を発色成分として用いる
ことを特徴とする酸化性物質の定量法。 - 【請求項３】酸化性物質が過酸化水素である、特許請求
の範囲第２項記載の定量法。 - 【請求項４】ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸
化発色させてその呈色を比色定量する特許請求の範囲第
３項記載の定量法。 - 【請求項５】過酸化水素が、酵素反応により生成する過
酸化水素である特許請求の範囲第３項又は第４項記載の
定量法。 - 【請求項６】過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定
量に於て酵素反応により生成する過酸化水素である特許
請求の範囲第５項記載の定量法。 - 【請求項７】生体試料中の微量成分の定量が、基質、又
は酵素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生
成する過酸化水素を定量することにより行う生体試料中
の基質又は酵素活性の定量である特許請求の範囲第６項
記載の定量法。 - 【請求項８】下記一般式［Ｉ］ ［式中、Ｒ１は低級アルキル基，低級アルコキシ基，ハ
ロゲン原子，ニトロ基，置換基を有していてもよいアミ
ノ基，-SO3H基又は-SO3M1基（但し、Ｍ１はアルカリ金
属イオン又はアンモニウムイオンを表わす。），-COOH
基又は-COOM2基（但し、Ｍ２はアルカリ金属イオン又は
アンモニウムイオンを表わす。）を置換基として有して
いてもよいフェニル基又はアラルキル基を表わし、
Ｒ２，Ｒ３は夫々独立して、少くともそのオルト位又は
パラ位のどちらかが置換基を有していてもよいアミノ基
で置換された置換フェニル基を表わし、Ｒ４はアルキル
置換カルバモイル基、又は置換基を有していてもよいフ
ェニル置換カルバモイル基を表わす。］ で示されるイミダゾール誘導体を発色成分として用いる
ことを特徴とするペルオキシダーゼ様物質の定量法。 - 【請求項９】ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダー
ゼである特許請求の範囲第８項記載の定量法。 - 【請求項１０】ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン
又はその他のヘム化合物である特許請求の範囲第８項記
載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60068315A JPH0625146B2 (ja) | 1985-03-30 | 1985-03-30 | 新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60068315A JPH0625146B2 (ja) | 1985-03-30 | 1985-03-30 | 新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61227570A JPS61227570A (ja) | 1986-10-09 |
| JPH0625146B2 true JPH0625146B2 (ja) | 1994-04-06 |
Family
ID=13370261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60068315A Expired - Lifetime JPH0625146B2 (ja) | 1985-03-30 | 1985-03-30 | 新規イミダゾ−ル誘導体及びこれを発色成分として用いる測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0625146B2 (ja) |
-
1985
- 1985-03-30 JP JP60068315A patent/JPH0625146B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｃｈｅｍ，Ａｂ，７２（１７）要約番号８９６３６Ｕ（１９７０） |
| Ｃｈｅｍ，Ａｂ，７４（２２）要約番号１１９３９１Ｗ（１９７１） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61227570A (ja) | 1986-10-09 |
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