JPH062720B2 - 新規なジフェニルアミン誘導体 - Google Patents
新規なジフェニルアミン誘導体Info
- Publication number
- JPH062720B2 JPH062720B2 JP23298785A JP23298785A JPH062720B2 JP H062720 B2 JPH062720 B2 JP H062720B2 JP 23298785 A JP23298785 A JP 23298785A JP 23298785 A JP23298785 A JP 23298785A JP H062720 B2 JPH062720 B2 JP H062720B2
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- JP
- Japan
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- compound
- solution
- color
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 「発明の利用分野」 本発明は、発色試薬として酸化性物質の定量やペルオキ
シダーゼ様物質の定量に使用し得る新規なジフェニルア
ミン誘導体に関する。
シダーゼ様物質の定量に使用し得る新規なジフェニルア
ミン誘導体に関する。
「発明の背景」 生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライド、グルコール、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分を測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行なう上で、必
須なものとなっている。例えば、血液中のコレステロー
ル、トリグリセライド、グルコール、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼなどを始め、非常に多
種類の微量成分を測定法が開発されており、疾病の診断
上役立っていることは周知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、Ｈ２Ｏ２生
成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目的成分に相当
するＨ２Ｏ２を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及
び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導
き、その呈色を比色定量することにより目的成分量を求
める方法が、比酸化性呈色試薬の開発と相まって増加し
つつある。例えば、コレステロール−コレステロールオ
キシダーゼ、トリグリセライド−リポプロテインリパー
ゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなど
の組合せて発生するＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）、被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その
呈色の吸光度を測定することにより目的成分量を求める
方法である。この方法に於て用いられる発色成分である
被酸化性呈色試薬の代表的なものとしては、4-アミノア
ンチピリンと、フェノール系化合物又はN,N-ジ置換アニ
リン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチ
ルベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン
系化合物との組合せ試薬、2,2′-アジノビス（3-エチル
ベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、トリ
フェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、o-ト
リジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、o-フェ
ニレンジアミン等が挙げられる。しかしながら、これら
従来から用いられている被酸化性呈色試薬は、大部分が
その呈色波長が600nm以下であり、ビリルビン、ヘモグ
ロビン等の血清成分の影響を受け易く（尿中成分測定時
には尿中の色素体の影響を受け易い）、また、4-アミノ
アンチピリンとの組合せ試薬やトリフェニルメタン系ロ
イコ色素の一部を除いて、いずれも色原体の安定性が低
い等の問題点を有する。一方、比較的色原体の安定性が
良く、又呈色波長が比較的長波長側にある色原体として
染料前駆体（ロイコ色素）のジフェニルアミン誘導体が
開示されている（特開昭56-145352号公報、特開昭59-18
2361号公報、特公昭60-33479号公報等）。
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行ない、これに
よる生成物を測定して目的成分量を求める、所謂“酵素
法”が一般に広く普及している。なかでも、Ｈ２Ｏ２生
成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目的成分に相当
するＨ２Ｏ２を生成させ、これをペルオキシダーゼ、及
び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導
き、その呈色を比色定量することにより目的成分量を求
める方法が、比酸化性呈色試薬の開発と相まって増加し
つつある。例えば、コレステロール−コレステロールオ
キシダーゼ、トリグリセライド−リポプロテインリパー
ゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなど
の組合せて発生するＨ２Ｏ２を、ペルオキシダーゼ（Ｐ
ＯＤ）、被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その
呈色の吸光度を測定することにより目的成分量を求める
方法である。この方法に於て用いられる発色成分である
被酸化性呈色試薬の代表的なものとしては、4-アミノア
ンチピリンと、フェノール系化合物又はN,N-ジ置換アニ
リン系化合物とを組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチ
ルベンゾチアゾリンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン
系化合物との組合せ試薬、2,2′-アジノビス（3-エチル
ベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、トリ
フェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、o-ト
リジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、o-フェ
ニレンジアミン等が挙げられる。しかしながら、これら
従来から用いられている被酸化性呈色試薬は、大部分が
その呈色波長が600nm以下であり、ビリルビン、ヘモグ
ロビン等の血清成分の影響を受け易く（尿中成分測定時
には尿中の色素体の影響を受け易い）、また、4-アミノ
アンチピリンとの組合せ試薬やトリフェニルメタン系ロ
イコ色素の一部を除いて、いずれも色原体の安定性が低
い等の問題点を有する。一方、比較的色原体の安定性が
良く、又呈色波長が比較的長波長側にある色原体として
染料前駆体（ロイコ色素）のジフェニルアミン誘導体が
開示されている（特開昭56-145352号公報、特開昭59-18
2361号公報、特公昭60-33479号公報等）。
これらのジフェニルアミン誘導体は、いずれもその呈色
波長が700nm以上と比較的長波長側にあり感度も比較的
高いが、色原体の安定性、呈色安定性共に未だ充分満足
のいくものであるとは云えず、また、いずれも水に対す
る溶解性が悪いという欠点をも有する。
波長が700nm以上と比較的長波長側にあり感度も比較的
高いが、色原体の安定性、呈色安定性共に未だ充分満足
のいくものであるとは云えず、また、いずれも水に対す
る溶解性が悪いという欠点をも有する。
「発明の目的」 本発明の目的は、呈色時の極大吸収波長が700nm以上の
長波長側にあり、感度も高く、しかも色原体の安定性、
呈色安定性共に優れた、水溶性のジフェニルアミン誘導
体を提供することにある。
長波長側にあり、感度も高く、しかも色原体の安定性、
呈色安定性共に優れた、水溶性のジフェニルアミン誘導
体を提供することにある。
「発明の構成」 本発明は、一般式〔Ｉ〕： 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は夫々独立して、式Ｃ
ｍＨ2m+1−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−（但し、ｍは１〜４の整数を
示す。）で表わされる基、又は炭素数１〜５のアルキル
基を示す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の内少なくとも１つは上記
ＣｍＨ2m+1−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−で表わされる基を示す。ま
た、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は夫々独立して、水素、低級アル
キル基又は低級アルコキシ基を示す。〕 で示されるジフェニルアミン誘導体である。
ｍＨ2m+1−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−（但し、ｍは１〜４の整数を
示す。）で表わされる基、又は炭素数１〜５のアルキル
基を示す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の内少なくとも１つは上記
ＣｍＨ2m+1−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−で表わされる基を示す。ま
た、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は夫々独立して、水素、低級アル
キル基又は低級アルコキシ基を示す。〕 で示されるジフェニルアミン誘導体である。
一般に、従来の発色試薬は水に体する溶解性が悪く、界
面活性剤を加えて可溶分散させている場合が多い。本発
明者らは、この界面活性剤（特に非イオン性界面活性
剤）の部分構造であるオキシ構造に着目し、色素化合物
にこのオキシ構造を導入することにより、水溶性が向上
すると共に界面活性剤との親水性が増し、その結果、色
原体の安定化（ブランクの安定化）と呈色安定性向上が
図れるのではないかと考え鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに到った。
面活性剤を加えて可溶分散させている場合が多い。本発
明者らは、この界面活性剤（特に非イオン性界面活性
剤）の部分構造であるオキシ構造に着目し、色素化合物
にこのオキシ構造を導入することにより、水溶性が向上
すると共に界面活性剤との親水性が増し、その結果、色
原体の安定化（ブランクの安定化）と呈色安定性向上が
図れるのではないかと考え鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成するに到った。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明のジフェニルアミン誘導
体に於てＲ１〜Ｒ４で示されるアルキル基としては、例
えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基等炭素数１〜５のアルキル基が挙げられ、直鎖
状、分枝状のいずれにても可である。
体に於てＲ１〜Ｒ４で示されるアルキル基としては、例
えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基等炭素数１〜５のアルキル基が挙げられ、直鎖
状、分枝状のいずれにても可である。
一般式〔Ｉ〕に於けるＲ５，Ｒ６，Ｒ７としては、水
素、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等炭素数１〜５のアルキル基（直鎖状、分
枝状のいずれにても可。）例えばメトキシ基、エトキシ
基、プロポキシ基、ブトキシ基、アミルオキシ基等炭素
数１〜５のアルコキシ基（直鎖状、分枝状のいずれにて
も可。）等が挙げられる。
素、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等炭素数１〜５のアルキル基（直鎖状、分
枝状のいずれにても可。）例えばメトキシ基、エトキシ
基、プロポキシ基、ブトキシ基、アミルオキシ基等炭素
数１〜５のアルコキシ基（直鎖状、分枝状のいずれにて
も可。）等が挙げられる。
一般式〔Ｉ〕で示される本発明化合物は、古くから知ら
れるインダミンの製法（R. Nietzki, Chemische Berich
te, 1883, 16, 464）に準じて色素を合成し、これを還
元することにより容易に得ることができる。
れるインダミンの製法（R. Nietzki, Chemische Berich
te, 1883, 16, 464）に準じて色素を合成し、これを還
元することにより容易に得ることができる。
例えば、まず一般式〔II〕で示されるアニリン誘導体を
合成し、また別に、一般式〔III〕で示されるフェニレ
ンジアミン誘導体を合成する。
合成し、また別に、一般式〔III〕で示されるフェニレ
ンジアミン誘導体を合成する。
但し、一般式〔II〕及び〔III〕に於けるＲ１〜Ｒ７は
前記一般式〔Ｉ〕に於けると同じ。
前記一般式〔Ｉ〕に於けると同じ。
次いで、〔II〕の化合物と〔III〕の化合物を上記イン
ダミンの製法に準じて、水溶液中、過ヨウ素酸で酸化縮
合し、色素（型）を得る。これを亜鉛、塩酸で還元すれ
ば、目的とするジフェニルアミン誘導体が得られる。
ダミンの製法に準じて、水溶液中、過ヨウ素酸で酸化縮
合し、色素（型）を得る。これを亜鉛、塩酸で還元すれ
ば、目的とするジフェニルアミン誘導体が得られる。
また、別法として、一般式〔IV〕で示されるハロゲノア
ニリン誘導体と、一般式〔III〕で示されるフェニレン
ジアミン誘導体とのウルマン縮合反応によって得ること
も可能である。
ニリン誘導体と、一般式〔III〕で示されるフェニレン
ジアミン誘導体とのウルマン縮合反応によって得ること
も可能である。
但し、一般式〔IV〕に於けるＲ１，Ｒ２，Ｒ５は前記一
般式〔Ｉ〕に於けると同じ。また、Ｘはハロゲン原子を
示す。
般式〔Ｉ〕に於けると同じ。また、Ｘはハロゲン原子を
示す。
例えば、一般式〔IV〕で示される化合物と一般式〔II
I〕で示されるフェニレンジアミン誘導体或いはそのア
シル体を、ニトロベンゼン中還流下縮合反応させれば、
目的物或いはそのアシル体が得られる。アシル体の場合
は、例えば、これをエチレングリコール中、水酸化カリ
ウムと共に加熱することにより脱アシル化し、目的物を
得る。
I〕で示されるフェニレンジアミン誘導体或いはそのア
シル体を、ニトロベンゼン中還流下縮合反応させれば、
目的物或いはそのアシル体が得られる。アシル体の場合
は、例えば、これをエチレングリコール中、水酸化カリ
ウムと共に加熱することにより脱アシル化し、目的物を
得る。
本発明化合物は、水或いは界面活性剤の溶存する水溶液
中で極めて安定で、所謂ブランク値が低い。一方、これ
を酸化性性質、例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化
水素により酸化すると、下記反応式に従って可視深色か
ら近赤外領域に吸収極大を有する呈色安定性に優れた色
素を定量的に形成する。また、本発明化合物は界面活性
能力を有する構造を備えているので、水或いは界面活性
剤の溶存する水溶液に対する溶解性が非常に良好なた
め、発色試液等の調製に於て極めて有利であり、好まし
い。
中で極めて安定で、所謂ブランク値が低い。一方、これ
を酸化性性質、例えばペルオキシダーゼの存在下過酸化
水素により酸化すると、下記反応式に従って可視深色か
ら近赤外領域に吸収極大を有する呈色安定性に優れた色
素を定量的に形成する。また、本発明化合物は界面活性
能力を有する構造を備えているので、水或いは界面活性
剤の溶存する水溶液に対する溶解性が非常に良好なた
め、発色試液等の調製に於て極めて有利であり、好まし
い。
表１に、本発明化合物の具体例６例について、そのロイ
コ体溶液の安定性、呈色後の安定性、極大吸収波長（λ
max）、感度（ε）を示すが、本発明化合物はこれら具
体例に限定されるものはない。
コ体溶液の安定性、呈色後の安定性、極大吸収波長（λ
max）、感度（ε）を示すが、本発明化合物はこれら具
体例に限定されるものはない。
表１中のロイコ体溶液の安定性と呈色溶液の安定性に於
て、ＡＡは極めて安定、Ａは安定、Ｂはやや不安定、Ｃ
は不安定であることを意味する。
て、ＡＡは極めて安定、Ａは安定、Ｂはやや不安定、Ｃ
は不安定であることを意味する。
本発明のジフェニルアミン誘導体は、酸化性物質の定量
やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色成分とし
て有効に用い得るが、とりわけ酵素反応により生成した
過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、
その呈色を比色定量することにより行なう生体試料中の
微量成分の定量に於ける発色成分として特に有効に使用
し得る。
やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色成分とし
て有効に用い得るが、とりわけ酵素反応により生成した
過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下発色系に導き、
その呈色を比色定量することにより行なう生体試料中の
微量成分の定量に於ける発色成分として特に有効に使用
し得る。
即ち、本発明化合物を発色試薬として用いる酸化性物質
の定量法は、基質、又は酵素反応により生成した物質に
酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を定量するこ
とにより行なう生体試料中の基質又は酵素活性の定量法
として特に効果的である。
の定量法は、基質、又は酵素反応により生成した物質に
酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を定量するこ
とにより行なう生体試料中の基質又は酵素活性の定量法
として特に効果的である。
本発明化合物を発色試薬として用いる定量方法により測
定可能な生体試料中の微量成分としては、例えば、コレ
ステロール、グルコース、グリセリン、トリグリセライ
ド、浮遊脂肪酸、尿酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミン
オキシダーゼ、グアナーゼ、コリンエステラーゼ等が挙
げられるが、これらに限定されるものではなく、酵素反
応により生成する過酸化水素を定量することによって測
定が可能な生体成分は全て定量可能である。
定可能な生体試料中の微量成分としては、例えば、コレ
ステロール、グルコース、グリセリン、トリグリセライ
ド、浮遊脂肪酸、尿酸、リン脂質、胆汁酸、モノアミン
オキシダーゼ、グアナーゼ、コリンエステラーゼ等が挙
げられるが、これらに限定されるものではなく、酵素反
応により生成する過酸化水素を定量することによって測
定が可能な生体成分は全て定量可能である。
本発明化合物を発色試薬として用いる定量法は、発色試
薬（被酸化性呈色試薬）として本発明のジフェニルアミ
ン誘導体を用いる以外は自体公知の酵素法（Ｈ２Ｏ２生
成酵素を用いる）による測定法に準じてこれを行なえば
足りる。
薬（被酸化性呈色試薬）として本発明のジフェニルアミ
ン誘導体を用いる以外は自体公知の酵素法（Ｈ２Ｏ２生
成酵素を用いる）による測定法に準じてこれを行なえば
足りる。
使用される発色試薬の濃度は、特に限定されないが、通
常数μmol/l以上、好ましくは50μmol/1〜100μmol/lの
濃度が用いられる。
常数μmol/l以上、好ましくは50μmol/1〜100μmol/lの
濃度が用いられる。
本発明化合物を発色試薬として用いる生体成分の定量方
法に於て、過酸化水素を生成させる酵素として用いられ
る酸化酵素（オキシダーゼ）及びその他の目的で用いら
れる酵素類並びに酵素反応に関与する基質及びその他の
物質の種類及び使用量は被酸化性呈色試薬を用いる自体
公知の生体成分の定量法に準じて夫々測定対象となる物
質に応じて適宜選択すればよい。また、本発明化合物を
発色試薬として用いる過酸化水素の定量に於て用いられ
るペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に特に限
定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシダーゼ
又はペルオキシダーゼ様物質が、一種若しくは要すれば
二種以上組合せて用いられる。また、その使用量は目的
に応じて適宜定められ、特に限定されない。
法に於て、過酸化水素を生成させる酵素として用いられ
る酸化酵素（オキシダーゼ）及びその他の目的で用いら
れる酵素類並びに酵素反応に関与する基質及びその他の
物質の種類及び使用量は被酸化性呈色試薬を用いる自体
公知の生体成分の定量法に準じて夫々測定対象となる物
質に応じて適宜選択すればよい。また、本発明化合物を
発色試薬として用いる過酸化水素の定量に於て用いられ
るペルオキシダーゼとしては、その起源、由来に特に限
定はなく、植物、動物、微生物起源のペルオキシダーゼ
又はペルオキシダーゼ様物質が、一種若しくは要すれば
二種以上組合せて用いられる。また、その使用量は目的
に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明化合物を発色試薬として用いる生体成分の定量
は、通常、pH4.0〜10.0、より好ましくはpH6.0〜8.0で
実施される。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、ク
エン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グッド
（Good's）緩衝液などが挙げられるが、特にこれらに限
定されない。
は、通常、pH4.0〜10.0、より好ましくはpH6.0〜8.0で
実施される。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、ク
エン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス緩衝液、グッド
（Good's）緩衝液などが挙げられるが、特にこれらに限
定されない。
本発明のジフェニルアミン誘導体は、過酸化水素等酸化
性物質の定量に有効に用い得るが、また、これと過酸化
水素とを組合せることによりペルオキシダーゼ様物質の
定量を行なうことも可能である。ペルオキシダーゼ様物
質としては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロ
ビンその他のヘム化合物が挙げられる。
性物質の定量に有効に用い得るが、また、これと過酸化
水素とを組合せることによりペルオキシダーゼ様物質の
定量を行なうことも可能である。ペルオキシダーゼ様物
質としては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグロ
ビンその他のヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明のジフェニルアミン誘導体は、例えば、ペ
ルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法に
於ける発色試薬としても応用可能であり、また、血清中
のヘモグロビンを過酸化水素若しくは過硼素酸ナトリウ
ムのような酸化性物質を用いて測定する場合の発色試薬
などにも有効に使用し得る。
ルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素免疫測定法に
於ける発色試薬としても応用可能であり、また、血清中
のヘモグロビンを過酸化水素若しくは過硼素酸ナトリウ
ムのような酸化性物質を用いて測定する場合の発色試薬
などにも有効に使用し得る。
以下に実施例を挙げるが、本発明はこれら実施例により
何ら制約を受けるものではない。
何ら制約を受けるものではない。
「実施例」 実施例１． 4′-ビス（ブキシエチル）アミノ-2- メチル-4-ジペンチルアミノジフェニ ルアミン〔本発明化合物(1)〕の合成 アニリン25ｇとトリス（ブトキシエチル）リン酸200ｇ
を170℃、６時間加熱した後、１Ｎ水酸化ナトリウム過
溶液500mlで洗浄脱塩し、カラムクロマトグラフィー
（シリカゲル，n-ヘキサンアで精製して、N,N-ビス（ブ
トキシエチル）アニリン51ｇを得た。
を170℃、６時間加熱した後、１Ｎ水酸化ナトリウム過
溶液500mlで洗浄脱塩し、カラムクロマトグラフィー
（シリカゲル，n-ヘキサンアで精製して、N,N-ビス（ブ
トキシエチル）アニリン51ｇを得た。
また別に、m-トルイジン25ｇをリン酸トリアミルに溶か
し、170℃で４時間加熱した後、１Ｎ水酸化ナトリウム
水溶液500mlで洗浄脱塩し、カラムクロマトグラフイー
（シリカゲル，n-ヘキサン）で精製し、N,N-ジアミル-m
-トルイジン40ｇを得た。このN,N-ジアミル-m-トルイジ
ン４ｇを水：メタノール＝１：１溶液10リットルに溶解し、
カプラー溶液を調製した。次に、N,N-ビス（ブトキシエ
チル）アニリン４ｇを６Ｎ塩酸100mlに溶解し、氷浴上
で亜硝酸ナトリウム５ｇを添加しニトロソ化した。これ
に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液160mlを注入し、ヘキサ
ン300mlで抽出後乾燥濃縮し、これをカラムクロマトグ
ラフィー（シリカゲル，n-ヘキサンノで精製した。得ら
れたニトロソ体をメタノール２リットルに溶解し、亜鉛120
ｇ、６Ｎ塩酸90mlで還元し、フェニレンジアミン誘導体
とした。この溶液から亜鉛を除去し、先に調製したカプ
ラー溶液とを合わせ、これに過ヨウ素酸34ｇを投入し、
酸化縮合反応を行なった。反応後、これを再び亜鉛35
ｇ、６Ｎ塩酸50mlで還元し、然る後、酢酸エチルで抽出
した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シ
リカゲル，n-ヘキサン）で精製し、淡緑色油状物1.9ｇ
（ジペンチルトルイジンからの収率21％）を得た。
し、170℃で４時間加熱した後、１Ｎ水酸化ナトリウム
水溶液500mlで洗浄脱塩し、カラムクロマトグラフイー
（シリカゲル，n-ヘキサン）で精製し、N,N-ジアミル-m
-トルイジン40ｇを得た。このN,N-ジアミル-m-トルイジ
ン４ｇを水：メタノール＝１：１溶液10リットルに溶解し、
カプラー溶液を調製した。次に、N,N-ビス（ブトキシエ
チル）アニリン４ｇを６Ｎ塩酸100mlに溶解し、氷浴上
で亜硝酸ナトリウム５ｇを添加しニトロソ化した。これ
に５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液160mlを注入し、ヘキサ
ン300mlで抽出後乾燥濃縮し、これをカラムクロマトグ
ラフィー（シリカゲル，n-ヘキサンノで精製した。得ら
れたニトロソ体をメタノール２リットルに溶解し、亜鉛120
ｇ、６Ｎ塩酸90mlで還元し、フェニレンジアミン誘導体
とした。この溶液から亜鉛を除去し、先に調製したカプ
ラー溶液とを合わせ、これに過ヨウ素酸34ｇを投入し、
酸化縮合反応を行なった。反応後、これを再び亜鉛35
ｇ、６Ｎ塩酸50mlで還元し、然る後、酢酸エチルで抽出
した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（シ
リカゲル，n-ヘキサン）で精製し、淡緑色油状物1.9ｇ
（ジペンチルトルイジンからの収率21％）を得た。
ＴＬＣ（シリカゲル，酢酸エチル：n-ヘキサン＝１：
９） Ｒｆ＝0.4。
９） Ｒｆ＝0.4。
ＮＭＲ（CDCl3）：δ0.90(t,12H,aliphatic CH3)、1.12
〜1.88(m,16H,pentyl CH2)、3.30〜3.72(m,8H,buthoxye
thyl CH2)、6.30〜6.91ppm(m,7H,aromatic H)。〔第１
図〕 M.S.（E.I.）：Ｍ＋＝553。
〜1.88(m,16H,pentyl CH2)、3.30〜3.72(m,8H,buthoxye
thyl CH2)、6.30〜6.91ppm(m,7H,aromatic H)。〔第１
図〕 M.S.（E.I.）：Ｍ＋＝553。
ＩＲ：ν1050，3400cm-1。
実施例２． 4′-ビス（ブキシエチル）アミノ-2, 2′-ジケチル-4-ジペンチルアミノジ フェニルアミン〔本発明化合物(2)〕 の合成 本実施例に於ける中間体フェニルジアミン及び同カプラ
ーは、夫々実施例１に於ける中間体フェニレンジアミン
及び同カプラーの製法に準じてこれを合成した。
ーは、夫々実施例１に於ける中間体フェニレンジアミン
及び同カプラーの製法に準じてこれを合成した。
N,N′-ビス（ブトキシエチル）-3-メチル-p-フェニレン
ジアミン１ｇとN,N-ジペンチル-m-トルイジン250mgを
水：メタノール−１：１溶液１リットルに溶かし、過ヨウ素
酸2.3ｇを加え反応を行なった。以下後処理は実施例１
と同様に操作して、淡黄色油状物50mg（収率8.8％）を
得た。
ジアミン１ｇとN,N-ジペンチル-m-トルイジン250mgを
水：メタノール−１：１溶液１リットルに溶かし、過ヨウ素
酸2.3ｇを加え反応を行なった。以下後処理は実施例１
と同様に操作して、淡黄色油状物50mg（収率8.8％）を
得た。
ＴＬＣ（シリカゲル，酢酸エチル：n-ヘキサン＝１：
９） Ｒｆ＝0.5。
９） Ｒｆ＝0.5。
ＮＭＲ（CDCl3）：δ0.90(t,12H,aliphatic CH3)、1.12
〜1.88(m,16H,pentyl CH2)、2.20(s,6H,aromatic C
H3)、3.30〜3.75(m,8H,buthoxyethyl CH2)、6.40〜6.85
ppm(m,7H,aromatic H)。〔第２図〕 M.S.（E.I.）：Ｍ＋＝567。
〜1.88(m,16H,pentyl CH2)、2.20(s,6H,aromatic C
H3)、3.30〜3.75(m,8H,buthoxyethyl CH2)、6.40〜6.85
ppm(m,7H,aromatic H)。〔第２図〕 M.S.（E.I.）：Ｍ＋＝567。
ＩＲ：ν1050，3400cm-1。
参考例１． 過酸化水素の定量 〔測定試験〕 本発明化合物(2)0.5mmol/l、ペルオキシダーゼ４U/mlの
濃度になるように、50mmol/lＰＩＰＥＳ〔ピペラジン-
N，N-ビス(2-エタンスルホン酸）〕−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH7.0）に溶解した。
濃度になるように、50mmol/lＰＩＰＥＳ〔ピペラジン-
N，N-ビス(2-エタンスルホン酸）〕−水酸化ナトリウム
緩衝液（pH7.0）に溶解した。
市販過酸化水素水をイオン交換水で0.5，1.0，1.5，2.
0，4.0mmol/lの濃度になるよう希釈した。
0，4.0mmol/lの濃度になるよう希釈した。
測定試液３mlに試料液20μｌを加え、37℃で５分間加温
後、755nmに於ける吸光度を測定した。
後、755nmに於ける吸光度を測定した。
第３図に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示した。
第３図より明らかな如く、各過酸化水素濃度（mmol/l）
に体してプロットした吸光度を結ぶ検量線は良好な定量
性を示している。
に体してプロットした吸光度を結ぶ検量線は良好な定量
性を示している。
参考例２． 正常人血清共存下での過酸化水素の 定量 〔測定試液〕 参考例１に同じ。
参考例１に同じ。
測定試液３mlに正常血清或いはイオン交換水50μを加
えた後、試料液20μを加え、37℃で５分間加温後、75
5nmに於ける吸光度を測定した。
えた後、試料液20μを加え、37℃で５分間加温後、75
5nmに於ける吸光度を測定した。
表２に過酸化水素濃度と吸光度との関係を示した。
表２より明らかな如く、人血清は吸光度に影響を与えな
いことを示している。
いことを示している。
参考例３． 尿酸の定量 〔測定試液〕 本発明化合物(2)0.5mmol/ｌ、ペルオキシダーゼ４U/m
l、ウリカーゼ0.05U/mlの濃度になるように、50mmol/ｌ
ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解
した。
l、ウリカーゼ0.05U/mlの濃度になるように、50mmol/ｌ
ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解
した。
10mg/dlの尿酸を有する標準液、及び人血清５検体を試
料とした。
料とした。
測定試液３mlに試料液20μを添加し、37℃で５分間加
温後、755nmに於ける吸光度（ＯＤ755）を測定した。
温後、755nmに於ける吸光度（ＯＤ755）を測定した。
次式に従い、人血清中の尿酸値を算出した。
また、尿酸測定用の市販キット〔尿酸Ｃ−テストワコ
ー，和光純薬工業（株）製〕を用い、同一人血清を測定
し本法と比較した。〔比較例〕 〔結果〕 結果を表３に示した。
ー，和光純薬工業（株）製〕を用い、同一人血清を測定
し本法と比較した。〔比較例〕 〔結果〕 結果を表３に示した。
参考例４． グルコースオキシダーゼ活性の測定 〔測定試液〕 本発明化合物(2)0.05mmol/ｌ、ペルオキシダーゼ ４U/
ｌ、グルコース ５％の濃度になるように、50mmol/ｌ
ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解
した。
ｌ、グルコース ５％の濃度になるように、50mmol/ｌ
ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0）に溶解
した。
グルコースオキシダーゼ活性値が夫々0.02，0.04，0.0
8，0.12，0.16，0.2U/ｌになるように、50mmol/ｌＰＩ
ＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0に溶解した溶
液を調製した。
8，0.12，0.16，0.2U/ｌになるように、50mmol/ｌＰＩ
ＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.0に溶解した溶
液を調製した。
測定試液３mlに試料液20μ１を添加した後、755nmにお
ける吸光度の時間的変化を測定した。
ける吸光度の時間的変化を測定した。
第４図に示すようなタイム・コースが得られた。
参考例５． グアナーゼの定量 〔測定試液〕 第１試液 本発明化合物(2)0.1mmol/l、ウリカーゼ1.2U/ml、キサ
ンチンオキシダーゼ0.15U/ml、スーパーオキシドジスム
ターゼ90U/ml、アスコルビン酸オキシダーゼ １U/ml、
カタラーゼ1000U/mlの濃度になるように、50mmol/lリン
酸緩衝液（pH7.0に溶解した。
ンチンオキシダーゼ0.15U/ml、スーパーオキシドジスム
ターゼ90U/ml、アスコルビン酸オキシダーゼ １U/ml、
カタラーゼ1000U/mlの濃度になるように、50mmol/lリン
酸緩衝液（pH7.0に溶解した。
第２試液 ゲアニン2.5mmol/ｌ、ＮａＮ３0.12％、ペルオキシダー
ゼ10U/mlの濃度になるように、50mmol/ｌリン酸緩衝液
（pH7.2）に溶解した。
ゼ10U/mlの濃度になるように、50mmol/ｌリン酸緩衝液
（pH7.2）に溶解した。
グアナーゼ（ウサギ肝由来）を活性値が夫々２，４，
６，８，10U/ｌになるように、50mmol/ｌリン酸緩衝液
（pH7.2）に溶解した。
６，８，10U/ｌになるように、50mmol/ｌリン酸緩衝液
（pH7.2）に溶解した。
試料液0.1mlに第１試液ｌmlを添加し、５分間37℃で予
備加温の後、第２試液ｌmlを加え、755nmに於ける吸光
度の時間的変化を測定した。
備加温の後、第２試液ｌmlを加え、755nmに於ける吸光
度の時間的変化を測定した。
第５図に示すようなタイム・コースが得られた。
参考例６． グアナーゼの定量 〔測定試液〕 参考例５に同じ。
グアナーゼ（ウサギ肝由来）を活性値が夫々２，４，
６，８，10U/lとなるように、正常人血清を用いて希釈
した。
６，８，10U/lとなるように、正常人血清を用いて希釈
した。
参考例に同じ。
第６図に酵素活性と吸光度変化の関係を示した。但し、
盲検はグアナーゼ無添加の血清を用いて測定した。
盲検はグアナーゼ無添加の血清を用いて測定した。
「発明の効果」 以上述べた如く、本発明の新規ジフェニルアミン誘導体
は、いずれもその呈色時の極大吸収波長が700nm以上と
長波長側にある為、例えば血清、尿等生体試料中の微量
成分の定量に於ける発色試薬としてこれを用いた場合に
は、試料中に共存する有色の妨害物質の影響を全く受け
ずに測定を行なうことができるという点、並びに、本発
明の新規ジフェニルアミン誘導体は水、或いは界面活性
剤の溶存する水溶液に対する溶解性が極めて良好で且つ
色原体の安定性、呈色安定性共に著しく優れている点に
顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである。
は、いずれもその呈色時の極大吸収波長が700nm以上と
長波長側にある為、例えば血清、尿等生体試料中の微量
成分の定量に於ける発色試薬としてこれを用いた場合に
は、試料中に共存する有色の妨害物質の影響を全く受け
ずに測定を行なうことができるという点、並びに、本発
明の新規ジフェニルアミン誘導体は水、或いは界面活性
剤の溶存する水溶液に対する溶解性が極めて良好で且つ
色原体の安定性、呈色安定性共に著しく優れている点に
顕著な効果を奏するものであり、斯業に貢献するところ
大なるものである。
第１図は、実施例１に於て得られた4′-ビス（ブトキシ
エチル）アミノ-2-メチル-4-ジペンチルアミノジフェニ
ルアミンのＮＭＲチャートを表わす。 第２図は、実施例２に於て得られた4′-ビス（ブトキシ
エチル）アミノ-2,2′-ジメチル-4-ジペンチルアミノジ
フェニルアミンのＮＭＲチャートを表わす。 第３図は、参考例１に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（mmol/ｌ）について得られた吸
光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 第４図は、参考例４の各グルコースオキシダーゼ活性に
於て得られたタイム・コースを表わし、横軸は反応時間
（分）、縦軸は吸光度を夫々表わす。 第５図は、参考例５の各グアナーゼ活性に於て得られた
タイム・コースを表わし、横軸は時間（分）、縦軸は吸
光度を夫々表わす。 第６図は、参考例６に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各グアナーゼ活性（U/ｌ）について得られた１分間
当たりの吸光度変化量を縦軸に沿ってプロットした点を
結んだものである。
エチル）アミノ-2-メチル-4-ジペンチルアミノジフェニ
ルアミンのＮＭＲチャートを表わす。 第２図は、実施例２に於て得られた4′-ビス（ブトキシ
エチル）アミノ-2,2′-ジメチル-4-ジペンチルアミノジ
フェニルアミンのＮＭＲチャートを表わす。 第３図は、参考例１に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各過酸化水素濃度（mmol/ｌ）について得られた吸
光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。 第４図は、参考例４の各グルコースオキシダーゼ活性に
於て得られたタイム・コースを表わし、横軸は反応時間
（分）、縦軸は吸光度を夫々表わす。 第５図は、参考例５の各グアナーゼ活性に於て得られた
タイム・コースを表わし、横軸は時間（分）、縦軸は吸
光度を夫々表わす。 第６図は、参考例６に於て得られた検量線を表わし、横
軸の各グアナーゼ活性（U/ｌ）について得られた１分間
当たりの吸光度変化量を縦軸に沿ってプロットした点を
結んだものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 三木 豊 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内 (72)発明者 橋爪 利至 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内 (72)発明者 時岡 伸之 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】一般式〔Ｉ〕： 〔式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４は夫々独立して、式Ｃ
ｍＨ2m+1−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−（但し、ｍは１〜４の整数を
示す。）で表わされる基、又は炭素数１〜５のアルキル
基を示す。但し、Ｒ１〜Ｒ４の内少なくとも１つは上記
ＣｍＨ2m+1−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−で表わされる基を示す。ま
た、Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７は夫々独立して、水素、低級アル
キル基又は低級アルコキシ基を示す。〕 で示されるジフェニルアミン誘導体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23298785A JPH062720B2 (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | 新規なジフェニルアミン誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23298785A JPH062720B2 (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | 新規なジフェニルアミン誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6293261A JPS6293261A (ja) | 1987-04-28 |
| JPH062720B2 true JPH062720B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=16948020
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23298785A Expired - Lifetime JPH062720B2 (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | 新規なジフェニルアミン誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062720B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2604657A4 (en) | 2010-08-11 | 2015-08-19 | Kyowa Medex Co Ltd | METHOD FOR PRESERVING AQUEOUS SOLUTION COMPRISING A LEUCO TYPE CHROMOGEN |
| CN103069003B (zh) | 2010-08-11 | 2016-01-20 | 协和梅迪克斯株式会社 | 糖化血红蛋白的测定方法 |
| WO2012081540A1 (ja) | 2010-12-13 | 2012-06-21 | 協和メデックス株式会社 | ロイコ型色原体含有水溶液の保存方法 |
| EP3492529A4 (en) | 2016-07-29 | 2020-12-16 | Hitachi Chemical Diagnostics Systems Co., Ltd. | PROCESS FOR PRESERVING AN AQUEOUS SOLUTION CONTAINING A LEUCO-TYPE CHROMOGEN |
| JP7408299B2 (ja) | 2018-06-07 | 2024-01-05 | キヤノン株式会社 | 過酸化水素の検出のための高分子色素および過酸化水素検出用構造体 |
-
1985
- 1985-10-18 JP JP23298785A patent/JPH062720B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6293261A (ja) | 1987-04-28 |
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