JPH06256222A - ポリエチレンオキシド改質プロテイン及びポリペプチドのシクロデキストリンとの凍結乾燥複合体 - Google Patents

ポリエチレンオキシド改質プロテイン及びポリペプチドのシクロデキストリンとの凍結乾燥複合体

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JPH06256222A
JPH06256222A JP5264846A JP26484693A JPH06256222A JP H06256222 A JPH06256222 A JP H06256222A JP 5264846 A JP5264846 A JP 5264846A JP 26484693 A JP26484693 A JP 26484693A JP H06256222 A JPH06256222 A JP H06256222A
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ピー．フィリップス クリストファー
Robert A Snow
エー．スノー ロバート
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、凍結乾燥非経口組成物に関し、分
子内凝集することがない貯蔵寿命の長い組成物を得るこ
とを目的とする。 【構成】 本発明組成物は、生物学的活性プロテイン性
物質と共有結合し、かつ寒冷たんぱく質シクロデキスト
リンと複合体を形成した低ジオールポリアルキレンオキ
シド、例えば、ポリエチレングリコールを含有する凍結
乾燥生物学的活性プロテイン性組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、低ジオールポリアルキ
レンオキシドに結合した生理的活性プロテイン及びポリ
ペプチドであって、寒冷たんぱく質シクロデキストリン
と組合わさったものの凍結乾燥化非経口（静脈用）水溶
液に関する。さらに詳細には、本発明は、低ジオールポ
リエチレングリコールに結合したスーパーオキシドジス
ムターゼであって、寒冷たんぱく質シクロデキストリン
と組合わさったものの凍結乾燥化非経口水溶液に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】生物学的活性プロテイン、特に酵素及び
ペプチドホルモンは、それらの特異性及び迅速触媒作用
の故に各種疾病治療用の理想的薬剤であると長い間考え
られてきた。このような酵素としては以下のものが挙げ
られる。オキシドレダクターゼ、例えば、ウレート（Ｕ
ｒａｔｅ）：酸素オキシドレダクターゼ（１．７．３．
３；″ウリカーゼ″）；過酸化水素：過酸化水素オキシ
ドレダクターゼ（１．１１．１．６；″カタラー
ゼ″）；コレステロール、還元−ＮＡＤＰ：酸素オキシ
ドレダクターゼ（２０−β−ヒドロキシル化）（１．１
４．１．９；″コレステロール ２０−ヒドロキシラー
ゼ″）；トランスフェラーゼ、例えば、ＵＤＰグルクロ
ネート・グルクロニル−トランスフェラーゼ（非特異性
受容体）（２．４．１．１７；″ＵＤＰグルクロニルト
ランスフェラーゼ″）；ＵＤＰグルコース：α−Ｄ−ガ
ラクトース−１−ホスフェート・ウリジリルトランスフ
ェラーゼ２．７．７．１２）；ヒドロラーゼ、例えば、
ムコペプチド・Ｎ−アセチルムラミル−ヒドロラーゼ
（３．２．１．１７；リソチーム）；トリプシン（３．
４．４．４）；Ｌ−アスパラギン アミノヒドロラーゼ
（３．５．１．１；″アスパラギナーゼ″）；リアー
ゼ、例えば、フルクトース−１，６−ジホスフェート・
Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートリアーゼ
（４．１．２．１２；″アルドラーゼ″）；イソメラー
ゼ、例えば、Ｄ−キシローズ・ケトル−イソメラーゼ
（５．３．１．５；キシローズ・イソメラーゼ）；及び
リガーゼ、例えば、Ｌ−シトルリン：Ｌ−アスパルテー
ト・リガーゼ（ＡＭＰ）（６．３．４．５）。
【０００３】ペプチドホルモンとしては以下を挙げるこ
とができる：インシュリン：ＡＣＴＨ；グルカゴン；ソ
マトスタチン；ソマトトロピン；チモシン；甲状腺ホル
モン；色素性ホルモン；ソマトメジン；エリトロポイエ
チン；黄体形成ホルモン；絨毛膜ゴナドトロピン；視床
下部放出因子；抗利尿性ホルモン；チロイド刺激性ホル
モン；カルシトニン；プロラクチン。
【０００４】生物学的活性プロテイン性物質、特に、非
−ヒト酵素を用いる治療は、それらの比較的短い半減期
及びそれらの免疫原性の故に成功しにくい。投与する
と、宿主防禦系が応答して、それに対する抗体の産生を
開始することにより外来酵素を除去し、それにより実質
的にそれらの治療効果を低下もしくは排除する。外来の
そしてさもなければ寿命の短いヒト酵素の投与を繰り返
すことは実質的に効果がなく、そしてそれに伴うアレル
ギー性応答のために危険な場合もある。これらの問題点
を解決するための各種試み、例えば、マイクロカプセル
への封入、リポソームへの捕捉、遺伝子工学及びポリマ
ーへの酵素の結合が行われてきた。これらの試みの中
で、最も有望なものは、プロテイン性物質のポリアルキ
レンオキシド（ＰＡＯ）ポリマーそして特にポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）への化学的結合であるようだ。
【０００５】米国特許第４，１７９，３３７号は、生理
的活性非免疫性水溶性ポリペプチド組成物であって、そ
の組成物ではポリエチレングリコール（以後、ＰＥＧと
称することもある）が、実質的免疫応答を誘起すること
なく、ポリペプチドが活性を喪失しないように保護する
役目をする組成物を提供するのに、プロテインと結合し
たポリエチレングリコールもしくはポリプロピレングリ
コールを使用することについて開示している。前記特許
に記載の、ポリエチレングリコールをプロテインへ結合
するための方法は、プロテインアミノ基をアミドもしく
はアミドへ転化し、その結果アミノ基の電荷担持能力を
喪失させること、又はプロテインのアミノ基もしはくそ
の近傍での、ヘテロ原子置換基、例えば、ヒドロキシル
基の導入又はポリマー主鎖中で反復しない環系の導入が
必要である。
【０００６】Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｏｃｃ
ｕ，Ｅ．，Ｓｃｈａｉｖｏｎ，Ｏ．，Ｖｅｌｏ，Ｇ．
Ｐ．，Ｃｏｎｆｏｒｔｉ，Ａ．，Ｆｒａｎｃｏ；Ｌ．，
及びＭｉｌａｎｉｎｏ，Ｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ
ｙ．３５，７５７〜７５８（１９８３）は、ウシ赤血球
由来スーパーオキシドジスムターゼをポリエチレングリ
コールカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エ
ステルで改質すると、ラット酵素の半減期が、未改質プ
ロテインのものと比べて増加することを報告している。
【０００７】味の素株式会社のヨーロッパ特許出願第０
２００４６７号は、活性化カルボキシルカプリング基を
用いてポリマーの両末端で官能基化され、各々がプロテ
インと反応可能であるポリアルキレンオキシド（ＰＡ
Ｏ）により化学的改質が施されているスーパーオキシド
ジスムターゼについて述べている。活性化カプリング部
位がポリマー鎖の反対側末端に位置しているので、ポリ
マーの一末端に活性基が存在することが、ポリマーの他
の末端の基の反応性に有意の影響を与えることはなさそ
うである。これらのポリマーは、両末端で反応してプロ
テインとクロス−カプリングして、プロテインとポリア
ルキレンオキシド間の共重合体を形成することができ
る。このような共重合体はその性質が十分に明らかでは
ないか、又は分子上化学量論的組成も有していない。
【０００８】Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．等は、Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓ
ｅ．１０，１４５〜１５４（１９８９）で、スーパーオ
キシドジスムターゼ（以後、ＳＯＤと称することがあ
る）のモノメトキシポリエチレングリコール（以後、Ｍ
ＰＥＧと称することがある）との誘導体が不均一な生成
物混合物となることを報告している。不均一性は、一官
能性メトキシル化分子中に二官能性ポリエチレングリコ
ール（ＤＰＥＧ）が存在するか否かに依存してあらわれ
る。
【０００９】一般に、これらの試みは、プロテイン性生
理学的活性物質の半減期を幾分延長しそして免疫性を低
減させることになる。しかしながら、これらの有望な生
物学的物質を用いて各種疾病を治療して成功するために
は更なる改良が必要なようである。同時係属出願番号第
０７／９３６，４１６号（引用することにより本明細書
に包含する）において、生物学的活性プロテイン性物質
は、低ジオールポリアルキレンオキシド、好ましくは、
ポリエチレンオキシドを用いてそれらを化学的に改質す
ることにより、半減期を長くしそして免疫原性を低減さ
せることができると開示されている。開示配合物は、ポ
リエチレングリコール改質プロテイン性物質についての
従来技術により開示されている配合物と比べて、顕著な
利点を有する。
【００１０】液体状態で保管すると、ポリエチレングリ
コールプロテイン性分子は加水分解して遊離のポリエチ
レングリコール、ポリエチレングリコール−プロテイン
及びスクシネート−プロテイン成分の混合物になる。こ
のような不安定化工程を回避するために配合物を凍結乾
燥してもよい。しかしながら、凍結乾燥すると、プロテ
インと安定剤の濃度が高レベルとなり、用いる賦形済次
第で貯蔵中に起こる分子内凝集度に悪影響を与える。
【００１１】シクロデキストリンは、共有結合した低ジ
オールポリエチレングリコール−プロテインの貯蔵中の
分子内凝集率を低下させ、したがって貯蔵寿命を長くす
ることが判明している。シクロデキストリンは、包接複
合体の形成能を有しそしてそれに伴って可溶性を有する
ことが知られている。これらの用途は以下に挙げる特許
に示されている。
【００１２】米国特許第４，５９６，７９５号は、シク
ロデキストリンの親水性誘導体、例えば、ポリ−β−シ
クロデキストリン及びヒドロキシプルピル−β−シクロ
デキストリンとの複合体の形で性ホルモンを舌下経路又
は口腔経路により投与することに関する。これらの複合
体は他のシクロデキストリン誘導体と比較して極めて水
溶性でありかつ効果的であることが判明した。
【００１３】米国特許第４，７２７，０６４号は、低水
溶性薬剤及び非晶質の水溶性シクロデキストリン基材混
合物からなる薬剤調製物について開示している。シクロ
デキストリン基材混合物を添加すると薬剤の溶解特性が
改質される。シクロデキストリン混合物は、非選択性ア
ルキル化により非晶質になったα，β又はγ−シクロデ
キストリンから調製する。
【００１４】国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０４０９９
号（ＷＯ ９０／０３７８４号）は、ポリペプチド及び
安定化／可溶化量の、β及びγ−シクロデキストリンの
ヒドロキシプロピル、ヒドロキシエチル、グルコシル、
マルトシル及びマルトトリオシル誘導体からなる群より
選ばれるシクロデキストリンからなる凍結乾燥組成物に
ついて述べている。
【００１５】米国特許第４，９８３，５８６号は、薬剤
を非経口投与した場合に注射部位にあらわれる親油性及
び／又は水不安定性薬剤の沈澱傾向を低減させる方法で
あって、約２０％〜５０％ヒドロキシプロピル−β−シ
クロデキストリン含有水溶液中の薬剤を投与することか
らなる方法を開示している。抗腫瘍剤、鎮静薬、精神安
定剤、鎮痙薬、抗うつ薬、催眠薬、筋肉弛緩薬、抗痙攣
剤、抗炎症剤、抗凝結薬、強心剤、血管拡張剤及び抗不
整脈剤を含む多数の薬剤が特許請求されている。
【００１６】シクロデキストリンとの複合体の形の、低
ジオールポリオキシエチレンオキシド及び生理的活性プ
ロテインもしくはポリペプチドからなる凍結乾燥非経口
配合物は、分子内凝集が発生することなく配合物の貯蔵
寿命を引延ばして安定化するとの知見を我々は驚くべき
ことに得た。
【００１７】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は、低ジ
オールポリアルキレンオキシド（以後、ＬＤＰＡＯと称
すこともある）、好ましくは低ジオールポリエチレング
リコール（以後、ＬＤＰＥＧと称すこともある）に共有
結合した生理的活性プロテインであってシクロデキスト
リンと複合体を形成したものからなる安定な非経口性配
合物を提供する。
【００１８】更に詳細には、本発明は、約１５０〜約１
５０，０００Ｕ／mLの、好ましくは、約２５，０００〜
約１５０，０００Ｕ／mLの、最も好ましくは、約５０，
０００〜約１５０，０００Ｕ／mLの共有結合で結ばれた
低ジオールポリエチレンオキシド／プロテイン；約０．
１〜約２０％ｗ／ｖの、好ましくは、約１．０〜約１５
％ｗ／ｖの、最も好ましくは、約５〜約１０％ｗ／ｖの
シクロデキストリン；及び約０．０１〜約５０mMのpH
５．７〜６．５の緩衝液からなる薬学的組成物に向けら
れている。
【００１９】本明細書において用いられるものとして、
ポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチレングリコ
ールについての用語″低ジオール″とは、約１０％以下
の非モノアルコキシル化ポリアルキレンオキシド、好ま
しくは非モノメトキシル化ポリエチレングリコールを含
有する線状ポリアルキレンオキシドを意味する。本発明
において用いられる好ましい低ジオールポリエチレンオ
キシドは、生物学的活性プロテイン、特に、スーパーオ
キシドジスムターゼに共有結合させるのに特に適切な、
約１，０００〜約１５，０００ドルトンの平均分子量を
有しかつ約１０％ｗ／ｗ以下の非モノメトキシル化ポリ
エチレングリコールを含むポリエチレングリコールポリ
マーである。更に好ましくは、約２，０００〜約１０，
０００ドルトンの、最も好ましくは、約４，０００〜約
６，０００ドルトンの平均分子量を有するポリエチレン
グリコールであって、そのポリエチレングリコールが約
７％ｗ／ｗ未満の、最も好ましくは、約５％ｗ／ｗ未満
の非モノメトキシル化ポリエチレングリコールを含有す
るものが本発明において用いられる。
【００２０】本発明に用いられる生物学的／生理的に活
性なプロテイン、ポリペプチド及びホルモンとしては以
下が挙げられる：組換型ヒトインターロイキン−４（ｒ
ｈｕ ＩＬ−４）；プロテアーゼ・サブチリジン・カル
スベルグ；スーパーオキシドジスムターゼ、例えば、ウ
シ、ヒト及び各種の組換型スーパーオキシドジスムター
ゼ、例えば、組換型ヒトスーパーオキシドジスムターゼ
（ｒｈｕ ＳＯＤ）；オキシドレダクターゼ、例えば、
ウレート（Ｕｒａｔｅ）：酸素オキシドレダクターゼ
（１．７．３．３；″ウリカーゼ″）；過酸化水素：過
酸化水素オキシドレダクターゼ（１．１１．１．６；″
カタラーゼ″）；コレステロール、還元−ＮＡＤＰ：酸
素オキシドレダクターゼ（２０−β−ヒドロキシル化）
（１．１４．１．９；″コレステロール ２０−ヒドロ
キシラーゼ″）；トランスフェラーゼ、例えば、ＵＤＰ
グルクロネート・グルクロニル−トランスフェラーゼ
（非特異性受容体）（２．４．１．１７；″ＵＤＰグル
クロニルトランスフェラーゼ″）；ＵＤＰグルコース：
α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェート・ウリジリル
トランスフェラーゼ２．７．７．１２）；ヒドロラー
ゼ、例えば、ムコペプチド・Ｎ−アセチルムラミル−ヒ
ドロラーゼ（３．２．１．１７；リソチーム）；トリプ
シン（３．４．４．４）；Ｌ−アスパラギン アミノヒ
ドロラーゼ（３．５．１．１；″アスパラギナー
ゼ″）；リアーゼ、例えば、フルクトース−１，６−ジ
ホスフェート・Ｄ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェ
ート−リアーゼ（４．１．２．１２；″アルドラー
ゼ″）；イソメラーゼ、例えば、Ｄ−キシロース・ケト
ル−イソメラーゼ（５．３．１．５；キシロース・イソ
メラーゼ）；及びリガーゼ、例えば、Ｌ−シトルリン：
Ｌ−アスパルテート・リガーゼ（ＡＭＰ）（６．３．
４．５）；インシュリン；ＡＣＴＨ；グルカゴン；ソマ
トスタチン；ソマトトロピン；チモシン；甲状腺ホルモ
ン；色素性ホルモン；ソマトメジン；エリトロポイエチ
ン；黄体形成ホルモン；絨毛膜ゴナドトロピン；視床下
部放出因子；抗利尿性ホルモン；チロイド刺激性ホルモ
ン；カルシトニン；プロラクチン；インターフェロン
（α，β及びγ）；抗体（ＩｇＧ，ＩｇＥ，ＩｇＭ，Ｉ
ｇＤ）；インターロイキン１，２，３，４及び７；顆粒
球コロニー刺激性因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球マクロファ
ージ・コロニー・刺激性因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；
表皮成長因子（ＥＧＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；骨
成長因子（ＢＧＦ）；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲ
Ｆ）；パパイン；キモトリプシン；テルモリジン；スト
レプトキナーゼ及びアクティバーゼ。
【００２１】本発明に用いられるシクロデキストリン
は、６，７及び８個のグルコース単位からそれぞれなる
α−，β−及びγ−シクロデキストリンである。これら
は当該技術分野において知られており、ある種の薬剤、
プロテイン及びペプチドと封入複合体（ｉｎｃｌｕｓｉ
ｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）を形成する能力を有し、そ
して付随性可溶化特性を有することが認められている。
【００２２】シクロデキストリンの外側は親水性である
が、シクロデキストリンの内部腔は親油性である。これ
らの性質の故に、これらは薬剤と封入複合体を形成する
のに用いられてきた。低ジオールポリアルキレンオキシ
ド／プロテイン接合体を安定化させる目的のためには、
β−シクロデキストリンのヒドロキシエチル、ヒドロキ
シプロピル、グルコシル、マルトシル及びマルトトリオ
シル誘導体が特に適している。
【００２３】本発明に用いられる薬学的に許容しうる水
性キャリアは、非毒性の不活性媒体であり、この媒体中
に、シクロデキストリン低ジオールポリエチレンオキシ
ド／ペプチド接合体及び薬学的に許容可能な緩衝液、例
えば、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリ
ウム及び鉱酸及び有機酸からの誘導体が溶解する。用
語″薬学的に許容可能な緩衝液″とは、その緩衝液が、
その緩衝液の医療投与量では哺乳類の組織に対して比較
的無害なので、活性複合体の有用特性が、緩衝液に帰因
する副作用により損われないことを意味する。
【００２４】本発明の配合物を調製する方法において
は、以下に示すように、第一に、低ジオールポリエチレ
ングリコールを生物学的活性プロテインに共有結合させ
る： ａ）ＬＤＰＥＧ＋カルボキシル化剤…＞ＬＤＰＥＧ−Ｃ
ＯＯＨ ｂ）ＬＤＰＥＧ−ＣＯＯＨ＋カルボキシル基活性化剤…
＞ＬＤＰＥＧ−ＣＯＯＨの活性エステル ｃ）ｎ（ＬＤＰＥＧ−ＣＯＯＨの活性エステル）＋プロ
テイン…＞（ＬＤＰＥＧ−ＣＯ）n −プロテイン、前記
式中、 ＬＤＰＥＧ−ＣＯＯＨはヒドロキシ部位がカルボキシル
化されたＬＤＰＥＧであり；ｎはプロテインとのＬＤＰ
ＥＧの結合部位の数である。
【００２５】ＬＤＰＥＧをそのヒドロキシ部位でカルボ
キシル化し、次にカルボキシル基をカルボキシル活性化
剤でエステル化して活性エステルを生成し、これを次に
プロテイン分子と結合させる。プロテインに結合するＬ
ＤＰＥＧ分子の数は活性基、例えば、プロテイン分子上
に存在する反応基、例えばアミノ基の数により変動する
であろう。
【００２６】このＬＤＰＥＧを薬学的に許容しうる水性
キャリアに溶解し、続いて所望シクロデキストリンの添
加及び溶解を行う。この溶液を次に凍結乾燥機で凍結乾
燥する。凍結乾燥溶液は、患者に投与するに際に滅菌水
を用いて元に戻す。本発明を、スーパーオキシドジスム
ターゼ（以下ＳＯＤと略記することもある）についての
具体例で説明する。
【００２７】スーパーオキシドジスムターゼは、すべて
の酸素代謝細胞に存在する細胞内酵素であり、スーパー
オキシドラジカルの、酸素と過酸化水素への転化の触媒
となることができる。スーパーオキシドラジカル及びそ
こから誘導される種は、各種炎症障害の原因となる物質
であると信じられている。スーパーオキシドジスムター
ゼは、Ｏｒｇｏｔｅｉｎの商標名の下にある種の炎症状
態の治療に用いられている。更に、ＳＯＤを、気管支形
成異常及び高圧酸素毒性、やけど及び感染が原因の急性
炎症、臓器移植の際の再灌流による損傷、水晶体後方の
線維増殖症、イオン化放射線治療の副作用並びにある種
の皮膚生理学上の症状に使用することが研究されてき
た。しかしながら、ＳＯＤを哺乳類に静脈注射で投与す
ると、酵素の半減期は僅か数分であり、循環系から消失
する。その結果、酵素活性は毒性物質を血流から除去す
るのに十分ではない。繰り返し投与すると悪影響を引き
起こす。
【００２８】各種分子量のポリアルキレンオキシド鎖か
らなり、１つの主鎖当り少くとも１個のヒドロキシ基を
含有する低ジオールポリアルキレンオキシド、例えば、
低ジオールポリエチレングリコール（ＬＤＰＥＧ）は、
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）と結合する
と、そのままのＳＯＤ又はＰＡＯ−ＳＯＤ組成物のいず
れよりも、半減期が長くしかも免疫抗原性が少ない、生
物学的活性組成物を生成する。凍結乾燥すると、ＬＤＰ
ＥＧは望ましくない凝集物を形成し、これが生物学的活
性に影響する。シクロデキストリンと複合体を形成する
と凝集物形成が排除されそして元に戻した配合物の寿命
が延びて安定となる。
【００２９】ＬＤＰＥＧのＳＯＤへの結合（以後、ＬＤ
ＰＥＧａｔｉｏｎと称することもある）方法は以下の工
程からなる：約１，０００〜約１５，０００、好ましく
は約２，０００〜１０，０００そして最も好ましくは約
４，０００〜６，０００ドルトンの平均分子量を有し、
約１０％以下の非モノメトキシ化ＰＥＧを含有する低ジ
オールメトキシ−ＰＥＧを、好ましくは無水コハク酸
（ＳＡ）を用いてコハク酸化してＬＤＰＥＧスクシネー
ト（ＬＤＰＥＧ−Ｓ）を生成することにより活性化し、
続いて好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ
Ｓ）を用いる反応エステルの形成によりＬＤＰＥＧ−Ｓ
Ｓを生成し、次にＬＤＰＥＧ−ＳＳをＳＯＤ上の接近可
能な反応性部位、好ましくはＳＯＤ上の第一アミン残
基、主にリジンイプシロンアミンと反応させる。
【００３０】特にＬＤＰＥＧ−ＳＯＤについて具体的に
述べれば、反応工程は以下のようである：
【００３１】
【化１】
【００３２】前記式中、 ＬＤＰＥＧ−ＯＨ＝１０％ｗ／ｗ以下のＨＯ−ＰＥＧ−
ＯＨを含有する低ジオールＣＨ3 Ｏ−ＰＥＧ−ＯＨ、 ＬＤＰＥＧ−ＳＳ＝１０％以下の〔（Ｃ4 Ｈ4 Ｏ2 Ｎ）
ＯＯＣ−ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯ〕2 ＰＥＧを含有する低ジ
オールＣＨ3 Ｏ−ＰＥＧ−ＯＣＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯ
（Ｃ4 Ｈ4 ＮＯ2 ）、 ＬＤＰＥＧ−Ｓ＝１０％以下の〔ＨＯＯＣ−ＣＨ2 ＣＨ
2 −ＣＯＯ〕2 ＰＥＧを含有する低ジオールＣＨ3 Ｏ−
ＰＥＧ−ＯＣＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯＨ、 ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド、 ＳＡ＝無水コハク酸、 ｂＳＯＤ＝ウシスーパーオキシドジスムターゼ、 ＮＨＳ＝（Ｃ4 Ｈ4 ＮＯ2 ）ＯＨ，Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド、 （ＬＤＰＥＧ）n ｂＳＯＤ＝低ジオール（ＣＨ3 Ｏ−Ｐ
ＥＧ−ＯＣＯＣＨ2 ＣＨ 2 ＣＯ）n −ｂＳＯＤ、 （ＬＤＰＥＧ）n-1 ｂＳＯＤ−Ｓ＝低ジオール（ＣＨ3
Ｏ−ＰＥＧ−ＯＣＯＣＨ 2 ＣＨ2 ＣＯ）n-1 −ｂＳＯＤ
−ＣＯＣＨ2 ＣＨ2 ＣＯＯＨ、 ＳＡｃｉｄ＝コハク酸 ｎ＝ＳＯＤ１個当りの低ジオールＰＥＧの数 Ｋ1 ，Ｋobs ，ｋ2 及びｋ3 は反応についての速度定数
である。
【００３３】本発明の配合物に用いる必須成分について
ここで述べる。
【００３４】出発原料、中間体及び試薬 スーパーオキシドジスムターゼ スーパーオキシドジスムターゼとは、スーパーオキシド
アニオンラジカル（Ｏ 2 - ・）の酸素と過酸化水素への
分解反応を触媒する一群の酵素に与えられる名称であ
る。
【００３５】ＳＯＤは、生物化学国際連合の系統的命名
法の下にスーパーオキシド・オキシドレダクターゼとし
て知られており、分類番号は１．１５．１．１である。
このような物質は、スーパーオキシドジスムターゼの他
に、オルゴティン及びヘモクプレインとも呼ばれてお
り、分子量は約４，０００〜約４８，０００の範囲であ
る。銅−亜鉛ジスムターゼは、全体の構造については著
しく一定の構造を有する一群である。例外なく、精製酵
素は、１モル当り銅と亜鉛を各々２モル含有する二量体
（分子量は通常３１，０００〜３３，０００）であるこ
とが判明している。マンガン／鉄群の酵素は、分子量、
サブユニット構造及び金属含有量のような基本的特性に
ついては均質ではない。あるものは二量体であり；他の
ものは四量体である。金属含有量はサブユニットポリペ
プチド鎖１モル当り約０．５〜１モルの範囲である。哺
乳動物並びにその機能競合類縁体及び変異体（ｍｕｔｅ
ｉｎｓ）から得られる天然のＺｎ／Ｃｕ含有酵素は、哺
乳動物のＺｎ／Ｃｕスーパーオキシドジスムターゼ（ｍ
ＳＯＤ）であると考えられる。
【００３６】本発明の配合物において、ｍＳＯＤの由来
は任意のものであってよい。ｍＳＯＤは、ウシ赤血球及
びヒト赤血球を原料として並びに微生物、例えばＥ−コ
リ及びイーストでの組換え合成により市販されている。
他の原料としては、例えば、Ｃｕｐｒｉ−Ｚｉｎｃウシ
肝臓スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ，ＥＣ１．
１５．１．１）がＤＤＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ株式会社（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）から入手できる。
【００３７】ポリエチレングリコール 本発明を実施するに当って、我々は、生物学的活性プロ
テインに結合させるために低ジオールＰＥＧを好んで用
いた。ある分子量を有するメトキシポリエチレングリコ
ールが市販されているが、（例えば、メトキシ−ＰＥＧ
5,000 はＵｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｏｒｐｏｒａ
ｔｉｏｎから２種類入手できる：すなわち、１４〜１７
％の高分子量ＰＥＧジオールを含有する従来から得られ
る高ジオールメトキシ−ＰＥＧ5,000 、及び４％未満の
ＰＥＧジオールを含有する低ジオール生成物）、そのい
くつかは、低免疫性を有するペグエイテッド（ｐｅｇａ
ｔｅｄ）プロテインを生成するように製造精製する必要
がある。例えば、市販原料から誘導されるメトキシ−Ｐ
ＥＧ−ＳＳを用いてＳＯＤをペグエイトすると、先に検
討したサイズ排除クロマトグラフィにより立証されるよ
うに、高分子量の生成物が得られる。この高分子量生成
物は、市販原料のＭ−ＰＥＧに見出される各種量のＰＥ
Ｇジオールから生成する活性化ジエステルによるプロテ
イン架橋から誘導されるものであると信じられている。
個々の活性エステルは、同一のポリマー鎖上に位置する
が、しかし化学的には互いに離れている。したがって、
ポリマー中に第二の反応性官能基が存在すると、２個の
官能基を隔てる距離が増すので、第一の反応性官能基の
反応性に対する影響がますます無視しうるものとなる傾
向がある。このように、個々の反応性は、ポリマー鎖の
反対側の末端に存在する成分とは独立したものである傾
向があり、試薬の無限希釈を行わなければ、架橋を回避
することはできない。したがって、極めて少量のジエス
テルを含むか、好ましくはジエステルを全く含まないこ
とが判明しているＭ−ＰＥＧ−ＳＳを合成することが重
要である。Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ等は、Ｊｏｕｒｎｏｌ
ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｔｉ
ｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｖｏｌ．５，１９９０年４
月，２２７〜２３１頁において、メトキシポリエチレン
グリコール２０００からポリエチレングリコール２００
０を精製することについて述べている。また、コハク酸
エステルを調製しかつＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを用
いるイオン交換クロマトグラフィによる分離も示してい
る。調製法は例３に示す。
【００３８】例４において述べる操作はＰＥＧ−２００
０についてはうまくいくが、高分子量ＰＥＧについては
うまくいかない。分子量がより高いＰＥＧ酸はアニオン
樹脂又はカチオン樹脂と結合しない；ポリエチレン主鎖
の質量が大きくなると懸垂酸のイオン性を妨害すると信
じられている。ＰＥＧコハク酸エステルを結合するため
には、極めてイオン力の低い緩衝液が必要であり、それ
らはイオン力の増加が極めて低い状況で溶出し、それら
が極めて弱く樹脂により保持されていることを示すもの
である。
【００３９】分子量の高いメトキシ−ＰＥＧは、逆相薄
層クロマトグラフィにかける前に、ヒドロキシ官能基が
先ず第一にジメトキシトリチル（ＤＭＴ）エーテルに転
化するならば、ジオール成分から分離することができる
ことが判明した。ヒドロキシルは酸処理により遊離させ
ることができる。メトキシ−ＰＥＧ5000−ジメトキシト
リチル（Ｍ−ＰＥＧ−ＤＭＴ）誘導体の調製法及び精製
法は以下のとおりであるが、詳細は例４〜７に示す。
【００４０】Ｍ−ＰＥＧ−ＤＭＴ及びＤＭＴ−ＰＥＧ−
ＤＭＴは同様の方法で調製する。ポリエーテルをエタノ
ールを含まないクロロホルムに溶解し、次いで大気圧
で、アルゴンのブランケットの下でクロロホルムをほぼ
半分まで留去することにより前記溶液を乾燥した。次に
溶液をアルゴン下で室温まで放冷し、続いて過剰のジイ
ソプロピルエチルアミン（１．５当量）、触媒として１
０モル％の４−ジメチルアミノピリジン、及び最後に過
剰量の４，４−ジメトキシトリチルクロリド（１．２当
量）を添加した。１５時間反応させた後、溶液を回転蒸
発により濃縮し、次いでこの溶液を無水エーテルに添加
してトリチル化ＰＥＧを沈澱させた。正の（ｒｅｇｕｌ
ａｒ）相ＴＬＣは、生成物、Ｄｒａｇｅｎｄｏｒｆ試薬
により着色したＰＥＧ主鎖から出発原料を明確に分離す
る。Ｍ−ＰＥＧ−ＤＭＴは正の相ＴＬＣによりＤＭＴ−
ＰＥＧ−ＤＭＴから分割されないが、逆の相Ｃ−１８Ｔ
ＬＣプレートはＭ−ＰＥＧ−ＤＭＴ，ＤＭＴ−ＰＥＧ−
ＤＭＴ，ＤＭＴクロリド及びＤＭＴアルコールを互いに
明確に分離する（移動相、４：１：１アセトニトリル／
水／イソプロパノール）。ＰＥＧ主鎖はＤｒａｇｅｎｄ
ｏｒｆの橙色に着色することにより確認し、そしてトリ
チル添加はプレートをＨＣｌ蒸気に露らして橙色着色を
示すことにより確認する。
【００４１】真のＭ−ＰＥＧ−ＤＭＴ5000は、Ｗａｔｅ
ｒｓ Ｃ−８，３００オングストローム孔サイズの１５
〜２０ミクロン粒子サイズのＰｒｅｐ−Ｐａｋ Ｂｏｎ
ｄａｐａｋカートリッジを用いて、真のＤＭＴ−ＰＥＧ
−ＤＭＴ８０００から明確に分離することが示された。
粗Ｍ−ＰＥＧ−ＤＭＴは超音波により３０％アセトニト
リル／水に溶解して約１２mg／mL濃度とし、そして２．
５ミクロンフィルターを通過させた。試料を、３０％ア
セトニトリル／水移動相を用いるカラム（２５mLに２
ｇ）に付した。８分間のアイソクラチック溶出後、汚染
ピークが溶出した（２８０nmに高吸収があるが、極めて
低い相対量を占める未知物質）。次に３０〜７０％アセ
トニトリル／水の勾配溶出を開始したところ、所望のＭ
−ＰＥＧ−ＤＭＴが５８〜６０％アセトニトリルで溶出
した。純正のＤＭＴ−ＰＥＧ−ＤＭＴは典型的に８０％
アセトニトリルで溶出する。所望ピークの最初の３／４
を収集し、後の１／４を棄捨した。この方法でＭ−ＰＥ
Ｇ−ＤＭＴ１５．４ｇを粗Ｍ−ＰＥＧ−ＤＭＴ２２．６
ｇから精製した。
【００４２】Ｍ−ＰＥＧ−ＤＭＴのトリチル開裂は以下
のとおりである：ＨＣｌを用いるＭ−ＰＥＧ−ＤＭＴか
らのＤＭＴ基の除去は、ＴＬＣ（粗非希釈反応混合物）
によるトリチル基の完全除去により行われた。しかしな
がらクロロホルム抽出物の濃度により逆反応がおこり、
その結果ＰＥＧの大部分が再トリチル化された。選択沈
澱によりこれを精製するのは不可能であった。水和化ト
リチルカチオン及び塩化物は明らかに平衡状態にあり、
その結果溶剤除去の際起こるような脱水和が有意量のＤ
ＭＴクロリドを生成する。この再トリチル化は非平衡対
イオンを用いることにより阻止できるかもしれない。硫
酸は不可逆的にＭ−ＰＥＧ−ＤＭＴの脱トリチルを行う
ことが判明した。硫酸開裂Ｍ−ＰＥＧをクロロホルムで
抽出し、濃縮し次いでエーテル中に沈澱させると精製ゼ
ロジオールＭ−ＰＥＧが得られる。この方法で、Ｍ−Ｐ
ＥＧ−ＤＭＴ１０ｇが開裂してゼロジオールＭ−ＰＥＧ
８．６８ｇが得られた。サイズ排除クロマトグラフィに
よるとこの物質は０．３％未満のジオールを含有した。
【００４３】他の、分子量がより高いメトキシ−ＰＥＧ
誘導体は同様の方法により調製することができる。以下
の例は、低ジオールＰＥＧ／プロテイン性接合体を調製
してシクロデキストリンとの複合体を形成することにつ
いて説明するのに役立つであろう。
【００４４】例１ Ａ．メトキシポリエチレングリコールスクシネート（Ｍ
−ＰＥＧ−Ｓ） ２リットルフラスコ中で、メトキシ−ＰＥＧ5,000 （Ｍ
−ＰＥＧ）１００ｇ（０．０２モル）を温（４０℃）無
水トルエン３００mLに撹拌しながら溶解した。窒素雰囲
気下でトルエン１４７mLを共沸除去して容量を減じ、ｍ
−ＰＥＧの水含有量を１．７３から０．２３％まで減じ
た。周囲温度まで冷却後、乾燥塩化メチレン２３３mL、
続いて無水コハク酸３．０ｇ（０．０９モル）及び４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）１．１ｇ（０．０
１モル）を添加した。反応物を撹拌し次いで一晩還流加
熱し、次いで塩化メチレン２００mLを減圧除去した。残
渣を撹拌しながら４リットルフラスコ中のエーテル１．
６リットルに添加した。これを４５分間撹拌し次いでろ
過した。フィルターケーキをエーテル７０mLで洗浄し次
いで減圧乾燥して粗ｍ−ＰＥＧ−スクシネート（ｍ−Ｐ
ＥＧ−Ｓ）１００．４ｇをＤＭＡＰ含有白色固体として
得た。
【００４５】粗Ｍ−ＰＥＧ−Ｓ（１００ｇ）を塩化メチ
レン６３３mLに溶解し、ジオキサン２７２mL続いて乾燥
塩化メチレン３１６mLで予め洗浄したＤｏｗｅｘ ５０
ｘ８−１００Ｈ＋樹脂１１４ｇを含むカラムを通過させ
た。カラムを次に更に３１６mLの塩化メチレンで洗浄
し、そして溶出液を合せ次いで無水硫酸マグネシウムで
乾燥した。塩化メチレン（８００mL）を減圧除去した。
残りの溶液を撹拌しながらフラスコ４０００mL中のエー
テル１６００mLに添加した。３０分間撹拌後、懸濁液を
３０分間放置し次にろ過した。フィルターケーキを次に
エーテル７５mLで洗浄し次いで減圧乾燥した。これによ
りｍ−ＰＥＧ−Ｓ９６．０ｇ（９４％収率）が白色固体
として得られ、この固体のプロトンＮＭＲスペクトルは
所定構造と一致した： 1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：
４．２７（三重，２Ｈ，−ＣＨ 2 −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）
−），３．６８（大きい一重オフスケール，ＰＥＧメチ
レンＯ−ＣＨ 2 −），３．３９（一重，３Ｈ，ＯＣ
Ｈ 3 ）、及び２．６５ppm （狭い多重，４Ｈ，−Ｃ（＝
Ｏ）−ＣＨ 2 −ＣＨ 2 −Ｃ（＝Ｏ）−）。カルボン酸含
有量０，０００２０７mol ／ｇを滴定により測定した。
【００４６】Ｂ．メトキシポリエチレングリコールＮ−
スクシンイミジルスクシネート（Ｍ−ＰＥＧ−ＳＳ） ２，０００mLのフラスコで、メトキシポリエチレングリ
コールスクシネート（ｍ−ＰＥＧ−Ｓ）９８．４８ｇ
（０．０１９２モル）を４０℃まで温めながら乾燥トル
エン４６８mL中に溶解した。溶液をろ過し次いで容量を
窒素下の共沸蒸留により２６３mLだけ減じた。得られた
粘稠液を乾燥塩化メチレン２２５mLを用いて窒素下で
１，０００mLの三ツ口フラスコに移した。これにＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド２．２２ｇ（０．０１９２モ
ル）を添加し、反応物をＮ−ヒドロキシスクシンイミド
が溶解するまで撹拌した。反応混合物を次に氷浴で５℃
まで冷却し、塩化メチレン２４mLに溶解して調製したジ
シクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）４．４４ｇ
（０．０１２５モル）を５分間かけて滴加した。塩化メ
チレン／ＤＣＣ溶液の添加中に、ジシクロヘキシル尿素
（ＤＣＵ）が反応混合物から結晶しはじめた。反応物を
放置して室温まで温め次いで一晩撹拌した。フラスコの
すすぎ洗いのための塩化メチレンを２５mL用いて反応フ
ラスコの内容物を２，０００mLのフラスコに移した。３
０℃減圧下で、塩化メチレン２５０mLを除去し、懸濁液
をろ過し次いでフィルターケーキを乾燥トルエン２５mL
で洗浄した。ろ液を次に撹拌しながら無水エーテル１，
２００mLに添加し、次いで得られた懸濁液を４５分間撹
拌してからろ過した。フィルターケーキを乾燥エーテル
１００mLですすぎ洗いし次いで２時間ラテックスゴム状
ダム（ｒｕｂｂｅｒ ｄａｍ）の下で乾燥した。得られ
た固体を次に高真空下で乾燥し次いでアルゴン下のグロ
ーブバッグ中のボトルに移した。これにより、標題化合
物（ｍ−ＰＥＧ−ＳＳ）９６．１３ｇ（９６．１％収
率）を白色固体として得、この固体は所定構造と一致し
た。プロトンＮＭＲスペクトルを示した。 1Ｈ−ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3 ）：４．３２（三重，２Ｈ，−ＣＨ 2 −Ｏ
−Ｃ（＝Ｏ）−），３．６８（大きな一重オフスケー
ル，ＰＥＧメチレンＯ−ＣＨ 2 −），３．３９（一重，
３Ｈ，ＯＣＨ 3 ），２．９９及び２．８０（三重対、各
２Ｈ、スクシネート−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ 2ＣＨ 2 −Ｃ
（＝Ｏ）−）、及び２．８５ppm （一重，４Ｈ，スクシ
ンイミド−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ 2 ＣＨ 2 −Ｃ（＝Ｏ）
−）。生成物の活性エステル含有量をトルエン中の過剰
なベンジルアミンとの反応、それに続くジオキサン中の
過塩素酸によるメチルレッド終点までの逆滴定により測
定し、０，０００１８２モル／ｇであることが判明し
た。
【００４７】Ｃ．低ジオールＰＥＧ−ＳＯＤ １ｇ当り８２．１mgのプロテインを含有するＳＯＤ水溶
液１１．８ｇをpH７．８の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液を用いて全量２００ｇまで希釈した。磁気撹拌し次
いで３０℃まで加熱した前記溶液に、例１Ｂで調製した
低ジオールメトキシＰＥＧ−ＳＳ３．４ｇを添加した。
反応混合物のpHを、必要に応じて０．５Ｎの水酸化ナト
リウム溶液を添加するようにpH設定モードをプログラム
してあるＭｅｔｔｌｅｒ ＤＬ２５滴定器を用いて７．
８に保持した。１時間後、反応混合物を０．２ミクロン
低プロテイン結合ポリスルホンフィルターを介してろ過
し、３０，０００ＮＭＷＬ膜４pkを備えたステンレスス
チールＭｉｌｌｉｐｏｒｅＭｉｎｉ−ｔａｎ装置を用い
て約６０mLまで濃縮し、次にpH６．２〜６．３で５０mM
リン酸ナトリウム緩衝化サリーン（０．８５％）２リッ
トルを用いるダイアろ過にかけた。低ジオールＰＥＧ−
ＳＯＤを含有する残留溶液を次に０．２ミクロンフィル
ターを介してろ過した。
【００４８】例２ Ａ．モノメトキシポリエチレングリコールスクシネート １２リットルの三ツ口フラスコに、窒素下で予め７０℃
まで温めたトルエン４リットル及びメトキシポリエチレ
ングリコール２２１２ｇを投入した。減圧下でトルエン
１．３リットルを共沸除去することにより容量を減じ
た。３０℃まで冷却後、塩化メチレン４リットル、続い
て無水コハク酸６６．４ｇ及び４−ジメチルアミノピリ
ジン２４．４ｇを添加した。反応物を３２時間還流し次
に塩化メチレン３．８リットルを大気圧下で除去した。
反応物を冷却し次いで撹拌しながらメチルｔｅｒｔ−ブ
チルエーテル２８リットルを含有する５ガロンのガラス
製容器中に注入した。得られた懸濁液を１時間撹拌し次
いでＬａｐｐフィルター上に収集した。このフイルター
ケーキを１リットルのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
で洗浄した。一晩かけて室温真空下で乾燥して白色の未
精製固体として標題化合物２．２５２kgを得た。
【００４９】未精製標題化合物を塩化メチレン８リット
ル中に溶解し次いでアセトン５リットル続いて塩化メチ
レン４リットルで予め洗浄したＤｏｗｅｘ ５０Ｗ−Ｘ
８樹脂（カチオン交換、水素形）３．０kgを含有するガ
ラス製圧力カラムを通過させた。次にカラムを塩化メチ
レン３リットルで洗浄した。カラム溶出液を合せ次いで
塩化メチレン１０リットルを大気圧下で除去した。残留
溶液を撹拌しながらメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル２
６リットル中に注入した。得られた懸濁液を４５分間撹
拌し次いで固体をろ別した。これをメチルｔｅｒｔ−ブ
チルエーテル３リットルで洗浄した。室温真空炉中で乾
燥して白色固体の標題化合物２．４６kg（９５％収率）
を得た。この物質は１．５％メトキシポリエチレングリ
コールを含有し、２．７２×１０-4モル／ｇ（理論値は
１．９６×１０-4モル／ｇ）と分析された。
【００５０】Ｂ．メトキシポリエチレングリコールＮ−
スクシンイミジルスクシネート 窒素下の１２リットルフラスコ中で、モノメトキシポリ
エチレングリコールスクシネート１．５kgを温めながら
トルエン７．２リットルに溶解した。減圧下で水を除去
して２．８リットルだけ容量を減じた。得られた粘稠液
を４０〜４５℃まで冷却し次いで塩化メチレン３．４リ
ットル続いてＮ−ヒドロキシスクシンイミド３３．８９
ｇを添加した。すべてのＮ−ヒドロキシスクシンイミド
が溶解するまで反応物を１時間撹拌し、次に反応物を１
０℃まで冷却し、次いで６７．７５ｇの１，３−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の塩化メチレン溶
液（３６８mL）を３０分間かけて滴加した。反応物を１
８時間撹拌しながら徐々に室温まで温めた。次に容量を
大気圧下で３．２リットルだけ減じた。懸濁液を０〜５
℃まで冷却し次いで３０分間撹拌した。これをろ過し次
いでこのフィルターケーキをトルエン２５０mLで洗浄し
た。ろ液と洗浄液を撹拌しながらメチルｔｅｒｔ−ブチ
ルエーテル２８リットルに添加した。得られた懸濁液を
４５分間撹拌し次にＬａｐｐフィルター上でろ過した。
フィルターケーキをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル１
リットルで洗浄し次いで４時間ラテックスダム下で乾燥
した。更に室温、減圧下の真空炉で一晩乾燥したところ
白色固体１．５kg（１００％収率）を得た。この物質は
１．７９×１０-4モル／ｇ（理論値は１．９２×１０-4
モル／ｇ）と分析された。
【００５１】Ｃ．メトキシポリエチレングリコールスク
シノイル ウシ スーパーオキシドジスムターゼ pH電極を備えた４２リットルの反応器中のpH７．８の温
（２９〜３０℃）リン酸塩緩衝液３２リットルにウシ赤
血球スーパーオキシドジスムターゼ１９４．０ｇを添加
した。容量を３９．５リットルに調整し次いで反応物を
２９℃まで温めた。pH滴定器の水酸化ナトリウム管を溶
液面の真上の反応器の中心上に調整した。pH滴定器を作
動させはじめてpHを０．５Ｎの水酸化ナトリウムで７．
８に調整した。ここでメトキシポリエチレングリコール
Ｎ−スクシンイミジルスクシネート６１４．７ｇを２分
間かけて添加し次いで反応物を４１分間撹拌しその間反
応温度を３０℃に保持しながら０．５Ｎの水酸化ナトリ
ウムでpHを７．８に調整した。次に反応物を２００Ｍｉ
ｌｌｉｐａｋフィルターを介してろ過し次いでＭｉｌｌ
ｉｐｏｒｅステンレススチールＰｅｌｌｉｃｏｎダイア
フィルター装置を用いて濃縮した。反応器を次にpH６．
２のリン酸塩緩衝液６００mLを用いてリンスした。リン
ス液をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ２００フィルター及びダイア
フィルター装置を介してろ過した後の濃縮物に添加し
た。濃縮物の最終容量は約９リットルであった。次に
２．１７時間かけてpH６．２のリン酸塩緩衝液２００リ
ットルに対するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ
ダイアフィルター装置を用いて濃縮物をダイアフィルタ
ーにかけた。ダイアフィルター装置をpH６．２のリン酸
塩緩衝液１．５リットルでリンスした。濃縮物の最終容
量は約８リットルであった。次に濃縮物をインラインの
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ２００ Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルタ
ーを介して清浄な５ガロンのガラス製カルボイに移し、
フィルターをpH６．２のリン酸塩緩衝液５００mLでリン
スした。こうして明澄な緑青色溶液として標題化合物
（活性：３２，９６０単位／mL）１１．９８kg（９１．
４％収率）が得られた。
【００５２】例３ Ａ．部分カルボキシメチル化ポリエチレンオキシドの調
製 ポリエチレンオキシド、Ｍｗ2000（Ｆｌｕｋａ，２５
ｇ，２５ミリ当量ＯＨ）をトルエン（１２０mL）に溶解
し、次いでＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップ装置にそれ以
上の水がトラップされなくなるまで共沸乾燥した（約２
５mLのトルエンが除去された）。溶液を５０℃まで冷却
し次いでカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．７ｇ，１
５mmol）で処理した。溶液を還流し更に溶剤を留去した
（約２５mL）。撹拌反応混合物を２５℃とし、次いで一
晩エチルブロモアセテート（３．４mL，１６mmol）で処
理した。沈澱した塩を重力ろ過により取出し、次いで塩
化メチレン（３０mL）で洗浄した。ろ液を部分濃縮（約
６０mLまで）し、次いで濃縮溶液をエチルエーテル（３
００mL）中に５０℃で激しく撹拌しながら徐々に注入す
ることによりポリマーを回収した。収集した白色ポリマ
ー粉末を真空乾燥した。収量：２４ｇ；ＩＲ（ｎｅａ
ｔ）は１７５３cm-1にエステルに基づく特性吸収を示し
た。このポリマーを１ＮのＮａＯＨ（５０mL）に溶解
し、次いでＮａＣｌ（１０ｇ）を添加した。約４５分
後、この溶液を６ＮのＨＣｌを用いて酸性化してpH３．
０とし、次いで塩化メチレン（３×６０mL）で抽出し
た。合せた有機相を乾燥（ＭｇＳＯ4 ）し、濃縮し（約
５０mLまで）、次いで冷撹拌エーテル（３００mL）に注
入した。沈澱生成物をろ過収集し次いで真空乾燥した。
収量：２２ｇ；ＩＲ（ｎｅａｔ）は１７３０cm-1に吸収
を示し、この吸収はω−カルボキシ基に対応する。
【００５３】Ｂ．ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘを用いる
部分カルボキシメチル化ＰＥＯの分離による精製α−ヒ
ドロキシ−ω−カルボキシメチルポリエチレンオキシド
の調製 同種−及び異種二官能性ＰＥＯの混合物（２２ｇ）を水
（４０mL）に溶解し、次いでテトラボレート形のＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５（Ｓｉｇｍａ，２７
ｇ，０．１モルイオン交換部位）を含有するカラムにか
けた。非誘導体化ポリマーを含有する第一画分を脱イオ
ン水で溶出した。溶出液がＰＡＡ試験について陰性にな
ったら、重炭酸アンモニウムの段階的イオン勾配液（各
１００mL毎に１〜２mMずつ増加して６〜２２mMまで）を
施し、画分収集（約４０mLずつ）を開始した。画分２−
２１はＰＡＡ試験に対して陽性であり、純粋なモノカル
ボキシル化ＰＥＯ（Ｒ1 ＝０．４９）を含有した。続く
３つの画分はＰＥＯを含有しなかったが、画分２５〜３
６は純粋なＰＥＯ−二酸（Ｒ1 ＝０．２６）を含有し
た。α−ヒドロキシ−ω−カルボキシメチルポリエチレ
ンオキシドを含有する画分を合せ次いで濃縮（約１００
mLまで）した。塩化ナトリウム（３５ｇ）をこの溶液に
溶解し、次にpH３まで酸性化し次いで塩化メチレン（３
×１００mL）で抽出した。合せたＣＨ2 Ｃｌ2 溶液を乾
燥（ＭｇＳＯ4 ）し、濃縮（約１００mLまで）し、次い
で徐々に冷撹拌エーテル（５００mL）に注入した。沈澱
ポリマーを収集し次いで十分に真空乾燥して生成物８．
８ｇを得た。13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：δ１７２．
７（ＣＯＯＨ）；７２．４（ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨ）；７
０．４（ＰＥＯ）；６９．０（ＣＨ2 ＣＯＯＨ）；６
１．３（ＣＨ2 ＯＨ）ppm 。
【００５４】カラムから単離したビス−カルボキシメチ
ルポリエチレンオキシドもまた分析した。13Ｃ−ＮＭＲ
（ＣＤＣｌ3 ）：δ１７２．４（ＣＯＯＨ）；７０．４
（ＰＥＯ）；６８．８（ＣＨ2 ＣＯＯＨ）ppm 。
【００５５】例４ ジメトキシトリチルメトキシポリエチレングリコールの
合成 メトキシポリエチレングリコール（５，０００ドルトン
平均分子量；３６．３ｇ，７．２６mmol）をクロロホル
ム５００mLに溶解し、続いてクロロホルム２５０mLを蒸
留除去して水を除去した。乾燥管をフラスコに接続し次
いで溶液を約５０℃まで放冷した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルエチルアミン（１．８mL，１０．３mmol）、続いて
４−ジメチルアミノピリジン（１００mg，０．８mmol，
１０mol％）及び４，４−ジメトキシトリチルクロライ
ド（９８％）２．９ｇを添加した。
【００５６】得られた混合物を一晩室温で撹拌し、この
間溶剤を回転蒸発器を用い６０℃で除去した。残渣を少
量のクロロホルムに取り出し、次いでＭ−ＰＥＧ−ＤＭ
Ｔを無水エーテル２リットルに添加することにより沈澱
させた。沈澱物を収集し、乾燥し次いで２０分間に亘り
３０〜９５％アセトニトリル勾配液（水に対して）を用
いるＷａｔｅｒｓ ＬＣ４０００方式のＣ−８ ３００
Ａ逆相予備カラムのクロマトグラフィにかけた。所望生
成物を５８〜６０％アセトニトリルで溶出した。３０％
アセトニトリル／水２０mL中の試料（２ｇ）をカラムに
５０mL／分流速で施した。大きな不純物ピークが溶出さ
れるまで、典型的に３〜５分、ｍｖ２８０μｍまでアイ
ソクラチックにこの溶出（３０％アセトニトリル／水）
を続けた。この第１ピーク溶出の後、勾配溶出を開始し
た。次の溶出ピークは所望のメトキシ−ＰＥＧ−ＤＭＴ
５０００であった。このピークの最初の３／４を収集
し、ピークの最後部は棄捨した。
【００５７】この方法で、２２．６ｇの粗Ｍ−ＰＥＧ−
ＤＭＴ５０００を２ｇずつ精製して標題生成物１５．４
４ｇを得た。
【００５８】例５ ジメトキシトリチルメトキシポリエチレングリコールか
らのゼロジオールメトキシポリエチレングリコールの合
成 １０ｇのＭ−ＰＥＧ−ＤＭＴ５０００を５００mLフラス
コに入れ、３２０mLのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した。硫
酸を緩流として添加（８０mL）して濃度を２０％とし
た。溶液は赤色かつ均一となった。一晩撹拌後、酸性溶
液をクロロホルム２×５００mLで抽出し、合せた抽出液
をＭｇＳＯ4 で乾燥し、濃縮し、次いで得られた赤色オ
イルを細流として無水エーテル２リットル中に２０℃で
注入した。沈澱を２４時間静置した。これをコースフリ
ット焼結ガラスロートに収集し、次に無水エーテル２×
２００mLで洗浄した。沈澱ケーキを細砕して真空乾燥し
てメトキシ−ＰＥＧ５０００（ゼロジオール）８．６８
ｇを得た。
【００５９】例６ ゼロジオールメトキシポリエチレングリコールからのゼ
ロジオールメトキシポリエチレングリコールスクシネー
トの合成 Ｍ−ＰＥＧ−ＯＨ５０００ゼロジオール（４．７ｇ，
０．９４mmol）をトルエン１００mLに溶解した。溶液を
還流し次いでＤｅａｎ−Ｓｔａｒｋトラップを用いて水
を除去した。１時間還流後、全部で８０mLのトルエンを
留去し、次いで２０mLのトルエンを含む容器をアルゴン
の正圧力下で冷却した。無水コハク酸を添加し（１１０
mg，１．１mmol）、続いて４−ジメチルアミノピリジン
（１３７mg，１．１２mmol）を添加した。無水コハク酸
が溶解しなかったので、無水のエタノール非含有クロロ
ホルム１０mLを添加し、得られた溶液を、炉乾燥コンデ
ンサーを用いて還流した。１５時間還流した後、溶液を
冷却し次に１０ｇのカチオン交換樹脂と共に撹拌し、ろ
過し次いでろ液を濃縮して標題化合物を得た。
【００６０】例７ ゼロジオールメトキシポリエチレングリコールスクシネ
ートからのゼロジオールメトキシポリエチレングリコー
ルスクシンイミジルスクシネートの合成 トルエン１００mLに溶解して調製した例７のＭ−ＰＥＧ
−スクシネート（４．１５ｇ，０．８３mmol）の溶液を
共沸乾燥した。トルエン部分を留去し（６０mL，反応フ
ラスコに４０mLを残す）次いでＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（１００mg，０．８７mmol）を添加し、続いてエ
タノール非含有無水クロロホルム３０mLを注意深く添加
した。更に２５mLの混合溶剤を留去し次いで溶液を室
温、アルゴン下で放冷した。ＤＣＣを添加し（２００m
g，９．７mmol）次いで溶液を撹拌した。１０分後、Ｄ
ＣＵが結晶しはじめた。２日間撹拌後、更に２５mg
（０．２２mmol）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添
加した。ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）スラリーをろ
過し次いで沈澱をトルエンで洗浄した。ろ液を回転蒸発
器で濃縮してジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）の沈澱を
更に得た。ろ過濃縮物を１リットルの無水エーテルに滴
加した。沈澱をＷｈａｔｍａｎの９cm６Ｆ／Ｆガラス繊
維フィルターを用いて収集し次に高真空下で１５時間乾
燥してＭ−ＰＥＧ−ＳＳ３．３７ｇを得た。
【００６１】活性エステル含有量：１．７１×１０-4mo
l ／ｇ；ＨＰＬＣは１．３％Ｍ−ＰＥＧ−Ｓを示した；
他の不純物：１．２％；ＤＣＵは検出されなかった；全
不純物：３％。
【００６２】例８ ゼロジオールＰＥＧ−ＳＯＤの合成 スーパーオキシドジスムターゼ（７５mg／mL貯蔵液１．
３３mL）を反応緩衝液１８．６７mLに添加し（１００mM
のリン酸ナトリウム．pH７．８）次いで得られた溶液を
３０℃とした。例８からのＭ−ＰＥＧ−ＳＳ（３００m
g）を一度に添加し次いでpHをpHセットを用いて７．８
に保持した。２８分後、反応物pHは不変となり次いで試
料を１０，０００カットオフのＣｅｎｔｒｉｕｍ遠心膜
を用いて濃縮した。濃縮試料を、１ＭのＨＣｌでpH６．
２に調整しておいたＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳを用いて
この方法で交換した。全部で６０mLの交換を５回行っ
た。サイズ排除ＨＰＬＣは無視しうる高さのＭＷピーク
を示し、このピークは標題化合物が無視しうる量のジオ
ール由来物質（すなわち、″ゼロジオール）を含有して
いることを示すものである。
【００６３】以下の例は、ＰＥＧに共有結合する他の生
物学的活性プロテインの調製について説明する。
【００６４】例９ 低ジオールメトキシポリエチレングリコール−スクシノ
イル−カタラーゼの合成 １mL当り２４．０mgのプロテインを含有するカタラーゼ
の水性懸濁液４．１７mLを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液（pH７．８）１５．８４mLを用いて希釈した。磁気
撹拌しかつ３０℃に加熱したこの溶液に低ジオールメト
キシＰＥＧ−ＳＳ５５０mgを添加した。反応混合物のpH
を、必要に応じて０．５規定の水酸化ナトリウム溶液を
添加するようなpHセットモードにプログラムされたＭｅ
ｔｔｌｅｒ ＤＬ２５を用いて７．８に保持した。０．
５時間後、反応混合物を０．４５ミクロンの低プロテイ
ン結合ポリスルホンフィルターを介してろ過し次いで２
つのＡｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ３０ Ｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（３０Ｋ ＮＭＷＬ膜）に置き
次いで緩衝液を数回ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳと交換し
た。低ジオールＰＥＧ−カタラーゼ含有保持溶液を次に
０．２ミクロンフィルターを介してろ過した。接合体形
成がＳＥＨＰＬＣ及びゲル電気泳動により立証された。
【００６５】例１０ 低ジオールＰＥＧ−オバルブミンの合成 オバルブミン（Ｓｉｇｍａ）５０３mgを、０．２５Ｍ，
pH７．８のリン酸塩緩衝液５０ｇに室温でテフロン被覆
磁気撹拌棒を備えたポリエチレンビーカ中で溶解した。
１５分間の撹拌後、低ジオールＭ−ＰＥＧ（５，００
０）−ＳＳ１．９００ｇを全部一度に添加した。反応混
合物のpHを、必要に応じて０．５ＮのＮａＯＨを添加す
るＭｅｔｔｌｅｒ ＤＬ２５pHセットを用いて７．８に
調整した。反応物を１時間室温に引続き放置し、次に反
応混合物を、４℃の冷蔵庫内で一晩アルゴン２５psi の
下で作動する撹拌セル装置を用いるＡｍｉｃｏｎ ＹＭ
３０膜を介してダイアフィルターにかけた。８００mLの
緩衝液をダイアフィルターにかけた後、生成物を限外ろ
過で濃縮し、０．５ミクロンポリスルホンフィルターを
介してろ過し、次いで殺菌ガラスバイアル中に貯蔵し
て、プロテイン含有量１０．５mg／mLの溶液４４．３ｇ
を得た。プロテイン改質度は、リジンアミンの滴定分析
により７１．４％と測定された。
【００６６】例１１ 低ジオールｍＰＥＧ5K−Ｓ−オバルブミンの合成 ０．２５Ｍのリン酸塩緩衝液（pH７．４）中の１０mg／
mLのオバルブミン冷溶液（Ｓｉｇｍａ，第VI等級）１０
mLを、低ジオールｍＰＥＧ5K−ＳＳ ３８２mgに添加し
５℃で１６時間撹拌した。生成物を、交換緩衝液として
ＤｕｌｂｅｌｃｏのＰＢＳを用いるＣｅｎｔｒｉｐｒｅ
ｐ ３０ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ａｍｉｃｏ，３
０Ｋ ＮＭＷＬ膜）で精製した。精製溶液を０．２μｍ
フィルターを介してろ過して、７４％改質（ＴＮＢＳ滴
定法）プロテイン１３．８mg／mLを含有するものを６．
５３９ｇ得た。
【００６７】同様にして、オバルブミン１００mgを２８
３ｇの低ジオールｍＰＥＧ5K−ＳＳと反応させて、７４
％改質プロテインを１３．８mg／mL含有するもの５．７
０４ｇを得た。
【００６８】例１２ 低ジオールｍＰＥＧ5K−Ｓ−ｒｈｕ−ＩＬ4 の合成 ｒｈｕ−ＩＬ４（Ｉｍｍｕｎｅｘ）の５．２６mg／mL溶
液１９０μＬを０．１Ｍのボレート緩衝液（pH８．５）
７７２μＬで希釈した。ｒｈｕ−ＩＬ４溶液を次にＤＭ
Ｆ中の低ジオールメトキシＰＥＧ−ＳＳの３４mg／mL溶
液２９．２μＬで処理した。室温で１時間２０分後、反
応混合物を遠心分離にかけ次いで予備ＳＥＨＰＬＣカラ
ムに直接射出した。精製接合体は実質的にゲル電気泳動
で単一バンドであることが判明した。
【００６９】例１３ 低ジオールｍＰＥＧ5K−Ｓ−ＮＴの合成 ０．２５Ｍリン酸塩緩衝液（pH７．８）２．１７５mL中
にニューロテンシン（ＮＴ）（ＢａＣｈｅｍ）８．７mg
を含有する溶液を、低ジオールｍＰＥＧ5K−ＳＳ １７
４mgに添加した。この反応混合物を室温で１．７５時間
保持し、次に冷凍した。純粋なモノ−ｍＰＥＧ5K−Ｓ−
ＮＴを、水／アセトニトル勾配液で溶出するＣ−８カラ
ムを用いる予備逆相ＨＰＬＣによりＮＴ−ＰＥＧ8K−Ｎ
Ｔから分離して得た。
【００７０】本発明配合物は、当業者に知られている通
常の技法を用いて調製する。場合により、配合物はサッ
カロース又はトレハロースを含有してもよい。具体的配
合物を第Ｉ表に説明する。
【００７１】
【表１】
【００７２】
【表２】
【００７３】本発明配合物は以下の方法により凍結乾燥
する。所望寸法のバイアルを選んで、投与要件に基づい
た配合物を充填した。投与量に合ったバイアルを選択す
るに当っては、充填容量はバイアルの直径を越えるべき
ではない。例えば、５mLの充填物を１０mL未満のバイア
ル中に導入すべきではない。充填後、バイアルを乾燥室
に置き次いで４℃に予め冷却した冷蔵庫棚上に直接載置
した。熱電対を数多くのバイアル内にセットして凍結乾
燥工程の配合物温度をモニターした。次にバイアルを棚
温度（４℃）と平衡に保ちその後棚温度を−４０℃まで
低下させた。−４０℃にいったん到達したら、バイアル
をこの温度に約６時間保持して配合物を完全に凍結す
る。この期間経過後、コンデンサーコイルを−８０℃ま
で冷却し、次いで真空ポンプをまわしてコンデンサー室
の脱気を行い、続いて第一乾燥及び第二乾燥工程を行
う。第一乾燥工程では、コンデンサと乾燥空間の主バル
ブを開け、乾燥室を窒素気体ブリードを用いて約１００
ミクロンの圧力まで脱気する。１００ミクロンの圧力に
達すると、棚温度を−２０℃まで上昇させて昇華工程を
開始する。凍結乾燥サイクルのこの部分は約１０〜１８
時間を要する。この第１乾燥工程は、すべての氷が凍結
マトリックスから消失し、熱電対温度が−２０℃に達し
た時点で完了する。第２乾燥工程では、温度を−２０℃
から＋２５℃で上昇させて、凍結乾燥工程中に除去され
なかったすべての氷を除去する。この除去に約４〜８時
間要した。
【００７４】第２乾燥工程終了後、主バルブを閉じ次い
で室内を僅かな真空に保つように乾燥室を窒素で充填す
る。次にストッパリングラムを作動させてクロジャーを
バイアル中に押下げた。乾燥室を次に大気圧と平衡に保
ち次いで室のドアを開いてバイアルを取出し次いでクリ
ンプシールをはめる。次にバイアルを、注射するために
水で再生するまで所定温度で貯蔵する。
【００７５】本発明配合物の貯蔵寿命は優れていること
が判明した。貯蔵寿命は、配合物の視覚上の外観を観察
するための再生溶液及び例７４及び７５に示した配合物
に含まれる材料の％高分子量（ＨＭＷ）を測定するため
のサイズ排除高性能液体クロマトグラフィ（ＳＥＨＰＬ
Ｃ）を用いる以下の比較研究により示される。本発明に
よる配合物Ａは１０％のＨＰＣＤを含有した。
【００７６】比較のための配合物Ｂは１０％のサッカロ
ースを含有するが、ＨＰＣＤは含有しなかった。両配合
物は、pH６．２の１０mMリン酸塩緩衝液及び７５，００
０Ｕ／mLのＰＥＧ ＳＯＤを含有した。バイアルの充填
容量は０．５mLであった；温度条件は４℃，２２℃，３
０℃及び５０℃であった；両配合物を凍結乾燥し、上記
温度に３０ヶ月保持し、次に再生して試験した。
【００７７】例７４ 再生配合物の外観 配合物Ａ 外 観 配合物Ａ 外 観 ４℃ 明澄、青緑色 ４℃ 明澄、青緑色 ２２℃ 明澄、青緑色 ２２℃ 明澄、青緑色 ３０℃ 明澄、青緑色 ３０℃ 明澄、青緑色 ５０℃ 明澄、青緑色 ５０℃ 不透明、黄褐色ＳＥＨＰＬを用いるＨＭＷ測定 Ｓｈｏｄｅｘ ＷＳ−８０３Ｆカラム（０．８×３０c
m）を０．１Ｍリン酸塩緩衝液、pH６．５，０．１５Ｍ
塩化ナトリウム、１mL／分流速で平衡化することにより
ＳＥＨＰＬＣを実施し、次いで２８０nmに設定した検出
器を介してポンプで引いた。このカラムは、その分画範
囲及び排除限界（１ミリオンＭＷより大きい）に基づく
分子量の差異を分解分析することができる。これらの条
件下では、高分子量材料は低分子量材料（塩及び小分子
量成分）より前に溶出する。検出器は、多くのパラメー
ターに基づくピークを積分し、パーセントベースに基づ
くピーク量を定量するようにプログラムされた計算器に
連結される。
【００７８】例７５に示された％ＨＭＷ種は貯蔵の際の
ポリペプチド凝集の程度の目安である。例７５もまた″
遊離Ｐｅｇ″（スクシネートエステル結合の加水分解度
の指標である）及び％酵素活性をも示す。
【００７９】例７５ 各種温度1 で２ヶ月及び１０ヶ月貯蔵した場合の、１０
％ショ糖又は１０％ＨＰβＣＤ含有凍結乾燥ＰＥＧ−Ｓ
ＯＤ配合物についての安定性
【００８０】
【表３】
【００８１】１．再生前の凍結乾燥ケーキの視覚試験に
よれば、５０℃サッカロース配合物が脱色したことを示
している。 ２．ＨＭＷは、ポリペプチド凝集物のような不純物を表
し、対照条件からの％差異として表される（時間）。 ３．遊離ＰＥＧは、スクシニルエステル結合の加水分解
を表し、対照条件からの％差異として表される（時
間）。 ４．初期値の％として表される。
【００８２】例７５のデータからわかるように、ＨＰβ
ＣＤ配合物は３０℃での貯蔵において優れた安定性を立
証する。酵素活性については貯蔵１０ヶ月後でさえも有
意の変化は認められず、満足すべき酵素の安定性が保持
されていることを示すものである。安定性としてのＨＰ
βＣＤの著しい優越性は、５０℃貯蔵におけるショ糖
（サッカロース）とＨＰβＣＤ配合物間の％ＨＭＷ値を
比較すると明らかである：５０℃で１０ヶ月間熱を加え
た後のＨＰβＣＤについての％ＨＭＷ値は、同一条件下
でサッカロース配合物についての＞５０と比較して僅か
に４．８であった。高温貯蔵下でさえＨＰβＣＤについ
ては劇的な安定性が得られることは、プロトン相互反応
を最少にししたがってＨＭＷ種の形成を低減するこの安
定剤により与えられる特異な安定化機構を示すものであ
る。シクロデキストリンが構造上中空を有するので、こ
の保護メカニズムは相互反応を最少化しかつ凝集を最少
化するある種の反応中心（ＨＭＷ凝集物の形成と関連す
る）の封じ込めに恐らく関連していると理論付けること
ができる。
【００８３】本発明により得られる高安定性により、生
成物を室温で貯蔵することが可能となりそしてその貯蔵
寿命が延長する。凍結乾燥生成物は従来のガラス製バイ
アル又は予備充填注射器のいずれにパッケージするのに
も適している。予備充填注射器は、″すぐ使用できる″
製品を提供するものであり、手数がかからず、緊急使用
に極めて適している。これらの配合物は、臨床、病院及
び緊急の際に、従来は得られなかった重大な用途を有す
る。
【００８４】本発明の好ましい実施態様を明細書におい
て記載し説明してきたが、これらは、本発明の概念及び
特徴を単に示すにすぎず、本発明及び特許請求の範囲を
限定するものではないことが理解されるであろう。

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 凍結乾燥用生理的活性プロテイン性水性
    組成物であって、前記組成物が、 約１５０〜約１５０，０００単位／mLの共有結合化低ジ
    オールポリエチレンオキシド／プロテイン；約０．１〜
    約２０％ｗ／ｖのシクロデキストリン；及び約０．０１
    〜約５０nMの緩衝液からなるものであり、前記組成物が
    約５．７〜約６．５のpHを有するものであるプロテイン
    性組成物。
  2. 【請求項２】 前記共有結合化低ジオールポリエチレン
    オキシド／プロテインが約２５，０００〜約１５０，０
    ００単位／mLの量存在する請求項１記載のプロテイン性
    組成物。
  3. 【請求項３】 前記共有結合化低ジオールポリエチレン
    オキシド／プロテインが約５０，０００〜約１５０，０
    ００単位／mLの量存在する請求項１記載のプロテイン性
    組成物。
  4. 【請求項４】 前記シクロデキストリンが約１．０〜約
    １５％ｗ／ｖの量存在する請求項１記載のプロテイン性
    組成物。
  5. 【請求項５】 前記シクロデキストリンが約５〜約１０
    ％ｗ／ｖの量存在する請求項１記載のプロテイン性組成
    物。
  6. 【請求項６】 前記低ジオールポリアルキレンオキシド
    が約１０％ｗ／ｗ以下の非モノアルコキシ化ポリアルキ
    レンオキシドを含有する線状ポリアルキレンオキシドで
    ある請求項１記載のプロテイン性組成物。
  7. 【請求項７】 前記非モノアルコキシ化ポリアルキレン
    オキシドが非モノメトキシル化ポリエチレングリコール
    である請求項６記載のプロテイン性組成物。
  8. 【請求項８】 前記ポリエチレングリコールが平均分子
    量約１，０００〜約１５，０００ドルトンを有する請求
    項７記載のプロテイン性組成物。
  9. 【請求項９】 前記ポリエチレングリコールが平均分子
    量約２，０００〜約１０，０００ドルトンを有する請求
    項７記載のプロテイン性組成物。
  10. 【請求項１０】 前記ポリエチレングリコールが平均分
    子量約４，０００〜約６，０００ドルトンを有する請求
    項７記載のプロテイン性組成物。
  11. 【請求項１１】 前記ポリエチレングリコールが約７％
    ｗ／ｗ未満の非モノメトキシル化ポリエチレングリコー
    ルを含有する請求項７記載のプロテイン性組成物。
  12. 【請求項１２】 前記ポリエチレングリコールが約５％
    ｗ／ｗ未満の非モノメトキシル化ポリエチレングリコー
    ルを含有する請求項７記載のプロテイン性組成物。
  13. 【請求項１３】 前記シクロデキストリンがβ−シクロ
    デキストリンの誘導体である請求項１記載のプロテイン
    性組成物。
  14. 【請求項１４】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    ヒドロキシプロピルシクロデキストリンである請求項１
    ３記載のプロテイン性組成物。
  15. 【請求項１５】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    グルコシルシクロデキストリンである請求項１３記載の
    プロテイン性組成物。
  16. 【請求項１６】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    マルトシルシクロデキストリンである請求項１３記載の
    プロテイン性組成物。
  17. 【請求項１７】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    マルトトリオシルシクロデキストリンである請求項１３
    記載のプロテイン性組成物。
  18. 【請求項１８】 前記プロテインが組換型ヒトインター
    ロイキン−４（ｒｈｕ ＩＬ−４）；プロテアーゼ・サ
    ブチリジン・カルスベルグ；オキシドレダクターゼ；カ
    タラーゼ；コレステロール；還元−ＮＡＤＰ；酸素オキ
    シドレダクターゼ（２０−β−ヒドロキシル化）（１．
    １４．１．９；″コレステロール ２０−ヒドロキシラ
    ーゼ″）；トランスフェラーゼ；ＵＤＰグルコース；ヒ
    ドロラーゼ；トリプシン（３．４．４．４）；Ｌ−アス
    パラギン アミノヒドロラーゼ（３．５．１．１；″ア
    スパラギナーゼ″）；リアーゼ；イソメラーゼ；及びリ
    ガーゼからなる群より選ばれる請求項１記載のプロテイ
    ン性組成物。
  19. 【請求項１９】 前記プロテインが、インシュリン；Ａ
    ＣＴＨ；グルカゴン；ソマトスタチン；ソマトトロピ
    ン；チモシン；甲状腺ホルモン；色素性ホルモン；ソマ
    トメジン；エリトロポイエチン；黄体形成ホルモンから
    なる群より選ばれる請求項１記載のプロテイン性組成
    物。
  20. 【請求項２０】 前記プロテインが、絨毛膜ゴナドトロ
    ピン；視床下部放出因子；抗利尿性ホルモン；チロイド
    刺激性ホルモン；カルシトチン；プロラクチン；インタ
    ーフェロン（α，β及びγ）；抗体（ＩｇＧ，ＩｇＥ，
    ＩｇＭ，ＩｇＤ）；インターロイキン１，２，３，４及
    び７；顆粒球コロニー刺激性因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球
    マクロファージ・コロニー・刺激性因子（ＧＭ−ＣＳ
    Ｆ）からなる群より選ばれる請求項１記載のプロテイン
    性組成物。
  21. 【請求項２１】 前記プロテインが、腫瘍壊死因子（Ｔ
    ＮＦ）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；表皮成長因
    子（ＥＧＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；骨成長因子
    （ＢＧＦ）；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）；パパ
    イン；キモトリプシン；テルモリジン；ストレプトキナ
    ーゼ及びアクティバーゼからなる群より選ばれる請求項
    １記載のプロテイン性組成物。
  22. 【請求項２２】 前記プロテインがスーパーオキシドジ
    スムターゼである請求項１記載のプロテイン性組成物。
  23. 【請求項２３】 前記スーパーオキシドジスムターゼが
    ウシスーパーオキシドジスムターゼである請求項２２記
    載のプロテイン性組成物。
  24. 【請求項２４】 前記スーパーオキシドジスムターゼが
    ヒトスーパーオキシドジスムターゼである請求項２２記
    載のプロテイン性組成物。
  25. 【請求項２５】 前記スーパーオキシドジスムターゼが
    組換ヒトスーパーオキシドジスムターゼである請求項２
    ２記載のプロテイン性組成物。
  26. 【請求項２６】 前記プロテインがオバルブミンである
    請求項１記載のプロテイン性組成物。
  27. 【請求項２７】 前記プロテインがカタラーゼである請
    求項１記載のプロテイン性組成物。
  28. 【請求項２８】 請求項１記載の凍結乾燥化プロテイン
    性組成物。
  29. 【請求項２９】 哺乳動物の組織上のスーパーオキシド
    アニオンに帰因する疾病の治療法であって、有効量の、
    請求項２２記載の組成物を投与することからなる方法。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物の組織上のスーパーオキシド
    アニオンに帰因する疾病の治療法であって、有効量の、
    請求項２３記載の組成物を投与することからなる方法。
  31. 【請求項３１】 哺乳動物の組織上のスーパーオキシド
    アニオンに帰因する疾病の治療法であって、有効量の、
    請求項２４記載の組成物を投与することからなる方法。
  32. 【請求項３２】 哺乳動物の組織上のスーパーオキシド
    アニオンに帰因する疾病の治療法であって、有効量の、
    請求項２５記載の組成物を投与することからなる方法。
  33. 【請求項３３】 前記疾病が炎症である請求項２９記載
    の方法。
  34. 【請求項３４】 前記疾病が虚血である請求項２９記載
    の方法。
  35. 【請求項３５】 前記疾病が再灌流損傷である請求項２
    ９記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記疾病が外傷である請求項２９記載
    の方法。
  37. 【請求項３７】 前記疾病が炎症である請求項３０記載
    の方法。
  38. 【請求項３８】 前記疾病が虚血である請求項３０記載
    の方法。
  39. 【請求項３９】 前記疾病が再灌流損傷である方法。
  40. 【請求項４０】 前記疾病が外傷である請求項３０記載
    の方法。
  41. 【請求項４１】 凍結乾燥化生物学的活性プロテイン性
    組成物の調製方法であって、前記方法が、 ａ）１０％ｗ／ｗ未満の非モノメトキシル化ポリエチレ
    ングリコールを含有するポリエチレングリコールをカル
    ボキシル化する工程； ｂ）前記カルボキシル化ポリエチレングリコールを活性
    化して活性ポリエチレングリコールエステルを得る工
    程； ｃ）前記活性ポリエチレングリコールエステルを生物学
    的活性プロテインに共有結合する工程； ｄ）前記の共有結合したポリエチレングリコールエステ
    ル及び前記生物学的活性プロテインを水性媒体に可溶化
    する工程； ｅ）前記水性媒体にシクロデキストリンを可溶化して均
    一溶液を得る工程； ｆ）前記溶液をpH約５．７〜約６．５に緩衝化する工
    程；そして ｈ）前記溶液を凍結乾燥する工程； からなる方法。
  42. 【請求項４２】 前記凍結乾燥用溶液が、 約１５０〜約１５０，０００単位／mLの共有結合化低ジ
    オールポリエチレングリコール／プロテイン；約０．１
    〜約２０％ｗ／ｖのシクロデキストリン；及び約０．０
    １〜約５０nMの緩衝液からなるものである請求項４１記
    載の方法。
  43. 【請求項４３】 前記ポリエチレングリコールが平均分
    子量約１，０００〜約１５，０００ドルトンを有する請
    求項４２記載の方法。
  44. 【請求項４４】 前記シクロデキストリンがβ−シクロ
    デキストリンの誘導体である請求項４２記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    ヒドロキシプロピルシクロデキストリンである請求項４
    ４記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    マルトシルシクロデキストリンである請求項４４記載の
    方法。
  47. 【請求項４７】 前記β−シクロデキストリン誘導体が
    マルトトリオシルシクロデキストリンである請求項４４
    記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記プロテインが、 組換型ヒトインターロイキン−４（ｒｈｕ ＩＬ−
    ４）；プロテアーゼ・サブチリジン・カルスベルグ；オ
    キシドレダクターゼ；カタラーゼ；コレステロール；還
    元−ＮＡＤＰ；酸素オキシドレダクターゼ（２０−β−
    ヒドロキシル化）（１．１４．１．９；″コレステロー
    ル ２０−ヒドロキシラーゼ″）；トランスフェラー
    ゼ；ＵＤＰグルコース；ヒドロラーゼ；トリプシン
    （３．４．４．４）；Ｌ−アスパラギン アミノヒドロ
    ラーゼ（３．５．１．１；″アスパラギナーゼ″）；リ
    アーゼ；イソメラーゼ；及びリガーゼからなる群より選
    ばれる請求項４１記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記プロテインが、インシュリン；Ａ
    ＣＴＨ；グルカゴン；ソマトスタチン；ソマトトロピ
    ン；チモシン；甲状腺ホルモン；色素性ホルモン；ソマ
    トメジン；エリトロポイエチン；黄体形成ホルモンから
    なる群より選ばれる請求項４２記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記プロテインが、絨毛膜ゴナドトロ
    ピン；視床下部放出因子；抗利尿性ホルモン；チロイド
    刺激性ホルモン；カルシトチン；プロラクチン；インタ
    ーフェロン（α，β及びγ）；抗体（ＩｇＧ，ＩｇＥ，
    ＩｇＭ，ＩｇＤ）；インターロイキン１，２，３，４及
    び７；顆粒球コロニー刺激性因子（ＧＣＳＦ）；顆粒球
    マクロファージ・コロニー・刺激性因子（ＧＭ−ＣＳ
    Ｆ）からなる群より選ばれる請求項４２記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記プロテインが、；腫瘍壊死因子
    （ＴＮＦ）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；表皮成
    長因子（ＥＧＦ）；神経成長因子（ＮＧＦ）；骨成長因
    子（ＢＧＦ）；成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）；パ
    パイン；キモトリプシン；テルモリジン；ストレプトキ
    ナーゼ及びアクティバーゼからなる群より選ばれる請求
    項４２記載の方法。
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