JPH084504B2 - 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ - Google Patents

安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ

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JPH084504B2 JP60090605A JP9060585A JPH084504B2 JP H084504 B2 JPH084504 B2 JP H084504B2 JP 60090605 A JP60090605 A JP 60090605A JP 9060585 A JP9060585 A JP 9060585A JP H084504 B2 JPH084504 B2 JP H084504B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、安定化された新規スーパーオキサイドジス
ムターゼ（以下、「SOD」と略記する。）に関し、抗炎
症剤，虚血性疾患症治療剤，心筋梗塞治療剤，放射線障
害治療剤等の医薬としての使用が期待される。
従来の技術 SODは、生体内での酸素に起因する毒性を除去するも
のとして、前記の医薬としての使用が可能である。
しかし、SODを血流中へ投与した場合のSODの血流内半
減期はわずか６分であり、急速に血中から失われてしま
うため、その薬理活性を充分に発揮することができな
い。
このため、SODの血流内寿命を延長させるため多くの
化学修飾が行なわれている。化学修飾SODの血流内半減
期（Ｔ−50）は、化学修飾SODの分子量とほぼ比例関係
が成り立つため、高分子量の化学修飾SODが望まれる
（文献E.Bocc,G.P.Velo,F.M.Veronese,pharmacol,R
es,Commun,14 113 1982年；文献E.Bocc,R.Largajol
li,F.M.Veronese,Z.Naturforschung 38 94 1983年）。
このため、例えば片端がメトキシ化されたポリエチレ
ングリコールを数多く結合させる等の手段がとられてい
る（文献，文献；文献P.S.Pyatak et al,Res.Com
mun.Chem.Pathol.Pharm.29 113（1980）） 発明が解決しようとする問題点 しかし、フィコール、ラットアルブミンによる修飾
法、P.S.Pyatakらのメトキシポリエチレングリコールに
よる修飾法では、SOD酵素活性が50％と低いという欠点
をもつ。
一方、Boccらの方法によるメトキシポリエチレング
リコール修飾法（文献，文献）では、医薬目的を達
成できる程度に高い酵素活性保持率を有しかつ長い血流
内半減期を有する物質は得られていない。
問題点を解決するための手段 発明者は、SOD活性が維持され、かつ血流内半減期の
長いSOD（以下、安定化SODという。）を開発すべく鋭意
検討した結果、ポリアルキレングリコール（その両端が
化学修飾されたものをも含む。）で化学修飾されたSOD
においてポリアルキレングリコール分子の両末端にSOD
が結合した骨格を有するSODが安定でかつ化学修飾によ
る活性の低下もなく安定性が高い事を確認し、上記目的
を達することを見出し、本発明を完成するに到った。
本発明による安定化SODは、分子量７〜50万望ましく
は、10〜40万分子量を有し、かつ、その活性保持率は85
〜100％と高い活性を有する。修飾するポリアルキレン
グリコールはSOD分子１個当り、0.5〜10,好ましくは１
〜６程度である。
修飾に用いるポリアルキレングリコールとしては、例
えば、ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコ
ール，エチレンオキサイド−プロピレンオキサイド共重
合体が採用される。その分子量は400〜10000程度のもの
であればよい。
反応に際しては、これらのポリアルキレングリコール
の両末端にカルボキシル基を付加したものを用いればよ
い。
その両末端の形としては、例えば （ｍは１〜12の整数を表わす。）を有するものいずれで
もよいが、結合の安定性の点で（２）及び（３）の形が
望ましい。
両末端にカルボキシル基を有するポリアルキレングリ
コール誘導体の製造法としては、（２）の形では、例え
ば、白金、パラジウム等の酸化触媒下でポリアルキレン
グリコールを酸化する方法、またモノハロゲン化カルボ
ン酸、ジアゾカルボン酸を両端のOH基と反応させて得る
方法等がある。
（３）の形では、両末端OH基にトシルクロリド及びヒ
ドラジンを反応させてアミノ基に変換した後（M.Mutte
r,Tetrahedron Letters 1978,2839参照。）ジカルボン
酸を反応しアミド結合を形成させることにより得ること
ができる。
本発明の安定化SODは上記ポリアルキレングリコール
の両末端にSODが結合した骨格を有する分子を含有する
ものであればどのようなものであってもよく、従って例
えば次の分子を例示することができる。
前記のようにして得られたポリアルキレングリコール
（その誘導体をも含む。）とSODをアミド結合により結
合させ、本発明の安定化SODを得ることができる。
本発明においては、前記した分子の単一物質だけでな
く、少くともこれら一種を含む混合物をも包含するもの
である。
アミド結合を形成する方法としては、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド等の縮合剤を用いる方法、また、Ｎ−
ヒドロキシコハク酸イミド、ｐ−ニトロフェノール等の
通常のペプチド合成におけるカルボン酸活性化剤により
活性エステルとし、これとSODを反応させアミド交換す
ることもできる。活性保持率を高く得るためには、後者
の活性エステルを介して反応を行なう方が望ましい。
反応に際しては、水、または、pH6.5〜10.0好ましく
は、pH7.2〜8.5になるよう調製した緩衝液にSODを0.1〜
10％好ましくは、0.5〜３％の濃度で溶解した後、活性
化させたポリアルキレングリコール誘導体をSOD1モルに
対し、１〜100倍モル、好ましくは２〜15倍モルを添加
して反応せしめる。その際SODの濃度と添加する活性化
ポリアルキレングリコールとSODのモル比により安定化S
ODの分子量をコントロールすることが可能である。
またSODとポリアルキレングリコール誘導体活性エス
テルを反応させる際グリシンやリジンなどのアミノ酸や
モノエタノールアミン等のアミン類を共存させて反応を
行なわせることにより、得られる安定化SODの分子量分
布を好ましい範囲（分子量が70,000〜500,000）にする
ことが可能となる。特にSOD濃度を2.5％以上で反応を行
なわしめる場合に分子量を目的の範囲にコントロールす
るのに有効である。
なお、本発明の安定化SODは、前記単一分子のみなら
ず各種の分子種の組成物をも含むが、必要に応じて好ま
しい構成比のものを調製できる。
前述の例示だけには限られず、より多量体の分子種も
数多くあり、SODとポリアルキレングリコールの結合様
式も多様である。
このようにして製造した安定化SODは単一分子ではな
く混合物の形で含まれ、当然本発明の範囲内に含まれ
る。さらに、原料物質、ポリアルキレングリコール分子
の両末端にSODが結合する骨格を一切有しない非架橋体
等不純物を一部混入したものも含まれる。このような場
合も前記物性（分子量等）を有する限り本発明の範囲内
に含まれる。
なお本発明の製造原料であるSODとしてはヒト由来、
牛、ウマ等の哺乳動物由来、大腸菌等微生物由来のも
の、遺伝子工学的手法によって微生物、酵母等から産出
されたもの等、その由来に制限はない。
実施例 以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1. 特開昭53−141219号明細書に記載された方法に従っ
て、白金パラジウム炭素触媒により両末端が酸化し得ら
れたカルボキシル基を有するポリエチレングリコール誘
導体（平均分子量4000）4.0g（0.001モル）、Ｎ−ヒド
ロキシコハク酸イミド0.46g（0.004モル）を300mlのN,N
−ジメチルホルムアミドに溶解した後、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド0.84g（0.004モル）を添加し、室温で
一夜攪拌した。
生成したジシクロヘキシル尿素を過し、液にエチ
ルエーテル600mlを加え、生成したスクシイミジル誘導
体の結晶を過し、エーテルでよく洗浄し、乾燥して活
性化誘導体の白色結晶4.2gを得た。
市販の牛血液由来SOD（東洋紡製3000単位/mg）100mg
（0.003ミリモル）をpH7.4に調整した0.1モル リン酸
ナトリウム緩衝液4mlに溶解し、上記で得られた活性化
誘導体37mg（0.009ミリモル）を加えた。
添加後、氷冷下３時間攪拌した。
反応中、安定化SODの分子量は、反応開始後１時間以
降でほとんど変化は見られず、３時間後には反応の大部
分は終了していた。反応終了後のSOD活性を測定した
が、反応前に比較し、活性保持率は、95±５％（全活性
285000単位）であった。
反応液は、分子量阻止３万の限外過膜により限外
過をくり返し、未反応の活性エステルまたは、その分解
物を除去することにより、修飾SOD溶液を得た。
このものの「TSK G 3000 SW」（東洋曹達（株）製）
カラムを使用したHPLCによる分子量分布を図１に示す。
このものを凍結乾燥して107mgの安定化SODを得た。
蛋白収率83％ 全活性236000単位 （活性保持率95％） 酵素１モル当たりの平均ポリエチレングリコール付加
モル数 2.4 実施例２ 市販の人赤血球由来SOD（シグマ社製2300単位/mg）を
「セファデックスＧ−100スーパーファイン」（ファル
マシア製）を使用してゲル過を行ない、分子量32000
付近の画分を集めて得た精製人SOD（3050単位/mg）50mg
（0.0015ミリモル）をpH7.4に調製した0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液2.5mlに溶解して、実施例１で得られた活
性化ポリエチレングリコール誘導体30mg（0.0075ミリモ
ル）を加え、氷冷下で３時間攪拌し、その後分子量分画
30,000の限外過を繰り返した後、凍結乾燥を行い60mg
の安定化SODを得た。
分子量分布を図２に示す。
蛋白収率 85％ 酵素活性保持率 94±５％ SOD酵素１モル当たりの平均ポリエチレングリコール
結合数 3.5 実施例3. オキシエチレン−オキシプロピレン共重合体（平均分
子量2750 BASF 社製「プルロニックＰ−94」）11.2g
（４ミリモル）、γ−ブロモ−ｎ−酪酸エチルエステル
7.8g（40ミリモル）を、充分脱水操作を行なったN,N′
−ジメチルホルムアミド300mlに溶解し、酸化銀15gを加
え、50〜60℃で24時間攪拌を行なった後、反応液を別
して固形物を除いた。
得られた液をエチルエーテル2.0l中へ加え、目的物
を沈殿させた。沈殿物を更にエチルエーテルで充分に洗
浄した後、乾燥し、水200mlに再度溶解した。再溶解液
を40〜50℃に加温した後、溶液の水素イオン濃度を測定
しながら、攪拌下で徐々に２規定の水酸化ナトリウム水
溶液を滴下し、pH11〜12の範囲に調整する。
pHが一定となった後、２時間攪拌を続けた。
その後１規定塩酸によりpH値を６に調整した反応液を
ロータリーエバポレーターで水を蒸発させる。得られた
固形物を再度N,N′−ジメチルホルムアミド100mlに溶解
させ、不溶物を過して除いた後、エチルエーテル１
中に加え、析出した結晶を過し、エチルエーテルで充
分洗浄した後、乾燥し、白色結晶を10.5gを得た。
得られた白色結晶を0.05Mのリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）200mlに溶解し、同じ緩衝液で平衡化した陰イ
オン交換樹脂「BIO−RAD 1×２」（バイオラット社製
樹脂容量300ml）に通液し、末端カルボキシル基を有す
るプルロニック誘導体を樹脂に吸着させた。その後0.05
モルの塩酸水溶液により吸着したプルロニック誘導体を
溶出した。得られた溶液を凍結乾燥することにより7.2g
の白色固体を得た。
その後、実施例１の方法によりプルロニック誘導体の
活性エステルを得た。牛SOD50mg（東洋紡製3000単位/mg
0.0015ミリモル）を0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.4）5mlに溶解し、氷冷下上記活性エステル33.5mg（0.
0105ミリモル）を添加し、３時間反応させることによ
り、安定化SOD55mgを得た。
SOD1分子当たりの共重合体の平均結合数 5.3 活性保持率 85％ 分子量分布図 図３ 実施例4. ポリエチレングリコール（平均分子量1000）の両末端
を実施例１に記載した方法で酸化したポリエチレングリ
コール誘導体4.09g（４ミリモル）、パラニトロフェノ
ール1.66g（12ミリモル）をN,N′−ジメチルホルムアミ
ド150mlに溶解し、2.48g（12ミリモル）のジシクロヘキ
シルカルボジイミドを添加し、室温にて、一夜反応させ
た。
反応終了後生成したジシクロヘキシル尿素を別し、
液にエチルエーテル2lを加えて、析出した結晶をエー
テルでよく洗浄した後、乾燥して白色結晶3.8gを得た。
牛SOD60mg（東洋紡製3000単位/mg,0.0018ミリモル）
とグリシン1.1mg（0.015ミリモル）を0.1Mホウ酸緩衝液
（pH8.2）2mlに溶解した後、上記で得られたポリエチレ
ングリコール誘導体の活性エステル17mg（0.014ミリモ
ル）を加え氷冷下３時間反応を行ない安定化SOD62mgを
得た。
SOD1分子当たりの平均ポリエチレングリコール結合数
4.5 活性保持率 90±５％ 分子量分布 図４ 実施例5. ポリエチレングリコール（平均分子量3800）からM.Mu
tterの方法（Tetrahedron Letters 2839（1978））によ
って得られた両末端アミン型のポリエチレングリコール
誘導体（両末端がＯ−CH2−CH2−NH2）5g（1.67ミリモ
ル）を充分脱水操作を行なったジオキサン100mlに溶解
させ、2.5g（2.5ミリモル）の無水コハク酸を加えた
後、室温で20時間反応させた。反応液をエチルエーテル
１中に加え、両末端にカルボキシル基を有するポリエ
チレングリコール誘導体4.8gを得た。
上記で得られたポリエチレングリコール誘導体を実施
例１に記した方法で活性化した活性化ポリエチレングリ
コール誘導体を製造した。
次に牛SOD（東洋紡製3000単位/mg）50mg（0.0015ミリ
モル）を0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）2.5mlに溶
解し、上記の活性エステル28mg（0.009ミリモル）を加
え、氷冷下で３時間攪拌し、反応させ安定化SODを得
た。
SOD1分子当たりの平均ポリエチレングリコール結合数
4.2 活性保持率 88％ 分子量分布 図５ なお前記実施例において製造した修飾体のポリアルキ
レンの結合モル数の決定は以下の方法で行なった。
凍結乾燥で得られた修飾SODの重量を測定し、数％に
なるように水溶液とし、その650−700nm（牛SOD680nm,
人SOD655nm）の吸光度から含まれる原料のSODの量を決
定する（牛SOD E＝300,人SOD E＝350）以上の如く得ら
れた修飾体及び非修飾体の重量比より結合するポリアル
キレングリコールの量を決定する。
また活性保持率は、次の如くして求めた。原料SODお
よび上記で得られた修飾SODを適量の緩衝液に溶解し、
その酵素活性をマコードらの方法（J.M.Mccord et al,
J.Biol・Chem 244,6049,1969年参照）により測定し、
また各々の酵素濃度を上記の吸光度法により決定し、反
応後の比活性の変化から活性保持率を決定した。
以上実施例で得られた安定化SODの活性保持率と参照
文献の分子量及び活性保持率を表１に示した。
【図面の簡単な説明】
図１〜５は、それぞれ実施例１〜５で得られた修飾SOD
の分子量分布を示したものである。なお、縦軸は、280n
mにおける吸光度を表わす。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリアルキレングリコールで化学修飾され
    たスーパーオキサイドジスムターゼにおいて、ポリアル
    キレングリコール分子の両末端にスーパーオキサイドジ
    スムターゼが結合した骨格を有することを特徴とする、
    主たる分子量が70,000〜500,000の範囲内にある安定化
    スーパーオキサイドジスムターゼ。
  2. 【請求項２】ポリアルキレングリコールがポリエチレン
    グリコール、ポリプロピレングリコールおよびエチレン
    オキサイド−プロピレンオキサイド共重合体より成る群
    より選択された高分子である特許請求の範囲第１項記載
    の化合物。
  3. 【請求項３】ポリアルキレングリコールの両末端がカル
    ボキシル基を有する特許請求の範囲第１項記載の化合
    物。
  4. 【請求項４】ポリアルキレングリコールの両末端が下記
    式で示される構造を有する物である特許請求の範囲第３
    項記載の化合物。 −CH2−Ｏ−(CH2)m−COOH （ただし、ｍは１〜12の整数を表す。）
  5. 【請求項５】ポリアルキレングリコールの両末端が下記
    式で示される構造を有する物である特許請求の範囲第３
    項記載の化合物。 （ただし、ｍは１〜12の整数を表す。）
  6. 【請求項６】ポリアルキレングリコールの分子量が400
    〜10,000である特許請求の範囲第１項記載の化合物。
JP60090605A 1985-04-26 1985-04-26 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ Expired - Lifetime JPH084504B2 (ja)

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JP60090605A JPH084504B2 (ja) 1985-04-26 1985-04-26 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ
DE8686303058T DE3676544D1 (de) 1985-04-26 1986-04-23 Mit einem poly(alkylenoxid) kombinierte superoxid-dismutase.
EP86303058A EP0200467B1 (en) 1985-04-26 1986-04-23 Superoxide dismutase combined with a poly(alkylene oxide)
US07/304,914 US5066590A (en) 1985-04-26 1989-02-02 Superoxide dismutase combined with a poly(alkylene oxide)

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JP60090605A JPH084504B2 (ja) 1985-04-26 1985-04-26 安定化ス−パ−オキサイドジスムタ−ゼ

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