JPH0625748B2

JPH0625748B2 - 多孔性電気泳動ゲル生成物およびその製造方法

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Publication number: JPH0625748B2
Application number: JP60139244A
Authority: JP
Inventors: チヤールズ・ベイラー・ジユニア
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Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1984-06-28
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 1994-04-06
Anticipated expiration: 2009-04-06
Also published as: IE851598L; US4790919A; GR851565B; DK296385A; DK167396B1; EP0169397A1; DE3584482D1; CA1261784A; DK296385D0; JPS6128512A; IE58481B1; EP0169397B1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、バイオ有機分子の分離に有用な、調整された
架橋密度をもつ電気泳動ゲル生成物およびその製造のた
めの光重合方法に関する。

背景技術電気泳動は、荷電された分子あるいは物質は電場に置か
れると泳動するという原理に基づいている。蛋白質およ
びその他のバイオポリマー（例えば、DNA、RNA、酸素お
よび炭水化物）は、荷電されるので、これらは、これら
の等電点以外のpH値で泳動する。泳動の速度は、とりわ
け、蛋白質またはバイオポリマーの荷電密度と電気泳動
のマトリックスの拘束性(restrictive properties)によ
つて決まる。質量に対する荷電の比が大きければ大きい
ほど分子はより速く泳動するものである。

電気泳動用の多くの支持媒体が慣用されている。最もポ
ピュラーなものは、紙またはセルローズアセテート、シ
リカゲル、アガロース、殿粉、およびポリアクリルアミ
ド性のシートである。紙、セルローズアセテート、およ
び薄層シリカ、の三物質は、比較的不活性であり、主に
支持体用としてかつ対流を最小限にするのに役立つ。こ
れらの物質を用いる蛋白質の分離は、選択したpHにおけ
る蛋白質の荷電密度に主として基づくもので、概して高
分離能の分離をもたらさない。

他方、殿粉、アガロース、およびポリアクリルアミドゲ
ルの三物質は、対流と拡散を最小限にするのみならず、
分離プロセスに活発に関与する。これらの物質は、多孔
性媒体を提供し、その孔の寸法は調整して分離する蛋白
質分子の寸法に近づけることができる。こうすれば、分
子のふるい分けが起り、荷電密度と分子の寸法の両方に
基づく分離をもたらす。

分子のふるい分けの限度は、ゲルの孔の寸法を泳動粒子
の寸法にいかに近づけられるかによつて決まると考えら
れる。アガロースゲルの孔の寸法な大きすぎるので、蛋
白質の大部分の分子の分子ふるい分けはごくわずかであ
り、分離は荷電密度に主として基づく。対照的に、ポリ
アクリルアミドゲルは、蛋白質分子の寸法により近づい
た孔をもつことができるので、分子ふるい効果に寄与す
る。ポリアクリルアミドは、高度に純粋にした状態に製
造できる合成ポリマーであるというさらにいつそうの利
点をもつ。

ゲル孔の寸法の変動範囲の広いものを作り出し、かつゲ
ル内に孔の寸法の勾配（グラジエント、gradient）を形
成する能力は、ポリアクリルアミドの追加された利点で
ある。孔の寸法の調整は、混合物を分子の寸法に基づい
てふるい分けることを可能にし、かつ、分子量測定を実
行可能にする。これらの測定は、分子の荷電の効果を中
和するナトリウムドデシルサルフエート(SDS)のような
洗浄剤(detergent)で蛋白質を被覆するならば、特に正
確になる。この技術は、エスデイーエス−ピーエージイ
ー(SDS-PAGE)電気泳動と言う。しかしながら、SDS電気
泳動ゲルを製造するための先行技術中に示される諸技術
は、再現性の高い生成物をもたらさない。

孔勾配ゲルポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドの濃度が勾
配状に増加し、それに応じて孔の寸法が勾配状に小さく
なるように製造し得る。これらのゲルは、試料の蛋白質
混合物の分析、および蛋白質を均一な荷電環境中に溶か
す変性剤としてSDSを使用する分子量測定の二つの目的
のため、単一濃度のゲルの代りに、今日、広範囲に用い
られている。勾配ゲルを製造するために使用する慣用的
技術は、高価で、かつ、ある程度再現可能な勾配を保証
するには多大の注意を必要とする。

異なつた濃度の複数のゲルが重なつて層になつた段階状
勾配(step gradient)がこれまで使用されてきた。不運
にも、これらは、蛋白質混合物の測定に不正確さを生じ
させる人工的な多成分帯(band)を層間の界面にもたらす
傾向がある。今日では、ポリアクリルアミドの連続的な
勾配を使用するのが普通である。通常の限度は、直線状
または非直線状の勾配になつた３〜３０％のアクリルア
ミドであり、分別すべく蛋白質の寸法によつて選ぶ特別
な範囲をともなう。勾配ゲル中での電気泳動の際、次第
に小さくなつていく孔がそれ以上の前進を妨げるまで蛋
白質は泳動する。この「孔の限界」に一度達すると、蛋
白質のバンデイングパターン(banding pattern)は、た
とえ泳動が完全に停止しなくても、時間が経つにつれて
容易に感知できる程に変化しない。

勾配ゲルによる電気泳動の主な利点の一つは、泳動して
いる蛋白質が、次第に小さくなつた孔寸法をもつゲルの
領域に絶え間なく進入し、蛋白質の泳動しているゾーン
の前進端部が後尾端部よりも強く阻止され、蛋白質の帯
(band)の顕著な鮮明化を生じることである。加えて、孔
の寸法の勾配は、一つのゲルで同時に分別することので
きる分子量の範囲を広げる。それ故、勾配ゲルは、均一
な孔寸法をもつゲルによつて通常可能なものよりもより
鮮明な帯(band)に複雑な蛋白質混合物を分別するのみな
らず、殆んど全ての成分の分子量測定をも可能にする。

孔勾配をもつゲルは、ゲルのモールド中にアクリルアミ
ドの濃度勾配を作り出すために、高濃度および低濃度の
モノマー溶液を混合することによつて通常製造する。こ
れらの技術は、所望の勾配を保証するために多大な注意
をもつて操作しなければならない綿密なポンプ操作計画
を含む。また、これらの技術は、時間がかかり、かつ高
価で、さらに再現性のある生産技術として役に立たな
い。

アクリルアミドの濃度勾配に加えて、サツカロースまた
はグリセロールの密度勾配は、重合の熱によつて引き起
こされる対流的乱れによつて混合がしばしば最小限にな
る。一部の研究者は、重合が最初にゲルの頂部で生じ、
次に底部に進行するのを保証するために、重合用触媒を
勾配状に含有させることによつて後者の問題を回避して
いる。これらの方法のいずれかによつて製造された勾配
ゲルは、一般に再現性が乏しい。

そのように製造されたポリアクリルアミドゲルはN,N′
−メチレン−ビス−アクリルアミド(BIS)のような二官
能化合物によるアクリルアミドの重合およびそれと同時
のポリマーオーの架橋の結果として生じる。重合の反応
開始の最も広くゆきわたつた方法は、ナトリウムまたは
アンモニウムの過硫酸塩および反応促進剤のN,N,N′,
N′−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を使用する
ものである。アクリルアミドの重合は、リボフラビンを
使用して光化学的にも実行できる。しかしながら、リボ
ラビンによつて開始する重合は、強烈な紫外線(UV)源ま
たは可視光線源を必要とし、これを光源の強度および波
長しだいで３０分ないし数時間の間印加しなければなら
ない。さらに、リボフラビンの使用の障害になるもの
は、それが、急速な光退色反応を受け、この反応は、リ
ボプラビンの濃度を低下させ、かつリボフラビンを反応
開始を起こさない状態に変化させ、結果的にモノマーの
ポリマーへの高率の転換を困難にするという事実であ
る。

リボフラビンによる光反応開始の特徴は非再現性であ
る。これは、完全に重合したかどうか不確実なので、必
要とされる露光の時間が長くなることおよびリボフラビ
ンの化学的不安定さという両方の理由による。先行技術
中に記載されているような重合の光反応開始は、異なっ
た濃度のモノマー液体を混合することによつて孔勾配ゲ
ルを作る際の問題を解消しない。実際、リボフラビンに
よる重合の速度の遅さおよび強烈な光源による長時間の
露光は、孔の勾配のデザインと再現性をだめにする対流
的混合の影響を過大にするように思われるだけである。

エー・クラムバツハ（A.Chrambach）とデイー・ロツド
バード（D.Rodbard）（Sep.Sci.7,663〜703,１９７２）
は、反応促進剤TEMEDの添加によるリボフラビン光反応
開始重合の加速について言及している。反応の良好な制
御のためには、しかしながら、このシステムもまた過硫
酸塩を存在させることが必要であつた。このシステム
は、リボフラビン単独の場合と同じく、異なつた濃度の
モノマーを混合することによつて孔勾配ゲルを作る際の
問題を解消しない。リボフラビン単独または添加した反
応促進剤（TEMED）と過硫酸塩をもつ場合の両方とも、
酸素がラジカル重合を抑制するので、モノマー混合物は
反応開始前に脱ガスしなければならない。

電気泳動用のこのようなゲルの製造および使用の詳細
は、ビー・デイー・ハーメス(B.D.Hames)とデイー・リ
ツクウツド（D.Rickwood）編の「蛋白質のゲル電気泳
動」pp.１〜89、アイアールエルプレス（IRL Pres
s）、ワシントン、デイー・シー（Washing,D.C.）（１
９８１）中で、ビー・デイー・ハーメスが一般的に、か
つ包括的に概説している。

pH勾配ゲル（IEF）両性物質（低分子量両性電解液）をゲル調合物に添加で
きる。重合に続いて、両性電解液物質は、そのpI（等電
点）に従つて電場中を泳動し、それらの等電点の順番に
各ゾーンで停止する。pH勾配がこのようにしてゲル中に
作られる。

IEF分離のなおいつそうの詳細は、ビー・デイー・ハー
メス（B.D.Hames）とデイー・リツクウツド（D.Rickwoo
d）の「蛋白質のゲル電気泳動」pp.１５７〜１８６、ア
イアールエルプレス（IRL Press）、ワシントン、デイ
ー・シー（Washington.D.C.）（１９８１）中に、ビー
・アンデルラン（B.An der Lan）とエー・クラムバッ
ハ(A.Chambach)が記載している。

一般文献の多数が、厚み５００μｍから１５００μｍの
ゲルについて記述していることに注意されたい。しかし
ながら、選ばれたいくつかの著作が、厚み２０μｍから
５００μｍの範囲の薄いゲルおよび超薄のゲルについて
記述している。ビー・ジー・ラドラ（Ｂ．Ｊ．Ｒａｄｏ
ｌａ）編「電気泳動′79」、ウオルター・ド・グライタ
ー(Walter De Gruter)、ニューヨーク(New York)(１
９８０)、PP.79〜94中でビー・ジエー・ラドラおよびそ
の中の参照文献が、シラン化したガラスまたはポリエス
テルのシート上にキャステイングすることによつて製造
した５０〜１００μｍのポリアクリルアミドゲル（勾配
なし）中の超薄層等電フォーカスイングについて論じて
いる。アール・シー・アレン（R.C.Allen）とピー・ア
ーナウド(P.Arnaud)編「電気泳動′81」、ウオルター・
ド・グライター（Walter De Gruyter）、ニューヨー
ク(New York)（１９８１）、pp.１８１〜189中で、ビ
ー・ジエー・ラドラ、エー・キンツコアー（A.Kinzkofe
r）、およびエム・フライ（M.Frey）は、超薄層（２０
〜５０μｍ）ポリアクリルアミドゲル中の等電フオーカ
スイング(focusing)について記載している。ゲルの製造
については何ら論じられていない。同書のpp.２５９〜
２７０中で、エー・ゴルグ（A.Gorg）、ダブリュー・ポ
ステル(W.Postel)、アール・ウエスタマイヤー(R.Weste
rmeier)、イー・ギアナツツア（E.Gianazza）、および
ピー・ジー・リゲツテイ（P.G.Ringhetti）もまた、厚
み２４０〜３６０μｍのポリアクリルアミドゲル中の等
電フオーカスイングと勾配電気泳動について記載してい
る。ゲルは、勾配混合によつて一度に垂直に注入され、
孔の寸法に勾配を形成する。超薄ゲルの利点が論じられ
ている。孔の寸法の勾配は、先行技術の方法を用いて薄
いゲルを得る多大の困難さの後にのみ得られる。結果と
して、薄いゲルの有利な特性は先行技術では広くは使用
されていない。

上記の緒方法のどれかによつて製造されたゲルは、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)および等電フオーカ
スイング(IEF)におけるこれらの有用性を落とすいくら
かの不利を受ける傾向がある。存在している不反応の重
合反応開始剤は、生体分子と反応でき、ひずんだ分離ま
たは試料の分解を引き起こす。現在の、極性をもつ無機
反応開始剤（過硫酸塩／TMMED）は、バツクグラウンド
の着色を増加する傾向があり、それ故、バツクグラウン
ド対試料スポツトとのコントラストを低下させる。本文
書中に記載した反応開始剤物質は、生体分子と反応ある
いは結合しない点で有益である。その主な理由は、不均
一反応開始剤については、それらが完全に有機物であ
り、易溶性でないからである。これらの反応開始剤は、
ゲル着色および脱色についても何の問題もない。

一般に、幾多の先行技術の方法を用いて製造した電気泳
動ゲルは、多くの不利を招く。なかでも、ゲル中の種々
の反応開始剤の存在は、反応開始剤と遊離モノマー緩衝
剤、あるいはアクリルアミドとの不規則な反応をしばし
ば引き起こした。さらに、無機反応開始剤またはその副
産物は、蛋白質の試料それ自体と反応することもあり、
それによつて電気泳動の結果をゆがめてしまう。反応物
の効果のない機械的混合および制御のできない反応の故
に、先行技術によつて製造したゲルは正確でもなく高度
に再現性のあるものでもない。先行技術が遭遇する他の
問題は、熱対流、振動、混合、および毛管現象作用の故
に、薄いゲル、すなわち厚み５００μｍ以下のゲルの製
造が比較的に困難であることである。さらに、これらの
先行技術は、これらがバツチタイプの操作であり労働集
約的なものであるから比較的に高くつく傾向にある。

発明の要約本発明によれば、電気泳動分離に有用な多孔性が得られ
る。この生成物は、光反応開始剤または水素ドナーの存
在を特徴とし、安定で、再現性があり、かつ電気泳動に
適する調整された多孔度をもつ。重合は、水溶性の有機
光反応開始剤を使用する均一系光重合あるいは光重合水
溶液中に有機反応開始剤を懸濁または分散した不均一系
光重合により開始、諸望の孔勾配を作るよう調整する。
ゲル生成物は、本質的にポリアクリルアミドと水からな
るが、アクリルアミド、アガロース、ビス−アクリルア
ミド、およびその他のモノマーまたはポリマーをさらに
含有してもよい。緩衝剤、両性電解液、洗浄剤、および
溶質もさらに調合物中に含有してよい。調合物は、特定
の使用のために、数理的に規定し得る規定した方法で重
合および架橋する。ゲル生成物は、５０μｍないし２mm
の間で厚みを変動させてもよいが、１００ないし３００
μｍの範囲が最も好ましい。

好ましくは、ゲル生成物は、重合し架橋したアクリルア
ミドモノマーから形成した水で膨張した多孔性マトリツ
クスからなる。ゲルを製造する溶液中のアクリルアミド
モノマーの濃度は、本質的に約３W/V％（重量／容量
％）ないし約３０W/V％で、かつ、光反応開始物質の水
溶性または水分散性成分は、約０．３〜１．２W/V％で
ある。ゲル生成物は、長さ、幅、および厚みの各デイメ
ンシヨンをもつてもよく、ゲルの孔の寸法は勾配状にな
つてよい。この勾配は、これらの三つのどのデイメンシ
ヨンにそつて変化してもよく、かつ、直線状でも孔寸法
の複雑な関数でもよい。

その発明の方法によれば、バイオ有機分子の試料をゲル
生成物の薄いプレート上に置く工程、生成物の一つのデ
イメンシヨンを横切つて電圧を印加する工程によつて、
荷電したバイオ有機分子をゲル生成物を用いて電気泳動
的に分離する。このゲル生成物もまた、長さ、幅、およ
び厚みの各デイメンシヨンをもち、かつ、各デイメンシ
ヨンの一つに沿って多孔度の勾配をもつ。

電気泳動分離に有用な多孔性ゲル生成物の製法は、次の
各工程からなる。

アクリルアミドモノマー約３W/V％ないし約３０W/V％お
よび架橋剤からなる混合物の水溶液または水分散液を形
成する。架橋剤は、全モノマーの約２W/V％ないし約１
５W/V％からなる。；光を吸収し、モノマーの重合を開
始する遊離ラジカル初生物質を添加する。；溶液を所望
のゲル生成物の形状に成形する。；成形した溶液を光照
射にさらし、モノマー溶液を重合させ、かつ、架橋させ
る。

遊離ラジカル発生物質（光反応開始物質）は、水溶性ま
たは水分散性化合物から本質的になる。これらの化合物
は、〔モノおよびジカルボニル化合物、ミヒラーの（Mi
cher′s）ケト〔4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ベンゾ
フエノン〕、４−カルボキシベンゾフエノン、ベンゾフ
エノン、9,10−フエナントレンキノン３−スルホネート
カリウム塩、１，２−ナフトキノン−２−スルホネート
カリウム塩、１，４−ナフトキノン−２−スルホネート
カリウム塩、４−トリクロロメチル−４−メチル−２，
５−シクロヘキサジエノンおよびその他の芳香族水溶性
まは水分散性モノおよびジカルボニル化合物；ベンゾイ
ンメチルエーテルのようなベンゾインエーテルその他の
ベンゾインおよびメチレンブルーと新規メチレンブルー
のような染料である。

モノおよびジカルボニル化合物および染料は、下記のも
のからなる水素ドナーとともに使用する。

Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタノールＮ−メチルジエタノールアミンナトリウムｐ−トルエンスルフイナートトリエタノールアミン架橋剤は、Ｎ，Ｎ′−（１，２−ジヒドロキシ−エチレ
ン）−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビ
ス−アクリルアミド（BIS）、Ｎ，Ｎ′−ジアリルタル
トラミド（DATD）、エチレンジアクリレートおよびＮ，
Ｎ′−ビス−アクリルシスタミンおよびその他の架橋用
モノマーである。

ある決まつた組成に対して、多孔度を変えるために、モ
ノマーの溶液に印加する光の強さを調整する工程を本発
明の方法は含む。光の強さは、写真の結像技術（imagin
g）に共通の技術であるアレイを用いて調整する。固定
したシート状ゲルに対しては、コンピュータおよびマイ
クロプロセツサープログラムした走行シヤツターによつ
て光束(flux)を調整してよい。代りに、連続製造に対し
ては、光の強さを調整する勾配濃度フイルター（neutra
l densiy filter）、グリツド、または様々の形状を
したアパーチャーの下部を個々のゲルモールドまたは連
続したすなわち分解していないゲル組成物を搬送または
走行させることによつて光速を加減することができる。

上記した方法で製造したゲル生成物は、多くの利点をも
つが、なかでも電気泳動性が向上した。例えば、勾配は
融通をもつてプログラムでき、かつ、写真結像技術によ
つて正確に、信頼をもつて再現できる。さらに、勾配混
合段階が避けられるので、本発明の方法を用いて、あつ
らえるもののゲル、すなわち、所望のいかなるパターン
の多孔度プロフイルをももち得るゲルのみならず、より
薄い容易に製造できる。本発明の方法によつて、連続的
なプロセスが可能となるので、一般に安価なゲルが製造
される。このゲルは、より安全であり、ユーザーはパツ
ケージしたゲルのみで、毒性のあるアクリルアミドを取
扱う必要がない。さらに、本発明によつて製造したゲル
は、より高い電圧の印加とそれにともなうより速い泳動
時間を可能にする。加えて、本発明のゲル生成物は、ゲ
ル調合物のイオン性含有物の減少によつて、内方浸透(e
ndosmosis)流を減少させた。

発明を実施するための最良の形態先行技術で経験された多くの困難を克服した本発明の方
法は、ゲルの重合の度合を既知の再現性のある多孔度プ
ロフイルに調整することを可能にする。無機反応開示剤
は、ある種の生体分子の分離を妨げることが先行技術中
に示されてきた。これは、無機反応促進剤の高度の極性
のためである。本発明は、完全に有機物であり、そのた
めに極性が乏しく、生体分子への妨害が少ない反応開始
剤を利用する。本発明は、ゲル溶液中のラジカル反応開
始−これは次にゲルの重合をもたらす−の手段として光
照射を利用する。ある決つたモノマー調合物の重合と架
橋の程度は、電気泳動ゲル中の蛋白質分離のかぎ(Key)
である電気泳動ゲルの分離特性を規定する。この光重合
技術は、全てのタイプのポリアクリルアミド電気泳動ゲ
ルの製造可能にする。この技術は、生じるゲル物質の多
孔度と電気泳動特性をこれまで得られなかつた程度まで
調整可能にする。このアプローチ法を用いれば、分子量
測定用の孔勾配ゲルおよび分子の荷電と等電点に基づく
分離用のpH勾配ゲルを含め、分析への広範な応用のため
に異なるタイプの電気泳動ゲルをうまく開発することが
できる。

第１図に、光反応開始剤の存在を特徴とする電気泳動ゲ
ル生成物の製造に使用する本発明の方法の各ステップを
示す。このゲル生成物は、光照射によつて、生成したラ
ジカルによつて重合が反応開始したところの重合した架
橋したモノマーから形成された水で膨張した多孔性マト
リツクスから本質的になる。第１図中、ステツプ２０か
ら６０は、ある決まつたゲル組成物の多孔度をプログラ
ミングする際の特有のアプローチ法を一体となつて提供
する基本的要件を明示する。各ステツプを次に記載す
る。

第一に、ゲルは、ステツプ２０で、ゲル成分を選択する
ことによつて調合する。このゲル成分は、選択した組成
物しだいであるが、ゲル物質が重合し架橋して所望のゲ
ル多孔度を生じる能力に影響し、かつ、その他の分離特
性にも影響する。ある決まつたゲル調合物に対する露光
パラメーターを確立するために、光源３０の照射特性を
測定することが必要である。いつたん、これを測定する
と、勾配ゲルを製造するために光源はマスクまたは機械
的シヤツターの手段により調整４０する。この手段は、
強さを加減する手段を提供し、それによつて複雑なゲル
多孔度パターンの確立を可能にする。

光照射の関数としてゲルの多孔度を調整するというこの
能力は、連続的製造工程に容易に適用し得る安定で正確
かつ再現性のある勾配を作る。したがつて、生産条件の
考慮５０をなしうることが保証される。上記各ステツプ
の全ては、本発明の生成物６０へつながる。

ゲルの調合２０本発明に従つて、光照射を介した電気泳動ゲルの製造を
考慮する際に、化学成分の考慮（ステツプ２０）は、所
望の多孔度プロフイルを得るために重要である。例え
ば、ゲル物質の選択は、蛋白質の特異または非特異結合
あるいは電気浸透(electro endosmosis)のようなゲルの
諸特性に影響を与える。

アクリルアミドはゲルの製造に用いる好ましい、かつ、
主要なモノマーである。しかしながら、ラジカルによつ
て反応開始する重合を受けることのできるその他の水溶
性モノマーを使用できる。その他の水溶性モノマーを所
望の多孔度を得るためにアクリルアミドと共重合させて
もよい。開示したプロセスに従つて、ゲル生成物を形成
するために、ある種の水溶性ポリマーも上述のモノマー
と共同して、あるいはじかに使用できる。

当初のゲル調合物および最後のゲル生成物中の上述した
モノマーの濃度は、約３w/v％から約３０w/v％の間で変
動してもよい。この範囲は、ゲルの安定性、強度および
多孔性マトリツクスの各理由から好ましい。アクリルア
ミドの濃度の低いゲルは、最も多孔性であり、大きな分
子を容易に通す。これは、分子に対しての制約がないこ
とが望まれるところのIEFに、または大きなDNAフラグメ
ントの分離に有用である。アクリルアミドの濃度の高い
ゲルは、多孔性が小さく、低分子量物質のより高度の分
離のための拘束的通路となる。

化学的架橋は、適当なポリ未飽和の、官能性アクリル酸
化合物またはアリール酸化合物の存在によつてゲル中に
発生し得る。

適当な架橋剤として作用する化合物は、例えば、N,N′
−メチレン−ビス−アクリルアミド(BIS)、N,N′−ジア
リルタルトラミド(DATD)、エチレンジアクリレート、N,
N′−ビス−アクリルシスタミン、N,N′−（1,2−ジヒ
ドロキシエチレン）ビス−アクリルアミド、およビTEOT
A（ポリオキシエチルトリメチロールプロパントリアシ
レート）である。BISは、反応性、安定度、および溶解
性の各理由から好ましいが、その他の架橋剤をBISに加
えてもよく、あるいはBISの代りに使用してもよい。こ
れらは、当初のゲル調合移に合計モノマー濃度の約０w/
w％〜約１０w/w％添加するが、実際の量は、ゲル中に要
求される架橋の程度によつて決定されるものであり、経
験的に決定してよい。好ましい範囲は、約２〜７％であ
る。もし、これらのコモノマーが最初のアクリルアミド
成分に加えられるなら、アクリルアミドの濃度は、合計
のモノマー濃度の約５０％より少なくなくてもよい。

当初の調合物（架橋剤を含有する）の合計モノマー濃度
は、w/v％ベース％Ｔとして表現する。架橋モノマーの
濃度は、合計モノマー濃度のw/w％として表現し、％Ｃ
と呼ぶ。

ゲル調合物は、電気泳動分離技術に調合したポリマー物
質の添加によつて改質してもよい。このような化合物
は、アガロース、寒天、およびポリアクリルアミド（分
子量が一様でないもの）であるが、これらに限らない。
化合物を粘性、多孔度およびゲルの強度を改善するため
に加えてもよい。これらは、約０w/v％ないし約２０w/v
％の範囲の濃度で調合物に加えることができる。好まし
い範囲は、個々のゲル生成物ごとに経験的に決定する。

ゲル調合物中で個々に、あるいは共同成分として有用で
ある水溶性ポリマーには、ポリアクリルアミド、ポリビ
ニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド、ポリメチル
ビニルエーテル、ポリビニルアルコールおよびアガロー
スである。

当初のゲル調合物および最終のゲルそれ自体は一様でな
い濃度の緩衝剤、洗浄剤、変性剤、両性電解質、および
溶質の添加によつてさらに改質してもよい。使用する緩
衝物質は、ゲル生成物の最終用途によつて決める。水性
系で使用する個々の緩衝剤の典型的例には、トリス−
（ヒドロキシメチル）アミノメタン(TRIS)塩酸、クエン
酸、リン酸水素ナトリウム、硼酸塩を含む。緩衝剤は、
個々に、あるいは完全な緩衝能力およびイオン強度を確
実にするために組み合わせて使用してもよい。このよう
な緩衝系に使用する濃度および混合物は、最終用途によ
つて選択し、この技術の当業者にとつては自明である。
詳細は、たとえばハーメス(Hames)およびリツクウツド
(Rickwood)などの一般的参考図書中に示されている。

洗浄剤をゲル調合物に、あるいは分離すべきバイオ有機
試料に直接加えてよい。両方のケースとも、洗浄剤を試
料の可溶化のため、または試料を単に寸法に基づいて分
離するように均一な電荷対質量比を維持するために加え
る。洗浄剤およびそれらの濃縮物は、ゲル生成物の最終
用途に基づいて、および分離すべき試料の型に基づいて
経験的に選択する。使用してもよい洗浄剤は、例えば、
セチルトリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジ
ニウムクロリド、デオキシコレート、ナトリウムドデシ
ルサルフエート(SDS)、ポリエチレンオキサイドソルブ
タンモノオレート、およびエトキシレート化オクチルフ
エノールである。ハーメス(Hames)およびリツクウツド
(Rickwood)などの一般的参考図書は、このような洗浄剤
の使用を詳細に論じている。

ゲル生成物をIEF分離に利用しようとするなら、両性電
解質をゲル調合物に加えねばならない。両性電解液は、
IEFゲルに加えられて、IEF分離に必要なpH勾配を形成す
る両性的電解液のことである。市販されている両性電解
液は、一般に多塩基アミンと多酸の複合混合物である。
本発明では、ゲル生成物に加える両性電解液のタイプま
たは濃度に関する制約条件はない。ハーメス(Hames)お
よびリツクウツド(Rickwood)などの参考図書は、すべて
のゲル混合物が本来有している両性電解液の制約条件を
明記している。

本発明の当初のゲル調合物は、溶解した酸素を取除くた
めにキヤステイングの前の不活性ガス（窒素、アルゴ
ン、ヘリウム等）パージングによつて脱ガスしてもよく
しなくてもよい。重合のための高強度の光照射の使用は
高いレベルのラジカルを発生し、溶解した酸素を急速に
激減させるので、試料の調整および露光条件が一定不変
のまゝである限りは、通常必要な当初のゲル調合物から
の酸素の厳格な排除は必要でなくなる。しかしながら、
露光中に大気中の酸素−これは拡散により急速に補給さ
れ得る−に起因する重合の抑制を防止するためにカバー
シートが必要である。

いつたん混合すると、当初のゲル調合物は、所望のより
さらに別の添加剤により改質してもよく、そして、次
に、キヤステイングモールド中かただ単に二枚のカバー
シートの間に入れる。キヤステイングの詳細は、生産の
考察５０の項で後述する。

優れた分離性能と脱色(destain)性能をもつゲルを生成
することを特徴とするいくつかの光反応開始剤、すなわ
ち遊離ラジカル発生物質を第１表に示す。

上表から、２kwの水銀ホトポリマー光源を使用すれば、
使用した反応開始剤と水素ドナーの組合わせしだいで１
５秒ほどの短時間の露光でゲルを生成できることがわか
る。

光源の照射特性３０と光源調整４０電気泳動ゲル生成物の一方から他方側への多孔度をうま
く調整するために、結果として生ずる照射されたパター
ンの均一性を知らねばならない。

このパターンは、スリツト、濃度フイルターまたはシヤ
ツタープログラムをデザインして非均一性を補整する際
に考慮しなければならない。上記の諸特性を確立するた
めに使用する技術は公知である、例えば、スペクトルラ
ジオメーターのような装置は、露光分布情報を定められ
たＸ、Ｙ座標の関数として集めるのに使用できる。

本発明では、好ましい光源は３００〜４００nmの出力を
もの紫外線である。これは、好ましい光反応開始剤と最
もよく相関する。実際には、反応開始剤を活性化させて
重合を起こさせるいかなる光源も使用できる。好ましい
照射源は、コールパーマーインスツルメント(Cole-Parm
er Instruments)社製の２個の１５ワツト自己フイルタ
ー作用黒色−ライトブルー管からなる長波UVランプであ
つた。これは、１０８゜のビームと光のおおい(housin
g)から0.5″の所の代表的強度が１１００μｗ／cm²の３
６５nm光をもたらす。ゲル溶液の重合に首尾よく使用さ
れた他の光源は３００〜６００cmの出力をもつ２kwアダ
ラツクス(Addalux)水銀ホトポリマーランプであつた。
後者の光源の場合は、ゲルはランプおおい(housing)か
ら４インチ（約１０cm）離れて配置した。この光源に対
するゲルタイムは１５秒であつた。黒−ブルーランプを
用いるゲルタイムは３０秒である（Hgホトポリマー源の
それの２倍）。第２の光源はかなりの赤外出力を有して
おり、３分以上の連続露光は重合中にゲルの冷却を必要
とする。

いつたん、光源の特性が決まると強度を調整してゲルの
多孔度を変動させることができる。調整は、光束（ワツ
ト／cm²）をゲルの長さ、幅および厚みの関数として調
整することによつてなされる。光束は固定シート状ゲル
に対しては、プログラムされたシヤツターあるいは走行
コンベヤによつて加減してもよい。搬送されるウエブ、
または走行するシート状ゲルの製造工程が望ましい場合
は、濃度フイルター、グリツド、または様々の形状をし
たアパーチヤーのような器具を光束を調整するのに用い
てもよい。固定式ゲル製造工程に、コンピユータ駆動シ
ヤツター、濃度フイルター、またはグリツドを取り入れ
ることもできる。これらの器具のより詳細な説明は、露
光勾配の形成に関連するセクシヨンで述べる。

有効多孔度(T)と光照射を介してゲル重合に印加された
強度(I) ポリアクリルアミド電気泳動ゲルは、水中に通常合計５
〜３０％のアクリルアミドを含有する溶液の重合によつ
て形成された架橋したポリマーの網状組織である。通
常、モノマーの２〜７％は、N,N′−メチレン−ビス−
アクリルアミド(BIS)である。これは、マトリツクスに
架橋部をもたらすために加える。通常、モノマーは、標
準の過硫酸塩反応開始化合物を用いて化学的に、あるい
はリボフラビンを用いて光化学的に重合する。ゲルの拘
束性は、ポリマー密度および架橋の程度を媒介して合計
モノマーの％（％Ｔ）と存在する架橋剤の量に関係す
る。

文献の取決めは、ゲルの拘束性をゲル中に重合した３％
のBISを含有する合計モノマーの％に換算して定義して
いる。例えば、“２０％T多孔度”をもつゲルは、合計
アクリルアミド２０％の溶液に３％のBISを加えたもの
を重合することによつて形成したゲルの拘束性を示す。
したがつて、ゲルを組成しだいで、１０、１５、２０％
Ｔの多孔度をもつものという風に呼ぶ。

この上述の取決めは、重合が完全になされると仮定して
いる故にゲル調合物の電気泳動応答性に関してはよく機
能する。本発明では、電気泳動応答性は、アクリルアミ
ドの含有量すなわち％Ｔに直接関連づけることはできな
い。これは、重合プロセスの程度と性質の両方を、照射
露光によつて調整するからである。例えば、光反応開始
した照射重合を用いれば、露光の範囲を変えることによ
つて、ある決まつた当初の調合物にある範囲の多孔度を
作ることができる。光反応開始で生産したゲルの等価多
孔度は、等価有効％Ｔと呼ぶことができ、本開示中では
Ｔと表示する。

露光勾配の形成電気泳動ゲルの性能と関連する最も一般的な事項として
この技術で用いられるものは、分子量対距離と多孔度対
距離の両プロフイルである。正確さ−これにより多孔度
をゲルの一方から他方への距離の関数として調整できる
−は、所望の性能関連事項によつて決まるプログラム可
能なプロフイルを考慮する際の唯一のものである。本発
明に従えば、多孔度に光反応開始を媒介して調整し、ゲ
ルは個別の研究者の特別のニーズに合うように製造でき
る。

多孔度勾配の形成には、固定式ゲルと搬送または走行式
ゲルの両方とも、照射光束の加減手段がいる。この光束
加減手段は、走行シヤツター、スクリーン、グリツド、
また様々な形状をしたアパーチヤーの形をしている。多
孔度勾配の製造に用いる典型的なスリツトを第２図に示
す。スリツトの形しだいで、決まつた多孔度プロフイル
が得られる。例えば、光源の下を走行するコンベアで運
ばれるゲルの上部に配置するマスク１０８として、段階
状の露光形態をしたスリツトを用いれば、ゲルに向いて
開いているマスクの領域においてのみ光源はゲル１１２
を重合させることになる。もし、ゲルをマスクおよび光
源に対して相対的に走行するか搬送するなら、ゲルのあ
る領域は、より長い時間露光（すなわちより多量の露
光）されることになる。露光は重合と架橋に比例し、そ
れが順番に多孔度に比例するので、孔勾配ゲルが製造で
きることになる。

例えば、第２図、第３図で、段階状のスリツト１１０を
用いて露光した電気泳動ゲル１１２は、レーン１１６か
ら１２６までの段階状の形の多孔度勾配をもつことにな
る。レーン１１６は重合の程度が最高で、対応して孔の
寸法128はより小さくなる。なぜなら、レーン１１６の
縦のスリツト長さ１３０はマスク中最大だからである。
レーン１２６はゲルの最低度の重合部分に当り、より大
きな孔寸法１１４に対応することになる。露光勾配の異
なるマスクの他の例は、第４図ａ、ｂ、ｃ、ｄに、例え
ば直線状のパターン１３０、多項式(Polynomial)パター
ン132、指数関数パターン１３４、あるいは段階状パタ
ーン１３６などを示した。

固定式または静止式のゲル露光では、予じめ決めた速度
でゲルの一方から他方へ走行するプログラム可能なシヤ
ツターアセンブリを使用して多孔度勾配を形成できる。
決められた強さを与えるためにゲルの一方から他方へ走
行するシヤツターの速度およびゲルの組成が多孔度プロ
フイルを決定する。シヤツター露光システムの詳細は、
連続的ゲル製造プロセスとあわせて生産の考察５０を記
述したセクシヨンで説明する。

生産条件の考慮５０既に開示した説明に従つて最適化したシステムによれ
ば、バツチモードか連続的な製造工程を使用して、ある
決まつた多孔度プロフイルをもつゲルを製造することが
完全に実現可能である。

本発明に従えば、第５図、第６図、第７図、および第８
図に最もよく示すように、ゲル調合物は、ポリスチレン
製のトレイ１１２とゲル支持体として機能するポリエス
テル製のカバーシート１０４をもつ二つの主要部分から
なるモールド中で露光する。うまくいつた実験で使用し
たトレイ１１２は、深さ１２ミル（３００μｍ）で、4.
5″×5″の浅いトレイであつた。これは、ゲルの長さの
約3/4に及んでおり、ゲルを８つのレーンに分割する列
になつた細長い隆起部を有していた。トレイ１１２は、
サーバフアインバイオケミカ(Serva Feinbiochemica)社
から入手できる厚さ７ミルの“Gel FIx”（商標）ポリ
エステルフイム１０４で被覆する。ポリエステルフイル
ムは、完成された電気泳動ゲル用の可撓性支持体とな
る。特別な２−Ｄ集積ゲルへの応用のためには、電極を
支持体フイルム上に印刷する。この場合は、レーンの細
長い隆起部および試料を付着するくぼみ(well)はモール
ドら取除く。

ポリエステルフイルム１０４をポリスチレントレイ１１
２へシールしてもよいが、これには、ダウコーニング(D
ow Corning)社製シリコーン高真空グリースの薄い被膜
をモールドの端部に塗布し、次に、二つの主要部分を一
緒に加圧ローリングする。グリースは水密な液体シール
をもたらす。二つの主要部分は、次に、ゲルの長さのス
トリツプ１２に切断した紙束用の可塑性回り縁(edge mo
lding)１１４用ストリツプ（スライド−ロツクバインデ
イングバーズSliede-Lock Binding Bars商標）を用いて
一緒にクランプする。露光後、ゲルはポリエステルフイ
ルム１０４製の支持体に優先的に接着し、かつこうして
二つの主要部分との間の接着力の相違によつてモールド
から剥離できる。

ポリエステルフイルム１０４は、トレイ112への取付け
前に、接着するのに水を用いてプレート１０２上に押し
つける。このラミネートを次に前述したシリコーングリ
ースと縁部クランプを用いてトレイ１１２に取付ける。
トレイ１１２は、トレイ１１２の相対した隅部に位置し
た小さな開孔１０６から充填する。トレイ１１２は、傾
けて保持して空気またはアルゴンがモノマー溶液と入れ
替るようにする。開孔１０６は、小さなゴム膜(septa)
１０８で蓋をし、アルミニウム板１０２をフイルム１０
４の下の位置に押し込んでゲルの支持体として機能させ
る。

ゲル調合物１１０、ポリエステルフイルム１０４、トレ
イ１１２、プレート１０２、および縁回り１１４からな
るモードルアセンブリーは、コンベアベルト上に直接載
せる。このデバイスは、ゲル支持体アセンブリ１４４と
呼び、選択する製造プロセスのタイプのいかんかかわら
ず、使用される。

第９図および第５図に示したものは、バツチタイプのモ
ードで露光勾配を製造できるコンピユーター駆動のシヤ
ツター装置である。プログラム可能なシヤツター１４２
は、光源１４０の下の適切な距離に設置する。この距離
は、ターゲツトに均一な照射分布をもたらす距離であ
る。ゲルの支持体アセンブリ１４４は、前述したように
モノマーで充填し、次に、支持体アセンブリの上側に充
填用孔１０６がくるように試料ホルダー１４６中に二つ
または三つ横に並べて置く（第９図に最もよく示してい
る）。プログラム可能なシヤツター１４２は、次に支持
体アセンブリ１４４の直上に位置させう。光源１４０を
次に励起させ、かつ最大限の強さにする。プログラム可
能なシヤツター１４２を次に作動開始させる。シヤツタ
ーは、所望の露光プロフイルに合つたコンピユータ１５
６のソフトウエアコマンドによつて制御されるネジ伝動
体１４８とステツプモータ１５０の組み合わせ装置を介
して開放し始める。インテル（ Intel商標）社製の８２
５５Ａプログラム可能ペリフエラルインターフエース１
５４をコンピユータとシヤツター駆動システム間のアナ
ログ対デイジタル制御通信を調整するのに使用した。紫
外線照射からユーザーを隔離するために、照射小室壁１
５２をシヤツターシステムと制御室との間に配置する。
この装置の平面は第１０図に示す。

露光完了と同時に光源は遮断する。

ゲル調合物の露光に用いる第２装置は、ゲルの連続製造
用のコンベヤシステムである。これは第１１図に示す。
ゲルの支持体アセンブリ１４４は、手作業によりモノマ
ーで充填し、次にステンレス鋼製コンベヤベルト１６０
上に載せる。このコンベヤベルトは、ゲルを光源164
に、次に集積領域１８０に運ぶのに使用する。

ゲルの支持体アセンブリ１４４をコンベヤベルト１６０
上に載せた後、光源１６４を励起する。光が安定したと
きコンベヤ１６０は動き出し、ゲルの支持体アセンブリ
１４４は一定の予じめ定めたベルト速度でスリツト、グ
リツド、またはスクリーンアセンブリ１６８の下部を通
過する。

典型的なスリツト、グリツド、またはスクリーンアセン
ブリ１６８の例図を第１２図と第13図に示す。都合のよ
いスリツトマスク１９６は、要求される所望の多孔度プ
ロフイルによつて選ぶ。スリツト１９６は、ホルダーと
シールドを組み合わせたアセンブリ１７８と一体になつ
ている。この組み合わせアセンブリ１７８は、ゲルの支
持体アセンブリ１４４を欲しない光から保護するととも
に都合のよい光フイルターのための保持手段として機能
する。光がスリツト１９６を通過できるように窓１９８
をスリツトの上部に設ける。スリツト１９６は、シール
ドアセンブリ１７８に平行に４個のブツシング１９４で
保持する。

コンベヤベルト１６０（第１１図）は、モーター１７０
によつて駆動する。モーターは、減速ギヤボツクス１７
２に連結する。これは、ベルト１７４を駆動し、ベルト
は順にベルトプーリー１７６を駆動する。コンベヤ１６
０および試料集積領域１８０の上部に配置したシールデ
イング１７８によつて、露光中ゲルの支持体アセンブリ
１４４を欲しない光から保護する。ゲルの支持体アセン
ブイ１４４がコンベヤ１６０を離れる際に、これらは排
出斜面１８２を試料貯蔵領域１８０へ滑落する。この貯
蔵領域１８０は水圧スタンド１８４によつて垂直に調整
できる。

光源は、一定のエネルギーをもつ一定不変の強さを決ま
つた量で定められた領域上に与えるので、重合は露光の
時間に比例する。時間はプログラムされたシヤツターの
作動によつて、あるいは所望の勾配に対応する寸法にカ
ツトされた多様な固定したスリツトの下部のコンベヤの
コンスタントな走行によつて調整できる。

スリツトのデイメンシヨン、シヤツターの作動、コンベ
ヤのベルト速度、および光の強さの計算は、すべて光重
合を使用した電気泳動ゲルの製造に先立つて決定しなけ
ればならないフアクターである。潜在的な製造プロセス
と矛循しない改良をコンベアシステムに加えて試料を連
続的に供給し排出するようにすることができる。上述の
各製造システムの各々を均一多孔度露光レーンごとに多
孔度を変えた露光、および連続勾配露光を形成するため
にいかにして使用するかを以下に説明する。

均一露光バツチタイプのシヤツターシステム（第９図参照）を用
いて均一露光を得るには、試料144をシヤターテーブル
１４６上に載せ、ゲルの各部を同じ時間長さの間露光す
るようにする。第１１図のコンベヤシステムでは、試料
１４４は四角形または矩形のスリツト１９６の下部を一
定の速さで通過する。これらの二つの製造方法は、たと
えこれらがともに同じく全体的な露光をもたらすもので
あるとしても互いに微妙に異なるものである。シヤツタ
ーシステムでは、試料１４４は、その全表面領域にわた
つて均一な瞬間的な露光を必らず受け、同時にゲル中の
全ての個所において重合が反応開始する。コンベヤシス
テムでは、露光の前線部がゲル上を通過し、これに対応
する重合すなわち反応前線部を、それにともなう拡散お
よび熱勾配とともに作り出す。

レーン露光バツチタイプシステム（第９図および第１０図参照）を
使用して、レーンごとに相違はあるが均一露光部を有す
る個々に分離したレーンをもつゲルを製造するには、第
２図および第３図に記載したものと同様な露光パターン
で試料をマスクするために、ゲルの長さ方向に一方から
他方へ段階状にシヤツター１４２を手操作または自動操
作で動かすことが必要である。”レーン”露光部を製造
する好ましい方法は、第２図に記載したのと同じスリツ
トパターンと一緒にコンベヤシステム（第１１図）を使
用するものである。

連続勾配露光使用する最後の露光の形態は、所望の多孔度の特別の範
囲に対応する露光勾配部またはゲルの長さ方向にそつて
電気泳動の方向に分子量の分布を規制する露光勾配部を
形成するものであつた。これらの勾配部は、シヤツタお
よびコンベヤと組み合わせた様々な固定スリツトの両方
を用いて製造した。各々の使用法を説明する。

バツチタイプのシヤツターシステム（第９図、第１０
図）を使用する場合は、支持体アセンブリ１４４を試料
ホルダー１４６に置く。プログラム可能シヤツター１４
２は、次に支持体アセンブリ１４４の直上に位置させ
る。光源１４０を次に励起し、最大強さにしたときにシ
ヤツター１４２に開放して所望の露光プロフイルを作
る。

露光の好ましい手段は、勾配を作るためのマスク１６８
を用いるとともに、コンベヤシステム（第１１図）を使
用することである。マスク１６８は、分子量または多孔
度対距離の特別なプロフイルを形成するのに必要とされ
る露光勾配を作るために要求される特別なパターンにカ
ツトする。試料１４４は、電気泳動方向をベルトの走行
方向に直角の方向にしてコンベヤ上に載せ、次に露光す
る。第4a〜ｄ図は、所望の電気泳動多孔度応答性を得る
のに役立つ異なつた代表的マスクパターンを示す。

コーテイング方法モールドを使用するキヤステイング方法は、純水による
モノマー調合物からゲルを製造するのに使用しなければ
ならないが、連続的コーテイング方法は、ポリアクリル
アミドか他の共存し得る水溶性ポリマーのいずれかを用
いて濃厚にした溶液によつて使用できる。二つの可能な
コーテイング方法を説明する。第一はカバーシートを利
用し、第二は不活性コーテイング反応室を利用するもの
である。

もし、ゲル調合物を光源から遠くの位置でコーテイング
するなら、第１４図に最もよく示すカバーシート２１０
を溶媒(水)の蒸発防止と重合のための酵素バリヤーの提
供のためにかぶせねばならない。カバーシート２１０
は、さらに印刷した電極およびこれと同様のものを含有
してもよい。また、これらはベースの一部分として含有
されていてもよい。均一なゲルの厚さを得るために、ス
ペーサー２１２を使用しなければならない。これらのス
ペーサーはテンプレートとしてのフイルム支持体２１４
上に置く。モノマー−ポリマー組成物２１８は、次にノ
ズル２２０を通してフイルム支持体２１４上にポンプで
送り込む。コーテイングナイフ２１６を使用してモノマ
ー−ポリマー調合物２１８を均一なゲルに形成する。

もし、モノマー−ポリマー組成物が十分に物質的な完全
な状態であれば、所望の厚みの被膜はドクターナイフ２
２２を用いて製造できる。このドクターナイフは、第１
５図に最もよく示すように、ゲルの製造中に支持体とな
るＵ形状のブラケツト２２１中に収容する。第１４図の
ように、モノマー−ポリマー組成物２１８は、ノズル２
２０を通してフイルム支持体２１４上にポンプで送る。
ゲルは、次にドクターナイフ２２２によつて成形し、次
に光源２２８によつて不活性雰囲気２２６中で重合す
る。温度と湿度はコーテイングおよび照射の間の溶媒損
失を防ぐために調整しなければならない。上記した方法
の両方とも、ある決まつたゲル生成物224を作るため、
濃厚化したモノマー溶液または純粋な水溶性ポリマー溶
液の照射に使用できる。

勾配ゲルおよび均一ゲル用の典型的な光重合SDS-PAGE調
合物を実施例１に、そしてIEFゲル用のものを実施例２
に記載する。

下記の実施例は、均質な反応開始物質を使用する光重合
ゲルの製造用のSDS-PAGE電気泳動ゲル調合物の製造を例
示する。４−カルボキシベンゾフエノンおよび水素ドナ
ーのトリエタノールアミンを含有する遊離ラジカル発生
物質は特に好ましい。

実施例１原料溶液を下記のとおり製造した。

モノマー溶液アクリルアミド８０ｇＮ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド２．１ｇ蒸留水２００mlとする量緩衝溶液トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン１８．１ｇナトリウムドデシル硫酸塩０．４ｇ蒸留水８０ml pHはHClで８．８に調整蒸留水１００mlとする量反応開始剤溶液４−カルボキシベンゾフエノン０．９０ｇトリエタノールアミン２．００ｇ蒸留水８５ml pHはHClまたはNaOHで８．８に調整蒸留水１００mlとする量ゲル溶液ゲル溶液は原料溶液を下記のとおり混合して製造した。

モノマー溶液５０％緩衝溶液２５％反応開始剤溶液２５％ゲル溶液は上述したような4.5″×5″で１２ミルの深さ
の浅いトレイ中に導入した。充填跡トレイは上述のよう
にポリエステルフイルムで被覆した。

SDS-PAGE電気泳動ゲルは、６０秒間の露光によつて先に
示したとおりに製造し、均一露光した試料および勾配露
光した試料の両方について評価した。より短い露光時間
を使用できるが、最高の分離は上記した黒色光源を使用
して約60秒で生じた。これらの試料は下記の成分からな
る蛋白質のBLR標準混合物を用いて評価した。

・インシユリン・ボビントライ（Bovin Try）、インヒビター・チトクロームＣ・リソジム・β−ラクトグロブリン・α−キモトリプシノーゲン・オバルブミン上述した反応開始物質は良好な分離および脱色特性をも
つゲルを生じた。上記の蛋白質混合物は均一露光では六
つの成分に、そして勾配露光したゲルについては七つの
成分に分離した。濃度フイルターを使用した場合は、そ
れを補なうため勾配ゲルにはより長い露光時間を使用し
た。加えて、勾配露光したゲルはより鋭いバンドを示し
た。再現性を上述した調合物を使用して明らかにした。

下記の実施例は、光重合ゲルの製造のためのIEFゲル調
合物の製造を例示する。

実施例２次の例は等電フオーカスイング用のゲルの製造への本発
明の組成物の応用可能性を例示する。原料溶液は下記の
とおり製造した。

原料モノマー溶液アクリルアミド６．４７gms ビス−アクリルアミド０．２０gms 脱イオン水６６．７mlとする量両性電解原料溶液フアーマライト（Pharmalyte商標）（pH3〜10）２．５m
l グリセロール４．０ml 脱イオン水１０mlとする量反応開始剤原料溶液ベンゾインメチルエーテル０．４gms エタノール１０ml 脱イオン水５０mlとする量 pH７．０に調整ゲル溶液ゲル溶液は原料溶液を下記のごとく混合して製造した。

モノマー溶液５０％緩衝溶液２５％反応開始剤溶液２５％ゲルは、実施例１と同様に製造した。しかしながら、露
光時間は、官能性ゲルを作るのに必要な露光が最低１０
分間でよい、荷電された反応開始種（species）を含有
するSDS-PAGEゲルの場合より長かつた。重合を完全にす
るために、上述した黒色光源を使用して２０分間露光し
た。しかしながら、より長い時間の重合は、反応開始剤
の非効率性によるのではなく、IEFゲルに要求されるア
クリルアミドモノマーの濃度が低い（SDS-PAGEゲル用が
７〜３０Ｔ／２〜７％であるのに対し一般に５〜７Ｔ／
２〜５％Ｃ）ことによる。IEFゲルは、pH勾配との干渉
を避けるために中性の反応開始成分の使用を必要とす
る。良好な分離能（フアルマシア製標準広域PI計測キツ
ト使用）と脱色性をもつゲルは、実施例２に示したとお
りに製造した溶液から得られた。ベンゾインメチルエー
テル（水素ドナーの使用を必要としない中性反応開始
剤）の混入を、共働溶媒としてのエタノールの添加（ゲ
ル溶液中に５％）によつて遂行した。エタノールは電気
泳動に不利な影響は与えない。

ゲル生成物６０光反応開始を経て電気泳動ゲルの重合を行なわせる本発
明を用いれば、ゲル生成物の薄いプレート上にバイオ有
機分子の試料を置く工程、プレートの薄さ方向のデイメ
ンシヨン以外のデイメンシヨンを横切つて電圧を印加す
る工程によつて、すでに開示したゲル生成物６０を用い
てバイオ有機分子を電気泳動的に分離することが可能と
なる。ゲル生成物は、厚みが５０μｍから２mmの間で変
動してもよいが、１００〜３００μｍの範囲が最も好ま
しい。さらに、要求される所望の電気泳動分離しだいで
ゲルにはゲルの一方から他方への距離に対する分子量ま
たは多孔度の特定の分布をデザインしてもよく、また均
一多孔度、レーン多孔度、または勾配多孔度プロフイル
を有してもよい。本発明に従つて製造したこのような光
重合したゲルの諸利点を下記に要約する。

正確で再現性のあるゲル−試料の調合と製造、露光、お
よび試料の配置の厳密な制御は、ゲルの製造の優れた再
現性をもたらす。言いかえれば、勾配の形状と型の再現
性が高い。

特別あつらえのゲル−ゲル勾配は、光のシヤツター、ス
リツト、またはマスクのマイクロプロセツサー制御によ
つていかなるパターンの多孔度プロフイルにもあつらえ
られる。例えば、不連続な勾配および複雑なプロフイル
の勾配を容易に製造できる。

ゲルの連続的製造−一般に現在はゲルはバツチ式に製造
されている。本件の場合は、連続的な製造ができる。そ
れ故ゲルの一つ一つは再現性のある状態で迅速に製造で
きる。

より薄いゲル−光重合プロセスは、従来のプロセスでは
容易に製造されない薄い勾配ゲル（５００μ）の製造を
可能にする。薄いゲルは動くのにより少いパワーしか必
要としないので、これらはより早く電気泳動されること
ができ、かつ取扱いがより簡単である。これはより迅速
でエネルギーの節約になる。

より安全なゲル−使用者は毒性のあるアクリルアミドを
取扱わなくてもよく、パツケージしたゲル物質はより安
全に取扱うことができる。

安定な勾配−他のシステム中の不反応の反応開始剤は、
遊離モノマーの重合またはポリマー架橋をゲルの製造が
完了した跡に引き起こすことがある。それ故、架橋密度
および勾配の変動は調整できなくなる。ここで説明した
反応開始剤は光がなくては重合を引き起こさず、それ
故、安定した電気泳動ゲルシステムを提供する。

【図面の簡単な説明】

添付図面第１図は紫外線または可視光線照射によつて電
気泳動ゲルを形成する方法のブロツクダイアグラム、第
２図は段階状の露光勾配用スリツトの平面図、第３図は
第２の段階状の露光勾配用スリツトによつて得たゲルの
多孔度プロフイルを示す図、第４Ａ図〜第４Ｄ図は多孔
度の勾配用に使用する異なつた代表的スリツトを示す
図、第５図はゲルモールドとフイルム支持体の組み合せ
の平面図、第６図は第５図の６−６線にそつて切断した
縦断面図、第７図はゲルモールドとフイルム支持体アセ
ンブリの底面図、第８図は第７図の８−８線にそつて切
断した縦断面図、第９図は電気泳動ゲルの製造に使用す
るシヤツターシステムの図、第１０図は電気泳動ゲルの
製造に使用するシヤツターシステムの最上部面を示す
図、第１１図は電気泳動ゲルの製造に使用するコンベヤ
システムの図、第１２図はゲルを照射する際に使用する
代表的なスリツトアセンブリを示す図、第１３図は第１
２図に示したスリツトの最上部面を示す図、第１４図は
カバーシートを利用する連続コーテイング方法を示す
図、そして第１５図は不活性コーテイング−照射室を利
用する連続コーテイングと重合方法を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】重合しかつ架橋した、モノマーと光開始剤
から形成された所定の体積を有する水で膨潤した多孔性
重合体マトリックスからなる多孔性電気泳動ゲル生成物
であって、該多孔性電気泳動ゲル生成物が、安定であ
り、荷電した高分子物質の電気泳動分離に対してゲルか
らゲルへと再現性であるコントロールされた電気泳動解
析能を有し、長さ、幅および厚さ寸法を有し、且つ長さ
および幅寸法の一方に沿って多孔度勾配を有し、そして
比較的薄い厚さ寸法に沿って均一な多孔度を有している
ことを特徴とする多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項２】モノマーがアクリルアミドである特許請求
の範囲第１項に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項３】水溶性光開始剤を用いた均一系光重合また
は開始剤が光重合水溶液中に懸濁または分散された不均
一系光重合によって重合が開始されたものである特許請
求の範囲第１項に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項４】アクリルアミドが約５w／v％である特許請
求の範囲第３項に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項５】アクリルアミドモノマーが約３w／v％〜約
30w／v％の範囲から本質的になる特許請求の範囲第３項
に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項６】生成物が３〜30w／v％のアクリルアミドモ
ノマーおよび約0.3〜1.2w／v％の水溶性または水分散性
光開始剤から本質的になる特許請求の範囲第１項に記載
した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項７】アクリルアミドモノマーの約２〜15w／v％
が架橋可能なモノマーである特許請求の範囲第６項に記
載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項８】多孔度の勾配が直線状である特許請求の範
囲第１項に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項９】多孔度の勾配が対数的である特許請求の範
囲第１項に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項１０】多孔度の勾配が複雑になっている特許請
求の範囲第１項に記載した多孔性電気泳動ゲル生成物。
【請求項１１】所定の体積を有し、長さおよび幅寸法を
有し、安定であり、再現性があり、且つ長さおよび幅寸
法の一方に沿ってコントロールされた多孔度勾配を有
し、光開始剤の存在によって特徴づけられる電気泳動分
離に有用な多孔性ゲル生成物の製造方法であって、イ）架橋剤が本質的にN,N′-(1,2-ジヒドロキシエチレ
ン)-ビス-アクリアミド、N,N′-メチレン-ビス-アクリ
ルアミド(BIS)、N,N′-ジアリルタルトラミド(DATD)、
エチレンジアクリレート、N,N′-ビス-アクリルシスタ
ミン、およびポリオキシエチルトリメチロールプロパン
トリアクリレーロ(TEOTA)である、約３w／v％〜約30w／
v％のアクリルアミドモノマーと、合計モノマーの約２w
／w％〜約15w／w％からなる架橋剤との混合物の水溶液
または分散液を調製し、ロ）照射された光を吸収して、モノマーの重合を開始す
るフリーラジカル発生系を添加し、ここでフリーラジカ
ル発生系は本質的に水溶性または水分散性である、モノ
およびジカルボニル化合物、ミヒラーのケトン〔4,4′-
ビス（ジメチルアミノ）ベンゾフェノン〕、４-カルボ
キシベンゾフェノン、ベンゾフェノン、9,10-フェナン
トレンキノン３-スルホネートカリウム塩、1,2-ナフト
キノン-２-スルホネートカリウム塩、1,4-ナフトキノン
−２−スルホネートカリウム塩、４-トリクロロメチル-
４-メチル-2,5-シクロヘキサジエノンおよび他の芳香族
水溶性または水分散性モノおよびジカルボニル化合物、
ベンゾインメチルエーテルのようなベンゾインエーテル
類および他のベンゾイン類またはメチレンブルーとニュ
ーメチレンブルーのような染料であり、ハ）上記の溶液を所望のゲル生成物の形状に形成し、ニ）所望の形状にされた溶液に光照射してモノマー溶液
または分散液を重合および架橋させそしてゲル生成物の
長さおよび／または幅にわたって該所定の形状にされた
溶液への光照射を所望の多孔度勾配になるように調整す
る；ことを特徴とする多孔性ゲル生成物の製造方法。
【請求項１２】モノマーがラジカル開始重合される他の
水溶性モノマーを含有していてもよい特許請求の範囲第
11項に記載した方法。
【請求項１３】遊離ラジカル発生系が、光照射によって
励起される遊離ラジカルを直接供給する１つまたはそれ
以上の化合物からなる特許請求の範囲第11項に記載した
方法。
【請求項１４】モノおよびジカルボニル化合物および染
料を下記のものから本質的になる水素ドナーと一緒に使
用する特許請求の範囲第11項に記載した方法；Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタノールＮ−メチルジエタノールアミンナトリウムｐ−トルエンスフィネートトリエタノールアミン。
【請求項１５】ゲルの多孔度をゲルの長さ、幅または厚
みの関数として変化させる特許請求の範囲第11項に記載
した方法。
【請求項１６】照射線量の調整をゲルの長さ、幅および
厚みの関数として光束を調整することによって行う特許
請求の範囲第11項に記載した方法。
【請求項１７】両性電解液を水溶液または水分散液に添
加し、遊離ラジカル物質が0.1w／v％より少ないベンゾ
インメチルエーテルを含有している特許請求の範囲第11
項に記載した方法。
【請求項１８】溶液に基体にコーティングすることによ
って溶液をゲル生成物の形に形成する特許請求の範囲第
11項に記載した方法。