JPH06273415A - コレシストキニンの測定用試薬及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 抗硫酸化チロシン抗体を含有することを特徴
とするコレシストキニンの測定用試薬及びこの試薬を使
用するコレシストキニンの測定方法。 【効果】 ＣＣＫの活性に影響するＣＣＫペプチド鎖中
の硫酸化チロシンを特異的に認識する抗硫酸化チロシン
抗体を用いるため，正確なＣＣＫ活性値を簡便，かつ短
時間に定量することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は，コレシストキニンの免
疫学的測定に有用なコレシストキニンの測定用試薬及び
測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】コレシストキニン（以下ＣＣＫという）
は，食物中の脂肪や脂肪酸などにより十二指腸粘膜中の
Ｉ細胞から放出される消化管ホルモンであり，おもな生
理作用は，胆嚢収縮，胃平滑筋や小腸平滑筋の収縮，膵
酵素分泌，肝胆汁分泌などを促進する。ＣＣＫ製剤は，
現在，医薬品として使われており，その１つは胆嚢収縮
剤として用いられ，他に膵分泌機能検査としてＰ−Ｓテ
ストに用いられている。このような，ＣＣＫの測定は，
疾患との関係を検出したり，ＣＣＫの血中動態を明らか
にするなど臨床的に非常に重要である〔日本生化学会
編，生化学データブック１（東京化学同人：１９７９
年）〕。

【０００３】その測定法としては，現在はバイオアッセ
イ法とラジオイムノアッセイ法がある。バイオアッセイ
法は，ウレタン麻酔下でモルモットを開腹し胆嚢を引き
出し，その収縮力を歪計で測定する麻酔モルモットの胆
嚢収縮法や麻酔ネコ膵酵素測定法である〔エス，リュン
グバーグ（S. Ljungberg），アクタ ファーム，スエ
ク，（ Acta Pharm. Suec.）, 6, 599 (1969) 〕。ラジ
オイムノアッセイ法は，一定量の抗ＣＣＫ抗体に対し
て，一定量の標識抗原と測定すべきＣＣＫを競合的に結
合させ，抗体と結合した，あるいは結合しなかった標識
抗原の量からＣＣＫ活性を測定するものである〔アー
ル，エス，ヤロウ（R. S. Yalow ）, エス，エイ，バー
ソン（S. A. Berson），ガストロエンテロロジイ（Gast
roenterology）, 58, 609 (1970)〕。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし，バイオアッセ
イ法は，操作が非常に煩雑で時間を要し，動物を用いて
定量するために測定値にばらつきが見られるという問題
がある。また，ＣＣＫペプチド中のチロシン残基は硫酸
化されており，脱硫酸化されると活性がなくなるという
問題もある。上記のラジオイムノアッセイ法では，ＣＣ
Ｋのホルモン活性は，ＣＣＫのチロシン残基の硫酸化に
よるが，抗ＣＣＫ抗体がＣＣＫ硫酸体と脱硫酸体の両方
を区別なく認識するために，正確なＣＣＫ活性測定には
不適当であるという問題がある。本発明は，簡便で，短
時間かつ正確にＣＣＫ活性を定量することができるＣＣ
Ｋの測定用試薬及び測定方法を提供することを目的とす
るものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは，このよう
な課題を解決するために鋭意研究の結果，ＣＣＫのペプ
チド鎖中の硫酸化チロシンと結合する抗体を用いると，
正確なＣＣＫ活性を簡便で，かつ短時間に測定できるこ
とを見い出し，本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち，第一の発明は，抗硫酸化チロシ
ン抗体を含有することを特徴とするコレシストキニンの
測定用試薬を要旨とするものである。また，第二の発明
は，上記の試薬を使用することを特徴とするコレシスト
キニンの測定方法を要旨とするものである。

【０００７】以下，本発明を詳細に説明する。本発明に
用いられる抗硫酸化チロシン抗体は，ポリクローナル，
モノクローナルに関係なく使用することができるが，特
に本発明においては，モノクローナル抗体を使用するこ
とが好ましい。また，ＩｇＧ，ＩｇＭなど，どのクラス
の抗体でも使用することができるが，特に本発明におい
ては，ＩｇＧを使用することが好ましい。

【０００８】本発明に用いられる抗硫酸化チロシン抗体
の反応特異性を以下に示す。 （１）抗原抗体反応により，遊離の硫酸化チロシン又は
ペプチド鎖中の硫酸化チロシンと結合する。 （２）遊離の硫酸化されていないチロシン又はペプチド
鎖中の硫酸化されていないチロシンとは実質的には結合
しない。 （３）抗体の分子量など，理化学的性質は一般に知られ
ている性質〔例えば「医科免疫学」（改訂第３版）１９
９０年（医学書院）に記載〕と同様である。 すなわち，ＩｇＧの分子量は約１３０，０００〜２１
０，０００であり，至適ｐＨは６〜９であり，安定ｐＨ
範囲は３〜１１であり，作用適温の範囲は０〜４０℃で
ある。

【０００９】このような性質のポリクローナル抗体を得
るには，例えば以下の方法で行えばよい。まず硫酸化チ
ロシンをハプテンとして，カブトガニヘモシアニン（以
下ＫＬＨという）などのキャリアタンパク質をカルボジ
イミド法などで結合したもの，又はペプチド鎖中のチロ
シンが硫酸化されたタンパク質（フィブリノーゲン，フ
ィブロネクチンなど）を抗原としてウサギ，ヒツジ，ヤ
ギ，マウス，ラット，ウマ等の哺乳動物に免疫する。こ
のとき，フロイントの完全アジュバント（以下ＦＣＡと
いう）などの免疫増強剤を用いると効果的である。さら
に硫酸化チロシンを用いて最終免疫を行う。最終免疫か
ら１〜１４日後，望ましくは３〜７日後に免疫した動物
から血清を採取する。この血清を，例えば硫酸化チロシ
ンを固定化した担体（例えばセファロースなど）を充填
したカラムに吸着させ，溶出後チロシンを固定化した担
体（例えばセファロースなど）を充填したカラムを通過
させ，チロシンにも結合する抗体を除去することによ
り，硫酸化チロシンに特異的に結合する抗体を得ること
ができる。

【００１０】また，前記した性質のモノクローナル抗体
を得るには，例えば以下の方法で行えばよい。まず以下
のようにして遊離の硫酸化チロシン又はペプチド鎖中の
硫酸化チロシンと結合し，遊離の硫酸化されていないチ
ロシン又はペプチド鎖中の硫酸化されていないチロシン
とは結合しないモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを取得する。そのためには，例えばポリクローナ
ル抗体の場合と同様の抗原をマウスに免疫して最終免疫
後，脾臓を摘出して，例えば「単クローン抗体（講談社
サイエンチフィック：１９８３年）」に記載されている
方法により，ミエローマと脾臓細胞とを細胞融合させ，
抗硫酸化チロシン抗体を産生するハイブリドーマを得る
ことができる。その抗硫酸化チロシン抗体産生ハイブリ
ドーマを選択するためには，例えば以下の方法で行えば
よい。

【００１１】すなわち，硫酸化チロシンを免疫の時に用
いたのとは別のキャリアタンパク質結合させた抗原を９
６穴のマイクロタイタープレートに固定化する。そのプ
レートにハイブリドーマの上清を加え，常法通り酵素免
疫測定法やラジオイムノアッセイなどで硫酸化チロシン
と結合するモノクローナル抗体を産生しているハイブリ
ドーマを選択すればよい。さらに同様にチロシンを免疫
の時に用いたのとは別のキャリアタンパク質を結合させ
た抗原を固定化した９６穴のマイクロタイタープレート
を用い，同様の酵素免疫測定法やラジオイムノアッセイ
などでチロシンとは反応しないハイブリドーマを選択す
る。このようにして選択されたハイブリドーマは限界希
釈法などによりクローニングすることができる。

【００１２】このようにして得られた抗硫酸化チロシン
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは「ＭＳＹ−
２」と命名し，通商産業省工業技術院微生物（生命工
学）工業技術研究所に寄託の手続を行い，平成３年（１
９９１年）１０月３０日受諾された。その受諾番号は微
工研条寄第３６４０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４０）で
ある。

【００１３】次に，抗硫酸化チロシンモノクローナル抗
体を得るには，例えばクローニングされた抗硫酸化チロ
シンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをフ
ラスコ，ホローファイバー，攪拌培養槽などを用いて培
養し，その培養上清から硫安分画やイオン交換，プロテ
インＡセファロースなどのクロマトグラフィーで分離精
製すればよい。

【００１４】本発明のＣＣＫ測定用試薬及び測定方法
は，抗硫酸化チロシンン抗体を用いて正確なＣＣＫ活性
を測定することができる。例えば，抗硫酸化チロシン抗
体を支持体に固相化しておき，これに酵素，ＲＩ，蛍光
物質等を標識した標識抗原及び非標識抗原である標準又
は被検体のＣＣＫを加える。標識抗原と非標識抗原とを
競合させることによって，その非標識抗原量，すなわち
ＣＣＫを定量する。次いで，数種のＣＣＫ活性既知の標
準抗原と競合する標識抗原に対するシグナルを各々測定
して検量線を作成し，ＣＣＫ活性未知の検体と競合する
標識抗原から得られるシグナルをこの検量線に当てはめ
て，そのＣＣＫ活性を定量すればよい。

【００１５】また，本発明においては，抗ＣＣＫ抗体と
抗硫酸化チロシン抗体の２種類の抗体を用いて正確なＣ
ＣＫ活性を測定することもできる。例えば，抗ＣＣＫ抗
体又は抗硫酸化チロシン抗体のうちの一方を支持体（固
相）に固定化する。抗ＣＣＫ抗体又は抗硫酸化チロシン
抗体を固相に固定化するためには，一般的な物理的吸着
法を用いることができるが，官能基をもつ固相に固定化
する場合には共有結合法を用いることもできる。物理的
吸着法では，多くの場合，アルカリのｐＨで，かつ比較
的イオン強度の低い条件でよく吸着される。このとき，
抗ＣＣＫ抗体又は抗硫酸化チロシン抗体の濃度として
は，０．００１ｍｇ／ｍｌ以上が適当であり，特に０．
０５〜０．２ｍｇ／ｍｌが好ましく，これを固相と接触
させればよい。その固相としては，プラスチック試験
管，マイクロタイタープレート，ガラスビーズ，プラス
チックビーズ，メンブレン等を用いることができる。

【００１６】次に，抗ＣＣＫ抗体又は抗硫酸化チロシン
抗体を固定した固相に，数種の非標識抗原であるＣＣＫ
濃度既知の液体又はＣＣＫ濃度未知の検体を加える。さ
らにこれに酵素，ＲＩ，蛍光物質等を標識した固相化用
抗体と異なる方の抗硫酸化チロシン抗体又は抗ＣＣＫ抗
体を加える。上記の酵素としては，ＨＲＰ，ウシ小腸ア
ルカリホスファターゼ等を用いることができる。また，
ＲＩとしては，１２５Ｉを，蛍光物質としては，フルオ
レセインイソチオシアネート，テトラメチルローダミン
イソシアネートなどを用いることができる。このように
して，数種のＣＣＫ活性既知の液体の標識抗体に対する
シグナルを各々測定して検量線を作成し，ＣＣＫ活性未
知の検体から得られるシグナルをこの検量線に当てはめ
て，その検体のＣＣＫ活性を定量すればよい。

【００１７】上記で用いた抗ＣＣＫ抗体としては，ポリ
クローナル抗体，モノクローナル抗体に関係なく使用で
きるが，特に本発明においては，入手し易さの面からポ
リクローナル抗体を使用すればよい。この抗ＣＣＫポリ
クローナル抗体としては，ケンブリッジ・リサーチ・バ
イオケミカル社製の抗ＣＣＫ抗血清やケミコン社の抗Ｃ
ＣＫ抗血清などの市販品があげられる。

【００１８】

【実施例】次に，本発明を参考例及び実施例により具体
的に説明する。 参考例１ ２０ｍｇの硫酸化チロシンと１０ｍｇのＫＬＨ（シグマ
社製）を１. ２ｍｌの蒸留水に溶解してｐＨを７とし
た。この溶液に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド塩酸水溶液１ｍｌ（０. ６
ｇ／ｍｌ）を，室温で攪拌しながら添加して４℃で７２
時間反応させ，透析後凍結乾燥して硫酸化チロシンとＫ
ＬＨの結合物２４ｍｇを得た。

【００１９】また，上記と同様の方法で２０ｍｇの硫酸
化チロシンとＢＳＡ１２ｍｇとから結合物（硫酸化チロ
シン−ＢＳＡ）２０ｍｇを得た。さらに，上記と同様の
方法でチロシン２０ｍｇとＢＳＡ１２ｍｇとから結合物
（チロシン−ＢＳＡ）２４ｍｇを得た。これらは免疫及
び酵素免疫測定法の抗原として用いた。

【００２０】参考例２ 参考例１で調整した硫酸化チロシンとＫＬＨの結合物１
ｍｇを生理食塩水リン酸緩衝液（以下ＰＢＳと略す。）
１ｍｌに溶解して等量のＦＣＡ（ナカライテスク社製）
と混合してエマルジョンを作製し，マウス（ＢＡＬＢ／
ｃ，日本クレア社製）２匹に腹腔内投与により免疫し
た。３週間後に同量の硫酸化チロシンとＫＬＨの結合物
をＦＩＡ（ナカライテスク社製）とエマルジョン化した
同様に追加免疫した。さらに３週間後，硫酸化チロシン
単独で最終免疫を行い，その３日後に脾臓を摘出して細
胞をＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコ社製）に懸濁して予
め培養しておいたミエローマＰ３・Ｕ１（４×１０7 ）
と混合して５０％（％は，重量％を表す，以下同様）の
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（シグマ社
製）を用いて融合した。

【００２１】次に融合後，ＨＡＴ選択培地にて２週間培
養しているハイブリドーマを選択した後，酵素免疫測定
法にて抗硫酸化チロシン抗体を産生するハイブリドーマ
をスクリーニングした。すなわち，参考例１で得られた
硫酸化チロシン−ＢＳＡ結合物を吸着させた９６穴マイ
クロタイタープレートにハイブリドーマ上清を加え，洗
浄後パーオキシダーゼ標識ヤギマウスＩｇＧ抗体を加え
た。これを数時間放置した後，洗浄し，基質溶液を添加
して対照のものより発色している上清のハイブリドーマ
をスクリーニングして限界希釈法にてクローニングし
た。

【００２２】上記で得られたハイブリドーマの細胞数６
×１０8 をギット培地（和光純薬工業社製）６００ｍｌ
に植え込み，５％の炭酸ガス存在下に３７℃で４日間培
養した。培養後，遠心分離により細胞を除き，得られた
培養上清を水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９. ０に調整
した後，プロテインＡセファロースカラムに通液した。
通液後，トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８. ６）で洗浄した
後，グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）で溶出した抗体
画分を集めてＰＢＳに透析したところ，１．１ｍｇの抗
硫酸化チロシンモノクローナル抗体を得た。

【００２３】実施例１ 市販されている抗ＣＣＫ抗体（ケンブリッジ・リサーチ
・バイオケミカル社製）を１００μｇ／ｍｌに調整して
ポリスチレンビーズ〔６. ５ｍｍф，イチコ（株）より
購入〕を抗ＣＣＫ抗体溶液中に一晩浸した後，１％のウ
シ血清アルブミンでブロッキングして抗ＣＣＫ抗体固定
化ポリスチレンビーズを調整した。

【００２４】次に，ＨＲＰ（ベーリンガーマンハイム社
製）１. ０ｍｇにスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミド
メチル）シクロヘキサン−１−カルボキレート（ジーベ
ンケミカル社製）３０μｇをｐＨ７. ０で反応させてＨ
ＲＰにマレイミド基を導入した。次いでこれに抗硫酸化
チロシン抗体Ｆａｂ’（参考例２で得られた抗硫酸化チ
ロシンモノクローナル抗体をペプシン消化し，その後還
元して調製したもの）１. ５ｍｇをｐＨ６. ０で混合
し，マレイミド基とＳＨ基を架橋してＨＲＰ標識抗硫酸
化チロシン抗体を調製した。

【００２５】上記で作成した抗ＣＣＫ抗体固定化ポリス
チレンビーズに，標準として市販のＣＣＫ〔ガストロイ
ンテスショナル ホルモン リサーチ ユニット（Gast
rointestinal Hormone Research Unit）カロリスカ イ
ンステイテユウト(the Karolinska Institute)社製〕を
０， ０. １，０. ２，０. ３，０. ４及び０. ５アイ
ビードッグユニット（Ｉｖｙ ｄｏｇ ｕｎｉｔ）とな
るように調整した溶液５０μｌと上記で作製したＨＲＰ
標識抗硫酸化チロシン抗体Ｆａｂ’１００ｎｇ／ｍｌ濃
度のものを２００μｌを加え，３７℃で１８時間インキ
ュベートし，抗原抗体反応を行った。その後，液相を除
き，０．２％のツウイーン２０，０．２％のウシ血清ア
ルブミン及び０. １５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７. ２）でビーズを
よく洗浄した後，基質（オルトフェニレンジアミン）を
添加して活性を測定し，検量線を作成した。その結果を
図１に示す。図１は，縦軸に吸光度（４９２ｎｍ）を，
横軸にＣＣＫ活性値をそれぞれ示しており，その図から
も明らかなごとく，正確にＣＣＫを測定することができ
た。

【００２６】実施例２ ＥＬＩＳＡプレート（コーイング社製）で参考例２で得
られた抗硫酸化チロシンモノクローナル抗体を５０ｍＭ
の炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９. ６）に溶解し，ＥＬ
ＩＳＡプレートの各穴に５０μｌずつ分注し，２５℃の
温度で２時間放置した。この液を除去した後，各穴に
１．０％のＢＳＡ，０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む
２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７. ２）を充
満させ，２５℃の温度で１時間放置した。さらに，この
液を除去し，０. ２％のトウイーン２０，０. ２％のＢ
ＳＡ及び０. １５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭの
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７. ２）からなる洗浄液
で各ウエルをよく洗浄し，抗硫酸化チロシン抗体固定化
プレートを作成した。

【００２７】一方，ＨＲＰ（ベーリンガーマンハイム社
製）１０ｍｇを１％のグルタルアルデヒド０. ２ｍｌに
溶かし室温で一晩反応させた後，０. １４ＭのＮａＣｌ
に対して透析しＨＲＰに結合していないグルタルアルデ
ヒドを除いた。グルタルアルデヒドを除いた透析内液を
取り出し，０. １４ＭのＮａＣｌで１ｍｌにした。これ
にＣＣＫを０. １４ＭのＮａＣｌで５ｍｇ／ｍｌにした
溶液１ｍｌを加えた後，直ちに１Ｍの炭酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ９．５）を０．２ｍｌ加え，よく攪拌し，４
℃で一晩反応させた。さらに，１Ｍのリジンを０. １Ｍ
になるように加え，４℃で２時間反応させてグルタルア
ルデヒドの未反応アルデヒド基をブロックした後，ＰＢ
Ｓに透析してＨＲＰ標識ＣＣＫを調整した。

【００２８】次に，抗硫酸化チロシン抗体を固定化した
ＥＬＩＳＡプレートに，実施例１と同様に，標準として
市販のＣＣＫ（ガストロインテスショナル ホルモン
リサーチ ユニット（Gastrointestinal Hormone Resea
rch Unit( カロリスカ インステイテユウト(the Karol
inska Institute)) 製）を０， ０. １，０. ２，０.
３，０. ４，０. ５，０. ６，０. ７，０. ８，０.
９，１. ０，１. １，１. ２，２. ０及び４. ０アイビ
ードッグユニット（Ｉｖｙ ｄｏｇ ｕｎｉｔ）となる
ように調整した溶液５０μｌと，上記で作製した１μｇ
／ｍｌ濃度のＨＲＰ標識ＣＣＫ５０μｌを添加して２５
℃の温度で１時間反応させた後，よく洗浄し，ＨＲＰ発
色試薬５０μｌを加え，２０分間反応させ，次いで１０
％のＳＤＳ５０μｌを添加して反応を停止させることに
より，４１５ｎｍにおける吸光度を測定して検量線を作
成した。その結果を図２に示す。図２は，縦軸に吸光度
（４１５ｎｍ）を，横軸にＣＣＫ活性値をそれぞれ示し
ており，その図からも明らかなごとく，正確にＣＣＫを
測定することができた。

【００２９】なお，比較のため，市販の標準ＣＣＫを
０， ０. １，０. ２，０. ３，０.４及び０. ５アイ
ビードッグユニット（Ｉｖｙ ｄｏｇ ｕｎｉｔ）とな
るように調整した溶液について，従来のバイオアッセイ
である麻酔モルモットの胆嚢収縮法〔エス，リュングバ
ーグ（S. Ljungberg），アクタ ファーム，スエク，
（Acta Pharm. Suec.）, 6, 599 (1969) 〕と，ラジオ
イムノアッセイであるヤロウ アンド バーソン（Yalo
w and Berson）法〔アール，エス，ヤロウ（R. S.Yalow
）, エス，エイ，バーソン（S. A. Berson），ガスト
ロエンテロロジイ（Gastroenterology）, 58, 609 (197
0)〕でそれぞれのＣＣＫ活性を測定し，同時に上記で作
成した検量線を用いて実施例２の測定用試薬とその測定
方法により，５０％が硫酸化されたＣＣＫをサンプルと
して測定した。このとき，それぞれのサンプルについて
５回測定した。

【００３０】その結果を図３に示す。図３は，縦軸にＣ
ＣＫ活性の測定値を，横軸にＣＣＫ活性値をそれぞれ示
している。この図からも明らかなごとく，実施例２の試
薬とその測定方法（●）により，測定したサンプルのＣ
ＣＫ活性値は，従来のバイオアッセイ法（△）とほぼ同
様なＣＣＫ活性の測定値が得られた。ただし，バイオア
ッセイ法では，測定値にばらつきが認められた。また，
ラジオイムノアッセイ法（■）によるＣＣＫ活性の測定
値は，非硫酸化体を区別できないため，実施例２による
ＣＣＫ活性の約２倍であった。

【００３１】

【発明の効果】本発明の測定用試薬及び測定方法は，Ｃ
ＣＫの活性に影響するＣＣＫペプチド鎖中の硫酸化チロ
シンを特異的に認識する抗硫酸化チロシン抗体を用いる
ため，正確なＣＣＫ活性値を簡便，かつ短時間に定量す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の測定用試薬及び測定方法を実施するた
めに作成したＣＣＫ活性の検量線を示した図である。

【図２】本発明の測定用試薬及び測定方法を実施するた
めに作成したＣＣＫ活性の検量線を示した図である。

【図３】本発明の測定用試薬及び測定方法とバイオアッ
セイ法とラジオイムノアッセイ法との各々におけるＣＣ
Ｋ活性の測定結果を示した相関図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗硫酸化チロシン抗体を含有することを
   特徴とするコレシストキニンの測定用試薬。
2. 【請求項２】 請求項１記載の試薬を使用することを特
   徴とするコレシストキニンの測定方法。