JPH06277066A - 髄膜炎菌“Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍａｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ”のトランスフェリン受容体のサブユニットをコードするＤＮＡ断片と、その製造方法 - Google Patents

髄膜炎菌“Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍａｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ”のトランスフェリン受容体のサブユニットをコードするＤＮＡ断片と、その製造方法

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JPH06277066A
JPH06277066A JP5173773A JP17377393A JPH06277066A JP H06277066 A JPH06277066 A JP H06277066A JP 5173773 A JP5173773 A JP 5173773A JP 17377393 A JP17377393 A JP 17377393A JP H06277066 A JPH06277066 A JP H06277066A
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JP5173773A
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ジャコブ エリック
Michele Legarin
ルグラン ミシェル
Veronique Mazarin
マザラン ベロニク
Bernadette Bouchon-Theisen
ブーション−ティーザン ベルナデット
Anthony B Schryvers
ビー． シュライヴァース アンソニー
Marie-Aline Bloch
ブロック マリー−アリーヌ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 髄膜炎菌Neisseria meningitidisのトランス
フェリン受容体サブユニットをコードするＤＮＡ断片。 【構成】 N. meningitidis のIM2394株またはIM2169株
のトランスフェリン受容体に対する抗血清で認識可能な
蛋白質をコードするＤＮＡ断片と、例えばIM2394株また
はIM2169株のＴｂｐ１サブユニットあるいはIM2394株ま
たはIM2169株のＴｂｐ２サブユニットをコードするもの
と、遺伝子組み換えでこの蛋白を産生する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はネイセリア メニンギチ
ジス(Neisseria meningitidis)のトランスフェリン受容
体サブユニットをコードするＤＮＡ断片と、組み換えに
よる各サブユニットの製造方法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に、髄膜炎はウィルスまたは細菌に
よって起こる。その主たる病原菌はN.meningitidisと、
ハエモフィラスインフルエンザエ(Haemophilus influen
zae)であり、これらは細菌性髄膜炎の約40％および約50
％の原因になっている。N. meningitidis による髄膜炎
はフランスでは年間約 600〜800 件を数え、アメリカ合
衆国では年間約 2,500〜3,000 件にものぼる。N. menin
gitidis 種は莢膜多糖(polysaccaride capsulaire)の種
類によってさらに幾つかの血清グループに分類される。
約12の血清グループが存在するが、髄膜炎の90％は３種
類の血清グループＡ，Ｂ，Ｃによって引き起こされるも
のである。N. meningitidis の血清グループＡとＣによ
る髄膜炎を予防するための莢膜多糖をベースとした効果
的なワクチンは既に存在している。これらの莢膜多糖そ
れ自体は２才以下の幼児では殆ど免疫原性を持たず、免
疫記憶が誘導されないが、これら多糖をキャリア蛋白に
結合させることによってこの欠点は解決することができ
る。これに対して N. meningitidisのＢグループの多糖
は、結合体の状態でもそうでなくても、人体内でほとん
ど免疫原性を持たない。従って、N. meningitidisのグ
ループＢによって引き起こされる髄膜炎に対する多糖ベ
ースのワクチン以外のワクチンが強く要望されている。
このために、N. meningitidis の外膜の各種蛋白が提案
されている。特に、ヒトのトランスフェリンと結合する
膜受容体が提案されている。
【０００３】一般に、大部分の細菌は増殖のために鉄を
必要とし、この金属を摂取するための特別なシステムを
有している。特に、遊離状態の鉄の量は人体内ではほぼ
ゼロに近く（10-18 Ｍのオーダー）、いずれにせよ細菌
の増殖には不十分な量しかないので、人間に対して強い
病原性を持つ N. meningitidisの場合には、人間の鉄輸
送蛋白、例えば、トランスフェリンやラクトフェリンが
鉄の唯一の摂取源である。N. meningitidis は鉄とキレ
ートを作った蛋白を固定して増殖に必要な鉄を摂取する
ために、ヒトのトランスフェリンおよびラクトフェリン
の受容体を有している。
【０００４】N. meningitidis B16B６株のトランスフェ
リン受容体は膜抽出物からシュリベール(Schryvers) 達
によって単離された (ＰＣＴ特許ＷＯ90／12591 号）。
精製されたこの蛋白質はほぼ２種類のポリペプチド、す
なわちＳＤＳの存在下のポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分離する見掛け分子量が約 100ｋＤの高分子量ポリ
ペプチドと、見掛け分子量が約70ｋＤの低分子量ポリペ
プチドとで構成されている。本明細書では、シュリベー
ル達が精製した物質をトランスフェリン受容体とよび、
それを構成するポリペプチドはサブユニットとよぶこと
にする。以下では、高分子量のサブユニットと低分子量
のサブユニットをそれぞれＴｂｐ１およびＴｂｐ２とよ
ぶことにする。
【０００５】しかし、シュリベール達によって報告され
た精製方法では大規模なトランスフェリン受容体の製造
を行うことはできない。この受容体を精製した状態で工
業的に製造するには、異種発現系を用いた生産段階が必
須となる。本発明の目的は、Neisseria meningitidisの
トランスフェリン受容体のサブユニットをコードするＤ
ＮＡ断片を提供することにある。
【０００６】さらに、シュリベール達による初期の研究
以降、トランスフェリン受容体の構造が異なる少なくと
も２種類の株が存在することが分かっている。このこと
は、種々の起源を有する数十種類のNeisseria meningit
idisの株の膜抽出物を研究した結果明らかになったもの
である。すなわち、膜抽出物を先ず最初にＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分離し、次いで、ニトロ
セルロースフィルム上へ電気移送(electrotransfer)
し、このニトロセルロースフィルムを下記条件で培養し
た： a) N. meningitidis Ｂ16Ｂ６株（IM2394ともいわれ
る）から単離したトランスフェリン受容体に対する抗体
を含むウサギ血清の存在下 b) N. meningitidis IM2169株から単離されたトランス
フェリン受容体に対する抗体を含むウサギ血清の存在
下、または、 c) パーオキシダーゼに結合させたヒトトランスフェリ
ンの存在下。 a)およびb)の場合には、ウサギの免疫グロブリンに対す
る抗体をパーオキシダーゼと結合させたものを添加し、
その後、その酵素の基質を添加してトランスフェリン受
容体のサブユニットを検出（視覚化）する。下記〔表
１〕および〔表２〕は、7.5 ％ポリアクリルアミドを含
むＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で見られる代表的な株のプロ
フィールを示しており、バンドは見掛け分子量 (キロダ
ルトン(kD)で表示) で特徴付けてある。
【０００７】
【表１】
【０００８】
【表２】
【０００９】これらの表の最初の２行に記載された結果
は２種の株が存在することを示している。第１のタイプ
〔表１〕は、この実験条件下で、２つのサブユニットが
共に抗IM2394株受容体血清によって認識されるが、抗IM
2169株受容体血清では高分子量のサブユニットのみが認
識される受容体を有する株に対応している。第２のタイ
プ〔表２〕は、この実験条件下で、２つのサブユニット
が共に抗IM2169株受容体血清によって認識されるが、抗
IM2394株受容体血清では高分子量のサブユニットのみが
認識される受容体を有する株に対応する。すなわち、低
分子量サブユニットのレベルで抗原性にバラつきがある
が、このバラつきは２つの主要タイプに分けられる限定
的なものである。このことはグリフィス (Griffiths)達
の報告 (FEMS Macrobiol. Lett. (1990) 69:31) で示唆
されていることとは違っている。
【００１０】これらの事実から、N. meningitidis の全
ての感染症の予防に効果的なワクチンは、高分子量サブ
ユニットが２つのタイプの抗血清で認識されるので、受
容体の起源となる株の種類とは無関係に、高分子量サブ
ユニットのみで構成すれば十分であるということができ
る。しかし、高分子量のサブユニットは中和抗体を産生
することができないので、上記の結論は当てはまらな
い。受容体の２つのサブユニットの中で小さい方のみし
かこの機能を有さない。低分子量サブユニットの特徴は
第１タイプの株と第２のタイプの株との抗原性に大きな
バラつきがあるという点にあるので、全ての N. mening
itidis感染症に対するワクチンとしては単一タイプのト
ランスフェリン受容体では十分ではない。従って、ワク
チンは少なくともIM2394株およびIM2169株それぞれの低
分子量サブユニットを含有するか、それらの均等物、場
合によってはNeisseria meningitidisの少なくとも１種
類の株の高分子量サブユニットを含有しなければならな
い。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は Neiss
eria meningitidis のIM2394またはIM2169株の受容体に
対する抗血清で認識されるペプチド、ポリペプチドまた
は蛋白をコードする単離されたＤＮＡ断片を提供するこ
とにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明のＤＮＡ断片は下
記アミノ酸配列の相同物(homologue) をコードする塩基
配列で構成することができる： (1) 添付の配列 NO.１〔表14〜20〕の１番目のシステイ
ン残基から579 番目のグルタミン残基まで、(2) 添付の
配列 NO.２〔表21〜26〕の１番目のグルタミン酸残基か
ら884 番目のフェニルアラニン残基まで、(3) 添付の配
列 NO.３〔表27〜38〕の１番目のグルタミン酸残基から
887 番目のフェニルアラニン残基まで、または(4) 添付
の配列 NO.４〔表39〜47〕の１番目のシステイン残基か
ら691 番目のグルタミン残基まで。
【００１３】本発明のＤＮＡ断片は上記以外の任意のア
ミノ酸配列をコードする塩基配列、ハイブリッド蛋白ま
たは前駆体をコードするためのオープンリーディングフ
レームを形成する２つの塩基配列を含んでいても良い。
【００１４】
【作用】本発明のＤＮＡ断片は以下の中から選択するの
が好ましい： ｉ）配列 NO.１に示す１番目のシステイン残基から579
番目のグルタミン残基までのアミノ酸配列と相同なアミ
ノ酸配列を有する蛋白をコードした塩基配列を有する単
離された第１のＤＮＡ断片 ii）配列 NO.２に示す１番目のグルタミン酸残基から88
4 番目のフェニルアラニン残基までのアミノ酸配列と相
同なアミノ酸配列を有する蛋白をコードした塩基配列を
有する単離された第２のＤＮＡ断片 iii)配列 NO.３に示す１番目のグルタミン酸残基から88
7 番目のフェニルアラニン残基までのアミノ酸配列と相
同なアミノ酸配列を有する蛋白をコードした塩基配列を
有する単離された第３のＤＮＡ断片 iv) 配列 NO.４に示す１番目のシステイン残基から691
番目のグルタミン残基までのアミノ酸配列と相同なアミ
ノ酸配列を有する蛋白をコードした塩基配列を有する単
離された第４のＤＮＡ断片。
【００１５】“相同なアミノ酸配列”とは基準として挙
げたアミノ酸配列に対して少なくとも75％、好ましくは
80％以上、さらには90％以上、最良の条件としては100
％の相同性を示す配列を意味する。ここで、“相同な”
という用語は全く同一な場合を含むものとする。相同性
の度合いは、各配列を並べて相同性の最大値を出すこと
により、簡単に算出することができる。そのためには、
図７に示すように人工的に空間を導入する必要がある。
最適状態に整合させた場合に、２つの配列のアミノ酸が
一致する位置を全て記録することにより、位置の総数に
対して、相同性の度合いを決定することができる。組合
せの数が非常に多いので、長くなるのを避けるために相
同配列は包括的な方法によって記載する。なお、蛋白の
生物的または免疫上の機能を損なわずに一つのアミノ酸
を別のアミノ酸に置換するための一般的な法則は当業者
に公知である。
【００１６】単離された最も好ましいＤＮＡ断片は、以
下のものをコードする塩基配列を有している： ｉ）配列 NO.２に示したアミノ酸配列（１番目のグルタ
ミン酸残基から884 番目のフェニルアラニン残基まで）
を有するIM2394株のサブユニットＴｂｐ１、 ii) 配列 NO.１に示したアミノ酸配列（１番目のシステ
イン残基から579 番目のグルタミン残基まで）を有する
IM2394株のサブユニットＴｂｐ２、 iii)配列 NO.３に示したアミノ酸配列（１番目のグルタ
ミン酸残基から887 番目のフェニルアラニン残基まで）
を有するIM2169株のサブユニットＴｂｐ１、または iv) 配列 NO.４に示したアミノ酸配列（１番目のシステ
イン残基から691 番目のグルタミン残基まで）を有する
IM2169株のサブユニットＴｂｐ２。
【００１７】トランスフェリン受容体は膜蛋白質である
ので、各サブユニットは先ずＮ−末端位置で蛋白質に繋
がったシグナルペプチドを含む前駆体の形で形成され
る。従って、本発明の他の対象は、下記のアミノ酸配列
と少なくとも80％、好ましくは100 ％の相同性を示すシ
グナルペプチドをコードする単離されたＤＮＡユニット
にある： ｉ）配列 NO.２の−24番目のメチオニン残基から−１番
目のアラニン残基まで ii) 配列 NO.３の−24番目のメチオニン残基から−１番
目のアラニン残基までまたは iii)配列 NO.４の−20番目のメチオニン残基から−１番
目のアラニン残基まで。
【００１８】本発明のＤＮＡ断片は、さらに、各配列 N
O.１、２、３または４に示すアミノ酸配列と相同なアミ
ノ酸配列を有する前駆体をコードする第５〔表48〜5
8〕、第６〔表59〜66〕、第７〔表67〜75〕および第８
〔表76〜82〕のＤＮＡ断片より選択することもできる。
【００１９】“単離されたＤＮＡ断片またはユニット”
とは、ｉ）ウィルスまたはプラスミドベクターに挿入さ
れるか、または ii）異種プロモータのコントロール下
に置かれるＤＮＡ断片またはゲノム由来のユニットを意
味する。
【００２０】さらに、本発明のシグナルペプチドをコー
ドしたＤＮＡユニットは、このＤＮＡユニットがシグナ
ルペプチドとは異種の蛋白をコードするＤＮＡ断片と繋
がってハイブリット前駆体をコードするオープンリーデ
ィングフレームを形成している時も、単離されていると
見なされる。
【００２１】本発明はさらに、N. meningitidis のIM23
94株またはIM2169株の受容体に対する抗血清によって認
識可能なペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を発現す
るカセット(cassette)にも関するものである。本発明の
カセットはＤＮＡ断片の少なくとも１つが適切な宿主細
胞内でこの断片を発現させるような要素の管理下に置か
れている。この発現カセットにおいては、成熟型をコー
ドした本発明の第１、第２、第３または第４のＤＮＡ断
片は、シグナルペプチドをコードしたＤＮＡユニットと
繋がっていてもいなくても良く、これは蛋白の分泌が求
められているか否かによるものである。蛋白を分泌させ
るのが好ましく、その場合は、ＤＮＡユニットは成熟型
に相同なまたは異種のシグナルペプチドをコードして、
それぞれ自然なまたはハイブリッド前駆体を合成する。
【００２２】本発明のＤＮＡ断片の発現に必須の要素
は、転写プロモーター、翻訳開始コドンおよび終止コド
ン、場合によっては転写ターミネーターである。プロモ
ーターは恒常性のものであっても、誘導性のものであっ
てもよい。IM2394株のＴｂｐ２サブユニットをコードす
るＤＮＡ断片は、異種細胞、特にE.coliに対して毒性を
有することに注意されたい。その場合には、誘導性プロ
モーター、例えばSalmonella thyphimurium のaraBジー
ンプロモーターなどを使用するのが好ましい。異種のシ
グナルペプチド（シグナル領域）または既にかなり多数
存在しているプロモーターをコードするＤＮＡユニット
のような要素は当業者に公知であり、その専門知識によ
って、発現に使用する宿主細胞に適合するようなシグナ
ル領域または特定のプロモーターを選択することができ
よう。
【００２３】さらに、Ｔｂｐ２サブユニットは、その前
駆体がリポ蛋白質前駆体に特徴的なシグナルペプチドを
有し、さらにアミノ基末端位置にシステインを有し、ア
ミノ基末端システインのわずかに下流に“ターン”型構
造をとる傾向の非常に強いアミノ酸（４個のグリシン）
を有することから、リポ蛋白質であることに注意された
い（Wu&Tokunaga, Current Top. Micob. Immunol. (198
6) 125: 127 参照）。リピデーションによってＴｂｐ２
の免疫原性が強化されている可能性がある。原核生物系
では、Ｔｂｐ２サブユニットを、それ自身の前駆体か、
またはリピデーションを可能にするような適当な異種シ
グナルペプチド、つまりＴｂｐ２以外のリポ蛋白のシグ
ナルペプチドを有する前駆体より得るのが好ましい。そ
のようなシグナルペプチドの特徴は、前駆体をタイプII
シグナルペプチダーゼで開裂させることによって遊離さ
れる点にある。シグナルペプチドの開裂部位の配列はコ
ンセンサス配列（Ｌ，Ｖ，Ｉ）（Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｇ）
（Ｇ，Ａ）Ｃ (システイン（Ｃ）は成熟型配列の最初の
アミノ酸である) に対応している。異種シグナルペプチ
ドの例としては、リポ蛋白質ColE1 、ColE3 、Lpp 、Nl
pA、OsmB、Pal 、RlpBおよびTraTを挙げることができ、
これらの配列は、対応する塩基配列と共に、配列 NO.９
〜24〔表83〜114 〕に示されている。
【００２４】結論として、本発明の特殊実施例では、本
発明の発現カセットは、(1) 配列 NO.１の１番目のシス
テイン残基から579 番目のグルタミン残基まで、または
(2) 配列 NO.４の１番目のシステイン残基から691 番目
のグルタミン残基まで、に示されるものに相同なアミノ
酸配列を有する蛋白を製造するための、 ｉ）Ｔｂｐ２サブユニット以外のリポ蛋白質のシグナル
ペプチド、例えばシグナルペプチドRlpBをコードするＤ
ＮＡユニットと、 ii) 上記蛋白をコードするＤＮＡ断片とで構成される。
【００２５】本発明はさらに、(i) 本発明の発現カセ
ットを含む宿主細胞を培養し、上記ペプチド、ポリペプ
チドまたは蛋白を培養液から回収することを特徴とする
N. meningitidisのIM2394株またはIM2169株の受容体に
対する抗血清によって認識されるペプチド、ポリペプチ
ドまたは蛋白を製造する方法と、(ii) この方法で参戦
されたペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質と、(iii)
これらを含む医薬組成物、特にワクチン用組成物とを提
供する。本発明方法を実施する場合の宿主細胞は哺乳類
細胞、酵母または細菌、特に細菌が好ましい。また、手
順も当業者が容易に選択できる。
【００２６】また、本発明の医薬組成物は、発現に必要
な要素の管理下で本発明のＤＮＡ断片が挿入さたゲノム
を有するウィルスまたはバクテリア由来のベクターを活
性成分として含むことができる。適当なベクターの例と
してはポックスウィルス、アデノウィルスおよび乳酸菌
を挙げることができる。
【００２７】本発明の医薬組成物はN. meningitidis 感
染症の予防処置に特に有用である。本発明医薬組成物は
通常の方法、特に臨床的に有効な量を担体または希釈剤
と組み合わせて製造することができる。この組成物は、
本明細書の技術分野、特にワクチン分野において通常行
われている任意の方法で投与することができる。特に経
口投与（腸溶性の薬剤として）または非経口的に投与す
ることができる。投与は１回で行っても、ある一定の期
間後に繰り返して投与してもよい。投与方法は治療を受
ける個人（体調、年令その他）等の各種のパラメータに
よって変る。組成物はさらに、薬学上使用可能なアジュ
バントを含んでいても良い。
【００２８】本発明の対象を決定するためのN. meningi
tidis のIM2394株（B16B6 とも呼ばれる）およびIM2169
株（M982とも呼ばれる）は登録番号ＣＩＰ7908およびＣ
ＩＰ7917でパスツール研究所（75015 パリ リュ デュ
ドクトゥール ロワ 25 ）から誰でも入手することが
できることを明記しておく。
【００２９】N. meningitidis のIM2394株およびIM2169
株のトランスフェリン受容体に特異的な抗血清は、以下
の実施例に記載の方法で得ることができる。以下、図１
〜13を参照して実施例を挙げて本発明をより詳細に説明
する。
【００３０】図１はラムダ ZAPIIファージの構造と、そ
のクローニング方法をスキームで示したものである。ラ
ムダZAPII は、プラスミド部分（ブルースクリプトSK）
にマルチクローニングサイトを備えた挿入ベクターであ
る。このプラスミド部分が、試験管内でヘルパーファー
ジとの共感染によって切り出され、プラスミドベクター
へと変換される。蛋白をコードする配列がlacZと相を同
じくして融合するか、クローンされたＤＮＡ断片がE.co
li内で機能するプロモーターを有していれば、特定の抗
体を用いて認識される所望の蛋白が生産されることにな
る。
【００３１】図２は、プラスミドpTG1265 の構造を示
し、pTG1265 はプラスミドpGB2よりチャーチワード達の
方法（Churchward et. al., Gene (1984) 31 : 165) に
より以下のようにして得られる：pGB2 をEcoRI およびH
indIII で切断し、クレノー（Klenow) ポリメラーゼで
処理し、1-kb SspI-PvuII 断片内にリゲーションする。
この断片はミード達の方法（Mead et al., Protein Eng
ineering (1986) 1 : 67 ; Pharmacia) でpT7T3184 か
ら得られるもので、マルチクローニングサイトと共にf1
-ori、lacZ配列、プロモータT3およびT7を備えている。
【００３２】図３はIM2394株のＴｂｐ１およびＴｂｐ２
をコードする配列を含むＤＮＡ領域と、クローニングさ
れた各種断片の遺伝子地図を示している。Ｂ＝BamH1 、
Ｅ＝EcoRI 、Ｈ＝HincII、Ｒ＝EcoRV 、Ｘ＝XbaI、Ｃ＝
ClaIを示す。
【００３３】図４はIM2169株のＴｂｐ１およびＴｂｐ２
をコードする配列を含むＤＮＡ領域と、クローニングさ
れた各種断片の遺伝子地図を示している。Ｃ＝ClaI、Ｈ
＝HincII、Ｍ＝MluI、Ｘ＝XbaI、？＝不確定な位置、を
示す。
【００３４】図５はプラスミド pARA13 の構造を示して
いる。pARA13は Salmonella typhimurium のアラビノー
スオペロン BAD(paraB) −TATAボックスの段階で変化さ
せたもの−と、AraC遺伝子を有し、E.coli内で複製可能
なプラスミドである。プロモータParaB の下流はマルチ
挿入部位になっている。 pARA プラスミドシリーズはカ
ノン達の報告（Cagnon et al., Prot. Eng. (1991) 4 :
843) に記載されている。
【００３５】図６は発現ベクターpTG3749 を作製する際
の方法を示したものである。
【００３６】図７および図８はIM2394およびIM2169株の
Ｔｂｐ１サブユニットの予想アミノ酸配列を比較したも
のである。相同性の度合いは約76％と推定される。
【００３７】図９および図10はIM2394およびIM2169株の
Ｔｂｐ２サブユニットの予想アミノ酸配列を比較したも
のである。相同性の度合いは約47％と推定される。
【００３８】図11は発現ベクターpTG3779 を作製する際
の方法を示すものである。
【００３９】図12は発現ベクターpTG4710 を作製する際
の方法を示すものである。
【００４０】図13は発現ベクターpTG4764 を作製する際
の方法を示すものである。
【００４１】
【実施例】実施例１ IM2394 株のトランスフェリン受容体のＴｂｐ１および
Ｔｂｐ２サブユニットをコードしたＤＮＡ断片のクロー
ニング １Ａ. 株の培養およびトランスフェリン受容体の精製 N. meningitidis 2394株の凍結乾燥体を約１mlのミュー
ラーヒントン(Mueller-Hinton)ブロス（ＢＭＨ、ディフ
コ(Difco) 社製）に取る。細菌懸濁液を加熱した血液
（５％）を含むミューラーヒントン固体培地に広げる。
10％の二酸化炭素を含む雰囲気下、37℃で24時間培養
後、増殖した細菌群を集め、３個の 250mlエーレンマイ
ヤーフラスコに分集した pH 7.2 のＢＭＨ 150mlに接種
する。37℃で攪拌しながら３時間培養する。こうして作
られた３つの培養液の各々を、遊離の鉄のキレート剤で
あるエチレンジアミンジ（ｏ−ヒドロキシフェニル酢
酸）（ＥＤＤＨＡ、シグマ(Sigma) 社製）30μＭを補充
した pH 7.2のＢＭＨ 400mlへ植付けすることができ
る。37℃で攪拌しながら16時間培養後、培養液の透明度
をグラム染色後に顕微鏡で観察してモニターする。懸濁
液を遠心分離し、微生物を含むペレットの重量を測定
し、−20℃で保存する。
【００４２】精製はほぼシュリベール達によって報告さ
れた方法（上記）で行う。細菌ペレットを溶かし、pH
8.0の 50mM トリス−塩酸バッファー（バッファーＡ）2
00 mlに再懸濁させる。懸濁液を４℃で20分、15,000×
ｇで遠心分離する。ペレットを回収し、バッファーＡに
再懸濁し、最終濃度を 150ｇ／リットルとする。150 ml
の画分をとり、高圧で運転されている細胞溶解装置（ラ
ニー(Rannie)社製、8.30Ｈ型）に入れ、800 気圧で８分
間処理する。得られた細胞溶解物を４℃で15分、15,000
×ｇで遠心分離する。上澄みを回収して４℃で、75分
間、200,000 ×ｇで遠心分離する。上澄みを除去した
後、ペレットをバッファーＡに懸濁し、ローリー(Lowr
y) 法で蛋白定量した後に、懸濁液の濃度を５mg／mlに
調節する。シュリベール記載の方法に従い、ビオチン化
(biotinylated)したヒトトランスフェリン 1.75mg を
1.4mlの膜懸濁液に添加する。膜成分の最終濃度を４mg
／mlとする。混合物を37℃で１時間インキュベートし、
次いで、４℃で75分間、100,000 ×ｇで遠心分離する。
膜ペレットを 0.1Ｍの塩化ナトリウムを含むバッファー
Ａに懸濁し、室温で60分インキュベートする。可溶化し
た後、一定量の30％(w/v) N-ラウロイルサルコシンと、
500 mM のＥＤＴＡをこの懸濁液に添加し、サルコシル
およびＥＤＴＡの最終濃度をそれぞれ0.5 ％および５mM
にする。37℃で攪拌しながら15分間インキュベーション
し、次いで、予めバッファーＡ中で洗浄したストレプト
アビジン−アガロース（ピアース(Pierce)社製）１mlを
添加する。懸濁液を室温で15分培養し、1,000 ×ｇで10
分間遠心分離を行う。その後、樹脂をカラムに詰め、直
接流出した溶離液は廃棄する。１Ｍの塩化ナトリウム
と、10mMのＥＤＴＡと、0.5 ％のサルコシルとを含む p
H 8.0 の 50mM トリス−塩酸バッファー（バッファー
Ｂ）を、カラム容積の３倍量用いて樹脂を洗浄した後、
750 mMのグアニジン塩酸を含有するバッファーＢをカラ
ム容積と等量用いて樹脂を洗浄する。続いて、２Ｍのグ
アニジン塩酸を含有するバッファーＢを用いてトランス
フェリン受容体を溶出させる。１Ｍの塩化ナトリウムを
含有する pH 8.0 の50mMトリス−塩酸バッファーを等量
入れた試験管に溶出液を分画する。カラムの出口でＵＶ
検出器を用いて溶出液の光学濃度を 280nmで測定する。
溶出ピークに相当する画分を集め、0.05％のサルコシル
を含む pH8.0の10mMリン酸バッファーで透析し、凍結乾
燥させる。凍結乾燥体を10倍濃度で水に懸濁する。0.05
％のサルコシルを含む pH8.0の50mMリン酸バッファー
（バッファーＣ）中で第２回目の透析を行い、次いで、
この溶液を孔隙率が0.22μｍのメンブレンで濾過する。
蛋白濃度を無菌条件下で測定し、バッファーＣを加え、
１mg／mlに調節する。この調製液を−70℃で保存する。
【００４３】 １Ｂ. トランスフェリン受容体に特異的な抗血清の調製 白子のニュージーランドラビットに、フロイントの完全
アジュバントに混合した 100μｇのIM2394受容体を皮下
注射および筋肉注射で投与する。最初の注射から21日お
よび42日経過後に、ウサギに再度100 μｇの精製した受
容体を、この場合はフロイントの不完全アジュバントと
混合して与える。最後の注射から15日経過後に動物から
血清を取り出し、デコンプリメントして孔隙率が0.45μ
ｍのメンブレンで濾過する。その後、濾液を、予め遊離
の鉄を加えて培養しておいた（こうすることによってト
ランスフェリン受容体の形成が抑えられる）初期株と接
触させて完全に吸収させる。接触方法は以下の通り：10
mlの濾液を、1010cfu(コロニー形成単位、unites forma
nt des colonies)のIM2394の培養液に添加する。攪拌し
ながら、４℃で１夜吸収させた後、遠心分離で細菌を除
去する。上澄み液を回収し、上記要領でさらに２回続け
て吸収操作を行う。
【００４４】 １Ｃ. ＤＮＡ断片を同定するペプチド配列の決定 １Ａで得られた材料を等分したものを乾燥し、２倍に濃
縮したラームリ（Laemmli)のバッファー（65mMトリス、
３％ＳＤＳ、10％グリセロール、５％２−メルカプトエ
タノール）に溶解する。等量の水を添加する。超音波処
理後、材料を２分間90℃に加熱し、ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動する。こうして分離したサブユニットを
pH8.3 の50mMトリス−ホウ素バッファー中、400mA で16
時間、ＰＶＤＦ膜（Immobilon, Millipore) に転写す
る。電気転写されたサブユニットをアミドブラックで染
色し、Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２に対応するバンドを回収
してＮ−末端のマイクロシーケンシング（微量配列決
定）に供する。これを数回繰り返し、下記〔表３〕に示
すＮ−端のコンセンサス配列を決定する。
【００４５】
【表３】
【００４６】Ｔｂｐ２の内部領域の配列を決定するため
に、ＰＶＤＦ膜上の蛋白を、pH8.2の0.1 Ｍトリスバッ
ファー中でトリプシンで切断する。37℃で４時間反応
後、70％のギ酸、続いて0.1 ％のトリフルオロ酢酸（TF
A)でペプチドを抽出する。このペプチドをＨＰＬＣで分
離する。IM2394のＴｂｐ２について、内部配列は下記
〔表４〕のように決定された：
【００４７】
【表４】
【００４８】１Ｄ. ゲノムＤＮＡの調製 １Ａで得られた細菌ペレットを、10mgのプロテナーゼＫ
を添加した溶液Ａ（50mMのグルコースおよび10mMのＥＤ
ＴＡを含むpH８の25mMトリス塩酸バッファー）約25mlに
再懸濁する。混合物を室温に10分間放置する。続いて、
10mgのリゾチームを含む溶液Ａ12.5mlを添加する。混合
物を再度室温で10分間放置する。混合物に0.5 mlの10％
サルコシルを補給し、４℃で10分間インキュベートす
る。続いて、２mgのＲＮＡ分解酵素２mgを添加し、37℃
で90分間インキュベーションを継続する。連続４回のフ
ェノール抽出を行いＤＮＡを精製する。最終的に水層に
存在するＤＮＡをエタノールで沈澱させる。セシウムク
ロライド密度勾配遠心分離によって高分子量ＤＮＡが得
られる。
【００４９】１Ｅ. クローニング 以下の要領で、ラムダZAP ベクター（図１）内に第１の
ＤＮＡライブラリーを作製する。ゲノムＤＮＡの調製物
を超音波処理で断片とする。得られた断片の末端をＴ4
ポリメラーゼでブラント化する。断片をメチル化する。
メチル化後、断片を EcoRIアダプターに繋げ、EcoRI で
処理してラムダZAPII ファージ（ストラタジーン(Strat
agene)社）のEcoRI 部位に挿入する。E. coli のXL1-bl
ue株( ストラタジーン社) を、上記で得られたＤＮＡラ
イブラリーで感染させる。１Ｂに記載の要領で調製した
IM2394株の受容体に特異的な抗血清を用い、白い溶菌プ
ラーク（組み換えファージが存在する）を試験した。こ
のことによって、２個のラムダZAPII クローンが同定さ
れた。これらのクローンに含まれるｐブルースクリプト
プラスミドはヘルパーファージの共感染によって摘出さ
れ、pBMT1 およびpBMT2 と呼ばれる。プラスミドpBMT1
およびpBMT2 はそれぞれ、3.8 kb および1.3 kbの Eco
RI-EcoRI 断片を有する。これらを図３に示す。
【００５０】ショットガン法（Bankier and Barrell,
Biochemistry(1983) B5 : 508)に従い、以下の要領でpB
MT1 のEcoRI- EcoRI挿入部分の配列を決定した：pBMT1
のEcoRI- EcoRI挿入部分を精製し、超音波処理して断片
とする。断片の末端をＴ4 ポリメラーゼで処理してブラ
ント化する。以上のように処理した断片をM13TG131ファ
ージ（キーニー達（Kieny et al., Gene (1983) 26 : 9
1)により報告されている）の部位に導入する。この調製
で得られた約200 のクローンの配列を決定した。それら
の配列をコンピュータ分析してpBMT1 内のEcoRI- EcoRI
挿入部分の完全な配列が再編成された。Ｔｂｐ１のＮ−
末端をコードする配列は、図３に示すようにその位置が
決定された。Ｔｂｐ１の分子量を考慮すれば、この挿入
部分がＴｂｐ１をコードする全てのＤＮＡ断片を含んで
いないことは明らかである。tbp1遺伝子の５’末端の上
流にオープンリーディングフレームが同定されたが、tb
p2遺伝子のＮ−末端をコードする領域を明らかに同定す
ることはできなかった。従って、Ｔｂｐ２の内部領域の
マイクロシーケンシングが、上記１Ｃに記載の通り確認
された。Ｃ−末端よりにある内部配列は、事実、tbp1の
上流のオープンリーディングフレームの３’部分に対応
していた。さらに、予めHincIIで切断したIM2394株のゲ
ノムＤＮＡを、pBMT1 の3.8-kb挿入部分の1.5-kbのHinc
II-HincII 領域に相当する放射性ＤＮＡプローブを用い
て、サザンブロッティングにより分析した。この結果、
２本のバンドが検出された。このことによって、pBMT1
に含まれる挿入部分は、別々な２箇所の座から得られた
配列が人為的に組み合わされて形成されたものであるこ
とが示される。tbp2の５’配列は従って存在しない。
【００５１】上記のラムダZAP 中のゲノムＤＮＡライブ
ラリーを、今度はpBMT2 に挿入されたEcoRI- EcoRI挿入
部分をプローブとして再度スクリーニングする。試験し
た200,000 個のプラークのうち内、29個の候補が得られ
た。誘導プラスミドpTG2749のみが、pBMT1 およびpBMT2
に関して新しい挿入部分を有していることがわかっ
た。pTG2749 の挿入部分は図３に示す通りである。挿入
部分のEcoRV 部位の上流領域（EcoRV-EcoRI 領域）をM1
3TG31 にサブクローニングし、サンガー達（Sanger et
al., PNAS (1977) 74 : 5463) に従って、合成プライマ
ーを用いて配列を決定した。Ｔｂｐ２のＮ−末端に相当
する配列がこうして得られる。IM2394株のＴｂｐ２をコ
ードするＤＮＡ断片の配列を、対応するアミノ酸配列と
共に、配列 NO.１に示す。成熟型Ｔｂｐ２をコードする
配列のすぐ上流に、pTG2749 の挿入部分が別の座から得
られた異なったゲノム領域を有している。これも、pBMT
1 の場合に検出されたものに類似の、クローニングによ
る人為構造である。ここで見られる再構成と、tbp1の
３’配列とtbp2の５’配列が存在しないことを考えて、
ラムダZAP 内に作られたゲノムＤＮＡライブラリーは、
クローニングを継続するには不適当であると判断され
た。
【００５２】その為以下の要領で、低コピープラスミド
内に第２のゲノムＤＮＡライブラリーを作製した：ゲノ
ムＤＮＡ調製物を部分的にSau3A で切断した。ショ糖密
度勾配遠心により４〜６kbのＤＮＡ断片を精製し、プラ
スミドpTG1265 のBamHI 部位に挿入する。このプラスミ
ド調製物を用いて、E. coli の５Ｋ株を形質転換した。
このライブラリーは約18,000個の独立したクローンを含
んでいると推定された。pBMT2 のEcoRI- EcoRI挿入部分
に対応する放射性プローブを用いて、第２のライブラリ
ーより得られる約50,000個のクローンを試験した。観察
されたクローンはたった１つ、つまり1.8-kbの挿入部分
を有するプラスミドpTG2759 であった。この挿入部分の
サイズは、Ｔｂｐ１をコードする遺伝子全てを含むには
不十分であると判断された。
【００５３】前パラグラフに記載の方法に従い (但しE.
coli ５Ｋ株をE. coli SURE株（ストラタジーン社) に
代えて) 第３のＤＮＡライブラリーを作製した。このラ
イブラリーは約60,000個の独立したクローンを含むもの
と推定された。下記実施例２に記載の図４に示したpTG2
754 の挿入部分より得られた2.4kb のMluI-HincII 断片
に対応する放射性プローブを用いて、第３のＤＮＡライ
ブラリーより70,000個のクローンを試験した。２個のク
ローン、つまり図３に示すプラスミドpTG2780 とpTG278
1 が検出された。pTG2780 とpTG2781 の挿入部分の配列
はサンガー法によって決定した。対応するアミノ酸配列
と共に配列 NO.２に示す。
【００５４】第４のライブラリーを作製した。ゲノムＤ
ＮＡをSau3A で切断し、約７kbの断片を含む画分をショ
糖密度勾配遠心により精製する。この画分は、tbp2に特
異的なＤＮＡプローブによって認識されたことから、tb
p1、2 の座に対応した断片を含んでいることが判る。Ec
oRV およびXbaIで切断し、SmaIおよびXbaIで切断したpT
G1265 中にリゲーションした後、E. coli 5Kを形質転換
した。tbp2に特異的なプローブを用いてクローンをスク
リーニングした。結果がプラスであった一連のクローン
のうち、特にpTG3791 を検討し、推定されているTbp2の
シグナルペプチドをコードした配列を含むtbp2の５’末
端配列を含有することが判明した。
【００５５】実施例２ IM2169株のトランスフェリン受容体のＴｂｐ１およびＴ
ｂｐ２サブユニットをコードするＤＮＡ断片のクローニ
ング ２Ａ. IM2169株の培養およびトランスフェリン受容体の
精製は、実施例１Ａに記載のものと同条件下に行った。 ２Ｂ. IM2169株の受容体に対する血清の調製は実施例１
Ｂに記載の方法に従って行った。 ２Ｃ. ＤＮＡ断片を同定する為のペプチド配列は、実施
例１Ｃに記載の方法に従って決定した。決定されたマイ
クロシーケンスは下記〔表５〕の通りである。
【００５６】
【表５】 ２Ｄ. IM2169株のゲノムＤＮＡの調製は、実施例１Ｄに
記載の方法に従って行った。
【００５７】２Ｅ. クローニング 上記実施例１に記載の要領で、第１のゲノムＤＮＡライ
ブラリー（Sau3A ＤＮＡの部分断片；pTG1265 ；E.ｃol
i 5K) を作製した。このライブラリーは約40,000個の独
立したクローンを含有し、そのうち約70％が４〜６kbの
挿入部分を有しているものと推測された。pBMT2 のEcoR
I-EcoRI 挿入部分に対応する放射性プローブを用いて、
上記ライブラリーより130,000 個のクローンを試験し
た。42個のクローンを分析し、そのうち図４に示す２個
のプラスミド：pTG2753 およびpTG2754 が残った。サザ
ンブロット分析の結果、pTG2753 およびpTG2754 の挿入
部分の制限酵素地図はゲノムＤＮＡの制限酵素地図に対
応していた。塩基配列の決定およびＮ−末端をコードす
る領域と内部領域の探索を行った結果、以下のことが示
された： (1) pTG2753 の1.9kb の挿入部分は、tbp2遺伝子の３’
部分とtbp1遺伝子の５’部分とを含有する；さらに(2)
pTG2754 の挿入部分はtbp2遺伝子の３’部分とtbp1遺伝
子の３’および５’部分とを含有するが、相の分裂が見
られる。この第１のライブラリーは従って、Ｔｂｐ１ま
たはＴｂｐ２をコードするＤＮＡ断片全体をクローニン
グすることはできなかった。
【００５８】上記の要領で、しかしXbaIで切断したゲノ
ムＤＮＡを用いて、第２のゲノムライブラリーを作製し
た。ショ糖密度勾配遠心を行ってＤＮＡ断片を精製し
た。tbp1の３’末端（pTG2754 の挿入部分の断片）に対
応する放射性プローブを用いて、サザンブロッティング
により、各画分（約500 μｌ）を試験した。ハイブリダ
イゼーション反応を示し、約６kbの断片を有する画分
を、pTG1265 へとクローニングした。E.coliの5K株を形
質転換した。pTG2754 より得られる0.6kb のHincII-Mlu
I 断片に対応する放射性プローブを用いて、上記ライブ
ラリーのうち約2,400 個のクローンを試験した。５個の
クローンの特徴が明らかになり、そのうち２個、つまり
pTG3720 およびpTG3721 が残り、これらは図４に示すよ
うにいずれもtbp1およびtbp2遺伝子を含んでいる。Ｔｂ
ｐ１をコードする塩基配列を完成させる為に、pTG3720
の挿入部分の、pTG2754 の挿入部分において相分裂が発
見された領域の配列を決定した。この配列決定により、
pTG2754 の挿入部分の相分裂は22bpの欠落によるもので
あることが示された。ＤＮＡ断片の完全な配列は配列 N
O.３に示す通りである。pTG3720 の挿入部分の配列決定
を行ってtbp2の配列を決定した。上記配列は実際に同定
されたが、この場合も相分裂が観察された。結局、tbp2
の配列はプラスミドpTG3721 より決定された。この配列
を配列 NO.４に示す。
【００５９】実施例３ IM2394株のＴｂｐ２サブユニットをコードするＤＮＡ断
片の発現 ３Ａ．発現ベクターpTG3749 の作製 プラスミドpARA13 (図５；Cagnon et al.,Prot. Eng.
(1991) 4 : 843) のSphI部位をクレノーポリメラーゼ
で処理して破壊し、プラスミドpTG3704 を作製する。Nc
oI開裂によってpTG3704 を直鎖状とし、クレノーポリメ
ラーゼで処理してブラント末端を作製し、HindIII で切
断する。さらに、オリゴペプチドOTG4015 およびOTG401
6 を合成して対とする。
【００６０】
【表６】
【００６１】２本鎖ＤＮＡ断片OTG4015 ／OTG4016 を、
上記の要領で処理したpARA13に挿入してプラスミドpTG3
717 を作製し、このプラスミドにおいてはErwinia caro
tovoraの蛋白質PelB前駆体のＮ−末端部分をコードする
配列、つまり下記〔表７〕に示す配列が再構成されてい
る（Lei et al., J. Bact. (1987) 169: 4379)。
【００６２】
【表７】
【００６３】プラスミドpTG2749 より、図６に示すよう
な、Tbp2のＮ−末端部分をコードする領域から内部のMl
uI部位までを含む断片を、プライマーOTG4015 およびOT
G4016 を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョン）により作製する。
【００６４】
【表８】
【００６５】ＰＣＲにより作製された断片をBamHI で切
断し、ファージM13TG131のBamHI 部位に挿入してM13TG3
724 を作製する。この断片の配列はシーケンシングを行
ってチェックした。SphI-MluI 断片の状態でM13TG3724
より取り出したＴｂｐ２のＮ−末端部分をコードする領
域を、続いて予めSphIおよびMluIで切断しておいたpTG3
717 に挿入してプラスミドpTG3743 を作製する。プラス
ミドpBMT1 より、Ｔｂｐ２のＣ−末端部分をコードする
領域を、BanIの粘着性末端をクレノーポリメラーゼでブ
ラント化したMluI-BanI 断片の状態で取り出す。この断
片を予めHindIII で切断し、クレノーポリメラーゼで処
理して最後にMluIで切断したpTG3743 に挿入し、プラス
ミドpTG3749 が得られる。
【００６６】３Ｂ．Ｔｂｐ２サブユニットの作製 E.coli MC1061(Casadaban & Cohen, J. Mol. Biol. (19
80) 138 : 179)を、pTG3749 で形質転換し、２ｇ／リッ
トルのグリセロールおよび100 μｇ／mlのアンピシリン
を添加したＬＢ培地で、温度37℃で培養した。指数増殖
期の培養液に、0.2 ｇ／リットルのアラビノースを添加
する。６時間培養を継続する。アラビノースを添加して
から１時間以内に発現が観察された。細胞溶解物全体を
ポリアクリルアミド電気泳動した結果、約70kDの蛋白質
が存在し、この蛋白はペロキシダーゼでラベルしたヒト
トランスフィリンに結合可能であった。
【００６７】実施例４ IM2169株のＴｂｐ２サブユニットをコードするＤＮＡ断
片の発現 ４Ａ．発現ベクターpTG3779 の作製 予め対にしたオリゴヌクレオチドOTG4038 およびOTG403
9 より成る合成断片をNcoIおよびHindIII で切断したプ
ラスミド pTG3704に挿入し、プラスミド pTG3756を作製
した。
【００６８】
【表９】
【００６９】プラスミドpTG2754 より、Ｔｂｐ１の前駆
体のＮ−末端をコードする領域からMluI部位までを含む
断片を、プライマーOTG4037 およびOTG4014 を用いてＰ
ＣＲにより作製する。
【００７０】
【表１０】
【００７１】このＰＣＲ断片をBamHI で切断し、M13TG1
31のBamHI 部位にクローニングしてM13TG3738 を作製
し、この断片の配列をチェックした。M13TG3738 をSphI
で直鎖状とし、T4ＤＮＡポリメラーゼで処理して末端を
ブラント化し、続いてMluIで切断してＴｂｐ１の前駆体
のＮ−末端をコードする領域を有する断片を単離した。
この断片を、NcoIで切断してT4ＤＮＡポリメラーゼで処
理したpTG3856 に挿入し、続いてMluIで切断してプラス
ミドpTG3778 を作製した。NcoI°／SphI°連結部の配列
をチェックした。Ｔｂｐ１の主要部分（３’tbp1) をコ
ードするpTG3720 のMluI-XbaI 断片をプラスミドpTG377
8 に挿入し、最終的にプラスミドpTG3779 を得た。
【００７２】４Ｂ．Ｔｂｐ１サブユニットの生成 E.coli MC1061 をpTG3779 で形質転換し、37℃のＬＢ培
地で培養する。指数増殖期の培地に0.2 ｇ／リットルの
アラビノースを添加する。４時間培養を継続する。細胞
溶解物全体を含む試料をポリアクリルアミドゲル電気泳
動した結果、約100 kDの蛋白質の存在が示され、この蛋
白は受容体に対する抗体によって認識された。
【００７３】実施例５ IM2394株のＴｂｐ２サブユニットをコードするＤＮＡ断
片（相同なシグナル配列と共に構成されている）の発現 ５Ａ．発現ベクターpTG4710 の作製 プラスミドpTG3749 より、Ｔｂｐ２のＣ−末端部分（内
部のBamHI 部位より）をコードし、tbp2の翻訳終了コド
ンの下流のHindIII 制限部位を含む断片を、プライマー
OTG4247 およびOTG4248 を用いてＰＣＲにより作製し
た。
【００７４】
【表１１】
【００７５】ＰＣＲによって作製された断片をHindIII
およびBamHI で切断し、成熟型Ｔｂｐ２のＮ−末端部分
をコードする pTG3749のSphI-BamHI断片と共に、SphIお
よびHindIII で切断したベクター pTG3743 に挿入し、
プラスミド pTG3786を作製する。ＰＣＲによって増幅さ
れた断片の配列を確認した。ＰＣＲにより、プライマー
OTG4491 およびOTG4494 を用いて、プラスミドpTG3791
よりＴｂｐ２前駆体のＮ−末端部分をコードし、内部Ec
oRV 部位までの断片を作製した。
【００７６】
【表１２】
【００７７】ＰＣＲにより作製された断片を続いてBspH
I およびEcoRV で切断し、araC遺伝子とaraBプロモータ
を含むpTG3704 のNcoI-SstI 断片と、tbp2の３’部分と
araBターミネーターを含むpTG3786 のEcoRV-Sst1断片に
同時にリゲーションする。得られたプラスミドpTG4710
をシーケンシングによってチェックする（ＰＣＲで増幅
された断片の配列）。
【００７８】５Ｂ．Ｔｂｐ２サブユニットの作製 E. coli Xac-I (Nomanly et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. (1986) 83, 6548)を、プラスミドpTG4710 で形質転
換し、Ｍ９培地＋0.5 ％サクシネート＋50μｇ／mlアル
ギニン＋100 μｇ／mlアンピシリン中、37℃で培養を行
った。指数増殖期に、0.2 ％のアラビノースを添加す
る。誘導時間を様々に変えて（１時間から３時間）細胞
を回収し、抽出物を調製する。ウェスタンブロット分析
後、トランスフェリン−ペロキシダーゼを用いてＴｂｐ
２を視覚化したところ、Ｔｂｐ２のほとんどが前駆体の
状態で生成していることが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で抽出物を分析し、蛋白質をコマシーブルーで染色し、
蛋白質が多量に生成していることが検出された（全蛋白
の５〜10％）。希釈系列をとったパルミチン酸エステル
とグリセロールを用いて生体内でラベル試験を行った結
果、成熟型だけがリピデートしていることが示された。
【００７９】実施例６ IM2394株のＴｂｐ２サブユニットをコードしたＤＮＡ断
片の発現（rlpBシグナル配列と共に構成されている） ６Ａ．発現ベクターpTG4764 の作製 pTG3786 より、RlpBシグナルペプチドをコードする断片
（Takase et al., J.Bacteriol. (1987) 169 : 5692）
と、成熟型のＴｂｐ２をコードする配列の最初から内部
のEcoRV 部位までの断片を、プライマーOTG4494 および
OTG4651 を用いてＰＣＲにより作製する。 OTG4494 ：実施例１参照
【００８０】
【表１３】
【００８１】ＰＣＲ断片をBspHI およびEcoRV で切断
し、tbp2遺伝子の３’部分を有するpTG3786 のEcoRV-Hi
ndIII 断片と共に、NcoIおよびHindIII で切断したベク
ターpTG3704 に挿入し、プラスミドpTG4764 を作製す
る。ＰＣＲで増幅された断片の配列をチェックする。
【００８２】６Ｂ．Ｔｂｐ２サブユニットの生成 E. coli Xac-I をプラスミドpTG4764 で形質転換し、Ｍ
９培地＋0.5 ％サクシネート＋50μｇ／mlアルギニン＋
100 μｇ／mlアンピシリン中、37℃で培養を行った。指
数増殖期に、0.2 ％のアラビノースを添加する。誘導時
間を様々に変えて（１時間から３時間）細胞を回収し、
抽出物を調製する。ウェスタンブロット分析後にトラン
スフェリン−パーオキシダーゼを用いて視覚化した結
果、成熟型のＴｂｐ２の分子量に相当する分子量を有す
る主要なバンドが観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで抽出
物を分析し、蛋白質をコマシーブルーで染色し、蛋白質
を検出した（生成量は全蛋白質の２〜５％と測定され
た）。希釈系列をとったパルミチン酸エステルとグリセ
ロールを用いて生体内でラベル試験を行った結果、生成
した蛋白質がリピデートしていることが示された。Xac-
I ／pTG4764 株からは、Xac-I ／pTG4710 株よりも多量
のリピデートした成熟型Ｔｂｐ２が生成した。
【００８３】配列リスト
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【００８４】
【表２１】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【００８５】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【表３２】
【表３３】
【表３４】
【表３５】
【表３６】
【表３７】
【表３８】
【００８６】
【表３９】
【表４０】
【表４１】
【表４２】
【表４３】
【表４４】
【表４５】
【表４６】
【表４７】
【００８７】
【表４８】
【表４９】
【表５０】
【表５１】
【表５２】
【表５３】
【表５４】
【表５５】
【表５６】
【表５７】
【表５８】
【００８８】
【表５９】
【表６０】
【表６１】
【表６２】
【表６３】
【表６４】
【表６５】
【表６６】
【００８９】
【表６７】
【表６８】
【表６９】
【表７０】
【表７１】
【表７２】
【表７３】
【表７４】
【表７５】
【００９０】
【表７６】
【表７７】
【表７８】
【表７９】
【表８０】
【表８１】
【表８２】
【００９１】
【表８３】
【表８４】
【００９２】
【表８５】
【表８６】
【００９３】
【表８７】
【表８８】
【００９４】
【表８９】
【表９０】
【００９５】
【表９１】
【表９２】
【００９６】
【表９３】
【表９４】
【００９７】
【表９５】
【表９６】
【００９８】
【表９７】
【表９８】
【００９９】
【表９９】
【表１００】
【０１００】
【表１０１】
【表１０２】
【０１０１】
【表１０３】
【表１０４】
【０１０２】
【表１０５】
【表１０６】
【０１０３】
【表１０７】
【表１０８】
【０１０４】
【表１０９】
【表１１０】
【０１０５】
【表１１１】
【表１１２】
【０１０６】
【表１１３】
【表１１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ラムダ ZAPIIファージの構造と、そのクロー
ニング法のスキーム。
【図２】 プラスミドpTG1265 の構造を示す図。
【図３】 IM2394株のＴｂｐ１およびＴｂｐ２をコード
する配列を含むＤＮＡ領域と、クローニングされた各種
断片の遺伝子地図を示す図。
【図４】 IM2169株のＴｂｐ１およびＴｂｐ２をコード
する配列を含むＤＮＡ領域と、クローニングされた各種
断片の遺伝子地図を示す図。
【図５】 プラスミドpARA13の構造を示す図。
【図６】 発現ベクターpTG3749 を作製する方法を示す
図。
【図７】 IM2394およびIM2169株のＴｂｐ１サブユニッ
トの予想アミノ酸配列の比較を示す図。
【図８】 図７の続き。
【図９】 IM2394およびIM2169株のＴｂｐ２サブユニッ
トの予想アミノ酸配列の比較を示す図。
【図１０】 図９の続き。
【図１１】 発現ベクターpTG3779 を作製する方法を示
す図。
【図１２】 発現ベクターpTG4710 を作製する方法を示
す図。
【図１３】 発現ベクターpTG4764 を作製する方法を示
す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 エリック ジャコブ フランス国 67120 ドルリシェーム グ ランドゥ リュ 107 (72)発明者 ミシェル ルグラン フランス国 67120 ドルリシェーム グ ランドゥ リュ 107 (72)発明者 ベロニク マザラン フランス国 69002 リヨン リュ ダン ギアン 28 (72)発明者 ベルナデット ブーション−ティーザン フランス国 67100 ストラスブール リ ュ デ カルム 30 (72)発明者 アンソニー ビー． シュライヴァース カナダ国 ティー３エイ ３ヴィ８ アル バータ カルガリー エドフォース ロー ド エヌダブリュ 39 (72)発明者 マリー−アリーヌ ブロック フランス国 69005 リヨン リュ エド モンロカール 134

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 N. meningitidis のIM2394株およびIM21
    69株のトランスフェリン受容体に対する抗血清によって
    認識可能なペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質をコー
    ドする単離されたＤＮＡ断片。
  2. 【請求項２】 下記アミノ酸配列に相同なアミノ酸配列
    をコードする塩基配列を含む請求項１に記載のＤＮＡ断
    片： (1) 添付の配列 NO.１の１番目のシステイン残基から 5
    79番目のグルタミン残基まで、(2) 添付の配列 NO.２の
    １番目のグルタミン酸残基から 884番目のフェニルアラ
    ニン残基まで、(3) 添付の配列 NO.３の１番目のグルタ
    ミン酸残基から 887番目のフェニルアラニン残基まで、
    または(4) 添付の配列 NO.４の１番目のシステイン残基
    から 691番目のグルタミン残基まで。
  3. 【請求項３】 下記アミノ酸配列をコードする塩基配列
    を含む請求項２に記載のＤＮＡ断片： (1) 配列 NO.１の１番目のシステイン残基から579 番目
    のグルタミン残基まで (2) 配列 NO.２の１番目のグルタミン酸残基から884 番
    目のフェニルアラニン残基まで (3) 配列 NO.３の１番目のグルタミン酸残基から887 番
    目のフェニルアラニン残基まで、または (4) 配列 NO.４の１番目のシステイン残基から691 番目
    のグルタミン残基まで。
  4. 【請求項４】 下記アミノ酸配列に相同なアミノ酸配列
    を有する蛋白質をコードする塩基配列を有する請求項２
    に記載のＤＮＡ断片： (1) 配列 NO.１の１番目のシステイン残基から579 番目
    のグルタミン残基まで (2) 配列 NO.２の１番目のグルタミン酸残基から884 番
    目のフェニルアラニン残基まで (3) 配列 NO.３の１番目のグルタミン酸残基から887 番
    目のフェニルアラニン残基まで、または (4) 配列 NO.４の１番目のシステイン残基から691 番目
    のグルタミン残基まで。
  5. 【請求項５】 下記をコードする塩基配列を有する請求
    項４に記載のＤＮＡ断片： i ）配列 NO.２に示すアミノ酸配列の１番目のグルタミ
    ン酸残基から884 番目のフェニルアラニン残基までを有
    するIM2394株のサブユニットＴｂｐ１ ii) 配列 NO.１に示すアミノ酸配列の１番目のシステイ
    ン残基から579 番目のグルタミン残基までを有するIM23
    94株のサブユニットＴｂｐ２ iii)配列 NO.３に示すアミノ酸配列の１番目のグルタミ
    ン酸残基から887 番目のフェニルアラニン残基までを有
    するIM2169株のサブユニットＴｂｐ１、または iv) 配列 NO.４に示すアミノ酸配列の１番目のシステイ
    ン残基から691 番目のグルタミン残基までを有するIM21
    69株のサブユニットＴｂｐ２。
  6. 【請求項６】 下記のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配
    列を有する前駆体をコードする塩基配列を有する請求項
    ２に記載のＤＮＡ断片： (1) 配列 NO.１の−20番目のメチオニン残基から579 番
    目のグルタミン残基まで (2) 配列 NO.２の−24番目のメチオニン残基から884 番
    目のフェニルアラニン残基まで (3) 配列 NO.３の−24番目のメチオニン残基から887 番
    目のフェニルアラニン残基まで、または (4) 配列 NO.４の−20番目のメチオニン残基から 691番
    目のグルタミン残基まで。
  7. 【請求項７】 下記をコードする塩基配列を有する請求
    項１または２に記載のＤＮＡ断片： i ）配列 NO.２に示すアミノ酸配列の−24番目のメチオ
    ニン残基から884 番目のフェニルアラニン残基までを有
    するIM2394株のサブユニットＴｂｐ１の前駆体、 ii) 配列 NO.１に示すアミノ酸配列の−20番目のメチオ
    ニン残基から579 番目のグルタミン残基までを有するIM
    2394株のサブユニットＴｂｐ２の前駆体、 iii)配列 NO.３に示すアミノ酸配列の−24番目のメチオ
    ニン残基から887 番目のフェニルアラニン残基までを有
    するIM2169株のサブユニットＴｂｐ１の前駆体、または iv) 配列 NO.４に示すアミノ酸配列の−20番目のメチオ
    ニン残基から691 番目のグルタミン残基までを有するIM
    2169株のサブユニットＴｂｐ２の前駆体。
  8. 【請求項８】 N. meningitidis のIM2394株またはIM21
    69株のトランスフェリン受容体に対する抗血清によって
    認識可能なペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質を産生
    するための発現カセットにおいて、発現に必要な要素の
    管理下に置かれた請求項１〜７に記載のＤＮＡ断片を有
    する発現カセット。
  9. 【請求項９】 上記ＤＮＡ断片が S. typhimurium のar
    aBプロモータを含む要素の管理下にある請求項８に記載
    の発現カセット。
  10. 【請求項１０】 下記のアミノ酸配列： (1) 配列 NO.１の１番目のシステイン残基から579 番目
    のグルタミン残基まで (2) 配列 NO.４の１番目のシステイン残基から691 番目
    のグルタミン残基まで に相同なアミノ酸配列を有する蛋白質を産生するため
    の、 ｉ）シグナルペプチドRlpBをコードしたＤＮＡユニット
    と ii）上記蛋白質をコードしたＤＮＡ断片とを有する請求
    項８または９に記載の発現カセット。
  11. 【請求項１１】ｉ）シグナルペプチドRlpBをコードした
    ＤＮＡユニットと ii）上記サブユニットをコードしたＤＮＡ断片とで構成
    される N. meningitidisのIM2394株またはIM2169株のＴ
    ｂｐ２サブユニットを産生するための請求項10に記載の
    発現カセット。
  12. 【請求項１２】 請求項８〜11に記載の発現カセットに
    よって形質転換された宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 N. meningitidis のIM2394株またはIM
    2169株のＴｂｐ２サブユニットに対する抗血清によって
    認識可能なペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質を産生
    するための方法において、 請求項12に記載の宿主細胞を培養して上記ペプチド、ポ
    リペプチドまたは蛋白質を培養液より回収する方法。
  14. 【請求項１４】 請求項13に記載の方法で得られるN. m
    eningitidis のIM2394株またはIM2169株のＴｂｐ２サブ
    ユニットに対する抗血清によって認識可能なペプチド、
    ポリペプチドおよび蛋白質を活性成分として含有する医
    薬組成物。
  15. 【請求項１５】 ゲノム内に請求項１〜７に記載のＤＮ
    Ａ断片を有し、その断片が発現に必要な要素の管理下に
    あるウィルスまたは細菌ベクターを活性成分として含有
    する医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 下記のアミノ酸配列に相同なアミノ酸
    配列を有するシグナルペプチドをコードする単離された
    ＤＮＡユニット： (1) 配列 NO.２の−24番目のメチオニン残基から−１番
    目の残基まで、(2) 配列 NO.３の−24番目のメチオニン
    残基から−１番目のアラニン残基まで、および、(3) 配
    列 NO.４の−20番目のメチオニン残基から−１番目のア
    ラニン残基まで。
  17. 【請求項１７】 下記のアミノ酸配列を有するシグナル
    ペプチドをコードする単離されたＤＮＡユニット： (1) 配列 NO.２の−24番目のメチオニン残基から−１番
    目の残基まで、(2) 配列 NO.３の−24番目のメチオニン
    残基から−１番目のアラニン残基まで、および(3) 配列
    NO.４の−20番目のメチオニン残基から−１番目のアラ
    ニン残基まで。
JP5173773A 1992-06-19 1993-06-21 髄膜炎菌“Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍａｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ”のトランスフェリン受容体のサブユニットをコードするＤＮＡ断片と、その製造方法 Pending JPH06277066A (ja)

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