JPH0627732B2 - 分析素子の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的液体のような液体試料の測定用試験
具もしくは素子の分野における改良に関する。特に、本
発明は、均一性特異的結合試験用の試験試薬をはじめと
する試験試薬を包含せしめた試験具もしくは素子に関す
る。

試験片及び同様の固体状分析素子は、種々のタイプの液
体試料、特に、生物学的液体の分析においてあたりまえ
のこととなつてきている。それらは、例えば、病気の診
断において有益である。それらは、広汎な分野、特に、
グルコース、蛋白質、潜血等種々の尿成分及び血液成分
を検出するための生体外の診断具として、多年に亘り、
知られかつ用いられている。例えば、米国特許第3,012,
976号；第3,164,534号；及び第3,485,587号を参照され
たい。

特異的結合試験を行うのに用いることができる試験具が
製造されている。特異的結合試験は、液体媒体中に極め
て低濃度で存在し、診断上、医学上、環境上及び工業上
重要な種々な有機物質を測定するのに有用である。それ
らの試験は配位子（ligandリガンド）とも言われてい
て、測定下で結合可能な分析対象物とそれに対する結合
相手との間の特異な相互作用を基礎としている。分析対
象物及びその結合相手の１つがハプテン（hapten，不完
全抗原）もしくは抗原であり、他方がそれに相当する抗
体である場合、この試験は、免疫試験として知られてい
る。例えば、米国特許出願第255,521号（１９８１年４
月２０日出願）、第202,378号（１９８０年１０月３０
日出願）及び第253,147号（１９８１年４月１０日出
願）を参照されたい。その各々には、かかる特異的結合
試験具が開示されて一般に知られている。

これらの試験片、及び同様の試験具では、試料を適用し
て試験具への適用場所から試薬が移動し去つてしまう原
因を招く場合には、それら試験具がもたらす結果の信頼
性が不確かなものとなつていた。このことは、試験具全
体に亘つての試薬濃度の非一様性及びその結果として、
検出しうる信号もしくは応答濃度の非一様性の原因とな
る。このために、単一試料と接触している単一試験具
が、試験具表面のどの部分が読み取りに用いられたかに
よつて、１つに定まらない様々な信号濃度を与えること
になる。

リンギング(ringing)効果と呼ばれているこれを回避す
るための試みに、従来用いられてきた方法は、展開層(s
preading layers)を使用することであつた。例えば、米
国特許第3,992,158号及び英国特許出願2,052,057号を参
照されたい。それらの主張するところによると、展開は
展開層においておこり、かつ展開された試料は、横方向
の静水圧を受けずに、試薬含有層にさらされるので、
“リンギング”現象が回避される。これらの層は、試験
具の製造を更に複雑とし、かつ費用もかさむものにす
る。

本発明は、試薬の移行の問題に向けられ、かつ解決する
ものであり、更に、展開層の必要性を回避するものであ
る。試験具全体に亘つての試薬濃度の一様性は、液体試
料の適用後でさえも保たれる。試験具表面のどの部分が
読み取られるかと関係なく、しかも、展開層を必要とす
る試験具より実質的に簡単な試験具で、信頼性の高い一
様かつ正確な信号濃度を得ることができる。

本発明は、特定の分析対象物についての液体試料の測定
に有用な分析素子の製造方法を提供するものである。本
発明は、（ａ）単一層分析対象物検出層に、分析対象物
検出系の反応性試薬を含む試薬水溶液、及び下記試薬移
行阻止物質をイオン化するのに有効なpH５以上に調整す
ることのできる緩衝剤を含有する水性溶液を包含させ、
ついで、この単一層分析対象物検出層を乾燥する工程、 （ｂ）この乾燥した単一層分析対象物検出層に、有機溶
剤；該分析対象物検出系に含まれる前記の試薬以外の試
薬；並びにカルボン酸ポリマー、スルホン酸ポリマー、
ポリアミン及びポリチロシンから選択される、非イオン
化形態であるがイオン化可能であって、非イオン化形態
では該溶媒に可溶である試薬移行阻止物質；を含む有機
性溶液を含有させ、ついでこれを乾燥する工程。

試薬移行阻止物質は、メチルビニルエーテルとマレイン
酸モノメチルエステルの共重合体のような、マレイン酸
モノエステルポリマーであることが好ましく、試薬移行
阻止物質をイオン化する条件は、工程(a)の液体が水性
であり、かつ、pHが少なくとも約５であり、緩衝液の介
在によつて達成されることが好ましい。

工程(b)の液体は、好ましくは、アセトンのような有機
質の液体である。本発明によつて達成される便利さは、
例えば、免疫試験素子等の特異的結合試験において、特
に貴重である。好ましい実施態様においては、水性試料
を、本発明に従つて製造された特異的結合試験片に加え
ると、分析対象物又はその特異的結合類縁体に標識成分
が結合した標識複合体が、水に不溶でイオン化されない
酸の形の試薬移行阻止物質中に一時的に物理的に固定さ
れた状態で捕獲され、そのことによつて、試料が展開す
る間移行することを阻止される。しかしながら、工程
(a)の緩衝液がそのイオン化効果を発揮するだけの時間
が経過するや否や、試薬移行阻止物質は、イオンの形で
かつ溶解する形に変換され、従つて複合体は、自由に、
分析対象物−応答反応に参加するようになる。

本発明は、従来の試験片及び同様のデザインの他の分析
素子の便利さの特徴のすべてを有する試験具を提供する
ものである。試験されるべき媒体は、分析対象物を含有
すると思われる、天然に存在する液体又は人工的に形成
された液体でもよく、通常、生物学的液体又はその稀釈
液である。試験できる生物学的液体としては、血清、プ
ラズマ、尿、唾液及び羊膜液と脳脊髄液が挙げられる。

本発明の試験素子には、血液、プラズマ、血清及び尿の
成分（分析対象物）の測定用として周知の、ここでは、
分析対象物検出系と呼ばれている試薬組成物を包含させ
ることができる。これらとしては、分析対象物に対し
て、特異的な酵素又は基質、及び検出しうる変化をおこ
すレドツクス指示薬及び螢光団(fluors)をはじめとする
更なる必要試薬をしばしば包含する。それらとしては、
分析対象物に対する特異的結合相手が存在する分析対象
物（リガンド）検出用の系、また、逆に液体媒体の分析
対象物もしくはリガンドとの結合キャパシティを検出す
るための系（通常は、分析対象物もしくはリガンドとの
結合相手が溶媒中に存在するため）も包含する。特定の
分析対象物に関する液体試料の測定は、それらの試薬方
法のすべてを包むよう意図されている。分析対象物は、
通常、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、炭水水物、糖
蛋白質、ステロイド、又は生物学的系に、それに対する
特異的結合相手が存在するか又は合成されうる他の有機
分子である。治療薬監視法(therapeuticdrugmonitorin
g)は、これらの特異的結合試験素子を応用したもので価
値のあるものである。

本発明の分析素子に用いられる担体は、種々の形をとる
ことができ、本願において、広汎なものとして意図され
ている。担体は、単一層分析対象物検出層であり同一若
しくは異なる吸収性又は他の物理的性質を有する若しく
はそれ以上の適切な材料からなることができる。例え
ば、米国特許第3,552,928号；第4,046,514号；及び4,84
5,247号を参照せよ。担体は、ろ紙のような吸収性のあ
る材料からなることが好ましく、分析対象物検出系の試
薬の溶液もしくは懸濁液がそこに含浸される。これらの
担体についての概念のすべては、他の物であっても、こ
の発明において用いることができる。担体として、どん
な材料が選ばれても、その構造と形状が何であつても、
その選択は、試薬系及び、試験具の予定された用途によ
つて決められる。

これらの試験系を有する試験具は、検出しうる応答即ち
螢光、燐光、化学ルミネセンスのような主として電磁輻
射線信号及び液体試料中で試験している分析対象物（リ
ガンド）の存在若しくは量に関連した可視スペクトル内
又は外の光吸収又は光反射の変化をもたらす。検出しう
る応答は、直接に感覚を通して又は分光光度計、紫外光
線読み取り装置、螢光計、又は他の読み取り装置のよう
な付属検出装置を用いて観察することができる。

試験具の製造 試薬移行によつて引き起こされる難点を克服するための
広範囲な研究の過程で、数多くの化合物が試験された。
これらの化合物としては、Ｋｌｕｃｅｌ ＬＦ（クルー
セル・エルエフ、登録商標）及びKlucelＧ（クルーセル
・ジー）のヒドロキシプロピルセルロース｛ヘルキユー
ス，インコーポレーテツド，ウイルミントン，デラウエ
ア(Hercules,Inc.,Wilmington,DE)｝、Gafquat７３４
（ガフコツト７３４，登録商標）の第４ジメチルアミノ
エチルメタクリレートとビニルピロリドンの共重合体
｛ジーエーエフ・コーポレーシヨン，ニユーヨーク，ニ
ユーヨーク（GAF Corp.,New York,NY)｝、Gantrez AN-
139（ガントレツツAN-139，登録商標）のメチルビニル
エーテルと無水マレイン酸の共重合体｛ジーエーエフ・
コーポレーシヨン（GAF Corp.），同上｝、酢酸セルロ
ース｛イーストマン・ケミカル・プロダクツ，インコー
ポレーテツド，キングスポート，テネシー（Eastman Ch
emical Products,Inc.,Kingsport,TN)｝、及びNatrosol
MR（ナトロゾール・エムアール，登録商標）とNatros
ol LR（ナトロゾール・エルアール）のヒドロキシエチ
ルセルロース｛ヘルキユース・インコーポレーテツド・
(Hercules,Inc.)，同上｝が挙げられる。いずれも、問
題解決の能力を示さなかつた。

従来の試験具の場合のように、本発明は所与の試験を行
うのに必要なすべての試薬を包含せしめた、１種又は別
種から作られた固体状担体を提供するもので、これによ
つて、使用者は、試験具を試験すべき試料と接触させ、
かつ得られた応答を測定する仕事をするだけでよい。か
かる従来の試験具とは異なり、本発明の試験具は、次の
説明及び実施例によつて、詳細に述べられかつ示される
ように、試薬移行阻止の利点を達成するものである。

それ自体、本発明は、結果の信頼性に悪影響を伴う、液
体試料と接触した際の試薬の移行が実質的にない試験具
を提供するものである。

ある好ましい実施態様においては、試薬移行阻止物質は
カルボン酸のポリマーである。かかるカルボン酸のポリ
マー類として、例えば、(1)メチルビニルエーテルとマ
レイン酸モノメチルエステルの共重合体、(2)メチルビ
ニルエーテルとマレイン酸モノエチルエステルの共重合
体、(3)メチルビニルエーテルとマレイン酸モノプロピ
ルエステルの共重合体、(4)メチルビニルエーテルとマ
レイン酸モノブチルエステルの共重合体、(5)酢酸ビニ
ルとマレイン酸モノメチルエステルの共重合体、(6)酢
酸ビニルとマレイン酸モノエチルエステルの共重合体、
(7)エチレンとマレイン酸モノメチルエステルの共重合
体、(8)エチレンとマレイン酸モノエチルエステルの共
重合体、(9)オクタデシルビニルエーテルとマレイン酸
モノメチルエステルの共重合体及び(10)オクタデシルビ
ニルエーテルとマレイン酸モノエチルエステルの共重合
体であつてよい。

カルボン酸ポリマーをイオン化するのに効果的な条件
は、例えば、工程(a)において、そのpHが少なくとも約
５である水性溶液を用いることによつて達成される。こ
れは、例えば、バイシンナトリウム｛バイシン(bicine)
はN,N−ビス（２−ヒドロオキシエチル）グリシンであ
る。｝、グリシルグリシン、エーエムピー(AMP)緩衝液
〔２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール〕、テイ
ーエーピーエス(TAPS)〔Ｎ−トリス−（ヒドロキシメチ
ル）−メチル−３−アミノプロパンスルホン酸〕、及び
テイーアールアイエス(TRIS)〔トリス−（ヒドロキシメ
チル）−アミノメタン〕を含む適切な緩衝液を用いるこ
とによつて達成される。

別の実施態様においては、試薬移行阻止物質は、スルホ
ン酸ポリマーである。例えば、かかるスルホン酸ポリマ
ー類としては、ポリスチレンスルホン酸塩、２−アクリ
ルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸とスチレンの
共重合体、及びポリビニルスルホン酸であつてよい。

ポリスルホン酸類をイオン化するのに効果的な条件は、
例えば、工程(a)において、ある水性溶液を用いて達成
され、用いられる特定のポリスルホン酸のpkaに相当す
るpH範囲に保たれて、スルホン酸基をイオン化する。

更に別の実施態様においては、試薬移行阻止物質はある
pH範囲ではイオン化され、異なるpH範囲では、イオン化
されないポリアミンである。例えば、かかるポリアミン
類としては、ポリリジン、ポリアルギニン及びポリヒス
チジンであつてもよい。

ポリアミン類をイオン化するのに効果的な条件は、工程
(a)において、ある水性溶液を用いて達成され、用いら
れる特定のポリアミンのpkaに相当するpH範囲に保たれ
て、アミン基がイオン化される。

更に別の実施態様においては、試薬移行阻止物質は、イ
オン化しうるフエノールである。例えば、かかるイオン
化しうるフエノール類としてはポリチロシンであつても
よい。

イオン化しうるフエノールをイオン化するのに効果的条
件は、例えば、工程(a)において、ある水性溶液を用い
て達成され用いられる特定のフエノールのpkaに相当す
るpH範囲に、保たれて、フエノール基がイオン化され
る。

本発明において意図されているように、移行阻止物質の
溶解性としては、完全な溶解がおこることを要求しては
いない。存在する移行阻止物質の１０％というように、
少ない比率の溶解でさえも、所望の結果を達成するのに
十分でありうる。分析対象物検出系の成分同志の相互反
応を可能にする程度の溶解が要求されているだけなので
ある。

非イオン形の移行阻止物質の、工程(a)の液体への不溶
性は、そのイオン形と比較して、溶解度及び溶解速度が
著しく低減されたものでなければならない。

本発明において意図されているように、移行阻止物質の
イオン化としては、移行阻止物質のイオン化されうる官
能基の各々又は大部分がイオン化されることを要求して
はいない。実際、試験具中に成分を適切に配合すれば、
移行阻止物質のイオン化されうる官能基の１０パーセン
トというような、少ない比率のイオン化でさえ、試験具
全体に亘る、試薬濃度及び信号濃度の所望の、一様性を
達成するのに十分でありうる。

(a)の試薬は、例えば、(i)分析対象物に対する特異的結
合相手、又は(ii)分析対象物に対する特異的結合相手、
及び分析対象物もしくはその特異的結合類縁体に結合し
た標識成分からなる標識複合体と反応して標識成分を切
断しうる成分とからなっていてもよい。

この１つの実施態様としては、(a)水性溶液中の組成物
であつて、β−ガラクトシダーゼ、及び分析対象物に対
する抗体からなるものを、マレイン酸モノエステルポリ
マーのカルボキシル基をイオン化するのに効果的な条件
下で、担体に含浸せしめ、次に、この担体を乾燥する工
程；及び次に、(b)工程(a)で得られた担体に、有機溶媒
中の組成物であつて、β−ガラクトース−ウンベリフエ
ロン−分析対象物もしくは分析対象物類縁複合体及びマ
レイン酸モノエステルポリマーからなる組成物を含浸せ
しめ、ついでこの担体を乾燥する工程で構成された、液
体試料中の分析対象物を測定するための均一系特異的結
合試験具の製造方法がある。

一具体的例としては、(a)水性溶液中の、組成物であつ
て、β−ガラクトシダーゼ、及びゲンタマイシンに対す
る抗体からなる組成物を、マレイン酸モノエステルポリ
マーのカルボキシル基をイオン化するのに効果的な条件
下で、担体に含浸せしめ、ついで、この担体を乾燥する
工程；及び次に、(b)工程(a)で得られた担体に、アセト
ン含有液体中の組成物であつて、β−ガラクトース−ウ
ンベリフエロン−シソマイシン複合体及びマレイン酸モ
ノエステルポリマーからなる組成物を含浸せしめ、つい
で、この担体を乾燥する工程からなる、液体試料中のゲ
ンタマイシンを測定するための均一系特異的結合試験素
子の製造方法がある。

別の実施態様としては、(a)水性溶液中の組成物であつ
て、グルコース、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシ
ダーゼアポ酵素及び分析対象物に対する抗体からなる組
成物を、マレイン酸モノエステルポリマーのカルボキシ
ル基をイオン化するのに効果的な条件下で、担体に含浸
せしめ、ついで、この担体を乾燥する工程；及び次に、
(b)工程(a)で得られた担体に、アセトン含有液体中の組
成物であつて、フラビンアデニンジヌクレオチド−分析
対象物もしくは分析対象物類縁体複合体、３，３′，
５，５′−テトラメチルベンジジンのようなテトラアル
キルベンジジン及びマレイン酸モノエステルポリマーか
らなる、組成物を含浸せしめ、ついで、この担体を乾燥
する工程からなる、液体試料中の分析対象物を測定する
ための均一系特異的結合試験素子の製造方法がある。

別の実施態様としては、工程(a)及び工程(b)に先立ち、
素子が試料と接触するまでは、指示試薬が工程(a)の試
薬と反応をおこさないようにするのに効果的な液体中で
指示試薬を、担体に含浸し、次に、この担体を乾燥する
付加工程からなる方法がある。この指示試薬は、３，
３′，５，５′−テトラメチルベンジジンのようなテト
ラアルキルベンジジンからなることが好ましい。

この実施態様の一具体例としては、(1)アセトン含有液
体中の、ある組成物、すなわち、３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジンからなる組成物を担体に含浸
し、ついで、この担体を乾燥する工程；次に、(2)水性
溶液中のある組成物、すなわちグルコース、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼアポ酵素及びテオフイ
リンに対する抗体からなる組成物を、マレイン酸モノエ
ステルポリマーのカルボキシル基をイオン化するのに効
果的な条件下で、工程(1)で得られた担体に含浸せし
め、ついで、この担体を乾燥する工程；及び、次に(3)
アセトン含有液中のある組成物、すなわち、フラビンア
デニンジヌクレオチド−テオフイリン複合体及びマレイ
ン酸モノエステルポリマーからなる組成物を、工程(2)
で得られた担体に含浸せしめ、ついで、この担体を乾燥
する工程からなる、液体試料中のテオフイリンを測定す
るための均一性特異的結合試験素子の製造方法がある。

種々の濃度の移行阻止物質で実験をした結果、所望の効
果を達成するのに十分な最低量が含まれていること以外
は、濃度範囲は特に重要ではないことが観察された。こ
の最低量は、用いられている特異的分析対象物−検出系
と両立するように決められるであろう。

試験具は、自己支持でもあるいは支持体に固着されても
よい。支持体は、光もしくは他のエネルギーに対し、不
透明であつても透明であつてもよい。どんな特定の担体
用の支持体の選択は、信号検出の意図された型式と両立
するものとなるであろう。支持体としては、約２００nm
と約９００nm間の範囲内の波長の電磁輻射線を伝達でき
る不透明支持体材及び透明支持体材が挙げられる。１又
はそれ以上の狭い波長帯域を伝達するが、近接する波長
帯域に対しては不透明である支持体を有することも又望
ましい。このことは、例えば、適切な吸収特性を有する
１又はそれ以上の着色剤を支持体に含浸もしくは塗布す
ることにより達成されるであろう。典型的な支持体は、
ポリスチレン、厚紙(cardboard)もしくは様々の他の構
造的に安定な材料から製造される。

次の実施例は、本発明に到達する際に行われた実験を述
べるものである。それらは、本発明の重要な特徴を証拠
だてる比較例を提供すると同時に実際の製造及び好まし
い実施態様の使用を示すものであるが、それらは本発明
の範囲を限定するものではない。

比較例１、比較例２、実施例１、実施例２、実施例３、
実施例４、実施例６、実施例７及び実施例８では、螢光
が、水平位置に保持された分析素子からの螢光発光を測
定するために、特に製造された｛エイムズ・カンパニ
ー，マイルス・ラボラトリーズ，インコーポレーテツ
ド，エルクハート，インヂアナのデイビジヨン(Ames Co
mpany,Division of Miles Laboratories Inc.,Elkhart,
IN)により｝光学繊維螢光計を用いて測定された。この
計器は、連続発光水銀ランプ励起光源、光学繊維読み取
り部、螢光検出用光電子増倍管及び読み取られるべき分
析素子の機械的保持器を用いた。この機械的素子保持器
は、Seralyzer （セラライザー，登録商標）反射光度
計｛エイムズ・カンパニー(Ames Company)，同上｝の保
持器と同様である。素子は、水平位置に静止して保持さ
れ、読み取られる露出面は上に向いており、そして上か
ら読み取られる。螢光計は、表面に対し９０°の角で素
子表面を照射する４０５nmの波長の励起光源をつくるた
めに、波長干渉フイルターを備えている。４０５nmの波
長で発する螢光光線の前面測定は、又パツドの表面と９
０°の角でなされる。

比較例１−ポリマーなしに製造された素子 この例は、本発明による試薬移行阻止物質なしに、素子
が製造された場合の実験を報告する。

素子の製造 素子の製造においては、与えられた量の螢光複合体β−
ガラクトース−ウンベリフエロン−フエノバルビタール
（β−GUPB）を各素子に導入することが必要である。こ
の例で用いられたβ−GUPB複合体は、米国特許第4,279,
992号の例９に記載されているようにして製造した。フ
エノバルビタールは、鎮痙剤、催眠剤及び鎮静剤として
有用である。これらの実験で試験された素子の製造に用
いた溶液は、以下の成分を含有した： β−ガラクトシダーゼの１エイムズ(Ames)単位は、２５
℃で、0.003M ONPGを含有するpH8.5の0.05Ｍバイシンナ
トリウムの水性緩衝液中で、１分間に、1.0マイクロモ
ルのオルト−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド(ONPG)を加水分解して、オルト−ニトロフエノール
を生成する酵素量である。

１枚の7.6cm×15.2cmのホワツトマン(Whatman)３１ETろ
紙｛ホワツトマン，インコーポレーテツド，クリフト
ン，ニユージヤージー(Whatman,Inc.Clifton,NJ)｝に、
飽和するまで、上に製造した水性溶液を含浸し、次に、
５０℃で１５分間対流炉中で乾燥した。ついで、水性溶
液の乾燥残査を含有するろ紙に、同様の方法で飽和する
まで、有機性溶液を含浸し、次に再び、５０℃で１５分
間対流炉中で乾燥した。

この含浸紙を銀メツキしたMylar （マイラー，登録商
標）ポリエステルフイルム｛スリーエム・カンパニー，
セント・ポール，ミネソタ（３Ｍ Campany,st.Paul,M
N)｝の接着面に貼り、一面に取り外し可能な裏打ちを有
するＹ９１５接着剤｛スリーエム・カンパニー（３Ｍ
Campany)，同上｝に更に貼り着けた積層体を形成した。
この最後の積層体を１cm巾のリボンに裁断し、取り外し
可能な裏打ちを取り外してから、8.3cm巾のTrycite
（トリサイト、登録商標）ポリスチレンフイルム｛ス
リーエム・カンパニー（３Ｍ Campany)，同上｝の側端
から0.64cmの位置に貼り着けた。トリサイト貼付積層体
を、横方向に切断して、５mm巾の試験片とし、従つて最
終的試験片の各々は、５mm×１０mmの含浸紙切片（セグ
メント）を具備する。

分析操作 このようにして製造した各試験具を、３０μ量の蒸溜
水に接触させて試験した。

試験具を、装置の試験片保持器に設置した後、一定量の
試験溶液を、試験具の露出表面にピペツドで添加し、試
験片保持器を、螢光検出計に挿入した。

複合体とβ−ガラクトシダーゼとを３分間反応させた
後、螢光種(species)の移動を、含浸紙の露出表面の異
なる位置点から、発光する螢光を走査して測定した。移
行指数、Rmは各試験具の前端及び後端での螢光信号の平
均値に対する試薬パツドの中心点での（試料の添加位置
点での）螢光信号の比として計算した。

結果 結論 この例で述べたようにして製造された素子は、移行指数
によつて定量されたように、含浸紙の露出表面の異なる
場所で発せられる螢光には、実質的な偏倚のあることを
示した。この現象は、信頼性の欠如の原因となり、これ
を容認できない。

比較例２ 最初の含浸工程（水性）のみにポリマーを配
合する。

この例は、マレイン酸モノエステルポリマーを、第１含
浸工程に用いる水性溶液に含有させ、β−GUS複合体を
添加した第２含浸工程に用いる第２の有機溶媒溶液には
含有させないで素子を製造した実験を報告する。

ガントレツツ(Gantrez)AN-139のモノメチルエステルの
合成 無水メタノール５７０ｍを１のビーカーに入れ、ガ
ントレツツAN-139 ５０ｇを磁気撹拌板上で急速撹拌し
ながら添加した。濃硫酸１０μを添加し、スラリーを
室温で１時間撹拌した。温度を５５〜６０℃に上げ、３
時間、ビーカーの蓋を僅かに開けたまゝにしておいた。
この間、大部分の固体状原料は溶解して、僅かに曇つた
溶液となつた。この溶液を室温まで冷却し、更に１８時
間撹拌した。残留固体は全く溶解しなかつた。ガントレ
ツツAN-１３９のモノメチルエステルの約１０％(w/w)溶
液を４℃で貯蔵し、必要に応じて用いた。

素子の製造 素子の製造においては、与えられた量の螢光複合体、β
−ガラクトース−ウンベリフエロン−シソマイシン（β
−GUS）を各素子に導入することが必要である。この例
で用いたβ−GUS複合体は、米国特許第4,279,992号の例
１に述べられているようにして製造した。シソマイシン
はゲンタマイシンの特異的結合類縁体である。ゲンタマ
イシンは、水溶性の、広いスペクトルをもつアミノグリ
コシドの抗生物質である。ゲンタマイシンに対する抗血
清は、Nature NewBiol.２３９巻：214頁（１９７２）に
記載されているようにして製造した。

これらの実験で試験された素子の製造に用いた溶液は、
以下の成分を含有していた： 上の水性溶液を用いて、10.2cm巾のホワツトマンCWhatm
an)31ETろ紙ロール｛ホワツトマン，インコーポレーテ
ツド，クリフトン，ニユージヤージー(Whatman,Inc.,Cl
ifton,NJ)｝に飽和するまで含浸し、7.5分間、強制空気
オバリー(Overly)乾燥器｛オバリー・インコーポレーテ
ツド，ニーナ，ウイスコンシン(Overly Inc.,Neenah,W
I)｝中で５０℃で乾燥した。第２浸漬液（有機性溶液）
も同様に含浸した。しかるのち、試験具を比較例１で述
べたようにして製造した。

分析操作 この例で述べたようにして製造した試験具を、施こされ
た試料が0.3Ｍバイシンナトリウム緩衝液にβ−ガラク
トシダーゼを加えたpH8.5の溶液（２単位／ｍ）２５
μであつた外は、比較例１で述べたと同様の分析操作
を用いて試験した。

結果 結論 この例に述べたようにして製造された素子は、移行指数
によつて定量されたように、含浸紙の露出表面の異なる
場所で発せられる螢光には、実質的な偏倚のあることを
示した。この現象は信頼性の欠如の原因となり、これを
容認できない。

実施例１ 両含浸工程でポリマーを配合する この例は、マレイン酸モノエステルポリマーを、第１含
浸工程に用いる水性溶液及びそれによつてβ−GUPB複合
体を添加した第２含浸処理に用いる第２の有機性溶液の
両者に含有させて螢光素子を製造した実験を報告する。

素子の製造 これらの実験で試験された素子を製造するのに用いられ
た溶液は以下の成分を含有していた： ガントレツツES−２２５は商業的に入手可能なガントレ
ツツＡＮ−１１９［商品名、ジーエーエフ コーポレー
シヨン(GAF Corp.)製メチルビニルエーテル−無水マレ
イン酸共重合体］のモノエチルエステルである。

上記の溶液を用いて、その後の素子製造操作は5.1cm巾
のホワツトマン(Whatman)31ETろ紙ロールを用い、かつ
全乾燥時間が５分間であつたことを除いては、比較例２
において述べたとおりであつた。

分析操作 この例に述べたようにして製造された試験具を比較例１
に述べたと同様の分析操作を用いて試験した。

結果 結論 この例において述べられたようにして製造された素子
は、移行指数によつて定量されたように、含浸紙の露出
表面の異なる場所で発光した螢光が、無視しうるほどの
偏倚しか示さなかつた。これは本発明による改良が、比
較例１及び２に示されたような先行技術による試験具を
悩ませた信頼性の欠如を克服したこと、及び更にはこの
改良が移行阻止物質を両含浸操作に含有したことによつ
て損われなかつたことを実証している。

実施例２ 第２含浸処理のみにポリマーを配合する この例は、マレイン酸モノエステルポリマーをβ−GUPB
複合体の含浸に用いる第２の有機性溶液にのみ含有させ
て、基質−標識螢光免疫試験素子を製造した実験につい
て報告する。ポリマーは、第１含浸処理に用いる水性溶
液には含有させなかつた。

素子の製造 これらの実験で試験された素子の製造に用いた溶液は以
下の成分を含有していた： 上記の溶液を用いて、比較例１で述べた操作によつて、
試験具を製造した。

分析操作 この例で述べたようにして製造した試験具を、試験溶液
及び比較例１に述べたと同様の分析操作を用いて試験さ
れた。

結果 結論 この例に述べたようにして製造された素子は、移行指数
によつて定量されたように、含浸紙の露出表面の異なる
場所から発光した螢光が、無視しうるほどの偏倚しか示
さなかつた。これは、本発明による改良が、比較例１及
び２に示されたような従来技術による試験具を悩ませた
信頼性の欠如を克服したことと共に、移行阻止物質は、
第２含浸処理（工程）にのみ含有されればよいというこ
とを実証している。

実施例３ 第２含浸工程のみに別のポリマーを配合す
る。フエノバルビタール用の基質標識螢光免疫試験素子 この例は、マレイン酸モノエステルポリマーを、β−GU
PB複合体の含浸に用いた第２の有機性溶液にのみ含有さ
せて、基質−標識螢光免疫試験素子を製造した実験を報
告する。ポリマーは、第１含浸処理に用いた水性溶液に
は含有させなかつた。

素子の製造 これらの実験で試験された素子の製造に用いた溶液は、
以下の成分を含有していた。

フエノバルビタールに対する抗体は、フエノバルビター
ル−ボウバイン・（bovine，ウシ科の動物）血清アルブ
ミン免疫原複合体で免疫化されたうさぎから採集され
た。上記の溶液を用いて、その後の素子製造操作が5.1c
m巾のホワツトマン(Whatman)31ETろ紙ロールを用いこと
を除いては、比較例２に述べたとおりであつた。

分析操作 この例に述べたようにして製造した試験具を、試料が、
５％(v/v)の正常な人間の血清及びフエノバルビタール
（３μｇ／ｍ）を含有する水性溶液３０μであつた
ことを除いては、比較例１に述べたと同様の分析操作を
用いて試験した。

結果 結論 この例で述べたようにして製造した素子は、移行指数に
よつて定量されたように、含浸紙の露出表面の異なる場
所から発光する螢光が、無視しうる偏倚しか示さなかつ
た。これは、本発明による改良が、比較例１及び２に示
されたような、先行技術を悩ませた信頼性の欠如を克服
していることを実証している。更に、この例の実験は、
移行阻止物質と、完全基質−標識免疫試験系との両立性
を実証している。

実施例４ ゲンタマイシン用の別の基質−標識螢光免疫
試験素子 この例は、マレイン酸モノエステルポリマーを、β−GU
S複合体の含浸に用いた第２の有機性溶液にのみ含有さ
せて、基質−標識螢光免疫試験素子を製造した実験につ
いて報告する。ポリマーは、第１含浸工程に用いた水性
溶液には含有させなかつた。

素子の製造 これらの例で試験した素子の製造に用いた溶液は、以下
の成分を含有していた： 上記の溶液を用いて、実施例１に述べた操作によつて、
試験具を製造した。

分析操作 この例で述べたようにして製造した試験具を、試験溶
液、及び試料が１０％の正常な人間の血清とゲンタマイ
シン（４μｇ／ｍ）を含有する水性溶液３０μであ
ることを除いては比較例１に述べたものと同様の分析操
作を用いて、試験した。

結果 結論 完全基質−標識螢光免疫試験系が分析素子に包含されて
いるこの例によつて、本発明により達成された改良もま
た実証されている。

先の例で用いられた複合体ではなく、むしろ有機染料を
用いる実験は広いスペクトルを有する試薬系を用いる本
発明の移行阻止物質の実用性を実証した。これは、以下
の例によつて示される。

比較例３ ブロモフエノールブルー染料を第２浸漬液に
配合し、ポリマーは第１・第２浸漬液の両者ともに配合
しない この例は、緩衝液及びブロモフエノールブルー染料を含
有する試験片が第１の水性溶液が緩衝液を含有し、第２
の有機性溶液が周知のpH指示薬であるブロモフエノール
ブルー染料を含有し、しかしいずれの溶液も本発明によ
る移行阻止物質を含有しないで製造された場合について
の実験を報告する。

素子の製造 これらの実験において試験された素子の製造に用いた溶
液は以下の成分を含有していた： 上述の溶液を用いて、その後の素子製造操作は、5.1cm
巾のホワツトマン(Whatman)５４ろ紙ロールを用いたこ
とを除いては、比較例２において述べたとおりであつ
た。

分析操作 ３枚の試験片を実験台の上端に載せ試験片の色の一様性
を注意深く観察しながら含浸紙の中心に、ゆつくりと２
０μの水をピペツトで施こした。

結果 ３枚の試験片の各々では、大部分のブロモフエノールブ
ルー染料は、含浸紙の中心から末端方向へ洗い流され、
中心点の色が弱まつた。

結論 目視検査だけでも、この例で報告したようにして製造し
た試験片の色が一様性を示さないことを観察するのに十
分であつた。

実施例５ ブロモフエノールブルー染料を第２浸漬液に
配合し、ポリマーを第２浸漬液のみに配合する。

この例は、緩衝液及びブロモフエノールブルー染料を含
有する試験片が第１の水性溶液が緩衝液を含有し、第２
の有機性溶液がブロモフエノールブルー染料及びマレイ
ン酸モノエステルポリマーを含有して、製造された場合
についての実験を報告する。

素子の製造 これらの実験で試験された素子の製造で用いた溶液は、
以下の成分を含有していた。

上記の溶液を用いて、その後の素子製造操作は、5.1cm
巾のホワツトマン(Whatman)５４ろ紙ロールを用いたこ
とを除いては、比較例２において述べたとおりであつ
た。

分析操作 分析操作は比較例３と同様であつた。

結果 ３枚の試験片の各々では、ブロモフエノールブルー染料
は、中心から末端方向へ全く又はほとんど、洗い流され
ず、含浸紙はそのまゝで全体に亘つて一様な色調強度を
有することが目視観察された。

結論 この例は、含浸紙中の、例えばブロモフエノールブルー
染料のような全く異なるタイプの試薬についても、方向
によつて改良が達成されることを証明している。

具体例について述べてきたが、本発明の細部にわたつて
数々の変化が、本発明の範囲から逸脱することなしに、
行われるであろう。

実施例６ 素子の製造 以下に示す実験で試験された素子の製造に用いた溶液は
以下の成分を含有していた。

上記の溶液を用いて、比較例１に記載の方法で試験具を
製造した。

分析操作 この例で述べたようにして製造した試験具を、比較例１
に記載されたものと同じ試験溶液及び分析操作を用いて
試験した。

ポリスチレンスルホン酸塩の平均移行指数（Ｒｍ）は
０．９６で、標準偏差は０．０１であった。このこと
は、スルホン酸ポリマーが試薬移行阻止物質として有効
であることを示している。

実施例７ ポリスチレンスルホン酸塩に代えてポリリジン（ポリア
ミン）を用いたほかは、実施例６と同様にして素子を製
造して試験した。その結果は、ポリリジンの平均移行指
数（Ｒｍ）は０．９６で、標準偏差は０．０１であっ
た。このことは、ポリアミンが試薬移行阻止物質として
有効であることを示している。

実施例８ ポリスチレンスルホン酸塩に代えてポリチロシン（イオ
ン化しうるフェノール）を用いたほかは、実施例６と同
様にして素子を製造して試験した。その結果は、ポリチ
ロシンの平均移行指数（Ｒｍ）は０．９６で、標準偏差
は０．０１であった。このことは、イオン化しうるフェ
ノールが試薬移行阻止物資として有効であることを示し
ている。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】液体試料中の分析対象物を測定するための
   分析素子の製造方法であって、次の工程からなることを
   特徴とする方法。 （ａ）単一層分析対象物検出層に、分析対象物検出系の
   反応性試薬を含む試薬水溶液、及び下記試薬移行阻止物
   質をイオン化するのに有効なpH５以上の条件に調整する
   ことのできる緩衝剤を含有する水性溶液を包含させ、つ
   いで、これを乾燥する工程、 （ｂ）この乾燥した単一層分析対象物検出層に、有機溶
   剤；該分析対象物検出系に含まれる前記試薬以外の残り
   の試薬；並びにカルボン酸ポリマー、スルホン酸ポリマ
   ー、ポリアミン及びポリチロシンから選択される、非イ
   オン化形態であるがイオン化可能であって、非イオン化
   形態では該溶媒に可溶である試薬移行阻止物質；を含む
   有機性溶液を包含させ、ついでこれを乾燥する工程。
2. 【請求項２】試薬移行阻止物質が、カルボン酸ポリマー
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】カルボン酸ポリマーが、（１）メチルビニ
   ルエーテルとマレイン酸モノメチルエステルの共重合
   体、（２）メチルビニルエーテルとマレイン酸モノエチ
   ルエステルの共重合体、（３）メチルビニルエーテルと
   マレイン酸モノプロピルエステルの共重合体、（４）メ
   チルビニルエーテルとマレイン酸モノブチルエステルの
   共重合体、（５）酢酸ビニルとマレイン酸モノメチルエ
   ステルの共重合体、（６）酢酸ビニルとマレイン酸モノ
   エチルエステルの共重合体、（７）エチレンとマレイン
   酸モノメチルエステルの共重合体、（８）エチレンとマ
   レイン酸モノエチルエステルの共重合体、（９）オクタ
   デシルビニルエーテルとマレイン酸モノメチルエステル
   の共重合体、及び（１０）オクタデシルビニルエーテル
   とマレイン酸モノエチルエステルの共重合体 からなる群より選ばれる特許請求の範囲第２項記載の方
   法。
4. 【請求項４】試薬移行阻止物質が、スルホン酸ポリマー
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. 【請求項５】スルホン酸ポリマーが、ポリスチレンスル
   ホン酸塩、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンス
   ルホン酸とスチレンの共重合体及びポリビニルスルホン
   酸から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】スルホン酸ポリマーのスルホン酸基をイオ
   ン化するのに有効なpHが、用いられる特定のスルホン酸
   ポリマーのpKaに相当するpH範囲である特許請求の範囲
   第４項又は５項記載の方法。
7. 【請求項７】有機溶媒が、アセトンである特許請求の範
   囲第１項記載の方法。
8. 【請求項８】反応性試薬が、分析対象物に対する特異的
   結合相手からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。
9. 【請求項９】前記（ａ）の反応性試薬を含む試薬が、分
   析対象物に対する特異的結合相手、及び分析対象物又は
   その特異的結合類縁体に標識成分が結合した標識複合体
   と反応して該標識成分を切断することができる成分を含
   む、特許請求の範囲第１項記載の方法。
10. 【請求項１０】工程（ａ）及び工程（ｂ）に先立ち、分
    析素子が試料と接触するまでは、指示薬が前記（ａ）の
    試薬と反応を起こさない液体中で、該指示薬を単一層分
    析対象物検出層に含浸させ、ついでこの単一層分析対象
    物検出層を乾燥する付加工程（ｃ）を含む特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
11. 【請求項１１】指示薬が、テトラアルキルベンジジンで
    ある特許請求の範囲第１０項記載の方法。
12. 【請求項１２】（ａ）β−ガラクトシダーゼ及び分析対
    象物に対する抗体を含む水性溶液を、非イオン化形態で
    あるがイオン化可能なマレイン酸モノエステルポリマー
    のカルボン酸基をイオン化するのに有効なpH５以上の条
    件下で、単一層分析対象物検出層に含浸させ、ついでこ
    れを乾燥し、 （ｂ）次に、この乾燥した単一層分析対象物検出層に、
    β−ガラクトース−ウンベリフェロン−分析対象物又は
    分析対象物類縁体複合体及び非イオン化形態であるがイ
    オン化可能なマレイン酸モノエステルポリマーを含む有
    機性溶液を含浸させ、ついでこれを乾燥することからな
    る、 特許請求の範囲第１項記載の液体試料中の分析対象物を
    測定するための分析素子の製造方法。
13. 【請求項１３】（ａ）β−ガラクトシダーゼとゲンタマ
    イシンに対する抗体を含む水性溶液を、非イオン化形態
    であるがイオン化可能なマレイン酸モノエステルポリマ
    ーのカルボン酸基をイオン化するのに有効なpH５以上の
    条件下で、単一層分析対象物検出層に含浸させ、ついで
    これを乾燥し、 （ｂ）次にこの単一層分析対象物検出層に、β−ガラク
    トース−ウンベリフェロン−シソマイシン複合体及び非
    イオン化形態であるがイオン化可能なマレイン酸モノエ
    ステルポリマーを含むアセトン溶液を含浸させ、ついで
    これを乾燥することからなる、 特許請求の範囲第１項記載の液体試料中のゲンタマイシ
    ンを測定するための分析素子の製造方法。
14. 【請求項１４】（ｃ）３，３′，５，５′−テトラメチ
    ルベンジジンを含むアセトン溶液を、単一層分析対象物
    検出層に含浸させ、ついでこれを乾燥し、 （ａ）次に、この単一層分析対象物検出層に、グルコー
    ス、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼアポ酵
    素及びテオフィリンに対する抗体を含む水性溶液を、非
    イオン化形態であるがイオン化可能なマレイン酸モノエ
    ステルポリマーのカルボン酸基をイオン化するのに有効
    なpH５以上の条件下で含浸させ、ついでこれを乾燥し、 （ｂ）次に、この単一層分析対象物検出層に、フラビン
    アデニンジヌクレオチド−テオフィリン複合体及び非イ
    オン化形態であってイオン化可能なマレイン酸モノエス
    テルポリマーを含むアセトン溶液を含浸させ、ついでこ
    れを乾燥することからなる、 特許請求の範囲第１項記載の液体試料中のテオフィリン
    を測定するための分析素子の製造方法。
15. 【請求項１５】（ａ）グルコース、ペルオキシダーゼ、
    グルコースオキシダーゼアポ酵素及び分析対象物に対す
    る抗体を含む水性溶液を、非イオン化形態であるがイオ
    ン化可能なマレイン酸モノエステルポリマーのカルボン
    酸基をイオン化するのに有効なpH５以上の条件下で単一
    層分析対象物検出層に含浸させ、ついでこれを乾燥し、 （ｂ）次にこの単一層分析対象物検出層に、フラビンア
    デニンジヌクレオチド−分析対象物又は分析対象物類縁
    体複合体、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジ
    ン、及び非イオン化形態であるがイオン化可能なマレイ
    ン酸モノエステルポリマーを含むアセトン溶液を含浸さ
    せ、ついでこれを乾燥することからなる、 特許請求の範囲第１項記載の液体試料中の分析対象物を
    測定するための分析素子の製造方法。