JPH0627739B2 - 増幅された続取りおよび気相検出を伴う結合アツセイ - Google Patents
増幅された続取りおよび気相検出を伴う結合アツセイInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は微生物学的試料中の標的結合対員子、たとえば
抗原、抗体、ハプテンまたは核酸鎖の測定法に関する。
また本発明はその測定法に用いられる試薬またはキツト
にも関する。本方法は一般に増幅された読取り（たとえ
ば酵素の使用によるもの）を伴い、また検出可能部分(d
etectable moiety)を気相に移行させ、ここで検出可能
部分を検出すること（定量的または定性的に測定するこ
と）を伴う。
抗原、抗体、ハプテンまたは核酸鎖の測定法に関する。
また本発明はその測定法に用いられる試薬またはキツト
にも関する。本方法は一般に増幅された読取り（たとえ
ば酵素の使用によるもの）を伴い、また検出可能部分(d
etectable moiety)を気相に移行させ、ここで検出可能
部分を検出すること（定量的または定性的に測定するこ
と）を伴う。
たとえば試料と標識した抗原および試薬抗体間の結合反
応を行う酵素イムノアツセイは周知である。アツセイの
結末には（分離を伴うか伴うことなく）、ある相（液相
または固相）に酵素が存在し、この酵素の濃度および／
または活性が試料アツセイにおける標的結合対員子の濃
度（または存在）の関数である。この種の酵素イムノア
ツセイの参考文献例には“酵素イムノアツセイ”（シー
アールシー・プレス社、１９８０年、イー・テイー・マ
ギオ編）が含まれる。この種の酵素イムノアツセイは一
般に不均質（競合または非競合）または均質として特色
づけられる。これらの異なる配置様式により下記の点で
異なる結果が得られる。すなわち競合不均質アツセイの
場合は、試料の標的抗原濃度が高いほど一般に分離後の
固相中の酵素濃度が低くなる。不均質非競合アツセイ
（たとえばサンドイツチアツセイ）の場合は、標的抗原
または抗体の濃度が高いほど一般に分離後の固相上の酵
素の濃度（従つて活性）が高くなる。均質アツセイの場
合には結合反応後の液相中における酵素の濃度は影響を
受けないが、酵素の活性は標的の濃度により調節され、
ある場合には標的抗体濃度が高いほど酵素活性が低い
が、他の場合には標的抗原濃度が高いほど酵素活性が高
い。酵素イムノアツセイの配置様式に関する概設はイー
・テイー・マギオ編“酵素イムノアツセイ”（シーアル
シー・プレス社、ボーカ・レイトン、ＦＬ１９８０
年）；ゴー(Ngo)ら、“モレ・アンド・セルラー・バイ
オケム、(Mol.&Cellular Biochem.)”，４４巻、３−１
２頁（１９８２年）；シー・ブレークら、“アナリス
ト”、１０９巻、５３３−５４７頁（１９８４年５月）
に掲載されている。
応を行う酵素イムノアツセイは周知である。アツセイの
結末には（分離を伴うか伴うことなく）、ある相（液相
または固相）に酵素が存在し、この酵素の濃度および／
または活性が試料アツセイにおける標的結合対員子の濃
度（または存在）の関数である。この種の酵素イムノア
ツセイの参考文献例には“酵素イムノアツセイ”（シー
アールシー・プレス社、１９８０年、イー・テイー・マ
ギオ編）が含まれる。この種の酵素イムノアツセイは一
般に不均質（競合または非競合）または均質として特色
づけられる。これらの異なる配置様式により下記の点で
異なる結果が得られる。すなわち競合不均質アツセイの
場合は、試料の標的抗原濃度が高いほど一般に分離後の
固相中の酵素濃度が低くなる。不均質非競合アツセイ
（たとえばサンドイツチアツセイ）の場合は、標的抗原
または抗体の濃度が高いほど一般に分離後の固相上の酵
素の濃度（従つて活性）が高くなる。均質アツセイの場
合には結合反応後の液相中における酵素の濃度は影響を
受けないが、酵素の活性は標的の濃度により調節され、
ある場合には標的抗体濃度が高いほど酵素活性が低い
が、他の場合には標的抗原濃度が高いほど酵素活性が高
い。酵素イムノアツセイの配置様式に関する概設はイー
・テイー・マギオ編“酵素イムノアツセイ”（シーアル
シー・プレス社、ボーカ・レイトン、ＦＬ１９８０
年）；ゴー(Ngo)ら、“モレ・アンド・セルラー・バイ
オケム、(Mol.&Cellular Biochem.)”，４４巻、３−１
２頁（１９８２年）；シー・ブレークら、“アナリス
ト”、１０９巻、５３３−５４７頁（１９８４年５月）
に掲載されている。
プリン／ピリミジンヌクレオチド間の特異的水素結合に
基づく標的ポリヌクレオチド配列（DNAまたはＲＮＡ）
のアツセイについてはすでに報告されている。これらの
アツセイの最も一般的な形態は、試料の核酸を一本鎖の
形で支持体上に固定化することを伴う。次いで、この標
的連鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含むプロー
ブを、プローブポリヌクレオチドに対しペンダントな酵
素または結合員子（たとえばビオチンまたは抗原）など
の標識を伴つた状態で施す。酵素がプローブポリヌクレ
オチドに直接に付着しない場合には、抗原（たとえばビ
オチン）に保有するプローブを使用し、次いで支持体を
抗体（すなわちたとえばアビジンまたはストレプアビジ
ン、いずれもビオチンに結合する）に結合した酵素と接
触させることにより間接的に付着させることができる。
コーテイングされた支持体を洗浄して未結合プローブ−
ビオチン結合体(Conjugate)または未結合アビジン−酵
素結合体を除去したのち、コーテイングされた支持体を
酵素反応のため基質と接触させる。一定期間後に酵素反
応の反応体または生成物のいずれかをアツセイすること
ができ、酵素反応量が高いことは試料中の標的ポリヌク
レオチド濃度が高いことに相当する。この種の方法は一
般にフアルコウらの米国特許第４，３５８，５３５号明
細書（１９８２年）；ヘラーらの欧州特許公開第７０，
６８７号明細書（スタンダード・オイル、１９８３年）
（６頁）に記載されており、プローブに連結したビオチ
ンなどを用いる上記方法の態様についてはワードらの欧
州特許公開第63,879号明細書（エール大学、１９８２
年）；ラバニらの欧州特許公開第９７，３７３号明細書
（エンゾ・バイオケム社、１９８４年）；リーリイらの
プロシ．・ナショ．・アカデ．・サイ．(Proc.Nat.Aca
d.Sci.)８０巻、４０４５−４０４９頁（１９８３年）
に記載されている。
基づく標的ポリヌクレオチド配列（DNAまたはＲＮＡ）
のアツセイについてはすでに報告されている。これらの
アツセイの最も一般的な形態は、試料の核酸を一本鎖の
形で支持体上に固定化することを伴う。次いで、この標
的連鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含むプロー
ブを、プローブポリヌクレオチドに対しペンダントな酵
素または結合員子（たとえばビオチンまたは抗原）など
の標識を伴つた状態で施す。酵素がプローブポリヌクレ
オチドに直接に付着しない場合には、抗原（たとえばビ
オチン）に保有するプローブを使用し、次いで支持体を
抗体（すなわちたとえばアビジンまたはストレプアビジ
ン、いずれもビオチンに結合する）に結合した酵素と接
触させることにより間接的に付着させることができる。
コーテイングされた支持体を洗浄して未結合プローブ−
ビオチン結合体(Conjugate)または未結合アビジン−酵
素結合体を除去したのち、コーテイングされた支持体を
酵素反応のため基質と接触させる。一定期間後に酵素反
応の反応体または生成物のいずれかをアツセイすること
ができ、酵素反応量が高いことは試料中の標的ポリヌク
レオチド濃度が高いことに相当する。この種の方法は一
般にフアルコウらの米国特許第４，３５８，５３５号明
細書（１９８２年）；ヘラーらの欧州特許公開第７０，
６８７号明細書（スタンダード・オイル、１９８３年）
（６頁）に記載されており、プローブに連結したビオチ
ンなどを用いる上記方法の態様についてはワードらの欧
州特許公開第63,879号明細書（エール大学、１９８２
年）；ラバニらの欧州特許公開第９７，３７３号明細書
（エンゾ・バイオケム社、１９８４年）；リーリイらの
プロシ．・ナショ．・アカデ．・サイ．(Proc.Nat.Aca
d.Sci.)８０巻、４０４５−４０４９頁（１９８３年）
に記載されている。
報告されている第２の型のポリヌクレオチドアツセイは
“サンドイツチ”アツセイである。これは免疫化学的分
析に用いられるサンドイツチアツセイに類似する。この
種のサンドイツチアツセイには、それぞれ標的ポリヌク
レオチド鎖の一部に相補的な２種のプローブポリヌクレ
オチドを使用する。第１のプローブポリヌクレオチドは
支持体に付着している。第２のプローブポリヌクレオチ
ドは酵素またはビオチン（これは次いでアビジン−酵素
結合体などを用いて酵素に結合させる）に付着させると
ができる。同時に、またはこれに続いてインキユベート
することにより、第１プローブ標的ポリヌクレオチド鎖
が付着した支持体、および酵素に結合した第２プローブ
（所望によりさらにビオチンおよびアビシンを介したも
の）を含む複合体が形成される。適宜洗浄したのちこの
種の複合体は支持体上にコーテイングされた状態で残る
酵素のみを示すはずである。次いで酵素反応の反応体を
導入し、酵素反応の生成物をアツセイすることにより、
第１相（支持体）上の酵素濃度を定量することができ
る。この酵素活性は試料中の標的ヌクレオチド鎖の濃度
と正比例するはずである。欧州特許公開第７０，６８７
号明細書（スタンダード・オイル、１９８３年）（８−
１０頁）；ＰＣＴ出願ＷＯ８３／０１４５９（オリオン
−イトマ・オイ、Orion-Yhtma Oy、１９８３年４月２９
日）を参照されたい。
“サンドイツチ”アツセイである。これは免疫化学的分
析に用いられるサンドイツチアツセイに類似する。この
種のサンドイツチアツセイには、それぞれ標的ポリヌク
レオチド鎖の一部に相補的な２種のプローブポリヌクレ
オチドを使用する。第１のプローブポリヌクレオチドは
支持体に付着している。第２のプローブポリヌクレオチ
ドは酵素またはビオチン（これは次いでアビジン−酵素
結合体などを用いて酵素に結合させる）に付着させると
ができる。同時に、またはこれに続いてインキユベート
することにより、第１プローブ標的ポリヌクレオチド鎖
が付着した支持体、および酵素に結合した第２プローブ
（所望によりさらにビオチンおよびアビシンを介したも
の）を含む複合体が形成される。適宜洗浄したのちこの
種の複合体は支持体上にコーテイングされた状態で残る
酵素のみを示すはずである。次いで酵素反応の反応体を
導入し、酵素反応の生成物をアツセイすることにより、
第１相（支持体）上の酵素濃度を定量することができ
る。この酵素活性は試料中の標的ヌクレオチド鎖の濃度
と正比例するはずである。欧州特許公開第７０，６８７
号明細書（スタンダード・オイル、１９８３年）（８−
１０頁）；ＰＣＴ出願ＷＯ８３／０１４５９（オリオン
−イトマ・オイ、Orion-Yhtma Oy、１９８３年４月２９
日）を参照されたい。
第３の一般型のポリヌクレオチドアツセイは、ダイアモ
ンドらの“置換ポリヌクレオチドアツセイ法およびそれ
に用いるポリヌクレオチド複合体試薬”と題する米国特
許出願第６０７，８８５号明細書（アライド・コーポレ
ーシヨンおよびジエネテイツクス・インステイチユート
社に譲渡、１９８４年５月７日出願）に記載されてい
る。本出願がアライド・コーポレーシヨンに譲渡された
ことに基づいて、これに関しこれら２出願は、十分に譲
渡されていると考えられる。この種の系においては、標
的ポリヌクレオチドに相補的なプローブポリヌクレオチ
ドは溶液状でまたは支持体上において供給されるが、水
素結合を介して第２のポリヌクレオチドと対をなしてお
り、標識ポリヌクレオチドと呼ばれる。その発明のある
形態においては、標識ポリヌクレオチドは酵素を標識と
して含むか、あるいはビオチンなどの結合決定因子を含
む。いずれの場合もこの試薬複合体を試料と接触させる
と、試料中の標的ポリヌクレオチドが試薬複合体に由来
する標識ポリヌクレオチドと置換するであろう。分離を
行うことにより、または置換が酵素活性に与える影響
（しばしば立体的因子による）により、ある相（一般に
液相）中の酵素の活性および／または濃度の試料中の標
的ポリヌクレオチドの濃度に正比例するであろう。
ンドらの“置換ポリヌクレオチドアツセイ法およびそれ
に用いるポリヌクレオチド複合体試薬”と題する米国特
許出願第６０７，８８５号明細書（アライド・コーポレ
ーシヨンおよびジエネテイツクス・インステイチユート
社に譲渡、１９８４年５月７日出願）に記載されてい
る。本出願がアライド・コーポレーシヨンに譲渡された
ことに基づいて、これに関しこれら２出願は、十分に譲
渡されていると考えられる。この種の系においては、標
的ポリヌクレオチドに相補的なプローブポリヌクレオチ
ドは溶液状でまたは支持体上において供給されるが、水
素結合を介して第２のポリヌクレオチドと対をなしてお
り、標識ポリヌクレオチドと呼ばれる。その発明のある
形態においては、標識ポリヌクレオチドは酵素を標識と
して含むか、あるいはビオチンなどの結合決定因子を含
む。いずれの場合もこの試薬複合体を試料と接触させる
と、試料中の標的ポリヌクレオチドが試薬複合体に由来
する標識ポリヌクレオチドと置換するであろう。分離を
行うことにより、または置換が酵素活性に与える影響
（しばしば立体的因子による）により、ある相（一般に
液相）中の酵素の活性および／または濃度の試料中の標
的ポリヌクレオチドの濃度に正比例するであろう。
上記の方法はすべて、酵素の増幅を利用して標的結合対
員子部分と比較して検出可能部分を高めるものである
が、これらのアツセイにおける共通の問題は、この種の
検出可能部分を結合反応および／または酵素反応が行わ
れる相（特に液相）中に存在する他の多くの有機物質お
よび生物学的物質から区別することである。特に螢光ま
たは吸光を測定する場合、このような妨害がきわめて一
般的であり、特異的結合反応または酵素反応により指令
されるよりも低い選択性および／または感度をアツセイ
に与える可能性がある。それにもかかわらず、これらの
妨害を克服するために提示される方法はいずれも、その
アツセイによつて定性的または定量的結果を得るのを不
当に複雑にしあるいは遅らせることがないために、最初
の２反応の場合と同様な簡潔さおよび速度を与えなけれ
ばならない。
員子部分と比較して検出可能部分を高めるものである
が、これらのアツセイにおける共通の問題は、この種の
検出可能部分を結合反応および／または酵素反応が行わ
れる相（特に液相）中に存在する他の多くの有機物質お
よび生物学的物質から区別することである。特に螢光ま
たは吸光を測定する場合、このような妨害がきわめて一
般的であり、特異的結合反応または酵素反応により指令
されるよりも低い選択性および／または感度をアツセイ
に与える可能性がある。それにもかかわらず、これらの
妨害を克服するために提示される方法はいずれも、その
アツセイによつて定性的または定量的結果を得るのを不
当に複雑にしあるいは遅らせることがないために、最初
の２反応の場合と同様な簡潔さおよび速度を与えなけれ
ばならない。
本発明は酵素（または他の調節された）反応に関連する
特異的結合反応の増幅効果を、検出可能部分の気相検出
により達成しうる高い感度および低いバツクグラウンド
と結びつけたものである。
特異的結合反応の増幅効果を、検出可能部分の気相検出
により達成しうる高い感度および低いバツクグラウンド
と結びつけたものである。
特に、本発明は次の： （ａ）第一の液相中で、生物学的試料中の標的結合対員
子(target binding pair member)に対し特異的な結合反
応を行い； （ｂ）既知量の、該標的結合対員子に対して特異的な、
対応する結合対員子(binding pair member)に結合した
酵素を該第一液相に、該標的結合対員子と酵素が結合し
た該結合対員子との間に結合反応を生起せしめるのに十
分な条件下で加え； （ｃ）該酵素により調節された(moderated)化学反応に
よって揮発性の検出可能部分に変換し得る前駆物質を該
第一液相に加え； （ｄ）該揮発性検出可能部分を気相に移行させ；そして （ｅ）該検出可能部分を検出する 工程を含んで成る、生物学的試料中の標的結合対員子を
測定する不均質相法を含む。
子(target binding pair member)に対し特異的な結合反
応を行い； （ｂ）既知量の、該標的結合対員子に対して特異的な、
対応する結合対員子(binding pair member)に結合した
酵素を該第一液相に、該標的結合対員子と酵素が結合し
た該結合対員子との間に結合反応を生起せしめるのに十
分な条件下で加え； （ｃ）該酵素により調節された(moderated)化学反応に
よって揮発性の検出可能部分に変換し得る前駆物質を該
第一液相に加え； （ｄ）該揮発性検出可能部分を気相に移行させ；そして （ｅ）該検出可能部分を検出する 工程を含んで成る、生物学的試料中の標的結合対員子を
測定する不均質相法を含む。
本発明はまた、次の： （ａ）特異的結合反応において標的結合対員子と競合し
得る特異的結合対員子に結合した酵素を液層中に含んで
成る第一反応試薬； （ｂ）該液層中で酵素により調節された化学反応によっ
て開裂し得る結合を含む非揮発性の結合体にして、該酵
素により該結合が開裂された際に該結合体から検出可能
部分が揮発性の形で放出される該結合体； （ｃ）該検出可能部分を気相に移行させる手段；及び （ｄ）該気相中の該検出可能部分を検出する手段 を含んで成る、生物学的試料中の標的結合対員子を測定
するための新規なキットも含む。
得る特異的結合対員子に結合した酵素を液層中に含んで
成る第一反応試薬； （ｂ）該液層中で酵素により調節された化学反応によっ
て開裂し得る結合を含む非揮発性の結合体にして、該酵
素により該結合が開裂された際に該結合体から検出可能
部分が揮発性の形で放出される該結合体； （ｃ）該検出可能部分を気相に移行させる手段；及び （ｄ）該気相中の該検出可能部分を検出する手段 を含んで成る、生物学的試料中の標的結合対員子を測定
するための新規なキットも含む。
本発明を先ず本発明方法に関して述べ、次いで本方法に
用いる試薬に関して、そして最後に本方法のための標的
結合対員子の例に関して述べる。多くの場合、説明のた
め抗原、抗体、ハプテンまたはポリヌクレオチドである
標的について論じるが、これらおよび他の特異的標的結
合対員子のそれぞれを本発明においてアツセイすること
ができ、特定の標的結合対員子には特定の形態が好まし
いことは理解されるであろう。本方法について論じる際
には、まず特異的結合反応（工程ａ）および反応調節工
程（工程ｂ）に関する配置様式について論じ；次いで酵
素反応（工程ｃ）について論じ；最後に検出可能部分を
移行させ（工程ｄ）そして検出可能な部分を検出する
（工程ｅ）工程について論じる。
用いる試薬に関して、そして最後に本方法のための標的
結合対員子の例に関して述べる。多くの場合、説明のた
め抗原、抗体、ハプテンまたはポリヌクレオチドである
標的について論じるが、これらおよび他の特異的標的結
合対員子のそれぞれを本発明においてアツセイすること
ができ、特定の標的結合対員子には特定の形態が好まし
いことは理解されるであろう。本方法について論じる際
には、まず特異的結合反応（工程ａ）および反応調節工
程（工程ｂ）に関する配置様式について論じ；次いで酵
素反応（工程ｃ）について論じ；最後に検出可能部分を
移行させ（工程ｄ）そして検出可能な部分を検出する
（工程ｅ）工程について論じる。
本発明に工程ａおよびｂに関する配置様式は、酵素イム
ノアツセイまたはポリヌクレオチドアツセイに関する上
記参考文献に記載されたもののいずれであつてもよい。
このような配置様式の例９種を添付の第１Ａ−１Ｉ図に
示し、ここでこれらについて述べる。第１Ａ図の場合、
アツセイの標的である（かつ試料中に含まれるならば種
々の量で含まれる）抗原(Ag)を、支持体たとえば試験管
壁またはポリスチレンビーズに付着させた抗体(Ab)、お
よび抗原−酵素結合体(Ag-E)に同時に接触させる。抗体
(Ab)は標的抗原(Ag)および抗原−酵素結合体(Ag-E)の抗
原の双方に特異的に結合するので、競合が起こり、固定
化された抗体のうちあるものは標的抗原と結合し、他の
ものは抗原−酵素結合体と結合するであろう。抗体がす
べての抗原−酵素結合体と結合するのに必要な量よりも
少量存在するならば、固体支持体に結合する抗原−酵素
の量は標的抗原の量が増加するにつれて減少するであろ
う。この競合的な結合工程ののち、コーテイングされた
支持体を洗浄し、酵素反応の反応体を添加する。本発明
においては、この反応（第１Ａ図に湾曲した矢印で示
す）は共役体の開裂または他の化学反応を伴い、揮発性
部分を生成する。この点において本反応は、螢光体、吸
光体(absorbant)、発光体(luminescent)または他の化学
的もしくは物理的に反応性の部分を与える一般に採用さ
れている酵素反応と異なる。それにもかかわらず、一般
的なイムノアツセイの場合と同様に一定期間の酵素反応
ののち生成する反応生成物の量は分離後の支持体上の酵
素濃度に正比例する。この酵素濃度は試料中の抗原濃度
に反比例するので、酵素反応生成物の濃度または量も標
的抗原の濃度または量と反比例するであろう。
ノアツセイまたはポリヌクレオチドアツセイに関する上
記参考文献に記載されたもののいずれであつてもよい。
このような配置様式の例９種を添付の第１Ａ−１Ｉ図に
示し、ここでこれらについて述べる。第１Ａ図の場合、
アツセイの標的である（かつ試料中に含まれるならば種
々の量で含まれる）抗原(Ag)を、支持体たとえば試験管
壁またはポリスチレンビーズに付着させた抗体(Ab)、お
よび抗原−酵素結合体(Ag-E)に同時に接触させる。抗体
(Ab)は標的抗原(Ag)および抗原−酵素結合体(Ag-E)の抗
原の双方に特異的に結合するので、競合が起こり、固定
化された抗体のうちあるものは標的抗原と結合し、他の
ものは抗原−酵素結合体と結合するであろう。抗体がす
べての抗原−酵素結合体と結合するのに必要な量よりも
少量存在するならば、固体支持体に結合する抗原−酵素
の量は標的抗原の量が増加するにつれて減少するであろ
う。この競合的な結合工程ののち、コーテイングされた
支持体を洗浄し、酵素反応の反応体を添加する。本発明
においては、この反応（第１Ａ図に湾曲した矢印で示
す）は共役体の開裂または他の化学反応を伴い、揮発性
部分を生成する。この点において本反応は、螢光体、吸
光体(absorbant)、発光体(luminescent)または他の化学
的もしくは物理的に反応性の部分を与える一般に採用さ
れている酵素反応と異なる。それにもかかわらず、一般
的なイムノアツセイの場合と同様に一定期間の酵素反応
ののち生成する反応生成物の量は分離後の支持体上の酵
素濃度に正比例する。この酵素濃度は試料中の抗原濃度
に反比例するので、酵素反応生成物の濃度または量も標
的抗原の濃度または量と反比例するであろう。
第１Ｂ図は第２の形式の酵素イムノアツセイを示す。こ
れは一般にサンドイツチ酵素イムノアツセイと呼ばれて
いる。この配置様式の場合、標的抗原(Ag)に対して反応
性の抗体(Ab)を支持体上に固定化する。試料を導入する
と、試料中の標的抗原(Ag)は支持された抗体に結合する
であろう。次いで抗原／抗体複合体に対して反応性の物
質（たとえば第２抗体Ab′）にカツプリングした酵素を
添加することにより、第１Ｂ図に示すように酵素が抗原
(Ag)、抗体(Ab)および第２抗体（Ab′）を介して支持体
に結合した複合体が形成される。標的抗原(Ag)の量また
は濃度が高いほど、この種の複合体がより多量形成され
る（支持された抗体(Ab)および第２抗体−酵素結合体
（Ab′−Ｅ）が制限試薬とならないように十分に多い量
で供給されていると解釈する）。この抗体−酵素結合体
（Ab′−Ｅ）は、抗原(Ag)が結合していない抗体（支持
されたもの）とは反応しないであろう。未反応の第２抗
体−酵素結合体（Ab′−Ｅ）を洗浄除去したのち、酵素
反応体ないしは基質を添加する。この場合も一定期間後
に酵素反応生成物をアツセイする。すなわち本発明の場
合は後記のように気相に移行させ、濃縮したのちに行う
が、一般のアツセイの場合は液相において吸光度、螢
光、ルミネセンスその他の特性を測定することにより行
う。この配置様式の場合、結合および分離後の支持体上
の酵素濃度は試料中の抗原(Ag)濃度に正比例する。従つ
て一定期間中の酵素反応生成物の濃度も標的抗原(Ag)の
濃度に正比例する。
れは一般にサンドイツチ酵素イムノアツセイと呼ばれて
いる。この配置様式の場合、標的抗原(Ag)に対して反応
性の抗体(Ab)を支持体上に固定化する。試料を導入する
と、試料中の標的抗原(Ag)は支持された抗体に結合する
であろう。次いで抗原／抗体複合体に対して反応性の物
質（たとえば第２抗体Ab′）にカツプリングした酵素を
添加することにより、第１Ｂ図に示すように酵素が抗原
(Ag)、抗体(Ab)および第２抗体（Ab′）を介して支持体
に結合した複合体が形成される。標的抗原(Ag)の量また
は濃度が高いほど、この種の複合体がより多量形成され
る（支持された抗体(Ab)および第２抗体−酵素結合体
（Ab′−Ｅ）が制限試薬とならないように十分に多い量
で供給されていると解釈する）。この抗体−酵素結合体
（Ab′−Ｅ）は、抗原(Ag)が結合していない抗体（支持
されたもの）とは反応しないであろう。未反応の第２抗
体−酵素結合体（Ab′−Ｅ）を洗浄除去したのち、酵素
反応体ないしは基質を添加する。この場合も一定期間後
に酵素反応生成物をアツセイする。すなわち本発明の場
合は後記のように気相に移行させ、濃縮したのちに行う
が、一般のアツセイの場合は液相において吸光度、螢
光、ルミネセンスその他の特性を測定することにより行
う。この配置様式の場合、結合および分離後の支持体上
の酵素濃度は試料中の抗原(Ag)濃度に正比例する。従つ
て一定期間中の酵素反応生成物の濃度も標的抗原(Ag)の
濃度に正比例する。
第１Ｃ図は現在用いられている一般的な型の均質イムノ
アツセイを、下記のように本発明に有用な形で示したも
のである。この配置様式の場合、潜在的に種々の量の標
的抗原(Ag)を含有する試料を、抗原−酵素結合体(Ag-E)
および一定の制限量の抗体(Ab)の双方と混合する。生じ
る競合的な結合反応において、ある抗原−酵素(Ag-E)は
未結合のまま残り、ある抗原−酵素(Ag-E)は抗体(Ab)と
結合し（Ab：Ag-Eとして）（この種の結合の立体的因子
により酵素活性は低下し、または失われる）、また標的
抗原(Ag)の一部も抗体(Ab)と結合する（Ab：Agとし
て）。第１Ａ図に関連して述べた第１の配置様式の場合
のように、標的抗原(Ag)の量が多いほどより多くの抗体
部位が標的抗原(Ag)にとられ、従つてより多量の抗原−
酵素結合体(Ag-E)が抗体とカツプリングまたは反応せず
に残される。次いで酵素反応の試薬を添加し、一定期間
監視することにより、酵素活性をアツセイすることがで
きる。試料中に存在する標的抗原(Ag)の量が多いほど、
その一定期間に存在する酵素反応生成物の量が多くな
る。本発明の場合、後記のようにこの種の酵素反応生成
物は濃縮し、気相に移行させたのち検出される。
アツセイを、下記のように本発明に有用な形で示したも
のである。この配置様式の場合、潜在的に種々の量の標
的抗原(Ag)を含有する試料を、抗原−酵素結合体(Ag-E)
および一定の制限量の抗体(Ab)の双方と混合する。生じ
る競合的な結合反応において、ある抗原−酵素(Ag-E)は
未結合のまま残り、ある抗原−酵素(Ag-E)は抗体(Ab)と
結合し（Ab：Ag-Eとして）（この種の結合の立体的因子
により酵素活性は低下し、または失われる）、また標的
抗原(Ag)の一部も抗体(Ab)と結合する（Ab：Agとし
て）。第１Ａ図に関連して述べた第１の配置様式の場合
のように、標的抗原(Ag)の量が多いほどより多くの抗体
部位が標的抗原(Ag)にとられ、従つてより多量の抗原−
酵素結合体(Ag-E)が抗体とカツプリングまたは反応せず
に残される。次いで酵素反応の試薬を添加し、一定期間
監視することにより、酵素活性をアツセイすることがで
きる。試料中に存在する標的抗原(Ag)の量が多いほど、
その一定期間に存在する酵素反応生成物の量が多くな
る。本発明の場合、後記のようにこの種の酵素反応生成
物は濃縮し、気相に移行させたのち検出される。
第１Ｄ図は本発明に用いられる第１の形態の核酸アツセ
イ配置様式を示す。この様式の場合、試料核酸（標的配
列Ｇを含む）を一本鎖の形で固相（たとえばニトロセル
ロース紙）上に固定化する。このコーテイングされた
紙を次いで試料の標的中の標的ヌクレオチド配列(G)
に対し相補的なポリヌクレオチド配列（Ｇ′）を含むプ
ローブポリヌクレオチド(P)の複合体と接触させる。さ
らにプローブポリヌクレオチド(P)を酵素(E)に共有結合
させる。適切なインキユベーシヨン期間および分離（特
に洗浄）ののち、コーテイングされた紙を酵素反応体
と接触させる。酵素反応生成物に関しアツセイすること
により（本発明においては気相に移行させ、濃縮したの
ち）、定量的測定値が得られる。これは試料中の標的ポ
リヌクレオチド配列(G)の量の関数であり、これに正比
例する。この方法の変法を第１Ｅ図に示す。この場合、
紙上に固定化された試料をまずビオチン(B)に結合さ
せたプローブポリヌクレオチド(P)と接触させ、次いで
酵素(E)に結合させたアビジンまたはストレプアビジン
(A)と接触させる。十分に洗浄およびその他の分離を行
つたのち、コーテイングされた紙を今度は酵素反応体
と接触させる。酵素(E)が紙上にコーテイングされた
範囲まで（図示されるように試料(G)、プローブ(P)、ビ
オチン(B)およびアビジン(A)を介した特異的付着のみに
よることが好ましいが、多くの場合非特異的結合による
ことも多い）酵素反応生成物が一定期間にわたつて蓄積
するであろう。この場合も酵素反応生成物の濃度（本発
明においては気相に移行させ、濃縮したのちに検出され
る）は、試料中の標的ポリヌクレオチド配列(G)の量ま
たは濃度の関係であり、これに正比例するであろう。
イ配置様式を示す。この様式の場合、試料核酸（標的配
列Ｇを含む）を一本鎖の形で固相（たとえばニトロセル
ロース紙）上に固定化する。このコーテイングされた
紙を次いで試料の標的中の標的ヌクレオチド配列(G)
に対し相補的なポリヌクレオチド配列（Ｇ′）を含むプ
ローブポリヌクレオチド(P)の複合体と接触させる。さ
らにプローブポリヌクレオチド(P)を酵素(E)に共有結合
させる。適切なインキユベーシヨン期間および分離（特
に洗浄）ののち、コーテイングされた紙を酵素反応体
と接触させる。酵素反応生成物に関しアツセイすること
により（本発明においては気相に移行させ、濃縮したの
ち）、定量的測定値が得られる。これは試料中の標的ポ
リヌクレオチド配列(G)の量の関数であり、これに正比
例する。この方法の変法を第１Ｅ図に示す。この場合、
紙上に固定化された試料をまずビオチン(B)に結合さ
せたプローブポリヌクレオチド(P)と接触させ、次いで
酵素(E)に結合させたアビジンまたはストレプアビジン
(A)と接触させる。十分に洗浄およびその他の分離を行
つたのち、コーテイングされた紙を今度は酵素反応体
と接触させる。酵素(E)が紙上にコーテイングされた
範囲まで（図示されるように試料(G)、プローブ(P)、ビ
オチン(B)およびアビジン(A)を介した特異的付着のみに
よることが好ましいが、多くの場合非特異的結合による
ことも多い）酵素反応生成物が一定期間にわたつて蓄積
するであろう。この場合も酵素反応生成物の濃度（本発
明においては気相に移行させ、濃縮したのちに検出され
る）は、試料中の標的ポリヌクレオチド配列(G)の量ま
たは濃度の関係であり、これに正比例するであろう。
第１Ｆ図はサンドイツチポリヌクレオチドアツセイを示
す。この場合、支持体ないしは固相（たとえば紙）に
標的ポリヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列に対し相
補的なヌクレオチド配列を含む第１プローブ（Ｐ１）が
結合している。第２プローブ（Ｐ２）は酵素(E)に共有
結合しており〔あるいはビオチオンなどに結合してお
り、のちにアビジン−酵素結合体（Ａ−Ｅ）を添加して
もよい〕、これら２種のプローブ（一方は固相上にあ
り、他方は溶液中にある）を試料と共にインキユベート
する。試料中の標的ポリヌクレオチド配列（それぞれＰ
１およびＰ２に相補的な配列P1′およびP2′を含む）は
Ｐ１およびＰ２の双方に結合し、その結果酵素が図示さ
れるようにＰ１、標的ポリヌクレオチド(G)およびＰ２
を介して、あるいは（前述したが図示されてはいない）
Ｐ１、試料(G)、Ｐ２、ビオチンおよびアビジンを介し
て固相に結合した複合体が形成されるであろう。洗浄し
て未結合酵素などを除去したのち、酵素反応体を添加
し、酵素反応生成物をアツセイする（本発明においては
気相に移行させ、濃縮したのち）。一定期間の酵素反応
後のこの種の酵素反応生成物の量は、試料中に一本鎖の
形で存在する標的ポリヌクレオチドの濃度または量の関
数であり、これに正比例する。
す。この場合、支持体ないしは固相（たとえば紙）に
標的ポリヌクレオチドの第１ヌクレオチド配列に対し相
補的なヌクレオチド配列を含む第１プローブ（Ｐ１）が
結合している。第２プローブ（Ｐ２）は酵素(E)に共有
結合しており〔あるいはビオチオンなどに結合してお
り、のちにアビジン−酵素結合体（Ａ−Ｅ）を添加して
もよい〕、これら２種のプローブ（一方は固相上にあ
り、他方は溶液中にある）を試料と共にインキユベート
する。試料中の標的ポリヌクレオチド配列（それぞれＰ
１およびＰ２に相補的な配列P1′およびP2′を含む）は
Ｐ１およびＰ２の双方に結合し、その結果酵素が図示さ
れるようにＰ１、標的ポリヌクレオチド(G)およびＰ２
を介して、あるいは（前述したが図示されてはいない）
Ｐ１、試料(G)、Ｐ２、ビオチンおよびアビジンを介し
て固相に結合した複合体が形成されるであろう。洗浄し
て未結合酵素などを除去したのち、酵素反応体を添加
し、酵素反応生成物をアツセイする（本発明においては
気相に移行させ、濃縮したのち）。一定期間の酵素反応
後のこの種の酵素反応生成物の量は、試料中に一本鎖の
形で存在する標的ポリヌクレオチドの濃度または量の関
数であり、これに正比例する。
第１Ｇ図はダイアモンドらの米国特許出願第６０７，８
８５号明細書に記載された第１の、すなわち不均質な形
の置換ポリヌクレオチドアツセイを示す。このアツセイ
においては、吸着により、または好ましくは共有結合に
よりプローブポリヌクレオチド(P)に結合した支持体た
とえばポリスチレンビーズを供給する。また試薬複合体
中には、この形式の場合酵素(E)が付着した標識ポリヌ
クレオチド(L)が供給される。この標識ポリヌクレオチ
ドはプリン、ピリミジン塩基対を介して、試料が最終的
に結合しうるプローブポリヌクレオチド(P)の標的結合
領域（ＴＢＲ）の一部（ＬＢＲ）に結合する（これらの
領域の配列および寸法は米国特許出願第６０７，８８５
号明細書に、より詳細に記載されている。その記載をこ
こに参考として引用する）。この固定化された試薬複合
体を試料と接触させると、試料中の標的ポリヌクレオチ
ド配列はプローブポリヌクレオチドに結合し、固相に由
来する標識ポリヌクレオチドと置換するであろう。液相
を固相から分離し、その酵素活性を測定する。あるいは
酵素を反応混合物中の試薬複合体と離れた別個の場所に
移動させ、ここでこれを酵素反応体と接触させることが
できる。いずれの場合も、酵素反応を既知の期間行わせ
ることにより、酵素反応生成物（本発明においては気相
に移行され、濃縮されている）を検出し、定量すること
ができる。この種の酵素反応生成物は固相から置換され
た標識ポリヌクレオチド(L)に結合した酵素の量の関数
であり、これに正比例し、従つて試料中の標識ポリヌク
レオチド(G)の量または濃度にも正比例するであろう。
８５号明細書に記載された第１の、すなわち不均質な形
の置換ポリヌクレオチドアツセイを示す。このアツセイ
においては、吸着により、または好ましくは共有結合に
よりプローブポリヌクレオチド(P)に結合した支持体た
とえばポリスチレンビーズを供給する。また試薬複合体
中には、この形式の場合酵素(E)が付着した標識ポリヌ
クレオチド(L)が供給される。この標識ポリヌクレオチ
ドはプリン、ピリミジン塩基対を介して、試料が最終的
に結合しうるプローブポリヌクレオチド(P)の標的結合
領域（ＴＢＲ）の一部（ＬＢＲ）に結合する（これらの
領域の配列および寸法は米国特許出願第６０７，８８５
号明細書に、より詳細に記載されている。その記載をこ
こに参考として引用する）。この固定化された試薬複合
体を試料と接触させると、試料中の標的ポリヌクレオチ
ド配列はプローブポリヌクレオチドに結合し、固相に由
来する標識ポリヌクレオチドと置換するであろう。液相
を固相から分離し、その酵素活性を測定する。あるいは
酵素を反応混合物中の試薬複合体と離れた別個の場所に
移動させ、ここでこれを酵素反応体と接触させることが
できる。いずれの場合も、酵素反応を既知の期間行わせ
ることにより、酵素反応生成物（本発明においては気相
に移行され、濃縮されている）を検出し、定量すること
ができる。この種の酵素反応生成物は固相から置換され
た標識ポリヌクレオチド(L)に結合した酵素の量の関数
であり、これに正比例し、従つて試料中の標識ポリヌク
レオチド(G)の量または濃度にも正比例するであろう。
ダイアモンドらの米国特許出願第６０７，８８５号明細
書に記載された型の第２の形態の不均質置換ポリヌクレ
オチドアツセイを第１Ｈ図に示す。この場合、プリン／
ピリミジン塩基対を介して固定化プローブポリヌクレオ
チド(P)に結合した標識ポリヌクレオチド(L)は多数のペ
ンダントビオチン部分(B)を含む。試料との反応によ
り、試料中の標的ポリヌクレオチド配列(G)の濃度また
は量の関数でありかつこれに正比例する量の上記標識ポ
リヌクレオチドが置換されるであろう。次いで液相中の
これら標識ポリヌクレオチド(L)を別個の固相に付着し
たアビジンまたはストレプアビジン分子(A)（たとえば
ストレプアビジンのカラム）に導通し、あるいは接触さ
せる。ビオチン(B)はアビジンまたはストレプトアビジ
ン(A)に強く結合するので、これらの標識ポリヌクレオ
チド(L)は少なくとも一部のペンダントビオチン分子(B)
を介して付着するであろう。しかし立体的因子のためペ
ンダントビオチン部分(B)の多くはアビジン分子(A)に付
着することができないと考えられる（特にアビジン分子
が互いに標識ポリヌクレオチドＬの長さよりも大きな間
隔で広がつている場合）。このような他のビオチン部分
はペンダントであり、次いでカラムに導通されたアビジ
ン−酵素複合体（Ａ−Ｅ）に選択的に結合するであろ
う。次いで洗浄し、固相にアビジン(A)、ビオチン(B)、
ならびに標識ポリヌクレオチド(L)、ビオチン(B)および
カラムアビジン(A)を介して結合した酵素(E)に関して固
相を試験することにより、酵素活性を通常の方法（酵素
反応体の添加、直接もしくは間接酵素反応生成物の気相
への移行、および濃縮）により測定できる。これらの酵
素反応生成物を測定することによりペンダントビオチン
部分に正比例し、従つて置換された標識ポリヌクレオチ
ド(L)に正比例し、最終的には試料中の標識ポリヌクレ
オチド(G)に正比例する数値が得られるであろう。
書に記載された型の第２の形態の不均質置換ポリヌクレ
オチドアツセイを第１Ｈ図に示す。この場合、プリン／
ピリミジン塩基対を介して固定化プローブポリヌクレオ
チド(P)に結合した標識ポリヌクレオチド(L)は多数のペ
ンダントビオチン部分(B)を含む。試料との反応によ
り、試料中の標的ポリヌクレオチド配列(G)の濃度また
は量の関数でありかつこれに正比例する量の上記標識ポ
リヌクレオチドが置換されるであろう。次いで液相中の
これら標識ポリヌクレオチド(L)を別個の固相に付着し
たアビジンまたはストレプアビジン分子(A)（たとえば
ストレプアビジンのカラム）に導通し、あるいは接触さ
せる。ビオチン(B)はアビジンまたはストレプトアビジ
ン(A)に強く結合するので、これらの標識ポリヌクレオ
チド(L)は少なくとも一部のペンダントビオチン分子(B)
を介して付着するであろう。しかし立体的因子のためペ
ンダントビオチン部分(B)の多くはアビジン分子(A)に付
着することができないと考えられる（特にアビジン分子
が互いに標識ポリヌクレオチドＬの長さよりも大きな間
隔で広がつている場合）。このような他のビオチン部分
はペンダントであり、次いでカラムに導通されたアビジ
ン−酵素複合体（Ａ−Ｅ）に選択的に結合するであろ
う。次いで洗浄し、固相にアビジン(A)、ビオチン(B)、
ならびに標識ポリヌクレオチド(L)、ビオチン(B)および
カラムアビジン(A)を介して結合した酵素(E)に関して固
相を試験することにより、酵素活性を通常の方法（酵素
反応体の添加、直接もしくは間接酵素反応生成物の気相
への移行、および濃縮）により測定できる。これらの酵
素反応生成物を測定することによりペンダントビオチン
部分に正比例し、従つて置換された標識ポリヌクレオチ
ド(L)に正比例し、最終的には試料中の標識ポリヌクレ
オチド(G)に正比例する数値が得られるであろう。
本発明に用いられる均質置換ポリヌクレオチドアツセイ
の配置様式を第１Ｉ図に示す。この場合、標識ポリヌク
レオチド(G)に相補的な標的結合領域を含むプローブポ
リヌクレオチド(P)に酵素(E)を含む標識ポリヌクレオチ
ド(L)（直接に結合したものとして示されているが、ア
ビジン−ビオチンなどにより間接的に結合していてもよ
い）をすべて溶液状で供給する。この試薬複合体の場
合、酵素(E)はプローブポリヌクレオチド(P)自体に、ま
たはプローブポリヌクレオチド(P)に付着した立体障害
の大きなある部分に近接して結合する塩基対により保持
されるであろう。次いで試料と接触させることにより、
若干のポリヌクレオチド(L)（ペンダント酵素を含む）
が試薬複合体から置換されるであろう。次いで酵素反応
体を添加することにより、大部分は酵素(E)が置換され
た場所においてのみ、また大体の場合試薬複合体中で酵
素(E)がなお立体障害を受けない場所において酵素反応
が起こるであろう。酵素反応生成物の検出により（本発
明においては気相に移行させ、濃縮したのち）、試薬複
合体から置換された標識ポリヌクレオチドの関数であ
り、これに正比例し、従つて試料中の標的ポリヌクレオ
チド(G)にも正比例する数値が得られる。
の配置様式を第１Ｉ図に示す。この場合、標識ポリヌク
レオチド(G)に相補的な標的結合領域を含むプローブポ
リヌクレオチド(P)に酵素(E)を含む標識ポリヌクレオチ
ド(L)（直接に結合したものとして示されているが、ア
ビジン−ビオチンなどにより間接的に結合していてもよ
い）をすべて溶液状で供給する。この試薬複合体の場
合、酵素(E)はプローブポリヌクレオチド(P)自体に、ま
たはプローブポリヌクレオチド(P)に付着した立体障害
の大きなある部分に近接して結合する塩基対により保持
されるであろう。次いで試料と接触させることにより、
若干のポリヌクレオチド(L)（ペンダント酵素を含む）
が試薬複合体から置換されるであろう。次いで酵素反応
体を添加することにより、大部分は酵素(E)が置換され
た場所においてのみ、また大体の場合試薬複合体中で酵
素(E)がなお立体障害を受けない場所において酵素反応
が起こるであろう。酵素反応生成物の検出により（本発
明においては気相に移行させ、濃縮したのち）、試薬複
合体から置換された標識ポリヌクレオチドの関数であ
り、これに正比例し、従つて試料中の標的ポリヌクレオ
チド(G)にも正比例する数値が得られる。
以上９例の考察からみて、結合対員子に結合した酵素の
濃度または活性が試料中の標的結合対員子の濃度または
量により正または負の影響を受ける各種の特異的結合反
応が可能であることは明らかであろう。上記の説明は標
的抗原および標的ポリヌクレオチド配列についてのみ述
べたが、これらの各種配置様式を標的ハプテン、標的抗
体、標的ホルモンおよび標的受容体（たとえばＴ細胞に
より産生されるもの）に適用できることは明らかであろ
う。酵素（または他の調節部分、たとえば触媒および補
助因子）の増幅作用は上記アツセイすべての活性を改善
するのに有用である。しかしこれは存在する標的結合員
子のコピー数が少ない場合に特に有用である。これはウ
イルス性および細菌性の抗原、ＤＮＡ、ならびにＲＮＡ
についてしばしば起こる。
濃度または活性が試料中の標的結合対員子の濃度または
量により正または負の影響を受ける各種の特異的結合反
応が可能であることは明らかであろう。上記の説明は標
的抗原および標的ポリヌクレオチド配列についてのみ述
べたが、これらの各種配置様式を標的ハプテン、標的抗
体、標的ホルモンおよび標的受容体（たとえばＴ細胞に
より産生されるもの）に適用できることは明らかであろ
う。酵素（または他の調節部分、たとえば触媒および補
助因子）の増幅作用は上記アツセイすべての活性を改善
するのに有用である。しかしこれは存在する標的結合員
子のコピー数が少ない場合に特に有用である。これはウ
イルス性および細菌性の抗原、ＤＮＡ、ならびにＲＮＡ
についてしばしば起こる。
特異的結合反応（１種または２種以上）および酵素反応
が双方とも終了した時点で、検出可能な部分を本発明に
おいては気相に移行させる。幾つかの好ましい形態の場
合、酵素反応の基質は酵素反応体が不揮発性または比較
的不揮発性であるが、少なくとも１種の酵素反応生成物
は揮発性または比較的揮発性であるものとして選ばれ
る。本発明の好ましい形態においては、酵素反応体は結
合体であり、酵素は加水分解酵素である。このような場
合、結合体は本質的にまたは比較的不揮発性であるが、
酵素により開裂しうる結合部分により結合体の残部に結
合した検出可能部分が結合体中に存在する。この種の検
出可能部分は揮発性もしくは比較的揮発性であり（のち
に詳述する）、かつ選ばれた検出手段（これについても
のちに記述する）により検出可能でなければならない。
が双方とも終了した時点で、検出可能な部分を本発明に
おいては気相に移行させる。幾つかの好ましい形態の場
合、酵素反応の基質は酵素反応体が不揮発性または比較
的不揮発性であるが、少なくとも１種の酵素反応生成物
は揮発性または比較的揮発性であるものとして選ばれ
る。本発明の好ましい形態においては、酵素反応体は結
合体であり、酵素は加水分解酵素である。このような場
合、結合体は本質的にまたは比較的不揮発性であるが、
酵素により開裂しうる結合部分により結合体の残部に結
合した検出可能部分が結合体中に存在する。この種の検
出可能部分は揮発性もしくは比較的揮発性であり（のち
に詳述する）、かつ選ばれた検出手段（これについても
のちに記述する）により検出可能でなければならない。
本発明方法を実施する過程でこの検出可能部分は気相に
移行されなければならない。この移行は、検出可能部分
を結合体が開裂した水性の液相（すなわち水性の酵素反
応混合物）から蒸発させる簡単な形式をとることができ
るものとする。またこの検出可能部分をある異なる水相
から、すなわち酵素反応後に種々の物理的または化学的
な処理または化学的な処理または分離を行つたのちのあ
る変化した形の水相から蒸発させることもできるものと
する。さらにまた、検出可能部分を水相から有機相中へ
抽出し、次いでこの有機相から蒸発させることもできる
ものと考えられる。この場合、無毒性であり水と混和し
ない有機溶剤、たとえばエーテル、ケトン、エステル、
脂肪族炭化水素および芳香族炭化水素を用いて、検出可
能部分および比較的少数の他の低極性物質を水相から抽
出することが好ましい。この場合、より極性の高い物
質、たとえば核酸、蛋白質、緩衝剤、および安定剤は水
相に残されるであろう。従つて検出可能部分を有機液体
相からそのままで（たとえばヘッドスペースクロマトグ
ラフイーの場合）、または制御された加熱パターンによ
り蒸発させることができる。検出可能部分が気相になる
と、これをこの相で検出することができるが、そうする
必要はない。たとえば気相に移行させたのち検出可能部
分を固相または液相（特にクロマトグラフイーカラム）
に捕獲してもよい。さらに検出可能部分を含む気相全体
を選択的に吸着、吸収、凝縮させ（たとえばガスクロマ
トグラフイー装置またはイオン移動度測定装置中で）、
これにより異なる速度で系内を移動する他の物質から目
的とする特定の検出可能部分を分離しうるものとする。
イオン移動度測定装置の例は米国特許第４，３１１，６
６９号（スパングラーら）、第４，３９０，７８４号
（ブラウニングら）、および第４，３７８，４９９号
（スパングラーら）各明細書に記載されている。これら
の場合、最終的な検出（たとえば電荷の測定、吸光、発
光、光イオン化など）自体は選択的である必要はない。
選択性は選択的な吸収、イオン移動、吸着などによつて
与えられているからである。気相への移行、クロマトグ
ラフイーの形式による分離、および発光もしくは吸光に
よる検出の組合わせの幾つかを下記の実施例（過去形で
記述）および予想例（現在形で記述）に示す。予想例の
実現可能性はその直前または直後の部分例により証明さ
れる（これらの部分例は過去形で記述する）。
移行されなければならない。この移行は、検出可能部分
を結合体が開裂した水性の液相（すなわち水性の酵素反
応混合物）から蒸発させる簡単な形式をとることができ
るものとする。またこの検出可能部分をある異なる水相
から、すなわち酵素反応後に種々の物理的または化学的
な処理または化学的な処理または分離を行つたのちのあ
る変化した形の水相から蒸発させることもできるものと
する。さらにまた、検出可能部分を水相から有機相中へ
抽出し、次いでこの有機相から蒸発させることもできる
ものと考えられる。この場合、無毒性であり水と混和し
ない有機溶剤、たとえばエーテル、ケトン、エステル、
脂肪族炭化水素および芳香族炭化水素を用いて、検出可
能部分および比較的少数の他の低極性物質を水相から抽
出することが好ましい。この場合、より極性の高い物
質、たとえば核酸、蛋白質、緩衝剤、および安定剤は水
相に残されるであろう。従つて検出可能部分を有機液体
相からそのままで（たとえばヘッドスペースクロマトグ
ラフイーの場合）、または制御された加熱パターンによ
り蒸発させることができる。検出可能部分が気相になる
と、これをこの相で検出することができるが、そうする
必要はない。たとえば気相に移行させたのち検出可能部
分を固相または液相（特にクロマトグラフイーカラム）
に捕獲してもよい。さらに検出可能部分を含む気相全体
を選択的に吸着、吸収、凝縮させ（たとえばガスクロマ
トグラフイー装置またはイオン移動度測定装置中で）、
これにより異なる速度で系内を移動する他の物質から目
的とする特定の検出可能部分を分離しうるものとする。
イオン移動度測定装置の例は米国特許第４，３１１，６
６９号（スパングラーら）、第４，３９０，７８４号
（ブラウニングら）、および第４，３７８，４９９号
（スパングラーら）各明細書に記載されている。これら
の場合、最終的な検出（たとえば電荷の測定、吸光、発
光、光イオン化など）自体は選択的である必要はない。
選択性は選択的な吸収、イオン移動、吸着などによつて
与えられているからである。気相への移行、クロマトグ
ラフイーの形式による分離、および発光もしくは吸光に
よる検出の組合わせの幾つかを下記の実施例（過去形で
記述）および予想例（現在形で記述）に示す。予想例の
実現可能性はその直前または直後の部分例により証明さ
れる（これらの部分例は過去形で記述する）。
第２図は本発明の読取り部を概略的に示す。ある量の酵
素(E)を特異的結合反応（第１Ａ、１Ｃ〜１Ｊに示す）
後に、またはその活性が調整されたのち（第１Ｂ図また
は１Ｋ図に示す）試験管に入れる。結合(I)により揮発
性部分(V)に結合した糖(S)の結合体を１０００単位とし
て示す量導入する。一定期間の競合に際して酵素反応に
より６００単位が開裂した場合、６００単位の開裂した
部分(V)は水相中に存在するであろう。次いで有機相で
抽出することにより、この部分のすべてまたは一定の部
分が有機相中へ抽出される（第２Ｂ図に概略的に示
す）。次いで有機相の一定部分をガスクロマトグラフの
入口(I)に注入することにより揮発性部分(V)は一緒に移
動し、検出器(D)に達し、検出器(D)の出力にピークを生
じるであろう。この出力は特異的結合反応後の第２Ａ図
の試験管における酵素活性と正比例する増幅された値を
表わす。従つてこの出力は分析される試料中の標的結合
員子の関数である。
素(E)を特異的結合反応（第１Ａ、１Ｃ〜１Ｊに示す）
後に、またはその活性が調整されたのち（第１Ｂ図また
は１Ｋ図に示す）試験管に入れる。結合(I)により揮発
性部分(V)に結合した糖(S)の結合体を１０００単位とし
て示す量導入する。一定期間の競合に際して酵素反応に
より６００単位が開裂した場合、６００単位の開裂した
部分(V)は水相中に存在するであろう。次いで有機相で
抽出することにより、この部分のすべてまたは一定の部
分が有機相中へ抽出される（第２Ｂ図に概略的に示
す）。次いで有機相の一定部分をガスクロマトグラフの
入口(I)に注入することにより揮発性部分(V)は一緒に移
動し、検出器(D)に達し、検出器(D)の出力にピークを生
じるであろう。この出力は特異的結合反応後の第２Ａ図
の試験管における酵素活性と正比例する増幅された値を
表わす。従つてこの出力は分析される試料中の標的結合
員子の関数である。
以上の考察から、検出可能部分の濃縮は気相への移行の
前、途中および／または後に実施できることが認められ
るであろう。たとえば抽出を行う場合、抽出工程により
第１相（水相）の他の成分に比して検出可能部分が高度
に濃縮される。クロマトグラフイーまたはイオン移動度
分離法を採用する場合、この種の濃縮は気相中で、また
は気相と固相（または液相）との間の相互作用により行
われる。しかし別個の濃縮工程を採用することにより、
デカルボキシラーゼを用いる酵素イムノアツセイ後のＣ
−１４標識二酸化炭素の測定の場合のように（エツチ・
エー・フイールドら、ジヤーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソジ、４７巻、１４５−５９頁（１９８１年））
第１相上で直接にそのままの蒸気相を分析するのを除く
ものとする。このようなフイールドらの酵素により放出
される放射性ガスの直接測定はラジオアクテイブイムノ
アツセイのすべての欠点をもつ。
前、途中および／または後に実施できることが認められ
るであろう。たとえば抽出を行う場合、抽出工程により
第１相（水相）の他の成分に比して検出可能部分が高度
に濃縮される。クロマトグラフイーまたはイオン移動度
分離法を採用する場合、この種の濃縮は気相中で、また
は気相と固相（または液相）との間の相互作用により行
われる。しかし別個の濃縮工程を採用することにより、
デカルボキシラーゼを用いる酵素イムノアツセイ後のＣ
−１４標識二酸化炭素の測定の場合のように（エツチ・
エー・フイールドら、ジヤーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソジ、４７巻、１４５−５９頁（１９８１年））
第１相上で直接にそのままの蒸気相を分析するのを除く
ものとする。このようなフイールドらの酵素により放出
される放射性ガスの直接測定はラジオアクテイブイムノ
アツセイのすべての欠点をもつ。
上記以外の適切な検出手段にはアール・エル・グロブの
“最新のガスクロマトグラフイーの実際”、第５章“検
出器”（２１３−２８０頁）に記載されているものが含
まれる。以下の論述において幾つかの気相検出法の例に
ついて述べる。それぞれの場合、代表的な検出可能部分
につき説明する。後記の表に、酵素により開裂しうる結
合部分により結合して不揮発性結合体となつている検出
可能部分を含む結合体である前駆物質を示す。この表の
末尾に本発明の種々の配置様式においてタグ(tag)とし
て使用できる一群の酵素の例を挙げる。各酵素はこの種
の酵素により開裂可能な結合を開裂させるために使用で
きることが当業者に知られている種々の相対物をもつこ
とは認められるであろう。またいずれの酵素についても
気相に移行させうる同一または他の検出可能部分を与え
る多数の他の結合体を使用できることは自明であろう。
“最新のガスクロマトグラフイーの実際”、第５章“検
出器”（２１３−２８０頁）に記載されているものが含
まれる。以下の論述において幾つかの気相検出法の例に
ついて述べる。それぞれの場合、代表的な検出可能部分
につき説明する。後記の表に、酵素により開裂しうる結
合部分により結合して不揮発性結合体となつている検出
可能部分を含む結合体である前駆物質を示す。この表の
末尾に本発明の種々の配置様式においてタグ(tag)とし
て使用できる一群の酵素の例を挙げる。各酵素はこの種
の酵素により開裂可能な結合を開裂させるために使用で
きることが当業者に知られている種々の相対物をもつこ
とは認められるであろう。またいずれの酵素についても
気相に移行させうる同一または他の検出可能部分を与え
る多数の他の結合体を使用できることは自明であろう。
しかし前駆物質は開裂して検出可能部分を生成しうる結
合体である必要はない。他の型の前駆物質は過酸化水素
の測定に関してケー・コバヤシら（ジヤーナル・オブ・
クロマトグラフイー、２４５巻、３３９−３４５頁（１
９８２年））が用いた多工程化学反応により例示される
下記の多工程化学化応によつて例示される（酸化酵素活
性のアツセイの一部として示唆されたもの）。
合体である必要はない。他の型の前駆物質は過酸化水素
の測定に関してケー・コバヤシら（ジヤーナル・オブ・
クロマトグラフイー、２４５巻、３３９−３４５頁（１
９８２年））が用いた多工程化学反応により例示される
下記の多工程化学化応によつて例示される（酸化酵素活
性のアツセイの一部として示唆されたもの）。
ここで糖がグルコースであつてもよく、その場合酵素１
は酸化酵素であるグルコースオキシダーゼであり、酵素
２はカタラーゼであり、PFBOAはペンタフルオルベンジ
ルオキシラミンであり、Ｏ−PFBOはＯ−ペンタフルオル
ベンジルオキシムである。本発明に適用した場合、酵素
１（たとえばグルコースオキシダーゼ）または酵素２
（たとえばカタラーゼ）は抗原、抗体、核酸または他の
結合対員子上のタグであつてよい。アツセイの最後に、
タグがグルコースオキシダーゼである場合グルコース、
酵素、メタノールおよびカタラーゼ（すべてグルコース
オキシダーゼに比べて過剰）を含む読取り試薬を添加す
る。一定期間後にPFBOAおよびＯ−PFBOを抽出し、電子
捕獲検出器を備えたガスクロマトグラフイーに注入する
か、または水溶液全体を注入する。PFBOAおよびＯ−PFB
Oに関する別個の信号が高い感度で測定されるであろ
う。同様にカタラーゼがタグである場合、過酸化水素、
メタノールおよびPFBOAを一定期間過剰に添加する。次
いで注入、または抽出と注入を行う。タグとして用いら
れる酵素または他の触媒もしくは補助触媒により調節さ
れる他の多くの同様な単一反応または多工程反応を行つ
て前駆物質を揮発性の検出可能部分に変換することもで
きる。しかし、濃縮および／または分離の各工程が前駆
物質を目的とする検出可能部分と区別するのに十分であ
るならば前駆物質（上記の例においてはメタノールおよ
びPFBOA）が不揮発性である必要はない。
は酸化酵素であるグルコースオキシダーゼであり、酵素
２はカタラーゼであり、PFBOAはペンタフルオルベンジ
ルオキシラミンであり、Ｏ−PFBOはＯ−ペンタフルオル
ベンジルオキシムである。本発明に適用した場合、酵素
１（たとえばグルコースオキシダーゼ）または酵素２
（たとえばカタラーゼ）は抗原、抗体、核酸または他の
結合対員子上のタグであつてよい。アツセイの最後に、
タグがグルコースオキシダーゼである場合グルコース、
酵素、メタノールおよびカタラーゼ（すべてグルコース
オキシダーゼに比べて過剰）を含む読取り試薬を添加す
る。一定期間後にPFBOAおよびＯ−PFBOを抽出し、電子
捕獲検出器を備えたガスクロマトグラフイーに注入する
か、または水溶液全体を注入する。PFBOAおよびＯ−PFB
Oに関する別個の信号が高い感度で測定されるであろ
う。同様にカタラーゼがタグである場合、過酸化水素、
メタノールおよびPFBOAを一定期間過剰に添加する。次
いで注入、または抽出と注入を行う。タグとして用いら
れる酵素または他の触媒もしくは補助触媒により調節さ
れる他の多くの同様な単一反応または多工程反応を行つ
て前駆物質を揮発性の検出可能部分に変換することもで
きる。しかし、濃縮および／または分離の各工程が前駆
物質を目的とする検出可能部分と区別するのに十分であ
るならば前駆物質（上記の例においてはメタノールおよ
びPFBOA）が不揮発性である必要はない。
本発明の診断用アツセイキツトには本方法の実施のため
の少なくとも２種の試薬および２種の手段が含まれる。
一試薬は特異的結合反応に関与しうる結合対員子（標的
結合対員子以外のもの）とカツプリングした調節部分
（たとえば酵素）を含む。第１Ａ−１Ｋ図から、この種
の酵素結合体は抗原、抗体、ハプテンまたはポリヌクレ
オチド（プローブポリヌクレオチドまたは標識ポリヌク
レオチド）のいずれかを含有しうることは明らかであろ
う。キツト中に必要とされる第２試薬は前駆物質または
一組の前駆物質（たとえば酵素により開裂しうる結合剤
により結合して不揮発性結合体となつている揮発性の検
出可能部分を含む結合体）である。この種の酵素結合体
および酵素反応体結合体の組合せを下記に示す。
の少なくとも２種の試薬および２種の手段が含まれる。
一試薬は特異的結合反応に関与しうる結合対員子（標的
結合対員子以外のもの）とカツプリングした調節部分
（たとえば酵素）を含む。第１Ａ−１Ｋ図から、この種
の酵素結合体は抗原、抗体、ハプテンまたはポリヌクレ
オチド（プローブポリヌクレオチドまたは標識ポリヌク
レオチド）のいずれかを含有しうることは明らかであろ
う。キツト中に必要とされる第２試薬は前駆物質または
一組の前駆物質（たとえば酵素により開裂しうる結合剤
により結合して不揮発性結合体となつている揮発性の検
出可能部分を含む結合体）である。この種の酵素結合体
および酵素反応体結合体の組合せを下記に示す。
同様な様式で適宜な結合体および酵素を用いることがで
き、これにより下記の揮発性の検出可能な部分を生成さ
せ、移行させ、濃縮し、そして検出することができる。
いずれの場合も可能な開裂しうる結合の型を示す。
き、これにより下記の揮発性の検出可能な部分を生成さ
せ、移行させ、濃縮し、そして検出することができる。
いずれの場合も可能な開裂しうる結合の型を示す。
置換基が開裂した検出可能部分を過度に不揮発性にしな
い限り（採用する特定の全体的系において気相に移行さ
せるのが困難である）、他の同様な検出可能部分、特に
ハロゲン原子（たとえば塩素またはフッ素）またはニト
ロ基を含有するものも使用できる。たとえば特定の高度
に塩素化された部分は過度に不揮発性となる可能性があ
る。さらに、選択的結合反応または調節された化学反応
に用いられる水性媒質中で副反応または自発的開裂を生
じないように検出可能部分および全体的結合体を選ぶべ
きである。
い限り（採用する特定の全体的系において気相に移行さ
せるのが困難である）、他の同様な検出可能部分、特に
ハロゲン原子（たとえば塩素またはフッ素）またはニト
ロ基を含有するものも使用できる。たとえば特定の高度
に塩素化された部分は過度に不揮発性となる可能性があ
る。さらに、選択的結合反応または調節された化学反応
に用いられる水性媒質中で副反応または自発的開裂を生
じないように検出可能部分および全体的結合体を選ぶべ
きである。
本発明に用いられる他の適切な酵素／開裂可能な結合体
の組合せには、たとえばビー・コツペンらのアナル．・
バイオケム(Anal.Biochem。)１３６巻、２７２−２７５
（１９８４）に記載された試料中の酵素に関する純粋の
アツセイについて知られているものが含まれる。この種
の酵素は幾つかの主要カテゴリーに分けられ、これには
加水分解酵素およびリアーゼが含まれる。加水分解酵素
には特に、検出可能部分（たとえば特定の糖、たとえば
グルコースまたはガラクトース）に結合した一般的なま
たは特異的な部分のエステル結合、アミド結合またはア
セタール結合を開裂するための酵素が含まれる。リアー
ゼにはそれらの基質から加水分解によらずに基を除去
し、二重結合を含む部分を残す酵素が含まれる。（たと
えば二酸化炭素を生成するデカルボキシラーゼの場合の
ように）。
の組合せには、たとえばビー・コツペンらのアナル．・
バイオケム(Anal.Biochem。)１３６巻、２７２−２７５
（１９８４）に記載された試料中の酵素に関する純粋の
アツセイについて知られているものが含まれる。この種
の酵素は幾つかの主要カテゴリーに分けられ、これには
加水分解酵素およびリアーゼが含まれる。加水分解酵素
には特に、検出可能部分（たとえば特定の糖、たとえば
グルコースまたはガラクトース）に結合した一般的なま
たは特異的な部分のエステル結合、アミド結合またはア
セタール結合を開裂するための酵素が含まれる。リアー
ゼにはそれらの基質から加水分解によらずに基を除去
し、二重結合を含む部分を残す酵素が含まれる。（たと
えば二酸化炭素を生成するデカルボキシラーゼの場合の
ように）。
これらの結合体以外の適切な前駆物質にはコバヤシらの
報文に関連して先きに論じたものが含まれる。
報文に関連して先きに論じたものが含まれる。
例１ ビオチンのアツセイ ビオチンおよび酵素標識ビオチンを固体支持体上に固定
化されたアビジンと競合反応させることにより行うビオ
チンのイムノアツセイについて以下に述べる。
化されたアビジンと競合反応させることにより行うビオ
チンのイムノアツセイについて以下に述べる。
アビジンコーテイングされたポリスチレン製試験官の調
製（ジー・エツチ・パーソンズ・ジユニアによる“メソ
ツズ・イン・エンザイモロジー”（ジエー・ジエー・ラ
ンゴンおよびエツチ・フオン・ブナキス編）、１９８１
年、１３巻、Ｂ部、２２４−２３９頁（アカデミツク・
プレス、ニユーヨーク）の記載に従う）。アビジン（５
mg）およびウシγ−グロブリン（５mg）を０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝化食塩液(PBS)(pH７．２）５０ｍに溶解し
た。この混合物に２５％グルタルアルデヒド水溶液０．
１ｍを添加した。得られた溶液を２５℃で６０分間イ
ンキユベートし、次いでＰＢＳで１０倍に希釈した。こ
の溶液０．４ｍずつを各ポリエチレン製試験官に分注
した。試験管を３７℃で２時間インキユベートし、次い
で水洗した（３回）。
製（ジー・エツチ・パーソンズ・ジユニアによる“メソ
ツズ・イン・エンザイモロジー”（ジエー・ジエー・ラ
ンゴンおよびエツチ・フオン・ブナキス編）、１９８１
年、１３巻、Ｂ部、２２４−２３９頁（アカデミツク・
プレス、ニユーヨーク）の記載に従う）。アビジン（５
mg）およびウシγ−グロブリン（５mg）を０．０５Ｍリ
ン酸塩緩衝化食塩液(PBS)(pH７．２）５０ｍに溶解し
た。この混合物に２５％グルタルアルデヒド水溶液０．
１ｍを添加した。得られた溶液を２５℃で６０分間イ
ンキユベートし、次いでＰＢＳで１０倍に希釈した。こ
の溶液０．４ｍずつを各ポリエチレン製試験官に分注
した。試験管を３７℃で２時間インキユベートし、次い
で水洗した（３回）。
ビオチン化−β−ガラクトシダーゼの製造。ビオチン化
−β−ガラクトシダーゼはシグマ・ケミカル社から購入
され、そのままの状態で使用された。
−β−ガラクトシダーゼはシグマ・ケミカル社から購入
され、そのままの状態で使用された。
競合的結合反応：ビオチンのアツセイ。０．０５％のツ
ウイーン(Tween)２０を含有するビオチン化−β−ガラ
クトシダーゼ（ビオチン中１．０×１０−８Ｍ）のリン
酸塩緩衝化食塩液を、１×10−６〜１×１０−１０Ｍの
濃度にわたる種々のビオチン溶液等容量と混合した。得
られた溶液それぞれ０．５ｍずつをアビジンコーテイ
ングしたポリスチレン製試験官に分注した。これらの試
験官を３７℃で１．５時間インキユベートすることによ
り競合的結合反応を行つた。次いで溶液を捨て、試験官
を３回水洗した。次いで固定化された酵素の量をＯ−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解
により測定した。各ポリスチレン製試験官に０．１Ｍリ
ン酸塩緩衝液（pH7.3)1.0ｍ、３．３６Ｍβ−メルカ
プトエタノール０．０５ｍ、および０．０３Ｍ塩化マ
グネシウム０．０５ｍを装入した。各試験官を３７℃
で５分間インキユベートして酵素を活性化し、次いで
０．０６８Ｍ・Ｏ−ニトロベンジル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド０．１ｍを添加した。基質の加水分解を３
７℃で１−1/2時間行つた。次いでニトロベンゼン（内
部基準）０．１２mgを含有するジエチルエーテル１ｍ
を添加し、試験官を１分間激しく振とうした。Ｏ−ニト
ロフエノールの定量はヒユウレツト−パツカードにより
販売されるフレームイオン化検出器を備えた１００／１
２０スペルコポート(Supelcoport,スペルコ社の商標）
上の１％ＳＰ−１２４０ＤＡを充填した６フイート（約
１．８３ｍ）のガラスカラムを用いてエーテル層をガス
クロマトグラフイー分析することにより行つた。結果を
次表に示す。
ウイーン(Tween)２０を含有するビオチン化−β−ガラ
クトシダーゼ（ビオチン中１．０×１０−８Ｍ）のリン
酸塩緩衝化食塩液を、１×10−６〜１×１０−１０Ｍの
濃度にわたる種々のビオチン溶液等容量と混合した。得
られた溶液それぞれ０．５ｍずつをアビジンコーテイ
ングしたポリスチレン製試験官に分注した。これらの試
験官を３７℃で１．５時間インキユベートすることによ
り競合的結合反応を行つた。次いで溶液を捨て、試験官
を３回水洗した。次いで固定化された酵素の量をＯ−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解
により測定した。各ポリスチレン製試験官に０．１Ｍリ
ン酸塩緩衝液（pH7.3)1.0ｍ、３．３６Ｍβ−メルカ
プトエタノール０．０５ｍ、および０．０３Ｍ塩化マ
グネシウム０．０５ｍを装入した。各試験官を３７℃
で５分間インキユベートして酵素を活性化し、次いで
０．０６８Ｍ・Ｏ−ニトロベンジル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド０．１ｍを添加した。基質の加水分解を３
７℃で１−1/2時間行つた。次いでニトロベンゼン（内
部基準）０．１２mgを含有するジエチルエーテル１ｍ
を添加し、試験官を１分間激しく振とうした。Ｏ−ニト
ロフエノールの定量はヒユウレツト−パツカードにより
販売されるフレームイオン化検出器を備えた１００／１
２０スペルコポート(Supelcoport,スペルコ社の商標）
上の１％ＳＰ−１２４０ＤＡを充填した６フイート（約
１．８３ｍ）のガラスカラムを用いてエーテル層をガス
クロマトグラフイー分析することにより行つた。結果を
次表に示す。
例２ ビオチンのアツセイ ビオチンのアツセイを例１に記載したと同様な方法で行
つた。ただしポリスチレン製試験官のコーテイングに用
いたアビジンの濃度を緩衝液５００ｍ当たり２mgに低
下させ、競合的結合反応に用いたビオチン化−β−ガラ
クトシダーゼ溶液を係数２だけ希釈した（ビオチン中
５．０×10−９Ｍ、β−ガラクトシダーゼにおいて０．
２５単位／ｍ）。結果を次表に示す。
つた。ただしポリスチレン製試験官のコーテイングに用
いたアビジンの濃度を緩衝液５００ｍ当たり２mgに低
下させ、競合的結合反応に用いたビオチン化−β−ガラ
クトシダーゼ溶液を係数２だけ希釈した（ビオチン中
５．０×10−９Ｍ、β−ガラクトシダーゼにおいて０．
２５単位／ｍ）。結果を次表に示す。
例３ ビオチンのアツセイ ビオチンのアツセイを例１の記載と同様に行つた。ただ
しビオチン化−β−ガラクトシダーゼの濃度を係数１．
５だけ高めた（ビオチン中１．５×１０−８Ｍ、β−ガ
ラクトシダーゼにおいて０．７５単位／ｍまで）。結
果を表３に示す。
しビオチン化−β−ガラクトシダーゼの濃度を係数１．
５だけ高めた（ビオチン中１．５×１０−８Ｍ、β−ガ
ラクトシダーゼにおいて０．７５単位／ｍまで）。結
果を表３に示す。
例４ チロキシンのアツセイ チロキシン−β−ガラクトシダーゼ結合体を製造し、こ
の結合体および遊離チロキシンをチロキシンに対して得
られた固定化抗血清と反応させることにより実施された
チロキシンのイムノアツセイにつき以下に述べる。
の結合体および遊離チロキシンをチロキシンに対して得
られた固定化抗血清と反応させることにより実施された
チロキシンのイムノアツセイにつき以下に述べる。
チロキシンメチルエステルの製造（ジエー・エヌ・アシ
ユレイおよびシー・アール・ハリントンによりバイオケ
ム．ジヤーナル(Biochem.J.)１９２９、２２、１４３６
−１４４５に記載された方法に従う）。乾燥メタノール
２５ｍ中に懸濁したチロキシン２．０ｇ（２．６ミリ
モル）を含有するスラリーを調製した。無水塩酸の急激
な流入により飽和させると上記物質は溶解し、発熱し
た。溶液の冷却に伴つて白色沈殿が生じた。塩酸による
飽和を繰り返したのちスラリーを濃縮し、沈殿（チロキ
シンメチルエステル塩酸塩）を取し、真空デシケータ
ー中で一夜乾燥させた。次いで塩酸エステルを５０％メ
タノール水溶液２００ｍに溶解し、等量の２Ｎ水酸化
ナトリウムで中和した。若干の物質が沈殿した。収率は
水１００ｍを添加し、氷浴中で冷却することにより高
めることができた。粗生成物をフリツト上に採取し、水
洗し、真空下に乾燥させた。純粋なチロキシンメチルエ
ステルは粗製物質を希メタノールから再結晶することに
より得られた。1 H NMR(CDCl3)δ2.20(2H,S),2.98(2H,d),3.78(1H,m),3.
80(3H,S),7.17(2H,S),7.80(2H,S)。元素分析：計算値(C
16H13I4NO4)：C,24.3；H,1.66；N,1.77。
ユレイおよびシー・アール・ハリントンによりバイオケ
ム．ジヤーナル(Biochem.J.)１９２９、２２、１４３６
−１４４５に記載された方法に従う）。乾燥メタノール
２５ｍ中に懸濁したチロキシン２．０ｇ（２．６ミリ
モル）を含有するスラリーを調製した。無水塩酸の急激
な流入により飽和させると上記物質は溶解し、発熱し
た。溶液の冷却に伴つて白色沈殿が生じた。塩酸による
飽和を繰り返したのちスラリーを濃縮し、沈殿（チロキ
シンメチルエステル塩酸塩）を取し、真空デシケータ
ー中で一夜乾燥させた。次いで塩酸エステルを５０％メ
タノール水溶液２００ｍに溶解し、等量の２Ｎ水酸化
ナトリウムで中和した。若干の物質が沈殿した。収率は
水１００ｍを添加し、氷浴中で冷却することにより高
めることができた。粗生成物をフリツト上に採取し、水
洗し、真空下に乾燥させた。純粋なチロキシンメチルエ
ステルは粗製物質を希メタノールから再結晶することに
より得られた。1 H NMR(CDCl3)δ2.20(2H,S),2.98(2H,d),3.78(1H,m),3.
80(3H,S),7.17(2H,S),7.80(2H,S)。元素分析：計算値(C
16H13I4NO4)：C,24.3；H,1.66；N,1.77。
実測値：C,24.0；H,1.64；N,1.63。
ｍ−マレイミドベンジルチロキシンメチルエステルの製
造（エヌ・モンジ・エツチ・マルカスおよびエー・カス
トロによるバイオケム・バイオフイジ。リサ．コミユ。
(Biochem.Biophys。Res.Commun)、１９７８、８５、６７
１−６７７の記載に従う）。ｍ−マレイミド安息香酸
（２２５ｍ、１．０６ミリモル）を塩化チオニル４ｍ
に溶解し、３０分間還流した。過剰の塩化チオニルを
減圧下に除去することにより塩化ｍ−マレイミドベンゾ
イルが淡黄色固体として得られた。この酸塩化物（２２
０mgをテトラヒドロフラン１０ｍに溶解）をチロキシ
ンメチルエステル400mg（０．５１ミリモル）および炭
酸ナトリウム400mgの懸濁液に攪拌下に滴加した。添加
終了後に混合物を３０分間還流した。溶剤を減圧下に除
去して粗製の黄色生成物を得た。この物質をシリカゲル
クロマトグラフイーによりクロロホルムを溶離剤として
精製した。1 NMR(CDCl3)δ3.85(3H,S),3.92(1H,m),5.77(1H,S),6.90
(2H,S),7.12(2H,S),7.57(2H,m),7.70(2H,S),7.80(2H,
m).元素分析：計算値(C27H18I4N2O7)：C,32.8；H,1.8
2；N,2.80。
造（エヌ・モンジ・エツチ・マルカスおよびエー・カス
トロによるバイオケム・バイオフイジ。リサ．コミユ。
(Biochem.Biophys。Res.Commun)、１９７８、８５、６７
１−６７７の記載に従う）。ｍ−マレイミド安息香酸
（２２５ｍ、１．０６ミリモル）を塩化チオニル４ｍ
に溶解し、３０分間還流した。過剰の塩化チオニルを
減圧下に除去することにより塩化ｍ−マレイミドベンゾ
イルが淡黄色固体として得られた。この酸塩化物（２２
０mgをテトラヒドロフラン１０ｍに溶解）をチロキシ
ンメチルエステル400mg（０．５１ミリモル）および炭
酸ナトリウム400mgの懸濁液に攪拌下に滴加した。添加
終了後に混合物を３０分間還流した。溶剤を減圧下に除
去して粗製の黄色生成物を得た。この物質をシリカゲル
クロマトグラフイーによりクロロホルムを溶離剤として
精製した。1 NMR(CDCl3)δ3.85(3H,S),3.92(1H,m),5.77(1H,S),6.90
(2H,S),7.12(2H,S),7.57(2H,m),7.70(2H,S),7.80(2H,
m).元素分析：計算値(C27H18I4N2O7)：C,32.8；H,1.8
2；N,2.80。
実測値：C,32.7；H,2.09；N,2.42。
チロキシン−β−ガラクトシダーゼの製造（エヌ・モン
ジ、エツチ・マルカスおよびエー・カストロによるバイ
オケミ．バイオフイジ．リサ。コミユ(Biochem。Biophy
s.Res.Commun。)、１９７８、８５、６７１−６７７の記
載に従う）。不活性雰囲気下に保存され、遊離スルフヒ
ドリル基１８．５モル／モル（８２２単位／mg）を含有
するβ−ガラクトシダーゼ（２．５mg）、脱ガスした
０．０５Ｍリン酸塩緩衝化食塩液（pH７．２）２．１ｍ
に溶解した。ｍ−マレイミドベンゾイルチロキシンメ
チルエステル０．２mg／ｍを含有するテトラヒドロフ
ラン２５０μを添加し、得られた混合物を２５℃で２
時間インキユベートした。同一緩衝液中で一夜透析した
のち、この物質を新たに調製した（３０×１．５cm）セ
フアデツクスＧ−２５のカラム上でクロマトグラフイー
処理した。酵素活性をもつ総容積１０ｍの単一画分を
採取した。
ジ、エツチ・マルカスおよびエー・カストロによるバイ
オケミ．バイオフイジ．リサ。コミユ(Biochem。Biophy
s.Res.Commun。)、１９７８、８５、６７１−６７７の記
載に従う）。不活性雰囲気下に保存され、遊離スルフヒ
ドリル基１８．５モル／モル（８２２単位／mg）を含有
するβ−ガラクトシダーゼ（２．５mg）、脱ガスした
０．０５Ｍリン酸塩緩衝化食塩液（pH７．２）２．１ｍ
に溶解した。ｍ−マレイミドベンゾイルチロキシンメ
チルエステル０．２mg／ｍを含有するテトラヒドロフ
ラン２５０μを添加し、得られた混合物を２５℃で２
時間インキユベートした。同一緩衝液中で一夜透析した
のち、この物質を新たに調製した（３０×１．５cm）セ
フアデツクスＧ−２５のカラム上でクロマトグラフイー
処理した。酵素活性をもつ総容積１０ｍの単一画分を
採取した。
チロキシンに対して得られた抗血清の精製。チロキシン
に対して得られた抗血清０．７５ｍを０．０５Ｍリン
酸塩緩衝化食塩液（pH７．２）で最終容積５ｍに希釈
した。この溶液を等容量の飽和硫酸アンモニウムと合わ
せると沈殿が生じた。この混合物を５０００rpmで２０
分間、温度を４℃に維持しながら遠心分離した。次いで
上澄液を捨て、ペレットをリン酸塩緩衝液５ｍに再溶
解した。
に対して得られた抗血清０．７５ｍを０．０５Ｍリン
酸塩緩衝化食塩液（pH７．２）で最終容積５ｍに希釈
した。この溶液を等容量の飽和硫酸アンモニウムと合わ
せると沈殿が生じた。この混合物を５０００rpmで２０
分間、温度を４℃に維持しながら遠心分離した。次いで
上澄液を捨て、ペレットをリン酸塩緩衝液５ｍに再溶
解した。
抗チロキシンコーテイングしたポリスチレン製試験管の
調製（ジー・エツチ・パーソン・ジユニア、メソツズ・
イン・エンザイモロジー”（ジエー・ジエー・ランゴン
およびエツチ・フアン・ブナキスら編）、１９８１、１
３巻、Ｂ部、２２４−２３９頁（アカデミツク・プレ
ス、ニユーヨーク）から応用）。精製した抗体溶液０．
２ｍを、グルタルアルデヒド０．０５％を含有する
０．０５Ｍリン酸塩緩衝化食塩液（pH７．２）中で３ml
に希釈した。溶液を２５℃で１時間インキユベートし、
次いでリン酸塩緩衝化食塩液で６０倍希釈した。の最終
溶液０．５ｍを各ポリスチレン製試験管に分注し；試
験管を３７℃で２時間反応させた。次いで溶液を捨て、
試験管を３回水洗した。
調製（ジー・エツチ・パーソン・ジユニア、メソツズ・
イン・エンザイモロジー”（ジエー・ジエー・ランゴン
およびエツチ・フアン・ブナキスら編）、１９８１、１
３巻、Ｂ部、２２４−２３９頁（アカデミツク・プレ
ス、ニユーヨーク）から応用）。精製した抗体溶液０．
２ｍを、グルタルアルデヒド０．０５％を含有する
０．０５Ｍリン酸塩緩衝化食塩液（pH７．２）中で３ml
に希釈した。溶液を２５℃で１時間インキユベートし、
次いでリン酸塩緩衝化食塩液で６０倍希釈した。の最終
溶液０．５ｍを各ポリスチレン製試験管に分注し；試
験管を３７℃で２時間反応させた。次いで溶液を捨て、
試験管を３回水洗した。
競合的結合反応：チロキシンのアツセイ。ツウイーン
０．０５％を含有する０．０５Ｍリン酸塩緩衝化食塩液
に溶解したチロキシン−β−ガラクトシダーゼ結合体の
溶液（約４．０単位／ｍ）を等容量の１×１０−６〜
１×１０−１０Ｍの濃度の各種チロキシン溶液と混合し
た。得られた溶液０．０５ｍずつを、チロキシンに対
して得られた抗血清でコーテイングしたポリスチレン製
試験管に分注した。試験管を３７℃で２時間インキユベ
ートすることにより競合的結合反応を行い、この時点で
溶液を捨て、試験管を３回水洗した。固定化された酵素
の量をＯ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドの加水分解により測定した。各ポリスチレン製試験管
に０．１Ｍリン酸塩緩衝液（pH７．２）１．０ｍ、
３．３６Ｍβ−メルカプトエタノール０．０５ｍ、お
よび０．０３Ｍ塩化マグネシウム０．０５ｍを装入し
た。試験管を３７℃で５分間インキユベートして酵素を
活性化し、次いで0.068Ｍ・Ｏ−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド０．１ｍを添加した。基質の
加水分解を３７℃で２時間行つた。ニトロベンゼン（内
部基準）０．１２mgを含有するジエチルエーテル１ｍ
を添加し、試験管を１分間激しく振とうした。Ｏ−ニト
ロフエノールの定量は、ヒユ−レツト−パツカードによ
り販売されるフレームイオン化検出器を備えた１００／
１２０スペルコポート上の１％ＳＰ−１２４０ＤＡを充
填した６フイート（約１．８３ｍ）のガラスカラムを用
いてエーテル層をガスクロマトグラフイー分析すること
によつて行つた。結果を表４の最終欄に示す。対応する
Ｏ−ニトロフエノールの比色定量による分析を比較のた
め表４の第３欄に示す。
０．０５％を含有する０．０５Ｍリン酸塩緩衝化食塩液
に溶解したチロキシン−β−ガラクトシダーゼ結合体の
溶液（約４．０単位／ｍ）を等容量の１×１０−６〜
１×１０−１０Ｍの濃度の各種チロキシン溶液と混合し
た。得られた溶液０．０５ｍずつを、チロキシンに対
して得られた抗血清でコーテイングしたポリスチレン製
試験管に分注した。試験管を３７℃で２時間インキユベ
ートすることにより競合的結合反応を行い、この時点で
溶液を捨て、試験管を３回水洗した。固定化された酵素
の量をＯ−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドの加水分解により測定した。各ポリスチレン製試験管
に０．１Ｍリン酸塩緩衝液（pH７．２）１．０ｍ、
３．３６Ｍβ−メルカプトエタノール０．０５ｍ、お
よび０．０３Ｍ塩化マグネシウム０．０５ｍを装入し
た。試験管を３７℃で５分間インキユベートして酵素を
活性化し、次いで0.068Ｍ・Ｏ−ニトロフエニル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド０．１ｍを添加した。基質の
加水分解を３７℃で２時間行つた。ニトロベンゼン（内
部基準）０．１２mgを含有するジエチルエーテル１ｍ
を添加し、試験管を１分間激しく振とうした。Ｏ−ニト
ロフエノールの定量は、ヒユ−レツト−パツカードによ
り販売されるフレームイオン化検出器を備えた１００／
１２０スペルコポート上の１％ＳＰ−１２４０ＤＡを充
填した６フイート（約１．８３ｍ）のガラスカラムを用
いてエーテル層をガスクロマトグラフイー分析すること
によつて行つた。結果を表４の最終欄に示す。対応する
Ｏ−ニトロフエノールの比色定量による分析を比較のた
め表４の第３欄に示す。
例５ チロキシンのアツセイ チロキシンのイムノアツセイを例４に記載したと同様に
行つた。ただし競合的結合反応に用いたチロキシン−β
−ガラクトシダーゼ溶液を係数４だけ希釈した（試薬１
ｍにつき１．０単位の酵素、または反応混合物１ｍ
につき０．５単位）。結果を次表に示す。
行つた。ただし競合的結合反応に用いたチロキシン−β
−ガラクトシダーゼ溶液を係数４だけ希釈した（試薬１
ｍにつき１．０単位の酵素、または反応混合物１ｍ
につき０．５単位）。結果を次表に示す。
例６（部分例） Ｏ−ニトロフエノールを含む試料を陰イオンスペクトル
用に調整され、５０℃で操作されるイオン移動スペクト
ロメーター（ＩＭＳ）により分析した。米国特許第４，
３７８，４９９号明細書（スパングラーら、１９８３
年）に示されたものと同様な配置様式（ただし膜入口を
含まず、Ni-63放射性イオン化源を用いる）を採用し
た。実験に用いたＩＭＳは長さ２cmの反応器領域および
長さ８cmのドリフト領域から成つていた。試料は入口に
設けられた小さな孔にワイヤ探針または注射器を挿入す
ることによりＩＭＳに導入した。入口を１２２℃に加熱
し、試料の保留を最小限に抑えるためにテフロン（TEFL
ON，登録商標）PTFEで内張りした。ワイヤ探針から脱着
し、あるいは注射器により注入したのち、試料はセルの
出口にある吸引ポンプにより反応器内へ導入されるキヤ
リヤーガス（精製した空気、＜１０ppm H2O）によつ
て、反応器へ輸送された。ドリフトガス（精製した空
気）をドリフト領域に向流させ、ＩＭＳセルのこの境界
領域から過剰の試料を除去した。ＩＭＳセルは５３℃に
加熱された。純Ｏ−ニトロフエノール蒸気について対照
実験を行つた（鋼製探針の先端をこの蒸気にさらしたの
ちＩＭＳの加熱された入口内で探針から蒸気を脱着させ
ることにより）。試料および応答の値を次表に示す。
用に調整され、５０℃で操作されるイオン移動スペクト
ロメーター（ＩＭＳ）により分析した。米国特許第４，
３７８，４９９号明細書（スパングラーら、１９８３
年）に示されたものと同様な配置様式（ただし膜入口を
含まず、Ni-63放射性イオン化源を用いる）を採用し
た。実験に用いたＩＭＳは長さ２cmの反応器領域および
長さ８cmのドリフト領域から成つていた。試料は入口に
設けられた小さな孔にワイヤ探針または注射器を挿入す
ることによりＩＭＳに導入した。入口を１２２℃に加熱
し、試料の保留を最小限に抑えるためにテフロン（TEFL
ON，登録商標）PTFEで内張りした。ワイヤ探針から脱着
し、あるいは注射器により注入したのち、試料はセルの
出口にある吸引ポンプにより反応器内へ導入されるキヤ
リヤーガス（精製した空気、＜１０ppm H2O）によつ
て、反応器へ輸送された。ドリフトガス（精製した空
気）をドリフト領域に向流させ、ＩＭＳセルのこの境界
領域から過剰の試料を除去した。ＩＭＳセルは５３℃に
加熱された。純Ｏ−ニトロフエノール蒸気について対照
実験を行つた（鋼製探針の先端をこの蒸気にさらしたの
ちＩＭＳの加熱された入口内で探針から蒸気を脱着させ
ることにより）。試料および応答の値を次表に示す。
１０−３Ｍにおける３回の実験に関する応答１曲線（液
体上における蒸気の探針採取）を比較すると、すべての
場合に実質的な応答が認められたが、エーテル溶液から
の応答は約２倍大きかつた。１０−５Ｍの溶液について
は信号は認められたが、これらは１０−３Ｍにおける３
例よりも大幅に小さかつた。１０−７Ｍおよび１０−９
Ｍの３種の溶液上における蒸気のこのような探針採取
は、認められる応答を示さなかつた。
体上における蒸気の探針採取）を比較すると、すべての
場合に実質的な応答が認められたが、エーテル溶液から
の応答は約２倍大きかつた。１０−５Ｍの溶液について
は信号は認められたが、これらは１０−３Ｍにおける３
例よりも大幅に小さかつた。１０−７Ｍおよび１０−９
Ｍの３種の溶液上における蒸気のこのような探針採取
は、認められる応答を示さなかつた。
応答２の曲線を比較すると、第１溶液は１０−３Ｍのニ
トロフエノールにおいて良好な応答を示したが、１０
−５Ｍにおいては予期されたピークが認められなかつ
た。緩衝液は、４種の濃度すべてにおいて同一の２１ミ
リ秒のピークが認められたという点でこの場合異例の挙
動を示した。恐らくこれらの溶液中に存在する結合体Ｏ
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが水相
と共に探針により運ばれ、熱により分解してＯ−ニトロ
フエノールを生成し、これが４種の溶液中において限ら
れた量のＯ−ニトロフエノールを遮蔽したのであろう。
トロフエノールにおいて良好な応答を示したが、１０
−５Ｍにおいては予期されたピークが認められなかつ
た。緩衝液は、４種の濃度すべてにおいて同一の２１ミ
リ秒のピークが認められたという点でこの場合異例の挙
動を示した。恐らくこれらの溶液中に存在する結合体Ｏ
−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドが水相
と共に探針により運ばれ、熱により分解してＯ−ニトロ
フエノールを生成し、これが４種の溶液中において限ら
れた量のＯ−ニトロフエノールを遮蔽したのであろう。
ＩＭＳに直接注入した溶液（水溶液およびエーテル溶
液）の応答３の曲線を比較すると、乾燥という特別な条
件下で水中１０−３Ｍにおいて弱い応答が認められたに
すぎない。対比すると、エーテル溶液については著しい
信号が１０−３Ｍおよび１０−５Ｍにおいて認められ、
１０−９においてすら容易に検出できる信号が認められ
た。１０−７Ｍの実験は、データを得る前にジエチルエ
ーテルが蒸発したため報告されていない（“ＮＭ”と示
す）。
液）の応答３の曲線を比較すると、乾燥という特別な条
件下で水中１０−３Ｍにおいて弱い応答が認められたに
すぎない。対比すると、エーテル溶液については著しい
信号が１０−３Ｍおよび１０−５Ｍにおいて認められ、
１０−９においてすら容易に検出できる信号が認められ
た。１０−７Ｍの実験は、データを得る前にジエチルエ
ーテルが蒸発したため報告されていない（“ＮＭ”と示
す）。
以上の定量的結果は限られた実験に基づくものである
が、ＩＭＳは本発明の反応生成物溶液からきわめて高い
感度および信頼性をもつて定量的データを与えると期待
される。
が、ＩＭＳは本発明の反応生成物溶液からきわめて高い
感度および信頼性をもつて定量的データを与えると期待
される。
例７ 例４の方法を反復し、ジエチルエーテルで抽出を行う。
Ｏ−ニトロフエノールの定量は例６（部分例）の最終部
分（応答３の数値）に示したイオン移動度検出により行
う。結果は例４の場合よりも感度が数オーダ高いと期待
される。
Ｏ−ニトロフエノールの定量は例６（部分例）の最終部
分（応答３の数値）に示したイオン移動度検出により行
う。結果は例４の場合よりも感度が数オーダ高いと期待
される。
例８ 例４の方法を反復し、ただしガスクロマトグラフイーカ
ラムに電子捕獲検出器を備える。Ｏ−ニトロフエノール
の定量は例４のデータに比べて感度が数オーダ高いと期
待される。
ラムに電子捕獲検出器を備える。Ｏ−ニトロフエノール
の定量は例４のデータに比べて感度が数オーダ高いと期
待される。
第１Ａ−１Ｉ図は本発明における酵素イムノアツセイお
よびポリヌクレオチドアツセイの配置様式の例を示す。 第２図は本発明の読取り部を概略的に示す。 これらの図面において各記号は下記のものを表わす。 Ag：抗原；Ab：抗体 Ｅ：酵素；Ab′：第２抗体 Ｇ：核酸の標的配列； Ｇ′：Ｇに対する相補的配列 Ｐ：プローブポリヌクレオチド； Ｂ：ビオチン；Ａ：アビジン Ｐ１：第１プローブ Ｐ２：第２プローブ P1′：Ｐ１に相補的な配列； P2′：Ｐ２に相補的な配列； Ｌ：標識ポリヌクレオチド； TBR：標的結合領域 LBR:TBRの一部（Ｌに結合する部分）
よびポリヌクレオチドアツセイの配置様式の例を示す。 第２図は本発明の読取り部を概略的に示す。 これらの図面において各記号は下記のものを表わす。 Ag：抗原；Ab：抗体 Ｅ：酵素；Ab′：第２抗体 Ｇ：核酸の標的配列； Ｇ′：Ｇに対する相補的配列 Ｐ：プローブポリヌクレオチド； Ｂ：ビオチン；Ａ：アビジン Ｐ１：第１プローブ Ｐ２：第２プローブ P1′：Ｐ１に相補的な配列； P2′：Ｐ２に相補的な配列； Ｌ：標識ポリヌクレオチド； TBR：標的結合領域 LBR:TBRの一部（Ｌに結合する部分）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−45561（ＪＰ，Ａ) 米国特許4197369（ＪＰ，Ａ)
Claims (20)
- 【請求項１】次の： （ａ）第一の液相中で、生物学的試料中の標的結合対員
子に対し特異的な結合反応を行い； （ｂ）既知量の、該標的結合対員子に対して特異的な、
対応する結合対員子に結合した酵素を該第一液相に、該
標的結合対員子と酵素が結合した該結合対員子との間に
結合反応を生起せしめるのに十分な条件下で加え； （ｃ）該酵素により調節された化学反応によって揮発性
の検出可能部分に変換し得る前駆物質を該第一液相に加
え； （ｄ）該揮発性検出可能部分を気相に移行させ；そして （ｅ）該検出可能部分を検出する 工程を含んで成る、生物学的試料中の標的結合対員子を
測定する不均質相法。 - 【請求項２】前記工程（ｄ）の後で前記気相中の前記揮
発性検出可能部分を濃縮する工程を更に含む、特許請求
の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記標的結合対員子が抗原又はハプテンで
あり、前記の対応する結合対員子が抗体である、特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】前記標的結合対員子がポリヌクレオチドで
あり、前記の対応する結合対員子が相補的ポリヌクレオ
チドである、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項５】前記相補的ポリヌクレオチドが該相補的ポ
リヌクレオチドと前記酵素に結合した第二のポリヌクレ
オチドとの複合体として供給され、ここで該酵素結合ポ
リヌクレオチドは該標的ポリヌクレオチドにより置換可
能なものである、特許請求の範囲第４項に記載の方法。 - 【請求項６】前記の前駆物質が前記酵素により開裂し得
る結合を含む実質的に非揮発性の結合体であり、この結
合の開裂により前記検出可能部分が揮発性の形で放出さ
れる、特許請求の範囲第１〜５項のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項７】前記結合がアセタール結合、エステル結合
及びアミド結合より成る群から選ばれる結合である、特
許請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】前記の前駆物質が前記結合により前記検出
可能部分に結合された糖から成る、特許請求の範囲第６
項に記載の方法。 - 【請求項９】前記検出可能部分がハロゲン置換基又はニ
トロ置換基を含んでいる、特許請求の範囲第６項に記載
の方法。 - 【請求項１０】前記検出可能部分がハロゲン置換−又は
ニトロ置換−フェニルである、特許請求の範囲第９項に
記載の方法。 - 【請求項１１】前記移行工程（ｄ）が前記検出可能部分
を前記第一液層から第二の有機液層中へ抽出し、該検出
可能部分を該第一液層から前記気相へ蒸発させることか
ら成る、特許請求の範囲第１〜１０項のいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１２】前記移行工程（ｄ）が前記検出可能部分
を前記第一液層から前記気相へ蒸発させることから成
る、特許請求の範囲第１〜１１項のいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１３】前記検出工程（ｅ）が前記気相を電子の
存在下に置き、前記検出可能部分により該気相中に捕獲
された電子を測定することから成る、特許請求の範囲第
１〜１２項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１４】前記検出工程（ｅ）が前記検出可能部分
をイオン化し、電磁場における該検出可能部分の移動度
を測定することから成る、特許請求の範囲第１〜１２項
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１５】前記検出工程（ｅ）が前記検出可能部分
をキャリヤーガスの気流中へ同伴し、該検出可能部分の
カラム内における移動を測定することから成る、特許請
求の範囲第１〜１２項のいずれか１項又は第１４項に記
載の方法。 - 【請求項１６】次の： （ａ）特異的結合反応において標的結合対員子と競合し
得る特異的結合対員子に結合した酵素を液層中に含んで
成る第一反応試薬； （ｂ）該液層中で酵素により調節された化学反応によっ
て開裂し得る結合を含む非揮発性の結合体にして、該酵
素により該結合が開裂された際に該結合体から検出可能
部分が揮発性の形で放出される該結合体； （ｃ）該検出可能部分を気相に移行させる手段；及び （ｄ）該気相中の該検出可能部分を検出する手段 を含んで成る、生物学的試料中の標的結合対員子を測定
するためのキット。 - 【請求項１７】前記結合体がアセタール結合、エステル
結合又はアミド結合より前記検出可能部分に結合された
糖である、特許請求の範囲第１６項に記載のキット。 - 【請求項１８】前記糖がモノサッカリドである、特許請
求の範囲第１７項に記載のキット。 - 【請求項１９】前記検出可能部分がハロゲン置換基又は
ニトロ置換基を含んでいる、特許請求の範囲第１６項に
記載のキット。 - 【請求項２０】前記検出手段が電子捕獲検出器である、
特許請求の範囲第１６項に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/645,202 US4629689A (en) | 1984-08-29 | 1984-08-29 | Binding assay with amplified read-out and gas-phase detection |
| US645202 | 1984-08-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6175260A JPS6175260A (ja) | 1986-04-17 |
| JPH0627739B2 true JPH0627739B2 (ja) | 1994-04-13 |
Family
ID=24588048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60185011A Expired - Lifetime JPH0627739B2 (ja) | 1984-08-29 | 1985-08-22 | 増幅された続取りおよび気相検出を伴う結合アツセイ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4629689A (ja) |
| EP (1) | EP0173055A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0627739B2 (ja) |
| CA (1) | CA1259911A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5516931A (en) * | 1982-02-01 | 1996-05-14 | Northeastern University | Release tag compounds producing ketone signal groups |
| US4766064A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit |
| US4766062A (en) * | 1984-05-07 | 1988-08-23 | Allied Corporation | Displacement polynucleotide assay method and polynucleotide complex reagent therefor |
| US4840892A (en) * | 1984-05-15 | 1989-06-20 | Smithkline Beckman Corporation | Polynucleotide hybridization probes |
| US4804625A (en) * | 1984-09-27 | 1989-02-14 | Amoco Corporation | Assay procedures |
| US4794073A (en) * | 1985-07-10 | 1988-12-27 | Molecular Diagnostics, Inc. | Detection of nucleic acid hybrids by prolonged chemiluminescence |
| EP0219842A1 (en) * | 1985-10-23 | 1987-04-29 | Allied Corporation | Nucleic acid assay employing pair segment inhibition or competition |
| AU6834187A (en) * | 1985-12-17 | 1987-07-15 | Genetics Institute Inc. | Displacement polynucleotide method and reagent complex |
| WO1988006732A1 (en) * | 1987-03-02 | 1988-09-07 | Allied Corporation | Tagged binding reagents and methods for detecting target analytes |
| IL85532A (en) * | 1987-03-13 | 1992-03-29 | Coulter Electronics | Method and lytic reagent system for isolation,identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples |
| US5362624A (en) * | 1988-05-25 | 1994-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process for the determination of an immunologically detectable substance and a suitable reaction vessel therefor |
| DE3826922A1 (de) * | 1988-08-09 | 1990-02-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur kolorimetrischen bestimmung eines analyten mittels enzymatischer oxidation |
| US5824478A (en) * | 1996-04-30 | 1998-10-20 | Vysis, Inc. | Diagnostic methods and probes |
| DE69735445T2 (de) | 1996-12-10 | 2006-08-10 | Sequenom, Inc., San Diego | Abspaltbare, nicht-flüchtige moleküle zur massenmarkierung |
| ES2330812T3 (es) | 1998-07-02 | 2009-12-15 | Gen-Probe Incorporated | Antorchas moleculares. |
| US6365339B1 (en) * | 1998-09-04 | 2002-04-02 | Bechtel Bwxt Idaho, Llc | Gender determination of avian embryo |
| EP2108048A1 (en) * | 2007-01-17 | 2009-10-14 | Meridian Bioscience, Inc. | Stable reagents and kits useful in loop-mediated isothermal amplification (lamp) |
| US20090203149A1 (en) * | 2008-02-13 | 2009-08-13 | General Electric Company | Enhanced methods for gas and/or vapor phase analysis of biological assays |
| US20100129786A1 (en) * | 2008-11-21 | 2010-05-27 | General Electric Company | Agents and methods for spectrometric analysis |
| US20100129785A1 (en) * | 2008-11-21 | 2010-05-27 | General Electric Company | Agents and methods for spectrometric analysis |
| US20100129795A1 (en) * | 2008-11-21 | 2010-05-27 | General Electric Company | Agents and methods for spectrometric analysis |
| US20100129787A1 (en) * | 2008-11-21 | 2010-05-27 | General Electric Company | Agents and methods for spectrometric analysis |
| US20120121511A1 (en) * | 2010-11-12 | 2012-05-17 | Los Alamos National Security, Llc | Infection detection methods and systems and related compounds and compositions |
| WO2019130347A1 (en) | 2017-12-26 | 2019-07-04 | Sree Chitra Tirunal Institute For Medical Sciences And Technology | Primers for isothermal amplification of mpt64 gene of mycobacterium tuberculosis and the process thereof |
| CN113736858B (zh) | 2020-05-28 | 2024-05-10 | 香港科技大学 | 一种环状寡核苷酸探针介导的核酸扩增子的实时监测方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| GB2078370A (en) * | 1980-06-13 | 1982-01-06 | Nat Res Dev | Binding assays |
| GB2102946B (en) * | 1981-06-30 | 1984-11-28 | Wellcome Found | Enzyme immunoassay |
| DE3134361A1 (de) * | 1981-08-31 | 1983-03-10 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur enzymimmuno-bestimmung in homogener phase |
-
1984
- 1984-08-29 US US06/645,202 patent/US4629689A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-07-12 CA CA000486727A patent/CA1259911A/en not_active Expired
- 1985-07-16 EP EP85108876A patent/EP0173055A3/en not_active Withdrawn
- 1985-08-22 JP JP60185011A patent/JPH0627739B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CA1259911A (en) | 1989-09-26 |
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| EP0173055A2 (en) | 1986-03-05 |
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