JPH0137693B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、液体中のハプテン又は抗原（対象物
質）の存在を、特定（又は、特異的）結合の相手
物質に対する該対象物質の親和性に基づいて測定
するための方法及び試薬に関するものである。更
に詳しくは、本発明は分離工程を必要とせず、か
つ標識物質として放射性物質もしくは部分変形し
た酵素を用いない特定結合による分析に用いる方
法及び試薬に関するものである。なお、本明細書
中では、「特定」と「特異的」とは同義に用いて
いる。 液体中の低濃度の物質の存在を検出するための
便利かつ信頼性が高く、更に危険性のない方法へ
の要望があることは明白である。このことは、
10-11モル濃度程度の低濃度で体液中に存在する
成分が病理学上重大である臨床化学の分野に於い
ては、特に該当する。そのような低濃度の物質を
検出することの困難さは、通常は試料の量が非常
に制限される臨床化学の分野に於いて増加する。 以前に於いては、物質は、その検出される物質
が必ず反応体であるような反応系に基づいて、液
体中で検出されていた。未知物質の存在は、反応
生成物の出現もしくは既知反応体の消失によつて
検出されている。ある場合に於いては、そのよう
な分析方法は、生成物の出現もしくは反応体の消
失の速度あるいは生成した生成物もしくは平衡に
達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定量的にもなり得た。それぞれの
分析の反応系は必然的に小さなグループの物質の
検出のみに限定されるか、あるいは個別性（特異
性）のないもののいずれかである。 個別性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用
できる分析系の研究により、放射性免疫分析法が
生み出された。この方法によると、検出対象を物
質の放射性標識を付されたものの量は、未知のも
のに個別性を有する限られた量の抗体について、
未知のものと競い合わされるようにされる。そし
て、抗体に結合されるようになる標識を付された
ものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例し
て変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本
来、抗体に結合されるようになる標識を付された
形の検出対象の物質を、そのような結合を起さな
い物質と分離することが必要となる。この必要と
される分離を遂行するための種々の手段が、例え
ば米国特許第3505019号、3555143号、3646346号、
3720760号及び3793445号に示されるように開発さ
れてきた。しかし、それらの手段は全て、結合−
被標識付与体の非結合−被標識付与体からの効率
的な分離を確実にするためにロ過、遠心分離もし
くは洗浄などの少なくとも一つの人手による操作
工程を必要としている。分離操作を不要にするこ
とができれば分析方法が非常に簡単になり、臨床
試験室に於いて更に有用となることであろう。 免疫分析に於いて放射性物質を用いることは、
放射性物質の代わりに酵素を付けた物質を用いる
ことによりある程度避けることができるようにな
つた。米国特許第3654090号及び3791932号に例示
されているように、酵素を付けた免疫分析を遂行
するために必要な人手による操作工程は大体に於
いて放射性免疫分析に於いて必要とされることと
同じで、煩わしい分離工程を必要とする。酵素を
付けた物質を用いることについては、付けられる
各々の酵素がその付された結合体の形成に用いら
れるために個別に化学的な変形が加えられなけれ
ばならないといつた他の不利益もある。付けられ
る他の物質、例えば補酵素もしくはビールス（ネ
イチヤー、219、186（1968））を使用することが提
案され、更に蛍光標識を用いること（フランス国
特許第2217350号）も提案されている。 放射性標識もしくは付けられた酵素による免疫
分析方法は、検出可能物質の幅を広げること、も
しくは操作を簡素化させることにより将来に於て
改良されうるにしても、その本質として、これら
の方法はある種の分離工程が必ず必要となる。最
近になり、分離工程を必要としない別種の方法が
公表された。従つてこの方法は、分離が必要であ
る不均一系との対照として、均一系と言われる。
米国特許第3817837号には、検出対象物質（リガ
ンド）に共有結合する標識物質としての酵素と対
象物質用の可溶性受容体（通常は抗体）から成る
可溶性複合体を分析対象の液体と結合させる工程
及び複合体中の酵素活性に対する対象物質の効果
を測定する工程を含む競合結合分析方法が開示さ
れている。 この方法は、酵素−結合−リガントの複合体と
受容体との反応により複合体中の酵素の酵素活性
が抑制される効果になるため、分離工程が不必要
となり、この点有利であるが、それにもかかわら
ずこの方法はその能力について厳しい制限がある
ため広範囲な分析の要求には応じられない。例え
ば、酵素−結合−リガンドの複合体の製造に於い
て、検出対象の物質もしくはリガンドは酵素に、
その結合位置が酵素の酵素的に活性な位置に近接
するように注意深く制御された方法により結合さ
れなければならないことは、明らかに必須であ
る。このことは複合体とされたリガンドと受容体
との間の反応により酵素的に活性な位置を封鎖す
る目的で必要とされる。酵素は、その大きさが、
分子量約10000から1000000の範囲で大きく変動す
る。こうして、分子量が500000もしくはそれ以上
の平均的酵素の活性位置を物理的に封鎖すること
ができるように、150000と300000の間の分子量を
有する抗体の形の受容体の結合位置は厳密に制御
されなければならない。酵素の化学構造は複雑で
あるため、そのような化学的結合を厳密に制御す
ることは実際困難であり、種々広範囲の酵素をふ
るい分けることによつても、わずか少数のみの酵
素がこの均一系分析方法に於いて使用できるもの
と考えられるであろう。 更に、定量的な試験結果を得るためには、各々
の酵素−結合−リガンド複合体について酵素の数
とリガンドの数を厳密に制御することが必須とな
る。この点でもまた、酵素の複雑なペプチド構造
のためにこのような制御が困難となる。従つてや
はり、リガンドと酵素の比の必要な制御が確実に
行なえるような適当な分子構造を有する酵素はわ
ずか少数であろうと考えられる。 先行技術の均一系分析方法は酵素による増幅を
含んでおり、このため非常に鋭敏であるとされて
いる。しかし、標識物質である酵素がそれ自身先
行技術の分析方法の鋭敏性を決定する制限要素と
なつているため、この方法の応用性は非常に限定
されたものとなる。この鋭敏性は明らかに酵素−
結合−リガンド結合体に於ける特定の酵素の触媒
的活性に制限される。従つて先行技術方法の応用
性は、有用な結合体の形成のための結合への要求
のみならず、そのような結合体を使用する分析の
鋭敏性の、特定の結合体の酵素への依存性によつ
ても制限される。 先行技術の均一系の分析方法は、尿やリンパ液
のような生物の液体の試験に応用する際にも更に
不利益がある。酵素−結合−リガンド結合体中に
含まれる酵素種が試験対象の液体試料中にかなり
の量存在するので、それにより分析方法の精度に
相当な影響を与える制御不可能の活性が背景（バ
ツクグラウンド）として現われるようになる。従
つて、人間もしくは動物の生物学的液体を試験す
る際に使用できる分析方法を形づくるためには、
そのような液体に対して内因性ではない外部的な
酵素を選んでこれを用いて酵素−結合−リガンド
結合体を形成するようにする必要があり、そのた
め、この分析方法の応用性は更に制限を受けるこ
とになる。 従つて本発明の目的は、分離工程を必要とせ
ず、かつ不便な放射性物質もしくは部分変形酵素
を標識物質として使用しない、液体中のハプテン
又は抗原（対象物質）を検出するための新規な方
法及び試薬を提供することである。 更に、先行技術の方法よりも更に応用範囲が広
く便利な均一系免疫分析方法及びその系を提供す
ることも目的の一つである。 対象物質もしくはその特定結合の相手物質に先
行技術方法の酵素よりも更に都合よく結合するこ
とのできる標識物質を用いる均一系免疫分析方法
及びその系を提供することも本発明の目的の一つ
である。 特定の結合反応によつて、先行技術方法の酵素
よりも更に容易に影響を受けやすい活性を有する
標識物質を含む結合体を用いる均一系免疫分析方
法及びその系を提供することもまた本発明の目的
の一つである。 種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることによ
り、先行技術方法に於ける酵素の活性のいかなる
変化よりも更に都合良くいかなる活性の変化につ
いても検出できる標識物質を含む結合体を用いた
均一系特定結合分析方法及びその系を提供するこ
ともまた本発明の目的の一つである。 更に、先行技術の方法よりも更に容易に生物の
液体の試験に応用できる均一系特定結合分析方法
及びその系を提供することも本発明の目的の一つ
である。 本発明の均一系免疫分析方法は、液体中のハプ
テン又は抗原を分析するための： (a) 液体を、 (1) 予め定められた特性を有する標識物質とハ
プテン又は抗原との結合体、及び (2) 標識化された結合体の抗体−束縛相及び抗
体−遊離相を生成する、ハプテン又は抗原に
対する抗体 からなる試薬と接触させる工程；及び (b) 束縛相と遊離相を分離することなく、液体中
のハプテン又は抗原の指標としての特性を測定
する工程 からなる均一系免疫分析方法であつて、 結合体中の標識物質が、酵素の作用により蛍光
性生成物を生成することのできる蛍光原基質であ
ることを特徴とするものである。 又、本発明の均一系免疫分析試薬は、液体中の
ハプテン又は抗原を均一系免疫分析方法により分
析するための： (1) 予め定められた特性を有する標識物質とハプ
テン又は抗原との結合体、及び (2) ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬であつて、 該試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合
体の抗体−束縛相及び抗体−遊離相を生成する結
合反応系を形成し、かつ、束縛相又は遊離相のど
ちらかにおける特性が液体中のハプテン又は抗原
の量の関数であつて、 結合体中の標識物質が、酵素の作用により蛍光
性生成物を生成することのできる蛍光原基質であ
ることを特徴とするものである。 本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ
鋭敏な均一系特定結合分析方法及びその系を、前
以つて決められた反応の成分として賦与された反
応活性を示す物質を標識物質として使用すること
に基礎を置いて提供するものである。そのような
物質はここに置いて「反応体」として示される。
この方法は、部分的には、ハプテン又は抗原（対
象物質）とその特定結合の相手物質（このうちの
一つに反応体が結合される）との間の反応が前以
つて決められた反応に於いて反応体の活性を変化
させるという事実に基づいている。この反応が、
特定結合反応を監視検出するための手段として働
く。この基本的現象により、本発明の方法を実施
する場合に種々の試験組成物及び装置を含む種々
の操作工程が採用される。好ましい基本的な操作
案は、直接結合技術と競合結合技術である。 直接結合技術に於いては、検出対象のハプテン
又は抗原を含んでいると推定される液体は、該対
象物質の特定結合の相手物質と結合している反応
体を含有する結合体と接触せしめられ、次いで反
応体の活性の何らかの変化が分析される。競合結
合技術に於いては、液体は対象物質の特定結合の
相手物質と接触せしめられ、また対象物質（リガ
ンド）もしくはその特定の結合に関する類似物質
の一方もしくは両方に結合している反応体を含有
する結合体と接触せしめられ、次いで反応体の活
性の何らかの変化が分析される。両方の技術に於
いて、反応体の活性は、前以つて決められた監視
検出反応を反応体と共に形成する少なくとも一種
の試薬を液体と接触させることにより測定され
る。液体中の対象物質の定性的な測定は、得られ
た反応と、対象物質を含まない液体中に於ける監
視検出反応をその特性（通常は反応速度）につい
て比較することにより行なわれる。その両者の差
異が反応体の活性の変化を指示している。液体中
の対象物質の定量的測定は、得られた反応と既知
量の対象物質を含有する液体中での監視検出反応
を比較することにより行なわれる。 監視検出反応は酵素触媒が用いられることが好
ましい。通常は、監視検出反応は、結合体中の反
応体に対して高度に鋭敏なものから選ばれる。こ
の点に於いて、発光もしくは蛍光発光反応系は非
常に有用である。特に好ましいのは循環反応系
で、反応体が循環する物質である反応系が特別に
好ましい。好ましい循環反応系の中でも、酵素を
触媒として利用する系が特に有利である。本発明
における結合体中の反応体は酵素系の反応体、即
ち酵素基質であり、9000より小さい分子量を有す
るものが好ましい。 本明細書に於いて用いられる用語は以下のよう
に定義される。「リガンド」、「対象物質」もしく
は「対象物質（リガンド）」は、物質もしくは一
群の物質で、その液体中の存在もしくは量が測定
されるものである。「対象物質（リガンド）の特
定結合の相手物質」とは、物質もしくは一群の物
質で、他の物質を排除して対象物質に対して特定
の結合の親和性を示すものである。「対象物質の
特定の結合に関する類似物質」とは、物質もしく
は一群の物質で、対象物質への特定結合の相手物
質の結合親和性に関して対象物質と本質的に同じ
挙動をとるものである。 一般には、特定結合反応の各成分、例えば、リ
ガンド又は抗原（対象物質）を含有すると推定さ
れる液体、結合体及び／又は対象物質の特定結合
の相手物質は、分析の目的にとつて有意な量もし
くは濃度の対象物質が液体に含まれている時に結
合体中の反応体の活性が測定できる程度に変化す
るのであれば、いかなる量、方法及び順序でも結
合し得るものである。特定結合反応の全ての成分
は液体に可溶であることが好ましく、そうであれ
ば均一分析系となる。しかし、対象物質の特定結
合の相手物質もしくは結合体が不溶性である不均
一分析系も所望により利用することができる。 直接結合技術を用いる場合、特定結合反応の成
分は、対象物質を含有すると推定される液体と、
対象物質の特定結合の相手物質と結合している反
応体を含有するある量の結合体である。結合体の
反応体が液体に接触した時の活性は、液体中の対
象物質と結合体中の特定結合の相手物質との間の
結合の量に逆比例して変化する。すなわち、液体
中の対象物質の量が増加すれば、結合体の反応体
の活性は低下する。定量的な結果を得るために
は、液体に接触する特定結合の相手物質の量は常
に、結合体の反応体の活性の何らかの変化の評価
が完了する前の結合体と液体が接触している間、
液体中に存在すると考えられる対象物質の全部と
結合できる量より多くされる。実際には、特定結
合の相手物質の量は、液体中に存在すると考えら
れる対象物質の最大予測量に基づいて、上述した
規準に従い選ばれる。直接結合技術は特に、自身
より小さな特定結合の相手物質を持つ高分子量対
象物質を検出するのに有用である。 競合結合技術を用いる場合、特定結合反応の成
分は、対象物質を含有すると推定される液体、対
象物質（リガンド）もしくは対象物質の特定の結
合に関する類似物質に結合されている反応体を含
むある量の結合体、及びある量の対象物質の特定
の結合の相手物質である。特定結合の相手物質は
結合体と液体の両方に実質的に同時に接触せしめ
られる。液体中のいかなる対象物質（リガンド）
も、特定結合の相手物質と結合するために結合体
中のリガンドもしくはその特定の結合の類似物質
と競合するので、液体と接触した時の結合体の反
応体の活性は、液体中の対象物質と特定結合の相
手物質との間の結合の量に正比例して変化する。
即ち、液体中の対象物質の量が増加するにつれ、
結合体の反応体の活性は増加する。定量的な結果
を得るためには、結合体中の反応体及び液体と接
触している特定結合の相手物質は通常、結合体の
反応体の活性の何らかの変化の評価が完了する前
の特定結合の相手物質、結合体そして液体が接触
している間、液体中に存在すると考えられる対象
物質の全てと結合体の形をした対象物質もしくは
その類似物質の全てとに結合することのできる量
よりも少なくされる。実際には、特定結合の相手
物質の量は、液体中に存在すると考えられる対象
物質の最大予測量に基づいて、上述した規準に従
い選ばれる。通常、液体に接触する結合体の形の
対象物質（リガンド）もしくはその類似物質の量
は、液体中の試験される対象物質の最少量を超え
てはならない。競合結合技術は特に、自身より大
きな特定結合の相手物質を持つ対象物質を検出す
るのに有用である。 競合結合技術の変形としては置換結合技術があ
り、この技術では結合体が先ず特定結合の相手物
質に接触せしめられ、次いで液体に接触する。特
定結合の相手物質に対する競争はその時に起こ
る。このような方法に於いては、特定結合の相手
物質に接触する結合体の量は、対象物質を含有す
ると推定される液体との接触の前の結合体と特定
結合の相手物質との接触の間存在している特定結
合の相手物質の量と結合することのできる量より
多い量の対象物質（リガンド）もしくはその類似
物質を含む量である。この接触の順序は二種類の
便利な方法のいずれによつても達成できる。一つ
の方法によれば、結合体は、対象物質を含有する
と推定されている液体との接触の前に、液性環境
下で特定結合の相手物質と接触せしめられる。第
二の方法によれば、対象物質を含有すると推定さ
れる液体は、結合体と特定結合の相手物質を含む
複合体と接触せしめられる。この場合、結合体中
の特定結合物質と特定結合の相手物質は互いに相
対して結合している。第一の方法に於いて特定結
合の相手物質と結合するようになる結合体の量、
これは第二の方法に於ける複合体の形に於ける結
合体の量になるが、この量は通常、結合体の反応
体の活性に何らかの変化の評価の完了する前の特
定結合の相手物質（又は複合体）と液体が接触し
ている時に液体中の対象物質の全てと置き換わる
ことのできる量よりも多くされる。 競合結合技術の他の変形としては順次飽和技術
がある。この技術では特定結合反応の成分は競合
結合技術で用いられるものと同じであるが、添加
の順序あるいは各成分の組合せ及び各成分の相対
比が競合結合技術の場合と異なつている。順次結
合技術によると、対象物質の特定結合の相手物質
は、液体と結合体の接触の前の期間に、対象物質
を含有すると推定される液体と接触せしめられ
る。液体に接触する特定結合の相手物質の量は通
常、液体が結合体と接触する前の、特定結合の相
手物質と液体が接触する時に、液体中に存在して
いると考えられている対象物質の全てと結合でき
る量よりも多くされる。更に、結合体の形の対象
物質もしくはその類似物質の量は通常、結合体の
反応体の活性の何らかの変化の評価が完了する前
の液体と結合体が接触する間、残存する未結合の
特定結合の相手物質の量と結合できる量よりも多
くされる。実際には、特定結合の相手物質及び結
合体中の対象物質もしくはその類似物質の量は、
液体中に存在すると思われる最大予測量に基づ
き、上述した基準に従い選ばれる。 他の添加順序及び特定結合反応の成分の他の相
対比を含む操作工程もまた、ここに述べた発明概
念から逸脱せずに均一系特定結合分析を行なうた
めに考案されるであろうことは予測されることで
ある。 前以つて決められた監視検出反応の成分の結合
体の反応体の活性の何らかの変化を評価する工程
は、特定結合反応の反応混合物を、監視検出反応
を結合体の反応体と共に形成する少なくとも一種
の物質と接触させ、次いでその反応の特性に対す
る特定結合反応の影響を測定することにより、都
合良く達成される。監視検出反応は一つのあるい
は一連の複数の化学的に変形もしくは転換する反
応から成る。特に記さない限り、本明細書に記す
「反応系」の用語は、前以つて決められた監視検
出反応の全体もしくは一部を意味する。 酵素触媒の反応系が利用される場合、その系は
結合体の反応体と更に少なくとも一種の酵素を含
むものであり、本発明においては、また基質の如
き酵素反応体の一種もしくは数種を含むものであ
る。そのような酵素触媒反応系は、単一の簡単な
酵素反応を含むか、又は複雑な一連の酵素反応及
び非酵素反応を含むであろう。例えば、酵素反応
系は単一の酵素触媒による劣化もしくは解離反応
から成るかもしれない。そのような系に於いて結
合体の反応体は、劣化もしくは解離を起こす酵素
基質であり、特定結合反応の反応混合物と接触す
るために必要な反応系の唯一の成分は、劣化もし
くは解離反応に触媒作用を及ぼす酵素である。更
に複雑な酵素触媒の反応系は二種もしくはそれ以
上の反応体が関与する単一の酵素反応でも良く、
あるいは数種の反応体が関与していても良い（但
し、この反応の内の一つは酵素触媒によるもので
ある）。そのような系に於いて、結合体の反応体
は酵素触媒による反応の酵素反応体の一つであ
り、特定結合反応の反応混合物は、結合体中のも
のとは別で選ばれた酵素触媒反応系を形成するの
に必要な適当な酵素及び反応成分と接触せしめら
れる。 この酵素触媒反応系は、微生物の如き生物体の
細胞の生態系のように複雑な生化学系を含むこと
もまた意図されている。例えば、特定な微生物の
成長に必須な栄養物質が結合体中の反応体として
選ばれても良い。反応体の活性に於ける何らかの
変化は、唯一の反応体である栄養物質源が結合体
である環境内にそのような微生物が置かれた場
合、その微生物の成長特性の変化をももたらすで
あろう。即ち、例えば特定結合反応の反応混合物
に接触したときの微生物の成長速度の変化は、そ
の中に対象物質が存在していることを示すもので
あろう。 結合体中の反応体と共に監視検出反応を形成す
る適当な反応成分は、特定結合反応の開始の前、
又はそれと同時に、あるいはそれに引き続き、単
独で或は結合した形で特定結合反応の反応混合物
に接触せしめられる。特定結合反応の開始後、監
視検出反応の必須成分の一部もしくは全てを含む
反応混合物は、通常、結合体中の反応体の活性の
何らかの変化を評価する前の前以つて決められた
時間培養される。培養期間の後、監視検出反応に
必要で、未だ反応混合物中に充分な量存在してい
ない成分をこれに加える。そして監視検出反応に
対する何らかの影響を評価して、液体中の対象物
質の存在もしくは量の指標とする。 対象物質が液体に存在しないか、又は有意では
ない量しか存在しない状況に於いては、前以つて
決められた監視検出反応は相対的に一定の性質を
示す。液体中に対象物質が存在する場合には、監
視検出反応の少なくとも一つの特性もしくは性質
が変化する。一般には結合体の反応体の活性は、
その反応体が監視検出反応に関与することのでき
る量もしくは速度と規定される。即ち、監視検出
反応の性質は液体中の対象物質の存在により、通
常は全反応速度もしくはその反応により生成する
一もしくは数種の反応生成物の平衡量について変
化する。通常の場合に於いては、結合体中の反応
体の監視検出反応への関与の能力は、該反応体が
結合している特定結合物質とその特定結合物質の
特定結合対応物質との間の反応により低下する。
即ち、遊離状態の結合体は、束縛された状態の場
合よりも監視検出反応に対して更に活性である。
特定結合反応の培養後に存在する遊離の結合体及
び束縛された結合体の相対量は液体中の対象物質
の量の関数となり、監視検出反応への影響を決定
するものとなる。 監視検出反応の全反応速度の変化が、対象物質
の存在を決定するのに用いられる特性である時
（これが好ましい）には、その速度は通常、反応
体の消失速度もしくは反応生成物の出現速度を測
定することにより決められる。そのような測定
は、通常のクロマトグラフ、重量分析、電位差滴
定、分光光度測定、蛍光測定、濁度測定、容量測
定等の分析技術を含む広範囲の種々の方法により
行なわれる。本方法は第一として低濃度の対象物
質の検出を目的として考えられているので、非常
に感度の良い反応系が本発明の新規な特定結合反
応系と組合わせて用いるように開発された。 監視検出反応の形態としては、生物発光もしく
は化学発光の現象を示す反応のように、酵素触媒
による発光反応系がある。結合体中の反応体は、
光発生反応もしくは酵素によるか又はよらない発
光反応の準備段階である反応の反応体であつても
良い。特定結合反応の結果得られる結合体の反応
体の何らかの変化が、発生する光の全量、ピーク
強度もしくは性質の変化を引き起こす。発光反応
系の例としてはＡ表に記されたものが挙げられ、
この表に於いては以下のような省略形が用いられ
ている。 ATP：アデノシン三燐酸 AMP：アデノシン一燐酸 NAD：ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チド NADH：還元型のニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチド FMN：フラビン・モノヌクレオチド FMNH2：還元型のフラビン・モノヌクレオチド hν：電磁波放射、通常は赤外、可視或は紫外領
域のもの
質）の存在を、特定（又は、特異的）結合の相手
物質に対する該対象物質の親和性に基づいて測定
するための方法及び試薬に関するものである。更
に詳しくは、本発明は分離工程を必要とせず、か
つ標識物質として放射性物質もしくは部分変形し
た酵素を用いない特定結合による分析に用いる方
法及び試薬に関するものである。なお、本明細書
中では、「特定」と「特異的」とは同義に用いて
いる。 液体中の低濃度の物質の存在を検出するための
便利かつ信頼性が高く、更に危険性のない方法へ
の要望があることは明白である。このことは、
10-11モル濃度程度の低濃度で体液中に存在する
成分が病理学上重大である臨床化学の分野に於い
ては、特に該当する。そのような低濃度の物質を
検出することの困難さは、通常は試料の量が非常
に制限される臨床化学の分野に於いて増加する。 以前に於いては、物質は、その検出される物質
が必ず反応体であるような反応系に基づいて、液
体中で検出されていた。未知物質の存在は、反応
生成物の出現もしくは既知反応体の消失によつて
検出されている。ある場合に於いては、そのよう
な分析方法は、生成物の出現もしくは反応体の消
失の速度あるいは生成した生成物もしくは平衡に
達した際に費やされた反応体の総量の測定を行な
うことにより、定量的にもなり得た。それぞれの
分析の反応系は必然的に小さなグループの物質の
検出のみに限定されるか、あるいは個別性（特異
性）のないもののいずれかである。 個別性が高く、かつ広範囲の物質の検出に応用
できる分析系の研究により、放射性免疫分析法が
生み出された。この方法によると、検出対象を物
質の放射性標識を付されたものの量は、未知のも
のに個別性を有する限られた量の抗体について、
未知のものと競い合わされるようにされる。そし
て、抗体に結合されるようになる標識を付された
ものの量は、存在する未知物質の水準に逆比例し
て変化する。放射性免疫分析技術に於いては、本
来、抗体に結合されるようになる標識を付された
形の検出対象の物質を、そのような結合を起さな
い物質と分離することが必要となる。この必要と
される分離を遂行するための種々の手段が、例え
ば米国特許第3505019号、3555143号、3646346号、
3720760号及び3793445号に示されるように開発さ
れてきた。しかし、それらの手段は全て、結合−
被標識付与体の非結合−被標識付与体からの効率
的な分離を確実にするためにロ過、遠心分離もし
くは洗浄などの少なくとも一つの人手による操作
工程を必要としている。分離操作を不要にするこ
とができれば分析方法が非常に簡単になり、臨床
試験室に於いて更に有用となることであろう。 免疫分析に於いて放射性物質を用いることは、
放射性物質の代わりに酵素を付けた物質を用いる
ことによりある程度避けることができるようにな
つた。米国特許第3654090号及び3791932号に例示
されているように、酵素を付けた免疫分析を遂行
するために必要な人手による操作工程は大体に於
いて放射性免疫分析に於いて必要とされることと
同じで、煩わしい分離工程を必要とする。酵素を
付けた物質を用いることについては、付けられる
各々の酵素がその付された結合体の形成に用いら
れるために個別に化学的な変形が加えられなけれ
ばならないといつた他の不利益もある。付けられ
る他の物質、例えば補酵素もしくはビールス（ネ
イチヤー、219、186（1968））を使用することが提
案され、更に蛍光標識を用いること（フランス国
特許第2217350号）も提案されている。 放射性標識もしくは付けられた酵素による免疫
分析方法は、検出可能物質の幅を広げること、も
しくは操作を簡素化させることにより将来に於て
改良されうるにしても、その本質として、これら
の方法はある種の分離工程が必ず必要となる。最
近になり、分離工程を必要としない別種の方法が
公表された。従つてこの方法は、分離が必要であ
る不均一系との対照として、均一系と言われる。
米国特許第3817837号には、検出対象物質（リガ
ンド）に共有結合する標識物質としての酵素と対
象物質用の可溶性受容体（通常は抗体）から成る
可溶性複合体を分析対象の液体と結合させる工程
及び複合体中の酵素活性に対する対象物質の効果
を測定する工程を含む競合結合分析方法が開示さ
れている。 この方法は、酵素−結合−リガントの複合体と
受容体との反応により複合体中の酵素の酵素活性
が抑制される効果になるため、分離工程が不必要
となり、この点有利であるが、それにもかかわら
ずこの方法はその能力について厳しい制限がある
ため広範囲な分析の要求には応じられない。例え
ば、酵素−結合−リガンドの複合体の製造に於い
て、検出対象の物質もしくはリガンドは酵素に、
その結合位置が酵素の酵素的に活性な位置に近接
するように注意深く制御された方法により結合さ
れなければならないことは、明らかに必須であ
る。このことは複合体とされたリガンドと受容体
との間の反応により酵素的に活性な位置を封鎖す
る目的で必要とされる。酵素は、その大きさが、
分子量約10000から1000000の範囲で大きく変動す
る。こうして、分子量が500000もしくはそれ以上
の平均的酵素の活性位置を物理的に封鎖すること
ができるように、150000と300000の間の分子量を
有する抗体の形の受容体の結合位置は厳密に制御
されなければならない。酵素の化学構造は複雑で
あるため、そのような化学的結合を厳密に制御す
ることは実際困難であり、種々広範囲の酵素をふ
るい分けることによつても、わずか少数のみの酵
素がこの均一系分析方法に於いて使用できるもの
と考えられるであろう。 更に、定量的な試験結果を得るためには、各々
の酵素−結合−リガンド複合体について酵素の数
とリガンドの数を厳密に制御することが必須とな
る。この点でもまた、酵素の複雑なペプチド構造
のためにこのような制御が困難となる。従つてや
はり、リガンドと酵素の比の必要な制御が確実に
行なえるような適当な分子構造を有する酵素はわ
ずか少数であろうと考えられる。 先行技術の均一系分析方法は酵素による増幅を
含んでおり、このため非常に鋭敏であるとされて
いる。しかし、標識物質である酵素がそれ自身先
行技術の分析方法の鋭敏性を決定する制限要素と
なつているため、この方法の応用性は非常に限定
されたものとなる。この鋭敏性は明らかに酵素−
結合−リガンド結合体に於ける特定の酵素の触媒
的活性に制限される。従つて先行技術方法の応用
性は、有用な結合体の形成のための結合への要求
のみならず、そのような結合体を使用する分析の
鋭敏性の、特定の結合体の酵素への依存性によつ
ても制限される。 先行技術の均一系の分析方法は、尿やリンパ液
のような生物の液体の試験に応用する際にも更に
不利益がある。酵素−結合−リガンド結合体中に
含まれる酵素種が試験対象の液体試料中にかなり
の量存在するので、それにより分析方法の精度に
相当な影響を与える制御不可能の活性が背景（バ
ツクグラウンド）として現われるようになる。従
つて、人間もしくは動物の生物学的液体を試験す
る際に使用できる分析方法を形づくるためには、
そのような液体に対して内因性ではない外部的な
酵素を選んでこれを用いて酵素−結合−リガンド
結合体を形成するようにする必要があり、そのた
め、この分析方法の応用性は更に制限を受けるこ
とになる。 従つて本発明の目的は、分離工程を必要とせ
ず、かつ不便な放射性物質もしくは部分変形酵素
を標識物質として使用しない、液体中のハプテン
又は抗原（対象物質）を検出するための新規な方
法及び試薬を提供することである。 更に、先行技術の方法よりも更に応用範囲が広
く便利な均一系免疫分析方法及びその系を提供す
ることも目的の一つである。 対象物質もしくはその特定結合の相手物質に先
行技術方法の酵素よりも更に都合よく結合するこ
とのできる標識物質を用いる均一系免疫分析方法
及びその系を提供することも本発明の目的の一つ
である。 特定の結合反応によつて、先行技術方法の酵素
よりも更に容易に影響を受けやすい活性を有する
標識物質を含む結合体を用いる均一系免疫分析方
法及びその系を提供することもまた本発明の目的
の一つである。 種々の広範囲の鋭敏な反応系を用いることによ
り、先行技術方法に於ける酵素の活性のいかなる
変化よりも更に都合良くいかなる活性の変化につ
いても検出できる標識物質を含む結合体を用いた
均一系特定結合分析方法及びその系を提供するこ
ともまた本発明の目的の一つである。 更に、先行技術の方法よりも更に容易に生物の
液体の試験に応用できる均一系特定結合分析方法
及びその系を提供することも本発明の目的の一つ
である。 本発明の均一系免疫分析方法は、液体中のハプ
テン又は抗原を分析するための： (a) 液体を、 (1) 予め定められた特性を有する標識物質とハ
プテン又は抗原との結合体、及び (2) 標識化された結合体の抗体−束縛相及び抗
体−遊離相を生成する、ハプテン又は抗原に
対する抗体 からなる試薬と接触させる工程；及び (b) 束縛相と遊離相を分離することなく、液体中
のハプテン又は抗原の指標としての特性を測定
する工程 からなる均一系免疫分析方法であつて、 結合体中の標識物質が、酵素の作用により蛍光
性生成物を生成することのできる蛍光原基質であ
ることを特徴とするものである。 又、本発明の均一系免疫分析試薬は、液体中の
ハプテン又は抗原を均一系免疫分析方法により分
析するための： (1) 予め定められた特性を有する標識物質とハプ
テン又は抗原との結合体、及び (2) ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬であつて、 該試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合
体の抗体−束縛相及び抗体−遊離相を生成する結
合反応系を形成し、かつ、束縛相又は遊離相のど
ちらかにおける特性が液体中のハプテン又は抗原
の量の関数であつて、 結合体中の標識物質が、酵素の作用により蛍光
性生成物を生成することのできる蛍光原基質であ
ることを特徴とするものである。 本発明は、非常に便利で、応用性が広く、かつ
鋭敏な均一系特定結合分析方法及びその系を、前
以つて決められた反応の成分として賦与された反
応活性を示す物質を標識物質として使用すること
に基礎を置いて提供するものである。そのような
物質はここに置いて「反応体」として示される。
この方法は、部分的には、ハプテン又は抗原（対
象物質）とその特定結合の相手物質（このうちの
一つに反応体が結合される）との間の反応が前以
つて決められた反応に於いて反応体の活性を変化
させるという事実に基づいている。この反応が、
特定結合反応を監視検出するための手段として働
く。この基本的現象により、本発明の方法を実施
する場合に種々の試験組成物及び装置を含む種々
の操作工程が採用される。好ましい基本的な操作
案は、直接結合技術と競合結合技術である。 直接結合技術に於いては、検出対象のハプテン
又は抗原を含んでいると推定される液体は、該対
象物質の特定結合の相手物質と結合している反応
体を含有する結合体と接触せしめられ、次いで反
応体の活性の何らかの変化が分析される。競合結
合技術に於いては、液体は対象物質の特定結合の
相手物質と接触せしめられ、また対象物質（リガ
ンド）もしくはその特定の結合に関する類似物質
の一方もしくは両方に結合している反応体を含有
する結合体と接触せしめられ、次いで反応体の活
性の何らかの変化が分析される。両方の技術に於
いて、反応体の活性は、前以つて決められた監視
検出反応を反応体と共に形成する少なくとも一種
の試薬を液体と接触させることにより測定され
る。液体中の対象物質の定性的な測定は、得られ
た反応と、対象物質を含まない液体中に於ける監
視検出反応をその特性（通常は反応速度）につい
て比較することにより行なわれる。その両者の差
異が反応体の活性の変化を指示している。液体中
の対象物質の定量的測定は、得られた反応と既知
量の対象物質を含有する液体中での監視検出反応
を比較することにより行なわれる。 監視検出反応は酵素触媒が用いられることが好
ましい。通常は、監視検出反応は、結合体中の反
応体に対して高度に鋭敏なものから選ばれる。こ
の点に於いて、発光もしくは蛍光発光反応系は非
常に有用である。特に好ましいのは循環反応系
で、反応体が循環する物質である反応系が特別に
好ましい。好ましい循環反応系の中でも、酵素を
触媒として利用する系が特に有利である。本発明
における結合体中の反応体は酵素系の反応体、即
ち酵素基質であり、9000より小さい分子量を有す
るものが好ましい。 本明細書に於いて用いられる用語は以下のよう
に定義される。「リガンド」、「対象物質」もしく
は「対象物質（リガンド）」は、物質もしくは一
群の物質で、その液体中の存在もしくは量が測定
されるものである。「対象物質（リガンド）の特
定結合の相手物質」とは、物質もしくは一群の物
質で、他の物質を排除して対象物質に対して特定
の結合の親和性を示すものである。「対象物質の
特定の結合に関する類似物質」とは、物質もしく
は一群の物質で、対象物質への特定結合の相手物
質の結合親和性に関して対象物質と本質的に同じ
挙動をとるものである。 一般には、特定結合反応の各成分、例えば、リ
ガンド又は抗原（対象物質）を含有すると推定さ
れる液体、結合体及び／又は対象物質の特定結合
の相手物質は、分析の目的にとつて有意な量もし
くは濃度の対象物質が液体に含まれている時に結
合体中の反応体の活性が測定できる程度に変化す
るのであれば、いかなる量、方法及び順序でも結
合し得るものである。特定結合反応の全ての成分
は液体に可溶であることが好ましく、そうであれ
ば均一分析系となる。しかし、対象物質の特定結
合の相手物質もしくは結合体が不溶性である不均
一分析系も所望により利用することができる。 直接結合技術を用いる場合、特定結合反応の成
分は、対象物質を含有すると推定される液体と、
対象物質の特定結合の相手物質と結合している反
応体を含有するある量の結合体である。結合体の
反応体が液体に接触した時の活性は、液体中の対
象物質と結合体中の特定結合の相手物質との間の
結合の量に逆比例して変化する。すなわち、液体
中の対象物質の量が増加すれば、結合体の反応体
の活性は低下する。定量的な結果を得るために
は、液体に接触する特定結合の相手物質の量は常
に、結合体の反応体の活性の何らかの変化の評価
が完了する前の結合体と液体が接触している間、
液体中に存在すると考えられる対象物質の全部と
結合できる量より多くされる。実際には、特定結
合の相手物質の量は、液体中に存在すると考えら
れる対象物質の最大予測量に基づいて、上述した
規準に従い選ばれる。直接結合技術は特に、自身
より小さな特定結合の相手物質を持つ高分子量対
象物質を検出するのに有用である。 競合結合技術を用いる場合、特定結合反応の成
分は、対象物質を含有すると推定される液体、対
象物質（リガンド）もしくは対象物質の特定の結
合に関する類似物質に結合されている反応体を含
むある量の結合体、及びある量の対象物質の特定
の結合の相手物質である。特定結合の相手物質は
結合体と液体の両方に実質的に同時に接触せしめ
られる。液体中のいかなる対象物質（リガンド）
も、特定結合の相手物質と結合するために結合体
中のリガンドもしくはその特定の結合の類似物質
と競合するので、液体と接触した時の結合体の反
応体の活性は、液体中の対象物質と特定結合の相
手物質との間の結合の量に正比例して変化する。
即ち、液体中の対象物質の量が増加するにつれ、
結合体の反応体の活性は増加する。定量的な結果
を得るためには、結合体中の反応体及び液体と接
触している特定結合の相手物質は通常、結合体の
反応体の活性の何らかの変化の評価が完了する前
の特定結合の相手物質、結合体そして液体が接触
している間、液体中に存在すると考えられる対象
物質の全てと結合体の形をした対象物質もしくは
その類似物質の全てとに結合することのできる量
よりも少なくされる。実際には、特定結合の相手
物質の量は、液体中に存在すると考えられる対象
物質の最大予測量に基づいて、上述した規準に従
い選ばれる。通常、液体に接触する結合体の形の
対象物質（リガンド）もしくはその類似物質の量
は、液体中の試験される対象物質の最少量を超え
てはならない。競合結合技術は特に、自身より大
きな特定結合の相手物質を持つ対象物質を検出す
るのに有用である。 競合結合技術の変形としては置換結合技術があ
り、この技術では結合体が先ず特定結合の相手物
質に接触せしめられ、次いで液体に接触する。特
定結合の相手物質に対する競争はその時に起こ
る。このような方法に於いては、特定結合の相手
物質に接触する結合体の量は、対象物質を含有す
ると推定される液体との接触の前の結合体と特定
結合の相手物質との接触の間存在している特定結
合の相手物質の量と結合することのできる量より
多い量の対象物質（リガンド）もしくはその類似
物質を含む量である。この接触の順序は二種類の
便利な方法のいずれによつても達成できる。一つ
の方法によれば、結合体は、対象物質を含有する
と推定されている液体との接触の前に、液性環境
下で特定結合の相手物質と接触せしめられる。第
二の方法によれば、対象物質を含有すると推定さ
れる液体は、結合体と特定結合の相手物質を含む
複合体と接触せしめられる。この場合、結合体中
の特定結合物質と特定結合の相手物質は互いに相
対して結合している。第一の方法に於いて特定結
合の相手物質と結合するようになる結合体の量、
これは第二の方法に於ける複合体の形に於ける結
合体の量になるが、この量は通常、結合体の反応
体の活性に何らかの変化の評価の完了する前の特
定結合の相手物質（又は複合体）と液体が接触し
ている時に液体中の対象物質の全てと置き換わる
ことのできる量よりも多くされる。 競合結合技術の他の変形としては順次飽和技術
がある。この技術では特定結合反応の成分は競合
結合技術で用いられるものと同じであるが、添加
の順序あるいは各成分の組合せ及び各成分の相対
比が競合結合技術の場合と異なつている。順次結
合技術によると、対象物質の特定結合の相手物質
は、液体と結合体の接触の前の期間に、対象物質
を含有すると推定される液体と接触せしめられ
る。液体に接触する特定結合の相手物質の量は通
常、液体が結合体と接触する前の、特定結合の相
手物質と液体が接触する時に、液体中に存在して
いると考えられている対象物質の全てと結合でき
る量よりも多くされる。更に、結合体の形の対象
物質もしくはその類似物質の量は通常、結合体の
反応体の活性の何らかの変化の評価が完了する前
の液体と結合体が接触する間、残存する未結合の
特定結合の相手物質の量と結合できる量よりも多
くされる。実際には、特定結合の相手物質及び結
合体中の対象物質もしくはその類似物質の量は、
液体中に存在すると思われる最大予測量に基づ
き、上述した基準に従い選ばれる。 他の添加順序及び特定結合反応の成分の他の相
対比を含む操作工程もまた、ここに述べた発明概
念から逸脱せずに均一系特定結合分析を行なうた
めに考案されるであろうことは予測されることで
ある。 前以つて決められた監視検出反応の成分の結合
体の反応体の活性の何らかの変化を評価する工程
は、特定結合反応の反応混合物を、監視検出反応
を結合体の反応体と共に形成する少なくとも一種
の物質と接触させ、次いでその反応の特性に対す
る特定結合反応の影響を測定することにより、都
合良く達成される。監視検出反応は一つのあるい
は一連の複数の化学的に変形もしくは転換する反
応から成る。特に記さない限り、本明細書に記す
「反応系」の用語は、前以つて決められた監視検
出反応の全体もしくは一部を意味する。 酵素触媒の反応系が利用される場合、その系は
結合体の反応体と更に少なくとも一種の酵素を含
むものであり、本発明においては、また基質の如
き酵素反応体の一種もしくは数種を含むものであ
る。そのような酵素触媒反応系は、単一の簡単な
酵素反応を含むか、又は複雑な一連の酵素反応及
び非酵素反応を含むであろう。例えば、酵素反応
系は単一の酵素触媒による劣化もしくは解離反応
から成るかもしれない。そのような系に於いて結
合体の反応体は、劣化もしくは解離を起こす酵素
基質であり、特定結合反応の反応混合物と接触す
るために必要な反応系の唯一の成分は、劣化もし
くは解離反応に触媒作用を及ぼす酵素である。更
に複雑な酵素触媒の反応系は二種もしくはそれ以
上の反応体が関与する単一の酵素反応でも良く、
あるいは数種の反応体が関与していても良い（但
し、この反応の内の一つは酵素触媒によるもので
ある）。そのような系に於いて、結合体の反応体
は酵素触媒による反応の酵素反応体の一つであ
り、特定結合反応の反応混合物は、結合体中のも
のとは別で選ばれた酵素触媒反応系を形成するの
に必要な適当な酵素及び反応成分と接触せしめら
れる。 この酵素触媒反応系は、微生物の如き生物体の
細胞の生態系のように複雑な生化学系を含むこと
もまた意図されている。例えば、特定な微生物の
成長に必須な栄養物質が結合体中の反応体として
選ばれても良い。反応体の活性に於ける何らかの
変化は、唯一の反応体である栄養物質源が結合体
である環境内にそのような微生物が置かれた場
合、その微生物の成長特性の変化をももたらすで
あろう。即ち、例えば特定結合反応の反応混合物
に接触したときの微生物の成長速度の変化は、そ
の中に対象物質が存在していることを示すもので
あろう。 結合体中の反応体と共に監視検出反応を形成す
る適当な反応成分は、特定結合反応の開始の前、
又はそれと同時に、あるいはそれに引き続き、単
独で或は結合した形で特定結合反応の反応混合物
に接触せしめられる。特定結合反応の開始後、監
視検出反応の必須成分の一部もしくは全てを含む
反応混合物は、通常、結合体中の反応体の活性の
何らかの変化を評価する前の前以つて決められた
時間培養される。培養期間の後、監視検出反応に
必要で、未だ反応混合物中に充分な量存在してい
ない成分をこれに加える。そして監視検出反応に
対する何らかの影響を評価して、液体中の対象物
質の存在もしくは量の指標とする。 対象物質が液体に存在しないか、又は有意では
ない量しか存在しない状況に於いては、前以つて
決められた監視検出反応は相対的に一定の性質を
示す。液体中に対象物質が存在する場合には、監
視検出反応の少なくとも一つの特性もしくは性質
が変化する。一般には結合体の反応体の活性は、
その反応体が監視検出反応に関与することのでき
る量もしくは速度と規定される。即ち、監視検出
反応の性質は液体中の対象物質の存在により、通
常は全反応速度もしくはその反応により生成する
一もしくは数種の反応生成物の平衡量について変
化する。通常の場合に於いては、結合体中の反応
体の監視検出反応への関与の能力は、該反応体が
結合している特定結合物質とその特定結合物質の
特定結合対応物質との間の反応により低下する。
即ち、遊離状態の結合体は、束縛された状態の場
合よりも監視検出反応に対して更に活性である。
特定結合反応の培養後に存在する遊離の結合体及
び束縛された結合体の相対量は液体中の対象物質
の量の関数となり、監視検出反応への影響を決定
するものとなる。 監視検出反応の全反応速度の変化が、対象物質
の存在を決定するのに用いられる特性である時
（これが好ましい）には、その速度は通常、反応
体の消失速度もしくは反応生成物の出現速度を測
定することにより決められる。そのような測定
は、通常のクロマトグラフ、重量分析、電位差滴
定、分光光度測定、蛍光測定、濁度測定、容量測
定等の分析技術を含む広範囲の種々の方法により
行なわれる。本方法は第一として低濃度の対象物
質の検出を目的として考えられているので、非常
に感度の良い反応系が本発明の新規な特定結合反
応系と組合わせて用いるように開発された。 監視検出反応の形態としては、生物発光もしく
は化学発光の現象を示す反応のように、酵素触媒
による発光反応系がある。結合体中の反応体は、
光発生反応もしくは酵素によるか又はよらない発
光反応の準備段階である反応の反応体であつても
良い。特定結合反応の結果得られる結合体の反応
体の何らかの変化が、発生する光の全量、ピーク
強度もしくは性質の変化を引き起こす。発光反応
系の例としてはＡ表に記されたものが挙げられ、
この表に於いては以下のような省略形が用いられ
ている。 ATP：アデノシン三燐酸 AMP：アデノシン一燐酸 NAD：ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チド NADH：還元型のニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチド FMN：フラビン・モノヌクレオチド FMNH2：還元型のフラビン・モノヌクレオチド hν：電磁波放射、通常は赤外、可視或は紫外領
域のもの
【表】
【表】
本発明方法で利用することができる発光反応系
に関する更に詳細な事項及び議論は、次の文献に
見られる。 ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、236：48（1961） ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイテイ、89：3944（1967） コルニア（Cornier）他、生物発光の進歩、ジ
ヨンソン他編、プリンストン大学出版部（ニユ
ー・ジヤージー、1966）363−84頁 ピー・クライス（Kries）、レニラ・ルシフエ
ラーゼ（Renilla Luciferase）の精製と性質、ジ
ヨージア大学博士論文（1967） アメリカン・ジヤーナル・オブ・フイジオロジ
ー、41：454（1916） バイオロジカル・ビユレタン、51：89（1926） ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、243：4714（1968） 好ましい鋭敏な監視検出反応としては、蛍光発
光を含み、かつ酵素触媒により得られる現象を含
むものがある。そのような反応系に於いては、結
合体中の反応体は酵素反応に於ける基質であり、
その酵素反応が、結合体中の基質と異なつた蛍光
発光性を有する生成物を生成するものである。特
定結合反応の結果得られる結合体中の酵素反応体
の活性の何らかの変化が、反応混合物の蛍光発光
性の変化をもたらす。そのような酵素触媒による
反応系のための一般的な反応式は以下の通りであ
る。 酸素反応の反応体(基質)−Ｘ−Ｚ −(酵素) ――――→ 生成物 上式に於てＸは酵素により開裂する結合もしく
は連結基、例えばエステル基もしくはアミド基、
を表わし、Ｚは利用される特定結合反応技術によ
り対象物質（リガンド）、対象物質の特定の結合
に関する類似物質もしくは対象物質の特定結合の
相手物質のいずれかとなる特定結合物質である。
この型の反応系で用いることのできる特定の結合
体は、フルオレセイン、ウンベリフエロン、３−
インドール、β−ナフトール、３−ピリドルー
ル、レゾルフイン、ローダミンＢ、その他の酵素
により開裂可能な種々の誘導体である。そのよう
な誘導体の可能な構造式の例は以下の通りであ
る。
に関する更に詳細な事項及び議論は、次の文献に
見られる。 ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、236：48（1961） ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイテイ、89：3944（1967） コルニア（Cornier）他、生物発光の進歩、ジ
ヨンソン他編、プリンストン大学出版部（ニユ
ー・ジヤージー、1966）363−84頁 ピー・クライス（Kries）、レニラ・ルシフエ
ラーゼ（Renilla Luciferase）の精製と性質、ジ
ヨージア大学博士論文（1967） アメリカン・ジヤーナル・オブ・フイジオロジ
ー、41：454（1916） バイオロジカル・ビユレタン、51：89（1926） ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー、243：4714（1968） 好ましい鋭敏な監視検出反応としては、蛍光発
光を含み、かつ酵素触媒により得られる現象を含
むものがある。そのような反応系に於いては、結
合体中の反応体は酵素反応に於ける基質であり、
その酵素反応が、結合体中の基質と異なつた蛍光
発光性を有する生成物を生成するものである。特
定結合反応の結果得られる結合体中の酵素反応体
の活性の何らかの変化が、反応混合物の蛍光発光
性の変化をもたらす。そのような酵素触媒による
反応系のための一般的な反応式は以下の通りであ
る。 酸素反応の反応体(基質)−Ｘ−Ｚ −(酵素) ――――→ 生成物 上式に於てＸは酵素により開裂する結合もしく
は連結基、例えばエステル基もしくはアミド基、
を表わし、Ｚは利用される特定結合反応技術によ
り対象物質（リガンド）、対象物質の特定の結合
に関する類似物質もしくは対象物質の特定結合の
相手物質のいずれかとなる特定結合物質である。
この型の反応系で用いることのできる特定の結合
体は、フルオレセイン、ウンベリフエロン、３−
インドール、β−ナフトール、３−ピリドルー
ル、レゾルフイン、ローダミンＢ、その他の酵素
により開裂可能な種々の誘導体である。そのよう
な誘導体の可能な構造式の例は以下の通りであ
る。
【表】
【表】
上式に於いて、R1は−OH又は−Ｘ−Ｚ（Ｘ及
びＺは前述と同じ）であり、R2は−Ｘ−Ｚ、そ
してR3は−Ｈ又は−CH3である。 本発明の好ましい実施態様に於いては必要性は
ないが、液体中の対象物質の存在が結合体の反応
体の活性に影響を与えるような場合でも不均一系
分析技術を用いることが望ましいこともある。そ
のような状況は、不均一系方法が特に都合の良い
場合にあらわれる。ある不均一系方法によれば分
析系中の対象物質の有効濃度を増加することがで
き、これにより感度を増大させることができる。
このような不均一系方法の例としては、本発明の
結合体もしくは対象物質の特定結合の相手物質
（これは、選ばれた特定の操作の型に従い選ばれ
る）のいずれかより成る不溶性マトリツクスを含
むカラム装置を用いたものがある。標識物質とし
て放射性標識もしくは酵素付加された物質を用い
る全ての他の不均一系分析方法もまた、本発明の
反応体を標識物質として用いて、同様に行なわれ
る。 本発明は、特定結合の相手物質が存在するいか
なるハプテン又は抗原（対象物質）の検出にも適
用することができる。対象物質は通常、ペプチ
ド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白質、ステロイド、
又は生物系内に特定結合の相手物質が存在するか
或は相手物質を合成することができる他の有機分
子である。その対象物質は、機能面の用語で言え
ば、抗原、その抗体、ハプテン（付着体）、その
抗体及びビタミン並びにそれらの受容体及び結合
物質から成る群より選ばれる。本発明を用いて検
出することのできる対象物質を特に例示すれば、
フエリチン、ブラデキニン、プロスタグランデイ
ン及び腫瘍特異性抗原のような抗原及びハプテ
ン；ビオチン、ビタミンB12、葉酸、ビタミンＥ
及びアスコルビン酸のようなビタミン；ミクロソ
ーム抗体、肝炎抗体、アレルゲン抗体のような抗
体；そしてチロキシン結合グロブリン、アビジ
ン、内因子及びトランスコバラミンのような特定
結合受容体が挙げられる。 一般に結合体は、より小さい対象物質（リガン
ド）に結合された反応体及びその選ばれた特定結
合の相手物質を含むことが好ましい。選ばれた特
定結合の相手物質の分子量が対象物質の分子量の
約1/10もしくはそれ以下である場合の対象物質を
検出する場合には、直接結合技術を用いるのが好
ましい。従つて、検出される対象物質が抗体もし
くは特定結合受容体である場合には、抗原に結合
した反応体或は抗体もしくは受容体の特定結合の
低分子量が相手物質に結合したハプテンを含む結
合体が用いられる直接結合技術によることが好ま
しい。選ばれた結合の相手物質の分子量が検出さ
れる対象物質の分子量の10倍もしくはそれ以上大
きい場合、即ち抗原、ハプテンもしくはビタミン
が検出対象である時、より小さな対象物質（リガ
ンド）に結合された反応体を含む結合体が用いら
れる競合結合技術もしくは順次飽和技術を利用す
ることが特に有利である。 本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応
体の測定可能な量の活性が維持されるような形
で、特定結合物質（選ばれた分析方法に依り、対
象物質、対象物質の特定の結合に関する類似物質
もしくは対象物質の特定結合の相手物質にいずれ
かである）に結合もしくは組合わされる。反応体
と特定結合物質との結合は、活性を有する反応体
を用いる監視検出反応が、上述の発光反応系に於
けるような結合を化学的に壊すように設計されて
いない分析の条件下では、通常実質的に変更でき
ない。しかし、ある場合には、そのような結合
は、壊されるように設計されるか、あるいは反応
活性の変化を評価するための手段としての選ばれ
た監視検出反応により影響を与えられる。そのよ
うな場合として、本明細書で前述した酵素による
蛍光発生基質の反応系がある。 反応体は特定結合物質に直接に結合しても良
く、その結果、結合体の分子量は反応体と特定結
合物質の全分子量に等しいか、又は小さくなるよ
うになる。しかし、通常は、反応体と特定結合物
質は、１から50個、好ましくは１から10個の炭素
原子もしくは窒素、酸素、硫黄、燐その他のよう
な複素原子を含む橋かけ基により連絡されてい
る。１個の原子を含む橋かけ基の例としては、メ
チレン基（炭素原子１個）及びアミノ基（複数原
子１個）がある。橋かけ基は通常1000を超えない
分子量を持つており、好ましくは200より小さい
ものである。橋かけ基は炭素原子もしくは複数原
子の鎖、もしくはそれらの組合わせたものを含ん
でおり、通常はエステル、アミド、エーテル、チ
オエステル、チオエーテル、アセタール、メチレ
ンもしくはアミノの如き基の形をした連結基によ
り、反応体と特定結合物質もしくはその活性誘導
体とに結合されている。 本発明の結合体中の反応体は、前以つて決めら
れた監視検出反応の成分として、賦与された（例
えば、一定の又は既知の）反応活性を有する物質
である。更に詳しく言えば、本明細書による開示
に於ては、「反応体」及び「反応活性を有する物
質」とは、自身とは異なる一もしくは数個の生成
物をもたらす、限定され、かつ測定可能な化学的
な変形（変質）をすることができ、更にその反応
体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのよう
な化学的な変形もしくは変質に関与するような他
の型の物質）の如き反応開始手段との相互作用に
より、電磁的放射、熱エネルギー、もしくは音波
エネルギーをもたらす物質を意味する。従つて本
明細書に於いて「反応体」と定義した物質群の内
には通常の無機及び有機試薬及び生化学的物質が
含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射性
アイソトープのような監視検出反応に於ける反応
体でないものは除外される。特定の化学物質は化
学的環境に従つて種々の形で機能することができ
るため、一つの化学物質が種々の異なつた分類に
分類されることがあるが、そのような物質が本明
細書の開示に於いていかなる機能を有するかが決
定されるのは、本明細書に記された選ばれた監視
検出反応に関するその物質の反応性によるもので
あるということが認識されるであろう。 本発明における反応体は酵素基質もしくはその
活性を有する部分変形物質もしくは誘導体のよう
な酵素反応の反応体である。酵素基質とは、酵素
を触媒として化学的変形（変質）をすることので
きる化合物もしくは部分である。基質が結合体の
反応体として用いられる場合、その好ましい分子
量は9000より小さく、更に好ましくは5000より小
さいものとなる。その程度の大きさの基質は、分
子としての複雑さが少ないため、結合体を作るた
めに用いるのに特に都合が良い。更に、特定結合
物質に結合された時に、その程度の基質の活性は
結合体とその特定結合物質の特定結合の対応物質
との反応により容易に影響を受ける。本発明に於
いて用いることを意図している酵素基質の例とし
ては、フルオレセインやウンベリフエロンの誘導
体のような前述した酵素により開裂する蛍光物
質；PH指示薬；及び分光光度測定用の指示色素
（特に発色型）が含まれる。 本発明の一形態として、対象物質が含有されて
いると考えられる液体と組合わされる特定結合反
応の成分は液体もしくは固体の形である。好まし
い均一系の分析系に於いては、該成分は通常は溶
液もしくは、液体に容易に溶解することのできる
固体の形である。試験対象の液体は通常、性質上
水性であるので、該成分は一般には水溶性の形態
である。即ち水溶液か、又は紛末か樹脂のような
水溶性固体の形である。本分析方法は、試験管の
ような標準の実験室用の容器中で、固体もしくは
液体の特定結合反応の成分及びそれに加えられる
反応系の成分により実施される。 一もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又
は一もしくは数種の監視検出反応の成分は、担体
に包含されていても良い。一つの考え方として担
体は、それらの成分の一種もしくは数種をその内
側部分に例えば液体もしくはゆるい固体の形で、
あるいはその内部表面の被膜の中に、含有する試
験管又はカプセルのような液体保持用容器でもよ
い。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性で
あるマトリツクスの形態であつてもよい。そのよ
うなマトリツクスは例えば吸収性紙；重合体のフ
イルム、膜、けばもしくは塊状物；ゲル及びその
他の形である。そのような形の場合、該装置は、
試験対象液体を接触させ、特定結合反応及び／又
は監視検出反応を行なわしめ、かつ得られる応答
を観察するために都合のよい手段を提供する。 試験対象となる液体は天然に存在するか或は人
工的に作られたものであつて、ハプテン又は抗原
（対象物質）が存在すると推定されるものである。
通常は生物体の液状物又はそれを希釈もしくは他
の処理を施して得られた液体である。本発明方法
により分析することのできる生物体の液状物に
は、血清、プラズマ、尿、羊水、脳液、せきずい
液等が含まれる。細胞等の固体材料もしくは気体
状のもの等の他の材料も、固体もしくは気体を溶
解させるか又は固体を抽出する等の方法により液
体の形にして分析することができる。 先行技術の均一系分析系とは対照的に、結合体
中の標識物質の反応活性と同じか又は類似した反
応活性を有する物質を含有する生物体の液体に於
ける対象物質を、バツクグラウンドに邪魔される
ことなく分析することができる。内因性バツクグ
ラウンド反応体活性は種々の方法で容易に除くこ
とができる。生物体の液体は、内因性反応体活性
を選択的に破壊するように処理することができ
る。そのような処理としては例えば、内因性活性
を化学的に破壊する清浄剤を作用させ、次いで該
清浄剤の破壊作用を不活性にする処理を行なう処
理が挙げられる。 本発明を以下において実施例及び参考例により
説明するが、これらは本発明を制限するものでは
ない。 参考例 １ ニコチンアミド・６−（２−アミノエチルアミ
ノ）・プリン・ジヌクレオチドの製造 ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（NAD）２ｇを10mlの水に溶かし、次いで0.6ml
のエチレンイミンを滴下した。この際、1M過塩
素酸を加えることによりPHを７以下に維持する。
エチレンイミンの滴下が終了した後、PHを4.5に
調整し、20−25℃に保持して反応させた。24時間
毎に0.6mlのエチレンイミンを加え、PHを4.5に再
調整した。96時間後に溶液を10倍体積量の−10℃
のアセトンに注ぎ、生成した油状物を集め、エー
テルで洗い、フラスコ中の約50mlの水に溶解させ
た。 得られた溶液を1N水酸化ナトリウムでPH7.0−
7.5に調整し、これに１グラムの重炭酸ナトリウ
ムを加えた。この溶液に窒素を４−５分通し、次
いで１グラムのヒドロ亜硫酸ナトリウムを加え
た。フラスコを密封し、室温で45分間放置した。
次に、この溶液を15分間酸素処理し、水酸化ナト
リウムによりPHを11.3に調整し、75℃で１時間加
熱した。反応混合物を室温に冷却し、0.6グラム
のトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを
加え、次いで5N塩酸を用いてPHを7.5に調整し
た。得られた溶液に1000国際単位のアルコール脱
水素酵素と１mlのアセトアルデヒドを加えた。反
応混合物の光学濃度の低下を340nｍで監視し、
低下が観察されなくなつた時にPHを3.5に調整し
た。溶液を10倍体積量の−10℃アセトンに注ぎ、
生成した油状物を分離し、エーテルで洗い、10−
15mlの水に溶解させた。 得られた溶液を、水で平衡にされたセフアデツ
クスＧ−10（スエーデン国、ウプサラのフアーマ
シア・エー・ビーより入手）の2.5×90cmのカラ
ムに導入した。12mlのフラクシヨンをそれぞれ集
めた。紫外領域の最大光学吸収の波長と、その波
長での光学密度を、各々のフラクシヨンについて
測定した。また、アルコール脱水素酵素により還
元した後の各々のフラクシヨンの340nｍでの光
学密度も測定した。264nｍで光学吸収の最大値
を有し、かつ340nｍでの光学密度と264nｍでの
光学密度との比が0.5より大きいフラクシヨンを
集めた。集めたものをロータリー・エバポレータ
ーにより15−20mlに濃縮し、水で平衡にされたダ
ウエツクス１−X8（米国、カリホルニア、リツチ
モンドのバイオ・ラド・ラボラトリーズから入
手）の2.5×28cmのカラムに通した。カラムに水
を更に加えて集められた物質を洗い、10mlのフラ
クシヨンをそれぞれ集めた。264nｍで光学吸収
の最大値を有し、かつ340nｍでの光学密度と
264nｍでの光学密度との比が0.1より大きいフラ
クシヨンを集めた。 集めたものを、水で平衡にされたダウエツクス
50−X2（米国、カリホルニア、リツチモンドのバ
イオ・ラド・ラボラトリーズから入手）の５×45
cmのカラムに通した。カラムに水を更に加えて集
められた物質を洗い、20mlのフラクシヨンをそれ
ぞれ集めた。264nｍで光学吸収の最大値を有し、
かつ340nｍでの光学密度と264nｍでの光学密度
との比が0.18より大きいフラクシヨンを集めた。
集めたものを４−５mlに濃縮し、以下のように電
気泳動法により精製した。 濃縮したものを、液の流れの方向に垂直な幅が
１−２cmの細長いワツトマン3MM紙（米国、ユ
ージヤージー、クリフトンのリーブ・エンジエル
から入手）に付けた。次いで紙をPH6.0で0.02M
燐酸ナトリウムで湿らせた。電気泳動法はサイエ
ンス121：829（1955）に記載されているデユラム
（Durrum）懸垂紙法に従つて、電位勾配約8.5ボ
ルト／cmで４−６時間実施した。目的のピリジ
ン・ジヌクレオチド誘導体の位置は、ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、
191：447（1951）に記載されている方法に従つて、
0.5Mシアン化ナトリウムを試験紙にスプレーし
た後に現われる蛍光により決められる。目的の誘
導体を含む領域を紙から切り取り、50mlの水で３
回抽出する。ニコチンアミド・６−（２−アミノ
エチルアミノ）・プリン・ジヌクレオチドを含有
する得られた抽出液を集め、３−４mlに濃縮し、
次いで−20℃に保存した。 参考例 ２ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと
ビオチンとの結合体の製造 参考例１で得たニコチンアミド・６−（２−ア
ミノエチルアミノ）・プリン・ジヌクレオチド22
mgを含有する１mlの水に16mgのビオチンを懸濁さ
せた。数滴の0.1N水酸化ナトリウムを加えてビ
オチンの溶解を助けた。得られた溶液に240mgの
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）−カルボジイミド・メト−ｐ−トルエン・ス
ルホネートを加え、0.1N塩酸を滴下することに
より溶液にした。反応混合物を室温で５時間放置
し、次いで10mlの−10℃のアセトンに注いだ。生
成した油状物を分離し、５−10mlのエーテルで２
度洗浄し、１−２mlの水に溶解させた。得られた
ものを、参考例１に述べた紙を用いた電気泳動法
により精製した。シアン化ナトリウムをスプレー
すると複数の蛍光帯が現われ、一つは陰極に移動
し、他は陽極に移動していた。後者の帯はNAD
−ビオチン結合体を含んでおり、これを水で抽出
し、−20℃に保存した。 参考例 ３ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと
２，４−ジニトロフエニルの結合体の製造 参考例１で得たニコチンアミド・６−（２−ア
ミノエチルアミノ）プリン・ジヌクレオチド23mg
を含有する1.5mlの水に26mgの重炭酸ナトリウム
を溶解させた。得られた溶液に、17μの２，４
−ジニトロフロロベンゼンを含有するエタノール
を加え、反応混合物を室温で暗中５時間撹拌し、
次いでこれに45mlの−10℃のアセトンを加えた。
生成した沈殿を分離し、10mlのアセトンで２度洗
浄し、５mlの水と共に撹拌した。分離した黄色の
可溶性物質を、参考例１に記した紙を用いて電気
泳動法により５時間かけて精製した。陽極へ移動
した帯はNADと２，４−ジニトロフエニルの結
合体を含んでいた。これを水で抽出し、３−５ml
に濃縮した後、−20℃に保存した。 参考例 ４ NADとNAD−ビオチン結合体の酵素循環速度
に対するアビジンとビオチンの影響 本参考例で用いられる循環反応系は、次の反応
に基礎を置いている。 (a) NAD−リガンド＋乳酸（塩）乳酸脱水素 ――――――→ 酵素NADH−リガンド＋ピルビン酸（塩） (b) NADH−リガンド ＋チアゾリルブルー（酸化型）ジアホラーゼ ―――――――→ NAD−リガンド＋チアゾリルブルー（還元型） 各々の全量0.5mlで、PH7.8の0.1MのＮ，Ｎ−ビ
ス−２−ヒドロキシエチルグリシン塩酸塩の緩衝
液を含み、第１表に示されるような濃度と活性度
のNAD、NAD−ビオチン結合体（参考例２で作
られたもの）、ビオチン及びアビジン（後者はビ
オチンに結合する親和性を有している）をそれぞ
れ含有する８種類の特定結合反応混合物を調製し
た。アビジンの活性度の１単位は1μｇのビオチ
ンと結合するアビジンの量である。 反応混合物を室温で２−３時間保存した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型の
チアゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の
0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の
乳酸脱水素酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジア
ホラーゼを含有）で全体容量を１mlにした溶液を
各々の反応混合物に加えることにより、該反応混
合物と酵素／基質水性混合物とを接触させた。酵
素／基質混合物の添加後の最初の１時間内で24分
毎に570nｍの各混合物の光学密度の全変化を測
定して、反応混合物各々について還元型のチアゾ
リルブルーの生成の相対速度を測定した。全操作
を２度繰り返し、結果の平均を第１表に示す。
びＺは前述と同じ）であり、R2は−Ｘ−Ｚ、そ
してR3は−Ｈ又は−CH3である。 本発明の好ましい実施態様に於いては必要性は
ないが、液体中の対象物質の存在が結合体の反応
体の活性に影響を与えるような場合でも不均一系
分析技術を用いることが望ましいこともある。そ
のような状況は、不均一系方法が特に都合の良い
場合にあらわれる。ある不均一系方法によれば分
析系中の対象物質の有効濃度を増加することがで
き、これにより感度を増大させることができる。
このような不均一系方法の例としては、本発明の
結合体もしくは対象物質の特定結合の相手物質
（これは、選ばれた特定の操作の型に従い選ばれ
る）のいずれかより成る不溶性マトリツクスを含
むカラム装置を用いたものがある。標識物質とし
て放射性標識もしくは酵素付加された物質を用い
る全ての他の不均一系分析方法もまた、本発明の
反応体を標識物質として用いて、同様に行なわれ
る。 本発明は、特定結合の相手物質が存在するいか
なるハプテン又は抗原（対象物質）の検出にも適
用することができる。対象物質は通常、ペプチ
ド、蛋白質、炭水化物、糖蛋白質、ステロイド、
又は生物系内に特定結合の相手物質が存在するか
或は相手物質を合成することができる他の有機分
子である。その対象物質は、機能面の用語で言え
ば、抗原、その抗体、ハプテン（付着体）、その
抗体及びビタミン並びにそれらの受容体及び結合
物質から成る群より選ばれる。本発明を用いて検
出することのできる対象物質を特に例示すれば、
フエリチン、ブラデキニン、プロスタグランデイ
ン及び腫瘍特異性抗原のような抗原及びハプテ
ン；ビオチン、ビタミンB12、葉酸、ビタミンＥ
及びアスコルビン酸のようなビタミン；ミクロソ
ーム抗体、肝炎抗体、アレルゲン抗体のような抗
体；そしてチロキシン結合グロブリン、アビジ
ン、内因子及びトランスコバラミンのような特定
結合受容体が挙げられる。 一般に結合体は、より小さい対象物質（リガン
ド）に結合された反応体及びその選ばれた特定結
合の相手物質を含むことが好ましい。選ばれた特
定結合の相手物質の分子量が対象物質の分子量の
約1/10もしくはそれ以下である場合の対象物質を
検出する場合には、直接結合技術を用いるのが好
ましい。従つて、検出される対象物質が抗体もし
くは特定結合受容体である場合には、抗原に結合
した反応体或は抗体もしくは受容体の特定結合の
低分子量が相手物質に結合したハプテンを含む結
合体が用いられる直接結合技術によることが好ま
しい。選ばれた結合の相手物質の分子量が検出さ
れる対象物質の分子量の10倍もしくはそれ以上大
きい場合、即ち抗原、ハプテンもしくはビタミン
が検出対象である時、より小さな対象物質（リガ
ンド）に結合された反応体を含む結合体が用いら
れる競合結合技術もしくは順次飽和技術を利用す
ることが特に有利である。 本発明の結合体に於いて、反応体は、その反応
体の測定可能な量の活性が維持されるような形
で、特定結合物質（選ばれた分析方法に依り、対
象物質、対象物質の特定の結合に関する類似物質
もしくは対象物質の特定結合の相手物質にいずれ
かである）に結合もしくは組合わされる。反応体
と特定結合物質との結合は、活性を有する反応体
を用いる監視検出反応が、上述の発光反応系に於
けるような結合を化学的に壊すように設計されて
いない分析の条件下では、通常実質的に変更でき
ない。しかし、ある場合には、そのような結合
は、壊されるように設計されるか、あるいは反応
活性の変化を評価するための手段としての選ばれ
た監視検出反応により影響を与えられる。そのよ
うな場合として、本明細書で前述した酵素による
蛍光発生基質の反応系がある。 反応体は特定結合物質に直接に結合しても良
く、その結果、結合体の分子量は反応体と特定結
合物質の全分子量に等しいか、又は小さくなるよ
うになる。しかし、通常は、反応体と特定結合物
質は、１から50個、好ましくは１から10個の炭素
原子もしくは窒素、酸素、硫黄、燐その他のよう
な複素原子を含む橋かけ基により連絡されてい
る。１個の原子を含む橋かけ基の例としては、メ
チレン基（炭素原子１個）及びアミノ基（複数原
子１個）がある。橋かけ基は通常1000を超えない
分子量を持つており、好ましくは200より小さい
ものである。橋かけ基は炭素原子もしくは複数原
子の鎖、もしくはそれらの組合わせたものを含ん
でおり、通常はエステル、アミド、エーテル、チ
オエステル、チオエーテル、アセタール、メチレ
ンもしくはアミノの如き基の形をした連結基によ
り、反応体と特定結合物質もしくはその活性誘導
体とに結合されている。 本発明の結合体中の反応体は、前以つて決めら
れた監視検出反応の成分として、賦与された（例
えば、一定の又は既知の）反応活性を有する物質
である。更に詳しく言えば、本明細書による開示
に於ては、「反応体」及び「反応活性を有する物
質」とは、自身とは異なる一もしくは数個の生成
物をもたらす、限定され、かつ測定可能な化学的
な変形（変質）をすることができ、更にその反応
体と化学物質（例、他の反応体、触媒、そのよう
な化学的な変形もしくは変質に関与するような他
の型の物質）の如き反応開始手段との相互作用に
より、電磁的放射、熱エネルギー、もしくは音波
エネルギーをもたらす物質を意味する。従つて本
明細書に於いて「反応体」と定義した物質群の内
には通常の無機及び有機試薬及び生化学的物質が
含まれる。しかし、触媒（酵素を含む）や放射性
アイソトープのような監視検出反応に於ける反応
体でないものは除外される。特定の化学物質は化
学的環境に従つて種々の形で機能することができ
るため、一つの化学物質が種々の異なつた分類に
分類されることがあるが、そのような物質が本明
細書の開示に於いていかなる機能を有するかが決
定されるのは、本明細書に記された選ばれた監視
検出反応に関するその物質の反応性によるもので
あるということが認識されるであろう。 本発明における反応体は酵素基質もしくはその
活性を有する部分変形物質もしくは誘導体のよう
な酵素反応の反応体である。酵素基質とは、酵素
を触媒として化学的変形（変質）をすることので
きる化合物もしくは部分である。基質が結合体の
反応体として用いられる場合、その好ましい分子
量は9000より小さく、更に好ましくは5000より小
さいものとなる。その程度の大きさの基質は、分
子としての複雑さが少ないため、結合体を作るた
めに用いるのに特に都合が良い。更に、特定結合
物質に結合された時に、その程度の基質の活性は
結合体とその特定結合物質の特定結合の対応物質
との反応により容易に影響を受ける。本発明に於
いて用いることを意図している酵素基質の例とし
ては、フルオレセインやウンベリフエロンの誘導
体のような前述した酵素により開裂する蛍光物
質；PH指示薬；及び分光光度測定用の指示色素
（特に発色型）が含まれる。 本発明の一形態として、対象物質が含有されて
いると考えられる液体と組合わされる特定結合反
応の成分は液体もしくは固体の形である。好まし
い均一系の分析系に於いては、該成分は通常は溶
液もしくは、液体に容易に溶解することのできる
固体の形である。試験対象の液体は通常、性質上
水性であるので、該成分は一般には水溶性の形態
である。即ち水溶液か、又は紛末か樹脂のような
水溶性固体の形である。本分析方法は、試験管の
ような標準の実験室用の容器中で、固体もしくは
液体の特定結合反応の成分及びそれに加えられる
反応系の成分により実施される。 一もしくは数種の特定結合反応の成分及び／又
は一もしくは数種の監視検出反応の成分は、担体
に包含されていても良い。一つの考え方として担
体は、それらの成分の一種もしくは数種をその内
側部分に例えば液体もしくはゆるい固体の形で、
あるいはその内部表面の被膜の中に、含有する試
験管又はカプセルのような液体保持用容器でもよ
い。他の考え方として担体は、試験対象の液体に
関して不溶性かつ多孔性で、好ましくは吸収性で
あるマトリツクスの形態であつてもよい。そのよ
うなマトリツクスは例えば吸収性紙；重合体のフ
イルム、膜、けばもしくは塊状物；ゲル及びその
他の形である。そのような形の場合、該装置は、
試験対象液体を接触させ、特定結合反応及び／又
は監視検出反応を行なわしめ、かつ得られる応答
を観察するために都合のよい手段を提供する。 試験対象となる液体は天然に存在するか或は人
工的に作られたものであつて、ハプテン又は抗原
（対象物質）が存在すると推定されるものである。
通常は生物体の液状物又はそれを希釈もしくは他
の処理を施して得られた液体である。本発明方法
により分析することのできる生物体の液状物に
は、血清、プラズマ、尿、羊水、脳液、せきずい
液等が含まれる。細胞等の固体材料もしくは気体
状のもの等の他の材料も、固体もしくは気体を溶
解させるか又は固体を抽出する等の方法により液
体の形にして分析することができる。 先行技術の均一系分析系とは対照的に、結合体
中の標識物質の反応活性と同じか又は類似した反
応活性を有する物質を含有する生物体の液体に於
ける対象物質を、バツクグラウンドに邪魔される
ことなく分析することができる。内因性バツクグ
ラウンド反応体活性は種々の方法で容易に除くこ
とができる。生物体の液体は、内因性反応体活性
を選択的に破壊するように処理することができ
る。そのような処理としては例えば、内因性活性
を化学的に破壊する清浄剤を作用させ、次いで該
清浄剤の破壊作用を不活性にする処理を行なう処
理が挙げられる。 本発明を以下において実施例及び参考例により
説明するが、これらは本発明を制限するものでは
ない。 参考例 １ ニコチンアミド・６−（２−アミノエチルアミ
ノ）・プリン・ジヌクレオチドの製造 ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（NAD）２ｇを10mlの水に溶かし、次いで0.6ml
のエチレンイミンを滴下した。この際、1M過塩
素酸を加えることによりPHを７以下に維持する。
エチレンイミンの滴下が終了した後、PHを4.5に
調整し、20−25℃に保持して反応させた。24時間
毎に0.6mlのエチレンイミンを加え、PHを4.5に再
調整した。96時間後に溶液を10倍体積量の−10℃
のアセトンに注ぎ、生成した油状物を集め、エー
テルで洗い、フラスコ中の約50mlの水に溶解させ
た。 得られた溶液を1N水酸化ナトリウムでPH7.0−
7.5に調整し、これに１グラムの重炭酸ナトリウ
ムを加えた。この溶液に窒素を４−５分通し、次
いで１グラムのヒドロ亜硫酸ナトリウムを加え
た。フラスコを密封し、室温で45分間放置した。
次に、この溶液を15分間酸素処理し、水酸化ナト
リウムによりPHを11.3に調整し、75℃で１時間加
熱した。反応混合物を室温に冷却し、0.6グラム
のトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンを
加え、次いで5N塩酸を用いてPHを7.5に調整し
た。得られた溶液に1000国際単位のアルコール脱
水素酵素と１mlのアセトアルデヒドを加えた。反
応混合物の光学濃度の低下を340nｍで監視し、
低下が観察されなくなつた時にPHを3.5に調整し
た。溶液を10倍体積量の−10℃アセトンに注ぎ、
生成した油状物を分離し、エーテルで洗い、10−
15mlの水に溶解させた。 得られた溶液を、水で平衡にされたセフアデツ
クスＧ−10（スエーデン国、ウプサラのフアーマ
シア・エー・ビーより入手）の2.5×90cmのカラ
ムに導入した。12mlのフラクシヨンをそれぞれ集
めた。紫外領域の最大光学吸収の波長と、その波
長での光学密度を、各々のフラクシヨンについて
測定した。また、アルコール脱水素酵素により還
元した後の各々のフラクシヨンの340nｍでの光
学密度も測定した。264nｍで光学吸収の最大値
を有し、かつ340nｍでの光学密度と264nｍでの
光学密度との比が0.5より大きいフラクシヨンを
集めた。集めたものをロータリー・エバポレータ
ーにより15−20mlに濃縮し、水で平衡にされたダ
ウエツクス１−X8（米国、カリホルニア、リツチ
モンドのバイオ・ラド・ラボラトリーズから入
手）の2.5×28cmのカラムに通した。カラムに水
を更に加えて集められた物質を洗い、10mlのフラ
クシヨンをそれぞれ集めた。264nｍで光学吸収
の最大値を有し、かつ340nｍでの光学密度と
264nｍでの光学密度との比が0.1より大きいフラ
クシヨンを集めた。 集めたものを、水で平衡にされたダウエツクス
50−X2（米国、カリホルニア、リツチモンドのバ
イオ・ラド・ラボラトリーズから入手）の５×45
cmのカラムに通した。カラムに水を更に加えて集
められた物質を洗い、20mlのフラクシヨンをそれ
ぞれ集めた。264nｍで光学吸収の最大値を有し、
かつ340nｍでの光学密度と264nｍでの光学密度
との比が0.18より大きいフラクシヨンを集めた。
集めたものを４−５mlに濃縮し、以下のように電
気泳動法により精製した。 濃縮したものを、液の流れの方向に垂直な幅が
１−２cmの細長いワツトマン3MM紙（米国、ユ
ージヤージー、クリフトンのリーブ・エンジエル
から入手）に付けた。次いで紙をPH6.0で0.02M
燐酸ナトリウムで湿らせた。電気泳動法はサイエ
ンス121：829（1955）に記載されているデユラム
（Durrum）懸垂紙法に従つて、電位勾配約8.5ボ
ルト／cmで４−６時間実施した。目的のピリジ
ン・ジヌクレオチド誘導体の位置は、ジヤーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、
191：447（1951）に記載されている方法に従つて、
0.5Mシアン化ナトリウムを試験紙にスプレーし
た後に現われる蛍光により決められる。目的の誘
導体を含む領域を紙から切り取り、50mlの水で３
回抽出する。ニコチンアミド・６−（２−アミノ
エチルアミノ）・プリン・ジヌクレオチドを含有
する得られた抽出液を集め、３−４mlに濃縮し、
次いで−20℃に保存した。 参考例 ２ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと
ビオチンとの結合体の製造 参考例１で得たニコチンアミド・６−（２−ア
ミノエチルアミノ）・プリン・ジヌクレオチド22
mgを含有する１mlの水に16mgのビオチンを懸濁さ
せた。数滴の0.1N水酸化ナトリウムを加えてビ
オチンの溶解を助けた。得られた溶液に240mgの
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチ
ル）−カルボジイミド・メト−ｐ−トルエン・ス
ルホネートを加え、0.1N塩酸を滴下することに
より溶液にした。反応混合物を室温で５時間放置
し、次いで10mlの−10℃のアセトンに注いだ。生
成した油状物を分離し、５−10mlのエーテルで２
度洗浄し、１−２mlの水に溶解させた。得られた
ものを、参考例１に述べた紙を用いた電気泳動法
により精製した。シアン化ナトリウムをスプレー
すると複数の蛍光帯が現われ、一つは陰極に移動
し、他は陽極に移動していた。後者の帯はNAD
−ビオチン結合体を含んでおり、これを水で抽出
し、−20℃に保存した。 参考例 ３ ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドと
２，４−ジニトロフエニルの結合体の製造 参考例１で得たニコチンアミド・６−（２−ア
ミノエチルアミノ）プリン・ジヌクレオチド23mg
を含有する1.5mlの水に26mgの重炭酸ナトリウム
を溶解させた。得られた溶液に、17μの２，４
−ジニトロフロロベンゼンを含有するエタノール
を加え、反応混合物を室温で暗中５時間撹拌し、
次いでこれに45mlの−10℃のアセトンを加えた。
生成した沈殿を分離し、10mlのアセトンで２度洗
浄し、５mlの水と共に撹拌した。分離した黄色の
可溶性物質を、参考例１に記した紙を用いて電気
泳動法により５時間かけて精製した。陽極へ移動
した帯はNADと２，４−ジニトロフエニルの結
合体を含んでいた。これを水で抽出し、３−５ml
に濃縮した後、−20℃に保存した。 参考例 ４ NADとNAD−ビオチン結合体の酵素循環速度
に対するアビジンとビオチンの影響 本参考例で用いられる循環反応系は、次の反応
に基礎を置いている。 (a) NAD−リガンド＋乳酸（塩）乳酸脱水素 ――――――→ 酵素NADH−リガンド＋ピルビン酸（塩） (b) NADH−リガンド ＋チアゾリルブルー（酸化型）ジアホラーゼ ―――――――→ NAD−リガンド＋チアゾリルブルー（還元型） 各々の全量0.5mlで、PH7.8の0.1MのＮ，Ｎ−ビ
ス−２−ヒドロキシエチルグリシン塩酸塩の緩衝
液を含み、第１表に示されるような濃度と活性度
のNAD、NAD−ビオチン結合体（参考例２で作
られたもの）、ビオチン及びアビジン（後者はビ
オチンに結合する親和性を有している）をそれぞ
れ含有する８種類の特定結合反応混合物を調製し
た。アビジンの活性度の１単位は1μｇのビオチ
ンと結合するアビジンの量である。 反応混合物を室温で２−３時間保存した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型の
チアゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の
0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の
乳酸脱水素酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジア
ホラーゼを含有）で全体容量を１mlにした溶液を
各々の反応混合物に加えることにより、該反応混
合物と酵素／基質水性混合物とを接触させた。酵
素／基質混合物の添加後の最初の１時間内で24分
毎に570nｍの各混合物の光学密度の全変化を測
定して、反応混合物各々について還元型のチアゾ
リルブルーの生成の相対速度を測定した。全操作
を２度繰り返し、結果の平均を第１表に示す。
【表】
反応１、４及び８は対照実験で、NADとNAD
−ビオチン結合体が存在しない場合には、循環が
殆んど起らないことを示している。反応２と３
は、NAD−ビオチン結合体が未加工のNADに比
べて著るしい酵素活性量を有することを示してい
る。反応３と６の結果からは、反応混合物中にア
ビジンが存在すると、存在するNADがビオチン
と結合している場合還元型のチアゾリルブルーの
生成を阻害することがわかる。反応６と７の結果
を比較すると、遊離のビオチンが存在すればチア
ゾリルブルーの阻害量が反応混合物のビオチンの
濃度に比例して低減することがわかる。 従つて本参考例に於いては、NADとビオチン
との結合体中のNADの循環反応系に関する活性
はアビジンの存在により低下し、そのような活性
の低下の大きさは、更にビオチンが存在する場合
には低減することが示されている。 参考例 ５ アビジンの直接結合−循環分析；循環速度に対
するアビジン量の変動の影響 本参考例に於いて用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々の全量が0.6ml
で、各々PH7.8の0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液と参考例２
にて得られたNAD−ビオチン結合体（250nM）
を含む７種類の特定結合反応混合物を調製した。
また、その反応混合物の内の６種は、第２表に示
した量のアビジンを含有する。 反応混合物を室温で２−３時間保存した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チ
アゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12M
のＮ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン塩酸
塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱水素
酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラーゼを
含有）で全体量を１mlにした溶液を各々の反応混
合物に加えることにより、該反応混合物と酵素−
基質水性混合物とを接触させた。酵素／基質混合
物の添加後の最初の１時間内で24分毎に570nｍ
の各混合物の光学密度の全変化を測定して、反応
混合物各々について還元型チアゾリルブルーの生
成の相対速度を測定した。アビジンを含有する
各々の反応混合物の光学密度の変化とアビジンを
含有しない反応混合物の光学密度の変化との比
（パーセントで表示）を計算し、第２表と添付し
た第１図に相対反応速度として記す。結果を第２
表と、またグラフの形で添付図面中の第１図に示
す。
−ビオチン結合体が存在しない場合には、循環が
殆んど起らないことを示している。反応２と３
は、NAD−ビオチン結合体が未加工のNADに比
べて著るしい酵素活性量を有することを示してい
る。反応３と６の結果からは、反応混合物中にア
ビジンが存在すると、存在するNADがビオチン
と結合している場合還元型のチアゾリルブルーの
生成を阻害することがわかる。反応６と７の結果
を比較すると、遊離のビオチンが存在すればチア
ゾリルブルーの阻害量が反応混合物のビオチンの
濃度に比例して低減することがわかる。 従つて本参考例に於いては、NADとビオチン
との結合体中のNADの循環反応系に関する活性
はアビジンの存在により低下し、そのような活性
の低下の大きさは、更にビオチンが存在する場合
には低減することが示されている。 参考例 ５ アビジンの直接結合−循環分析；循環速度に対
するアビジン量の変動の影響 本参考例に於いて用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々の全量が0.6ml
で、各々PH7.8の0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液と参考例２
にて得られたNAD−ビオチン結合体（250nM）
を含む７種類の特定結合反応混合物を調製した。
また、その反応混合物の内の６種は、第２表に示
した量のアビジンを含有する。 反応混合物を室温で２−３時間保存した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チ
アゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12M
のＮ，Ｎ−ビス−ヒドロキシエチルグリシン塩酸
塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱水素
酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラーゼを
含有）で全体量を１mlにした溶液を各々の反応混
合物に加えることにより、該反応混合物と酵素−
基質水性混合物とを接触させた。酵素／基質混合
物の添加後の最初の１時間内で24分毎に570nｍ
の各混合物の光学密度の全変化を測定して、反応
混合物各々について還元型チアゾリルブルーの生
成の相対速度を測定した。アビジンを含有する
各々の反応混合物の光学密度の変化とアビジンを
含有しない反応混合物の光学密度の変化との比
（パーセントで表示）を計算し、第２表と添付し
た第１図に相対反応速度として記す。結果を第２
表と、またグラフの形で添付図面中の第１図に示
す。
【表】
以上のように本参考例に於いては、循環反応系
の相対循環速度、従つてNAD−ビオチン結合体
中のNADの活性は、特定結合反応混合物中に存
在するアビジンの量の逆の関数となることが示さ
れている。従つて本参考例によれば、液体中の対
象物質であるアビジンの存在を定量的に測定する
ための直接結合−循環分析技術を利用する試験用
の試薬と方法が提供される。 参考例 ６ ビオチンの競合結合−循環分析；循環速度に対
するアビジン量の変動の影響 本参考例において用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々の全量が0.45ml
で、各々PH7.8の0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液と参考例２
にて得られたNAD−ビオチン結合体（180nM）
を含有する７種類の特定結合反応混合物を調製し
た。反応混合物の６種、即ち第３表の番号１−６
までには更に0.11単位のアビジンが含まれてい
る。また、アビジンを含有する６種類の反応混合
物の内５種、即ち第３表の混合物２−６には、第
３表に示した濃度のビオチンが含まれている。 反応混合物を室温で２−３時間保持した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チ
アゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12M
のＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグリシン
塩酸塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱
水素酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラー
ゼを含有）で全体量を１mlにした溶液を各々の反
応混合物に加えることにより、該反応混合物と酵
素／基質水性混合物とを接触させた。酵素／基質
混合物の添加後の最初の１時間内で24分毎に
570nｍの各混合物の光学密度の全変化を測定し
て、反応混合物各々について還元型チアゾリルブ
ルーの生成の相対速度を測定した。ビオチンを含
有する各々の反応混合物の光学密度の変化とビオ
チンもアビジンも含有しない反応混合物の光学密
度の変化との比（パーセントで表示）を計算し、
第３表と添付した第２図に相対反応速度として記
す。結果を第３表と、またグラフの形で添付図面
中の第２図に示す。
の相対循環速度、従つてNAD−ビオチン結合体
中のNADの活性は、特定結合反応混合物中に存
在するアビジンの量の逆の関数となることが示さ
れている。従つて本参考例によれば、液体中の対
象物質であるアビジンの存在を定量的に測定する
ための直接結合−循環分析技術を利用する試験用
の試薬と方法が提供される。 参考例 ６ ビオチンの競合結合−循環分析；循環速度に対
するアビジン量の変動の影響 本参考例において用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々の全量が0.45ml
で、各々PH7.8の0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液と参考例２
にて得られたNAD−ビオチン結合体（180nM）
を含有する７種類の特定結合反応混合物を調製し
た。反応混合物の６種、即ち第３表の番号１−６
までには更に0.11単位のアビジンが含まれてい
る。また、アビジンを含有する６種類の反応混合
物の内５種、即ち第３表の混合物２−６には、第
３表に示した濃度のビオチンが含まれている。 反応混合物を室温で２−３時間保持した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チ
アゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12M
のＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグリシン
塩酸塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱
水素酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラー
ゼを含有）で全体量を１mlにした溶液を各々の反
応混合物に加えることにより、該反応混合物と酵
素／基質水性混合物とを接触させた。酵素／基質
混合物の添加後の最初の１時間内で24分毎に
570nｍの各混合物の光学密度の全変化を測定し
て、反応混合物各々について還元型チアゾリルブ
ルーの生成の相対速度を測定した。ビオチンを含
有する各々の反応混合物の光学密度の変化とビオ
チンもアビジンも含有しない反応混合物の光学密
度の変化との比（パーセントで表示）を計算し、
第３表と添付した第２図に相対反応速度として記
す。結果を第３表と、またグラフの形で添付図面
中の第２図に示す。
【表】
【表】
以上のように本参考例に於いては、循環反応系
の相対循環速度、従つてNAD−ビオチン結合体
中のNADの活性は、特定結合反応混合物中に存
在するビオチンの量の直接の関数となることが示
されている。従つて本参考例によれば、液体中の
対象物質であるビオチンの存在を定量的に測定す
るための、競合結合−循環分析技術を利用する試
験用の試薬と方法が提供される。 参考例 ７ ２，４−ジニトロフエニルとその誘導体の抗体
の直接結合−循環分析 本参考例に於いて用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々、PH7.8の
0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液と、第４表に示された量の濃
度のNAD、NAD−２，４−ジニトロフエニル結
合体（参考例３で得たもの）、２，４−ジニトロ
フエニルの抗血清及びニコチンアミド・モノヌク
レオチド（NMN）をそれぞれ含有する８種類の
0.6mlの特定結合反応混合物を調製した。 反応混合物を室温で３−４時間保存した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チ
アゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12M
のＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグリシン
塩酸塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱
水素酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラー
ゼを含有）で全体量を１mlにした溶液を各々の反
応混合物に加えることにより、該反応混合物と酵
素／基質水性混合物とを接触させた。酵素／基質
混合物の添加後の最初の１時間内で24分毎に
570nｍの各混合物の光学密度の全変化を測定し
て、反応混合物各々について還元型チアゾリルブ
ルーの生成の相対速度を測定した。全操作を２度
繰り返し、結果の平均を第４表に示す。
の相対循環速度、従つてNAD−ビオチン結合体
中のNADの活性は、特定結合反応混合物中に存
在するビオチンの量の直接の関数となることが示
されている。従つて本参考例によれば、液体中の
対象物質であるビオチンの存在を定量的に測定す
るための、競合結合−循環分析技術を利用する試
験用の試薬と方法が提供される。 参考例 ７ ２，４−ジニトロフエニルとその誘導体の抗体
の直接結合−循環分析 本参考例に於いて用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々、PH7.8の
0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液と、第４表に示された量の濃
度のNAD、NAD−２，４−ジニトロフエニル結
合体（参考例３で得たもの）、２，４−ジニトロ
フエニルの抗血清及びニコチンアミド・モノヌク
レオチド（NMN）をそれぞれ含有する８種類の
0.6mlの特定結合反応混合物を調製した。 反応混合物を室温で３−４時間保存した。0.1
mlの1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チ
アゾリルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12M
のＮ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグリシン
塩酸塩緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱
水素酵素と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラー
ゼを含有）で全体量を１mlにした溶液を各々の反
応混合物に加えることにより、該反応混合物と酵
素／基質水性混合物とを接触させた。酵素／基質
混合物の添加後の最初の１時間内で24分毎に
570nｍの各混合物の光学密度の全変化を測定し
て、反応混合物各々について還元型チアゾリルブ
ルーの生成の相対速度を測定した。全操作を２度
繰り返し、結果の平均を第４表に示す。
【表】
反応１は対照実験で、NADとNAD−ビオチン
結合体が存在しない場合には、循環が殆んど起ら
ないことを示している。反応２は、NAD−２，
４−ジニトロフエニル結合体が酵素循環系で活性
であることを示している。反応３及び５からは
２，４−ジニトロフエニルの抗体が存在すると
NADの循環が妨げられることがわかる。反応６
の結果に示されているように、そのような阻害は
NMNを添加することにより逆転する。反応３と
４の結果からは、NMNが存在すると循環速度
は、不存在の場合に比べて約15％大きくなること
がわかる。この結果は、他の測定によるとNMN
は抗体の不存在下では循環速度に影響を与えない
ことが示されているので、恐らく外部のNADが
混入したためと思われる。しかしながら、抗血清
はNAD自体に関していくらかの活性を有してお
り、この活性はNMNが存在すると阻害される。 以上のように本参考例に於いてはNADと２，
４−ジニトロフエニルとの結合体中のNADの循
環反応系に関する活性は、２，４−ジニトロフエ
ニルの抗体の存在により低下することを示されて
いる。従つて、本参考例によれば、液体中の対象
物質である２，４−ジニトロフエニルの存在を測
定するための直接結合−循環分析技術を利用する
試験用の試薬と方法が提供される。 参考例 ８ ２，４−ジニトロベンゼンとその誘導体の競合
結合−循環分析；循環速度に対するＮ−（２，
４−ジニトロフエニル）−６−アミノカプロエ
ート量の変動の影響 本参考例に於いて用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々の全量が0.6ml
で、各々PH7.8の0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液、300nM
のNAD−ジニトロフエニル結合体（参考例３で
得られたもの）及び50μMのニコチンアミド・モ
ノヌクレオチドを含有する７種類の特定結合反応
混合物を調製した。７種類の反応混合物の内６
種、即ち第５表の１から６にはまた、他の反応混
合物の循環速度を85％阻害するのに充分な量の
２，４−ジニトロフエニルの抗体が含まれてい
る。Ｎ−（２，４−ジニトロフエニル）−６−アミ
ノカプロエート（バイオケミカル・ジヤーナル、
42：287（1948）に記載された方法により製造され
る２，４−ジニトロベンゼンの誘導体）が更に、
抗体を含有している６種類の反応混合物の内５
種、即ち第５表の２−６に、該表に示された濃度
で含まれている。 反応混合物を室温で約４間保持した。0.1mlの
1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チアゾ
リルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12MのＮ，
Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグリシン塩酸塩
緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱水酵素
と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラーゼを含有）
で全体量を１mlにした溶液を各々の反応混合物に
加えることにより、該反応混合物と酵素／基質水
性混合物とを接触させた。酵素／基質混合物の添
加後の最初の１時間内で24分毎に570nｍの各混
合物の光学密度の全変化を測定して、反応混合物
各々について還元型チアゾリルブルーの生成の相
対速度を測定した。Ｎ−（２，４−ジニトロフエ
ニル）−６−アミノカプロエートを含有する各々
の反応混合物の光学密度の変化と、Ｎ−（２，４
−ジニトロフエニル）−６−アミノカプロエート
も２，４−ジニトロフエニルの抗体も含有しない
反応混合物の光学密度の変化との比（パーセント
で表示）を計算し、第５表と添付した第３図に相
対反応速度として記す。結果を第５表と、またグ
ラフの形で添付図面中の第３図に示す。
結合体が存在しない場合には、循環が殆んど起ら
ないことを示している。反応２は、NAD−２，
４−ジニトロフエニル結合体が酵素循環系で活性
であることを示している。反応３及び５からは
２，４−ジニトロフエニルの抗体が存在すると
NADの循環が妨げられることがわかる。反応６
の結果に示されているように、そのような阻害は
NMNを添加することにより逆転する。反応３と
４の結果からは、NMNが存在すると循環速度
は、不存在の場合に比べて約15％大きくなること
がわかる。この結果は、他の測定によるとNMN
は抗体の不存在下では循環速度に影響を与えない
ことが示されているので、恐らく外部のNADが
混入したためと思われる。しかしながら、抗血清
はNAD自体に関していくらかの活性を有してお
り、この活性はNMNが存在すると阻害される。 以上のように本参考例に於いてはNADと２，
４−ジニトロフエニルとの結合体中のNADの循
環反応系に関する活性は、２，４−ジニトロフエ
ニルの抗体の存在により低下することを示されて
いる。従つて、本参考例によれば、液体中の対象
物質である２，４−ジニトロフエニルの存在を測
定するための直接結合−循環分析技術を利用する
試験用の試薬と方法が提供される。 参考例 ８ ２，４−ジニトロベンゼンとその誘導体の競合
結合−循環分析；循環速度に対するＮ−（２，
４−ジニトロフエニル）−６−アミノカプロエ
ート量の変動の影響 本参考例に於いて用いた循環反応系は参考例４
に示したものと同じである。各々の全量が0.6ml
で、各々PH7.8の0.12MのＮ，Ｎ−ビス−２−ヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液、300nM
のNAD−ジニトロフエニル結合体（参考例３で
得られたもの）及び50μMのニコチンアミド・モ
ノヌクレオチドを含有する７種類の特定結合反応
混合物を調製した。７種類の反応混合物の内６
種、即ち第５表の１から６にはまた、他の反応混
合物の循環速度を85％阻害するのに充分な量の
２，４−ジニトロフエニルの抗体が含まれてい
る。Ｎ−（２，４−ジニトロフエニル）−６−アミ
ノカプロエート（バイオケミカル・ジヤーナル、
42：287（1948）に記載された方法により製造され
る２，４−ジニトロベンゼンの誘導体）が更に、
抗体を含有している６種類の反応混合物の内５
種、即ち第５表の２−６に、該表に示された濃度
で含まれている。 反応混合物を室温で約４間保持した。0.1mlの
1M乳酸リチウム、0.05mlの10ｍＭ酸化型チアゾ
リルブルー、及び充分な量のPH7.8の0.12MのＮ，
Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチルグリシン塩酸塩
緩衝液（0.38国際単位の牛の心臓の乳酸脱水酵素
と1.5国際単位の豚の心臓のジアホラーゼを含有）
で全体量を１mlにした溶液を各々の反応混合物に
加えることにより、該反応混合物と酵素／基質水
性混合物とを接触させた。酵素／基質混合物の添
加後の最初の１時間内で24分毎に570nｍの各混
合物の光学密度の全変化を測定して、反応混合物
各々について還元型チアゾリルブルーの生成の相
対速度を測定した。Ｎ−（２，４−ジニトロフエ
ニル）−６−アミノカプロエートを含有する各々
の反応混合物の光学密度の変化と、Ｎ−（２，４
−ジニトロフエニル）−６−アミノカプロエート
も２，４−ジニトロフエニルの抗体も含有しない
反応混合物の光学密度の変化との比（パーセント
で表示）を計算し、第５表と添付した第３図に相
対反応速度として記す。結果を第５表と、またグ
ラフの形で添付図面中の第３図に示す。
【表】
以上のように本参考例に於いては、循環反応系
の相対循環速度、従つてNAD−ジニトロフエニ
ル結合体中のNADの活性は、特定結合反応混合
物中に存在するＮ−（２，４−ジニトロフエニル）
−６−アミノカプロエートの量の直接の関数とな
ることが示されている。従つて本参考例によれ
ば、液体中の対象物質であるＮ−（２，４−ジニ
トロフエニル）−６−アミノカプロエートの存在
を定量的に測定するための、競合結合−循環分析
技術を利用する試験用の試薬と方法が提供され
る。 実施例 １ ビオチンとウンベリフエロンの結合体の製造 100mgのウンベリフエロン、167mgのビオチン及
び141mgのジシクロヘキシルカルボジイミドを10
mlのジメチルホルムアミドに溶かして反応混合物
を調製した。この反応混合物を−18℃に４時間保
存し、次いで７℃で一夜、更に室温で３−４時間
放置した。更に141mgのジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを加えて反応混合物を７℃で３−４時間
撹拌し、室温で一夜放置した。得られた沈殿を濾
別し、捨てた。濾液に75mlの氷冷水を加え、得ら
れた混合物を０℃で１時間保存した。得られた沈
殿を濾別し、捨てた。濾液を蒸発乾固し、残査を
３−４mlの塩化メチレンに溶解させた。得られた
溶液に５mlのジエチルエーテルを加えた。得られ
た沈殿はビオチン−ウンベリフエロン結合体を含
有しており、これを濾別し、乾燥し、次いで室温
に保存した。 実施例 ２ 標識物質として酵素基質を用いてのビオチンと
アビジンの特定結合分析 本実施例に於いて用いられた特定結合分析系は
次の反応に基づいている。 各々全量0.3mlで、各々PH8.0の0.1Mのトリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液
及びそれぞれ第６表に示された量もしくは濃度の
ウンベリフエロン−ビオチン結合体（実施例１で
得たもの）、ビオチン及びアビジンを含有する10
種類の特定結合反応混合物を調製した。 この反応混合物を室温で１−３時間保存した。
第６表の反応混合物番号２−10は、また、0.26国
際単位の牛の肝臓のカルボン酸加水分解酵素（エ
ステラーゼ）を含む。次いで各々の反応混合物に
ついての相対反応速度を、364nｍの励起にセツ
トした111型ターナー蛍光計（米国、カリホルニ
ア州、パロ・アルト、プルガス・ストリート2524
のジー・ケイ・ターナー（Turner）・アソシエー
シヨンから入手）により、448nｍで各々より発
生する蛍光を監視検出して測定した。蛍光計より
発生した電気信号は細長いチヤート記録計に伝え
られ、１分間当りに発生した蛍光の量を記録計の
図形から測定し、チヤート紙の区画を基にして任
意な単位とした。結果を第６表に示す。
の相対循環速度、従つてNAD−ジニトロフエニ
ル結合体中のNADの活性は、特定結合反応混合
物中に存在するＮ−（２，４−ジニトロフエニル）
−６−アミノカプロエートの量の直接の関数とな
ることが示されている。従つて本参考例によれ
ば、液体中の対象物質であるＮ−（２，４−ジニ
トロフエニル）−６−アミノカプロエートの存在
を定量的に測定するための、競合結合−循環分析
技術を利用する試験用の試薬と方法が提供され
る。 実施例 １ ビオチンとウンベリフエロンの結合体の製造 100mgのウンベリフエロン、167mgのビオチン及
び141mgのジシクロヘキシルカルボジイミドを10
mlのジメチルホルムアミドに溶かして反応混合物
を調製した。この反応混合物を−18℃に４時間保
存し、次いで７℃で一夜、更に室温で３−４時間
放置した。更に141mgのジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを加えて反応混合物を７℃で３−４時間
撹拌し、室温で一夜放置した。得られた沈殿を濾
別し、捨てた。濾液に75mlの氷冷水を加え、得ら
れた混合物を０℃で１時間保存した。得られた沈
殿を濾別し、捨てた。濾液を蒸発乾固し、残査を
３−４mlの塩化メチレンに溶解させた。得られた
溶液に５mlのジエチルエーテルを加えた。得られ
た沈殿はビオチン−ウンベリフエロン結合体を含
有しており、これを濾別し、乾燥し、次いで室温
に保存した。 実施例 ２ 標識物質として酵素基質を用いてのビオチンと
アビジンの特定結合分析 本実施例に於いて用いられた特定結合分析系は
次の反応に基づいている。 各々全量0.3mlで、各々PH8.0の0.1Mのトリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩衝液
及びそれぞれ第６表に示された量もしくは濃度の
ウンベリフエロン−ビオチン結合体（実施例１で
得たもの）、ビオチン及びアビジンを含有する10
種類の特定結合反応混合物を調製した。 この反応混合物を室温で１−３時間保存した。
第６表の反応混合物番号２−10は、また、0.26国
際単位の牛の肝臓のカルボン酸加水分解酵素（エ
ステラーゼ）を含む。次いで各々の反応混合物に
ついての相対反応速度を、364nｍの励起にセツ
トした111型ターナー蛍光計（米国、カリホルニ
ア州、パロ・アルト、プルガス・ストリート2524
のジー・ケイ・ターナー（Turner）・アソシエー
シヨンから入手）により、448nｍで各々より発
生する蛍光を監視検出して測定した。蛍光計より
発生した電気信号は細長いチヤート記録計に伝え
られ、１分間当りに発生した蛍光の量を記録計の
図形から測定し、チヤート紙の区画を基にして任
意な単位とした。結果を第６表に示す。
【表】
反応１は対照実験で、エステラーゼが存在しな
いと反応が起らないことを示す。反応２と３の結
果は、ウンベリフエロン−ビオチン結合体は酵素
反応中では活性であることを示し、反応４−８の
結果を比較すると、アビジンが存在すると反応混
合物中のアビジンの量に比例して反応速度が阻害
されることがわかる。反応８、９及び10の結果を
比較すると、アビジンによる反応速度の阻害量は
反応混合物中に存在するビオチンの量の直接の関
数であることがわかる。 以上の如く本実施例に於いては、エステラーゼ
反応により発生する蛍光の発生速度、即ちウンベ
リフエロン−ビオチン結合体の基質の活性はアビ
ジンの存在により低下し、その活性の低下の大き
さはビオチンの存在により低減されることが示さ
れている。従つて本発明によれば、液体中の対象
物質であるビオチンとアビジンの存在を測定する
ために、標識物質として酵素基質を使用する特定
結合分析技術を利用する試験用の試薬と方法が提
供される。 実施例 ３ ２，４−ジニトロフエニルとフルオレセインの
結合体の製法 フルオレセイン−3′，6′−ビス−〔６−（２，４−
ジニトロアニリノ）ヘキサノエート〕 この合成は基本的には６−（２，４−ジニトロ
アニリノ）ヘキサン酸の酸クロリドとフルオレセ
インの二ナトリウム塩との反応を含んでいる。６
−（２，４−ジニトロアニリノ）ヘキサン酸はバ
イオケミカル・ジヤーナル、42：287−94（1948）
に記載された方法により製造される。 ６−（２，４−ジニトロアニリノ）ヘキサン酸
の1.5ｇ（５ミリモル）の溶液を、10mlの温塩化
チオニルと15分間反応させ、冷却し、次いで20ml
のヘキサンを蒸留することにより酸クロリドに変
えた。この得られた固体の酸クロリドを濾過して
集め完全に乾燥させて、これを、600mgのフルオ
レセインの二ナトリウム塩を10mlの乾燥アセトン
に溶かした溶液に加えた。５時間還流させた後、
２mlの水と５mlのアセトンを加えて反応を止め
た。25℃で30分間置いた後、この混合物を濃縮乾
固し、残査を酢酸エチルと重炭酸ナトリウム水溶
液で分配した。有機相を分離し、１％の水性硫酸
で洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで
蒸発させた。得られた赤色の油状物を、60ｇのシ
リカゲル60（西独、ダルムシユタツト、エー・メ
ルク社より入手）で、溶離液としてアセトンを四
塩化炭素に溶かした（20％容積比）ものを用いて
クロマトグラフにかけた。1.2ｇの不純なビスエ
ステルを、60ｇのシリカゲル60で、アセトンを四
塩化炭素に溶かした（10％容積比）ものを用いて
再度クロマトグラフにかけた。適当なフラクシヨ
ンを一緒にし、蒸発させて180mgの黄色のガラス
状の固体を得た。 計算値（C44H38N6O15として）：Ｃ、59.33；
Ｈ、4.30；Ｎ、9.43.分析値：Ｃ、60.92；Ｈ、
4.35；Ｎ、示6.65. 赤外スペクトルには、予期されたエステルのカ
ルボニルの伸縮が1765cm-1に見られた。 実施例 ４ 標識物質として酵素基質（部分変形したフルオ
レセイン）を用いての２，４−ジニトロフエニ
ルの誘導体及びその抗体の特定結果分析 本実施例に於いて用いられた特定結合分析系
は、図式１に示した反応に基づいている。 Ａ ２，４−ジニトロフエニルの抗体の直接結合
−蛍光分析；反応速度に対する抗体の量の変動
の影響 ７種類の特定結合反応混合物を調製して、分
析した。各々の反応混合物では、1μｇの２，
４−ジニトロフエニル−フルオレセイン結合体
（実施例３により得たもの）のジメチルスルホ
キシド（20μ）溶液を、第７表に示した容積
の２，４−ジニトロフエニルの抗血清と充分な
容積のPH7.0の0.1Mビスヒドロキシエチルグリ
シン塩酸塩緩衝液とを一緒にして全量を2.0ml
とした。結合体中のエステル結合の加水分解に
よるバツクグラウンド速度は、470nｍに励起
をセツトした蛍光計を用いて実施例２に記述し
た一般的な技術により510nｍでの蛍光強度の
増加速度（率）を測定することにより、各々の
反応混合物について３分間測定した。次いで、
0.54単位の第型エステラーゼ（米国、ミズー
リ州、セントルイスのシグマ・ケミカル・カン
パニーより入手、E.C.No.3.1.1.1）を含有するPH
7.0の0.1Mビスヒドロキシエチルグリシン塩酸
塩緩衝液10μ容量を、各々の反応混合物に加
えた。得られた全反応速度を、バツクグラウン
ド加水分解速度の場合と同様な方法で測定し
た。結果を第７表に示す。バツクグラウンド加
水分解速度は全反応速度から差し引かれてお
り、従つて、エステラーゼ触媒反応による正味
の反応速度が得られた。正味の酵素触媒反応速
度とバツクグラウンドのアルカリ性加水分解反
応速度との間の関係、及び反応混合物中に存在
する抗血清の量は添付図面の第４図にグラフの
形で示す。
いと反応が起らないことを示す。反応２と３の結
果は、ウンベリフエロン−ビオチン結合体は酵素
反応中では活性であることを示し、反応４−８の
結果を比較すると、アビジンが存在すると反応混
合物中のアビジンの量に比例して反応速度が阻害
されることがわかる。反応８、９及び10の結果を
比較すると、アビジンによる反応速度の阻害量は
反応混合物中に存在するビオチンの量の直接の関
数であることがわかる。 以上の如く本実施例に於いては、エステラーゼ
反応により発生する蛍光の発生速度、即ちウンベ
リフエロン−ビオチン結合体の基質の活性はアビ
ジンの存在により低下し、その活性の低下の大き
さはビオチンの存在により低減されることが示さ
れている。従つて本発明によれば、液体中の対象
物質であるビオチンとアビジンの存在を測定する
ために、標識物質として酵素基質を使用する特定
結合分析技術を利用する試験用の試薬と方法が提
供される。 実施例 ３ ２，４−ジニトロフエニルとフルオレセインの
結合体の製法 フルオレセイン−3′，6′−ビス−〔６−（２，４−
ジニトロアニリノ）ヘキサノエート〕 この合成は基本的には６−（２，４−ジニトロ
アニリノ）ヘキサン酸の酸クロリドとフルオレセ
インの二ナトリウム塩との反応を含んでいる。６
−（２，４−ジニトロアニリノ）ヘキサン酸はバ
イオケミカル・ジヤーナル、42：287−94（1948）
に記載された方法により製造される。 ６−（２，４−ジニトロアニリノ）ヘキサン酸
の1.5ｇ（５ミリモル）の溶液を、10mlの温塩化
チオニルと15分間反応させ、冷却し、次いで20ml
のヘキサンを蒸留することにより酸クロリドに変
えた。この得られた固体の酸クロリドを濾過して
集め完全に乾燥させて、これを、600mgのフルオ
レセインの二ナトリウム塩を10mlの乾燥アセトン
に溶かした溶液に加えた。５時間還流させた後、
２mlの水と５mlのアセトンを加えて反応を止め
た。25℃で30分間置いた後、この混合物を濃縮乾
固し、残査を酢酸エチルと重炭酸ナトリウム水溶
液で分配した。有機相を分離し、１％の水性硫酸
で洗い、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで
蒸発させた。得られた赤色の油状物を、60ｇのシ
リカゲル60（西独、ダルムシユタツト、エー・メ
ルク社より入手）で、溶離液としてアセトンを四
塩化炭素に溶かした（20％容積比）ものを用いて
クロマトグラフにかけた。1.2ｇの不純なビスエ
ステルを、60ｇのシリカゲル60で、アセトンを四
塩化炭素に溶かした（10％容積比）ものを用いて
再度クロマトグラフにかけた。適当なフラクシヨ
ンを一緒にし、蒸発させて180mgの黄色のガラス
状の固体を得た。 計算値（C44H38N6O15として）：Ｃ、59.33；
Ｈ、4.30；Ｎ、9.43.分析値：Ｃ、60.92；Ｈ、
4.35；Ｎ、示6.65. 赤外スペクトルには、予期されたエステルのカ
ルボニルの伸縮が1765cm-1に見られた。 実施例 ４ 標識物質として酵素基質（部分変形したフルオ
レセイン）を用いての２，４−ジニトロフエニ
ルの誘導体及びその抗体の特定結果分析 本実施例に於いて用いられた特定結合分析系
は、図式１に示した反応に基づいている。 Ａ ２，４−ジニトロフエニルの抗体の直接結合
−蛍光分析；反応速度に対する抗体の量の変動
の影響 ７種類の特定結合反応混合物を調製して、分
析した。各々の反応混合物では、1μｇの２，
４−ジニトロフエニル−フルオレセイン結合体
（実施例３により得たもの）のジメチルスルホ
キシド（20μ）溶液を、第７表に示した容積
の２，４−ジニトロフエニルの抗血清と充分な
容積のPH7.0の0.1Mビスヒドロキシエチルグリ
シン塩酸塩緩衝液とを一緒にして全量を2.0ml
とした。結合体中のエステル結合の加水分解に
よるバツクグラウンド速度は、470nｍに励起
をセツトした蛍光計を用いて実施例２に記述し
た一般的な技術により510nｍでの蛍光強度の
増加速度（率）を測定することにより、各々の
反応混合物について３分間測定した。次いで、
0.54単位の第型エステラーゼ（米国、ミズー
リ州、セントルイスのシグマ・ケミカル・カン
パニーより入手、E.C.No.3.1.1.1）を含有するPH
7.0の0.1Mビスヒドロキシエチルグリシン塩酸
塩緩衝液10μ容量を、各々の反応混合物に加
えた。得られた全反応速度を、バツクグラウン
ド加水分解速度の場合と同様な方法で測定し
た。結果を第７表に示す。バツクグラウンド加
水分解速度は全反応速度から差し引かれてお
り、従つて、エステラーゼ触媒反応による正味
の反応速度が得られた。正味の酵素触媒反応速
度とバツクグラウンドのアルカリ性加水分解反
応速度との間の関係、及び反応混合物中に存在
する抗血清の量は添付図面の第４図にグラフの
形で示す。
【表】
【表】
本実施例のこの部分に於いては、加水分解反
応の正味の反応速度は特定結合反応混合物中に
存在する対象物質である２，４−ジニトロフエ
ニルの抗体の量の逆の関数であることが示され
ている。また、バツクグラウンドの加水分解反
応の反応速度は特定結合反応混合物中に存在す
る抗体の量の直接の関数であることが示されて
いる。従つて本発明によれば、液体中の対象物
質である２，４−ジニトロフエニルの抗体の存
在を、直接結合−蛍光分析を用いて測定するた
めの試験用の試薬と方法が提供される。 Ｂ ２，４−ジニトロフエニルの誘導体の競合結
合−蛍光分析；反応速度に対する２，４−ジニ
トロフエニル−β−アラニンの量の変動の影響 各々全量2.0mlで、各々PH7.0の0.1Mのビスヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液と第８表
に示した濃度の２，４−ジニトロフエニル−β
−アラニン（ジヤーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイテイ、76：1328（1954）に記
載された方法に従つて製造）を含有する10種類
の特定結合反応混合物を調製した。10種の反応
混合物の内の９種、即ち第８表の２〜10には、
他の混合物即ち反応混合物１のエステラーゼ触
媒反応速度を60％阻害するのに充分な量の２，
４−ジニトロフエニルの抗血清が加えられた。 混合した後、1μMの２，４−ジニトロフエ
ニル−フルオレセイン結合体（実施例３で得た
もの）のジメチルスルホキシド（20μ）の溶
液を各反応混合物に加えた。次いで、0.54国際
単位の第型エステラーゼ（米国、ミズーリ
州、セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパ
ニーより入手、E.C.No.3.1.1.1）を含有するPH7.0
の0.1Mビスヒドロキシエチルグリシン塩酸塩
緩衝液10μ容量を、各々の反応混合物に加え
た。得られた反応速度を本実施例のＡと同様に
測定した。反応１（抗体不存在）の反応速度に
対する反応２−10の各反応の反応速度の百分率
比を計算した。結果を第８表及びグラフの形で
添付図面の第５図に示す。
応の正味の反応速度は特定結合反応混合物中に
存在する対象物質である２，４−ジニトロフエ
ニルの抗体の量の逆の関数であることが示され
ている。また、バツクグラウンドの加水分解反
応の反応速度は特定結合反応混合物中に存在す
る抗体の量の直接の関数であることが示されて
いる。従つて本発明によれば、液体中の対象物
質である２，４−ジニトロフエニルの抗体の存
在を、直接結合−蛍光分析を用いて測定するた
めの試験用の試薬と方法が提供される。 Ｂ ２，４−ジニトロフエニルの誘導体の競合結
合−蛍光分析；反応速度に対する２，４−ジニ
トロフエニル−β−アラニンの量の変動の影響 各々全量2.0mlで、各々PH7.0の0.1Mのビスヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液と第８表
に示した濃度の２，４−ジニトロフエニル−β
−アラニン（ジヤーナル・オブ・アメリカン・
ケミカル・ソサイテイ、76：1328（1954）に記
載された方法に従つて製造）を含有する10種類
の特定結合反応混合物を調製した。10種の反応
混合物の内の９種、即ち第８表の２〜10には、
他の混合物即ち反応混合物１のエステラーゼ触
媒反応速度を60％阻害するのに充分な量の２，
４−ジニトロフエニルの抗血清が加えられた。 混合した後、1μMの２，４−ジニトロフエ
ニル−フルオレセイン結合体（実施例３で得た
もの）のジメチルスルホキシド（20μ）の溶
液を各反応混合物に加えた。次いで、0.54国際
単位の第型エステラーゼ（米国、ミズーリ
州、セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパ
ニーより入手、E.C.No.3.1.1.1）を含有するPH7.0
の0.1Mビスヒドロキシエチルグリシン塩酸塩
緩衝液10μ容量を、各々の反応混合物に加え
た。得られた反応速度を本実施例のＡと同様に
測定した。反応１（抗体不存在）の反応速度に
対する反応２−10の各反応の反応速度の百分率
比を計算した。結果を第８表及びグラフの形で
添付図面の第５図に示す。
【表】
本実施例のこの部分に於いては、加水分解反
応の反応速度は反応混合物中の２，４−ジニト
ロフエニル−β−アラニンの量の直接の関数で
あることが示されている。従つて本発明によれ
ば、液体中の２，４−ジニトロフエニルの誘導
体のような対象物質の存在を、競合結合−蛍光
分析技術を用いて測定するための試験用の試薬
と方法が提供される。 Ｃ ２，４−ジニトロフエニルの誘導体の競合結
合−分光分析；反応速度に対する２，４−ジニ
トロフエニル−β−アラニンの量の変動の影響 各々全量1.0mlで、各々PH7.0の0.1Mのトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液及び第９表に示した濃度の２，４−ジニト
ロフエニル−β−アラニンを含有する８種類の
特定結合反応混合物を調製した。８種の反応混
合物の内７種、即ち第９表の２−８に、他の混
合物即ち反応混合物１のエステラーゼ触媒反応
速度を82％阻害するのに充分な量の２，４−ジ
ニトロフエニルの抗血清を加えた。 混合した後、0.1ｍＭの２，４−ジニトロフ
エニル−フルオレセイン結合体（実施例３で得
たもの）のジメチルスルホキシド（10μ）の
溶液を各混合物に加えた。次いで、2.16国際単
位の第型エステラーゼ（米国、ミズーリ州、
セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー
より入手、E.C.No.3.1.1.1）を含有するPH7.0の
0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン塩酸塩緩衝液20μ容量を、各々の反応混
合物に加えた。１分間当りの489nｍでの各反
応混合物の吸収の変化をギルフオード
（Gilford）2000分光々度計で記録した。結果を
第９表及びグラフの形で添付図面の第６図に示
す。
応の反応速度は反応混合物中の２，４−ジニト
ロフエニル−β−アラニンの量の直接の関数で
あることが示されている。従つて本発明によれ
ば、液体中の２，４−ジニトロフエニルの誘導
体のような対象物質の存在を、競合結合−蛍光
分析技術を用いて測定するための試験用の試薬
と方法が提供される。 Ｃ ２，４−ジニトロフエニルの誘導体の競合結
合−分光分析；反応速度に対する２，４−ジニ
トロフエニル−β−アラニンの量の変動の影響 各々全量1.0mlで、各々PH7.0の0.1Mのトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液及び第９表に示した濃度の２，４−ジニト
ロフエニル−β−アラニンを含有する８種類の
特定結合反応混合物を調製した。８種の反応混
合物の内７種、即ち第９表の２−８に、他の混
合物即ち反応混合物１のエステラーゼ触媒反応
速度を82％阻害するのに充分な量の２，４−ジ
ニトロフエニルの抗血清を加えた。 混合した後、0.1ｍＭの２，４−ジニトロフ
エニル−フルオレセイン結合体（実施例３で得
たもの）のジメチルスルホキシド（10μ）の
溶液を各混合物に加えた。次いで、2.16国際単
位の第型エステラーゼ（米国、ミズーリ州、
セントルイスのシグマ・ケミカル・カンパニー
より入手、E.C.No.3.1.1.1）を含有するPH7.0の
0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン塩酸塩緩衝液20μ容量を、各々の反応混
合物に加えた。１分間当りの489nｍでの各反
応混合物の吸収の変化をギルフオード
（Gilford）2000分光々度計で記録した。結果を
第９表及びグラフの形で添付図面の第６図に示
す。
【表】
本実施例のこの部分に於いては、反応速度は
反応混合物中の２，４−ジニトロフエニル−β
−アラニンの量の直接の関数であることが示さ
れている。従つて本発明によれば、液体中の
２，４−ジニトロフエニルの誘導体のような対
象物質の存在を、競合結合−分光分析技術を用
いて測定するための試験用の試薬と方法が提供
される。 Ｄ ２，４−ジニトロフエニルの誘導体の競合結
合−蛍光分析；非酵素性監視検出反応の利用 ここで用いられた特定結合分析系は、結合体
中のエステル結合の加水分解に触媒として働く
エステラーゼ以外は図式１に示されたものと同
じである。 各々全量２mlで、各々PH7.5の0.1Mのトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液及び第10表に示された濃度の２，４−ジニ
トロフエニル−β−アラニンを含有する８種類
の特定結合反応混合物を調製した。50μの
２，４−ジニトロフエニルの抗血清を各反応混
合物に加えた。混合した後、2μMの２，４−
ジニトロフエニル−フルオレセイン結合体（実
施例３で得られたもの）のジメチルスルホキシ
ド溶液（20μ）を各反応混合物に加え、得ら
れた反応速度を本実施例のＡと同様に測定し
た。結果を第10表に示す。
反応混合物中の２，４−ジニトロフエニル−β
−アラニンの量の直接の関数であることが示さ
れている。従つて本発明によれば、液体中の
２，４−ジニトロフエニルの誘導体のような対
象物質の存在を、競合結合−分光分析技術を用
いて測定するための試験用の試薬と方法が提供
される。 Ｄ ２，４−ジニトロフエニルの誘導体の競合結
合−蛍光分析；非酵素性監視検出反応の利用 ここで用いられた特定結合分析系は、結合体
中のエステル結合の加水分解に触媒として働く
エステラーゼ以外は図式１に示されたものと同
じである。 各々全量２mlで、各々PH7.5の0.1Mのトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン塩酸塩緩
衝液及び第10表に示された濃度の２，４−ジニ
トロフエニル−β−アラニンを含有する８種類
の特定結合反応混合物を調製した。50μの
２，４−ジニトロフエニルの抗血清を各反応混
合物に加えた。混合した後、2μMの２，４−
ジニトロフエニル−フルオレセイン結合体（実
施例３で得られたもの）のジメチルスルホキシ
ド溶液（20μ）を各反応混合物に加え、得ら
れた反応速度を本実施例のＡと同様に測定し
た。結果を第10表に示す。
【表】
本実施例のこの部分では、バツクグラウンド
の加水分解速度は、エステラーゼがない場合に
は、反応混合物中の２，４−ジニトロフエニル
−β−アラニンの量の逆の関数であることが示
されている。従つて本発明によれば、液体中の
２，４−ジニトロフエニルの誘導体のような対
象物質の存在を、結合の相手物質が結合体中の
対象物質（リガンド）と結合した後に監視検出
反応に関与することを含む競合結合−蛍光技術
を用いて測定するための試験用の試薬と方法が
提供される。 実施例 ４ コルチゾール−ウンベリフエロン結合体の製造 コルチゾール−21−ヘミスクシネート−ウンベリ
フエロン Ａ コルチゾール−21−ヘミスクシネート 無水スクシン酸（0.5ｇ）を0.5ｇのコルチゾ
ール（ヒドロコルチゾン）を含む10mlの乾燥ピ
リジン溶液に加え、室温で一夜撹拌した。100
mlの水を加えた後混合物を100mlの酢酸エチル
で抽出した。有機相を水で一回洗浄し、100ml
の飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。水相
を分離し、10％塩酸でPH４にする。生成した沈
殿を濾過により集め、乾燥し、次いでヘキサン
−アセトン混合溶媒で再結晶すると目的の中間
体が得られた。融点171−２℃ Ｂ コルチゾール−ウンベリフエロン結合体 本実施例のＡで得られた中間体100mgを１ml
の乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に
50mgのカルボジイミドを加え、30分間撹拌し
た。50mgの７−ヒドロキシクマリンのジメチル
ホルムアミド溶液（２ml）を加え、反応混合物
を室温で一夜撹拌した。生成した沈殿を濾別
し、捨てた。水を濾液に加え、この混合物を酢
酸エチルで抽出した。有機相を一度水で洗浄
し、分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた
後、濾過し、真空中で蒸発乾固させた。残査を
アセトン−ヘキサン混合溶媒で結晶化すると目
的の結合体が得られた。融点126℃ 実施例 ５ 標識物質として酵素基質（部分変形ウンベリフ
エロン）を用いたコルチゾールの特定結合分析 本実施例に於いて用いた特定結合分析系は次の
反応に基づいている。 コルチゾール−ウンベリフエロン結合体エステラー
ゼ ―――――――→ H2O，pH8.5ウンベリフエロン 各々全体量が２mlで、各々PH8.5の0.1Mビスヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液及び第６表
に示した濃度のコルチゾールを含有する８種類の
特定結合反応混合物を調製した。８種の反応混合
物の７種、即ち第11表の２−８に、他の反応混合
物即ち反応混合物１のエステラーゼ触媒反応速度
を70％阻害するのに充分な量のコルチゾールの抗
血清を加えた。 混合した後、2μMのコルチゾール−ウンベリ
フエロン結合体（実施例４で得たもの）を溶かし
た20μのPH8.5の0.1Mビスヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液を各反応混合物に加えた。更
に混合した後、15μの豚のエステラーゼ（0.81
単位／ml）を各反応混合物に加えた。得られた反
応速度を各反応混合物について実施例２に記述し
た方法と同様な方法で測定した。得られた結果を
第11表に示す。
の加水分解速度は、エステラーゼがない場合に
は、反応混合物中の２，４−ジニトロフエニル
−β−アラニンの量の逆の関数であることが示
されている。従つて本発明によれば、液体中の
２，４−ジニトロフエニルの誘導体のような対
象物質の存在を、結合の相手物質が結合体中の
対象物質（リガンド）と結合した後に監視検出
反応に関与することを含む競合結合−蛍光技術
を用いて測定するための試験用の試薬と方法が
提供される。 実施例 ４ コルチゾール−ウンベリフエロン結合体の製造 コルチゾール−21−ヘミスクシネート−ウンベリ
フエロン Ａ コルチゾール−21−ヘミスクシネート 無水スクシン酸（0.5ｇ）を0.5ｇのコルチゾ
ール（ヒドロコルチゾン）を含む10mlの乾燥ピ
リジン溶液に加え、室温で一夜撹拌した。100
mlの水を加えた後混合物を100mlの酢酸エチル
で抽出した。有機相を水で一回洗浄し、100ml
の飽和重炭酸ナトリウム溶液で抽出した。水相
を分離し、10％塩酸でPH４にする。生成した沈
殿を濾過により集め、乾燥し、次いでヘキサン
−アセトン混合溶媒で再結晶すると目的の中間
体が得られた。融点171−２℃ Ｂ コルチゾール−ウンベリフエロン結合体 本実施例のＡで得られた中間体100mgを１ml
の乾燥ジメチルホルムアミドに溶かした溶液に
50mgのカルボジイミドを加え、30分間撹拌し
た。50mgの７−ヒドロキシクマリンのジメチル
ホルムアミド溶液（２ml）を加え、反応混合物
を室温で一夜撹拌した。生成した沈殿を濾別
し、捨てた。水を濾液に加え、この混合物を酢
酸エチルで抽出した。有機相を一度水で洗浄
し、分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた
後、濾過し、真空中で蒸発乾固させた。残査を
アセトン−ヘキサン混合溶媒で結晶化すると目
的の結合体が得られた。融点126℃ 実施例 ５ 標識物質として酵素基質（部分変形ウンベリフ
エロン）を用いたコルチゾールの特定結合分析 本実施例に於いて用いた特定結合分析系は次の
反応に基づいている。 コルチゾール−ウンベリフエロン結合体エステラー
ゼ ―――――――→ H2O，pH8.5ウンベリフエロン 各々全体量が２mlで、各々PH8.5の0.1Mビスヒ
ドロキシエチルグリシン塩酸塩緩衝液及び第６表
に示した濃度のコルチゾールを含有する８種類の
特定結合反応混合物を調製した。８種の反応混合
物の７種、即ち第11表の２−８に、他の反応混合
物即ち反応混合物１のエステラーゼ触媒反応速度
を70％阻害するのに充分な量のコルチゾールの抗
血清を加えた。 混合した後、2μMのコルチゾール−ウンベリ
フエロン結合体（実施例４で得たもの）を溶かし
た20μのPH8.5の0.1Mビスヒドロキシエチルグ
リシン塩酸塩緩衝液を各反応混合物に加えた。更
に混合した後、15μの豚のエステラーゼ（0.81
単位／ml）を各反応混合物に加えた。得られた反
応速度を各反応混合物について実施例２に記述し
た方法と同様な方法で測定した。得られた結果を
第11表に示す。
【表】
【表】
本実施例には、反応速度は反応混合物中のコル
チゾールの量の直接の関数であることが示されて
いる。従つて本発明によれば、液体中のコルチゾ
ールの存在を測定するための、競合結合−蛍光分
析技術を利用する試験用の試薬と方法が提供され
る。 実施例 ６ ゲンタマイシンの分析 Ａ グリコン−染料−抗原複合体の調製 グリコン−染料−抗原複合体を調製するため
の反応経路を次の表に示す。 ３−カルボエトキシ−７−ヒドロキシクマリ
ン（）は、J.Am.Chem.Soc.、63：3452
（1971）に記載されているように酢酸、ベンゼ
ン及びピペリジン中で、２，４−ジヒドロキシ
−ベンズアルデヒド（Aldrich Chemical Co.、
ミルウオーキー、イスコンシン州、U.S.A.）
をマロン酸ジエチルとクノフナーゲル
（Knoevenagel）縮合せしめることによつて調
製された。β−〔７−（３−カルボキシクマリン
オキシ）〕−Ｄ−ガラクトシドのカリウム塩
（）は、Clin.Chim.Acta12：647（1965）にお
いてリーバツク（Leaback）により、メチルウ
ンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシドの調製
について記載されているように３−カルボエト
キシ−７−ヒドロキシクマリン（）と２，
３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−ガラク
トシル−ブロミド（Ｉ、シグマ・ケミカル社、
セントルイス、ミズリー州、U.S.A.）とを反
応させることにより調製した。この化合物のカ
リウム塩はｎ−ブタノール／メタノール／水
（容量比４／２／１）とメタノール／水（１／
６）とのグラジエントを用いてシリカゲル60
（Silica gel−60）（E.Merck、セントルイス、
ミズリー州、U.S.A.）上でグラマトグラフイ
ーにかけることによつて精製した。アセトン−
氷から再結晶したのち、修正された融点は258
〜263℃（分解）であつた。元素分析： 計算値（C16H15O10Kとしての） Ｃ：47.28％、Ｈ：3.73％、Ｋ：9.62％ 実測値 Ｃ：47.28％、Ｈ：3.74％、Ｋ：9.34％ 施光度 〔α〕D20＝−77.40（１ｇ・H2O） NMR（ 2H2O）、δ：8.2（ｓ、1H） 7.6（ｍ、1H） 7.0（ｍ、2H） 5.1（ｓ、1H） 及び4.0（ｍ、6H） 赤外線分析（KBr）：炭素−酸素二重結合及び
炭素−炭素二重結合を示した（1705及び1620
cm-1） β−ガラクトシル−ウンベリフエロン−シソ
マイシン（）を、２mlの水中でβ−〔７−（３
−カルボキシクマリンオキシ）〕−Ｄ−ガラクト
シドのカリウム塩（）50mg（117μmol）を硫
酸シソマイシン171mg（シソマイシンの遊離塩
基として223μmol、Schering Corp.、ブルーム
フイールド、ニユージヤージー州、U.S.A.）
と反応させることにより調製した。PHは、1M
のHClを滴下することによつて3.8に調整した。
溶液を氷浴上で冷却し、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
塩酸塩（Pierce Chemical Co.、ロツクフオル
ド、イリノイ州、U.S.A.）30mg（150μmol）を
加えた。２時間後、混合物を、25℃でCM−
Sephadex Ｃ−25（Phermacia Laboratories
Inc.、ピスカタウエイ、ニユージヤージー州、
U.S.A.）の2.5×50cmカラム上でクロマトグラ
フイーにかけた。5.8mlづつの画分を集め、そ
れらの345nｍにおける吸光度を監視した。カ
ラムを50ｍmol／ギ酸アンモニウム200mlで
洗い未反応のβ−〔７−（３−カルボキシクマリ
ンオキシ）〕−Ｄ−ガラクトシド（）を溶出せ
しめた。50ｍmol／ギ酸アンモニウム400ml
と1.8mol／ギ酸アンモニウムの直線勾配
（グラジエント）の溶離液をカラムに流した。
345nｍで吸収のピークを示す物質は約
1.4mol／ギ酸アンモニウムのところで溶出
した。345nｍで吸収を示す３個のピークをこ
の洗浄において溶出した。溶離した未反応のシ
ソマイシンは、最後の345nｍ吸収ピークから
うまく分離された。 カルボジイミドによつて活性化された反応に
より、β−〔７−（３−カルボキシクマリンオキ
シ）〕−ガラクトシド及びシソマイシンの第一級
アミノ基との間にアミド結合が形成される。β
−ガラクトシル−ウンベリフエロン−シソマイ
シンの主ピーク（最後の345nｍ吸収ピーク）
が本研究のために使用された。ギ酸アンモニウ
ムは凍結乾燥によつて除去された。単離された
標識複合体の吸光係数は、現在未だ判つていな
いので、相対濃度をA345単位で表した。1A345
単位は１cmの光路長で測定したときに345nｍ
で1.0の吸光度を示す、１ml溶液に含まれる物
質の量である。 Ｂ 試験操作法−速度試験 試験法の原理は第７図に摸式的に示されてい
る。 50ｍmol／ Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロ
キシエチル）−グリシン（Bicine）緩衝液（PH
8.2、Nutritional Biochemicals Corp.、クリ
ーブランド、オハイオ州、U.S.A.）中で調製
された試薬は、β−ガラクトシダーゼ（25nｇ
蛋白／ml、エツシユリヒア−コリから得られた
酵素、等級、シグマ・ケミカル社製）及びゲ
ンタマイシンに対する抗血清（Nature New
Biol.239：214（1972）に記載の方法で調製、抗
体が存在しない場合の速度の20〜30％に、最終
の試薬における反応速度を減少せしめるに充分
な量）を含んでいた。酵素の１単位（Ｕ）は、
37℃、PH7.2で１分間当りβ−ニトロフエニル
−β−Ｄ−ガラクトシド1μmolを加水分解する
量であると定義された。使用された酵素製剤は
蛋白１mg当り745Uの比活性を有していた。 キユベツトに入れた試薬2.0mlに対して1μ
の標準血清又は未知試料を入れた。混合したの
ち、上記Ａにおいて調製された標識複合体の水
溶液（１ml当り0.125A345）5μを各キユベツ
トに加え、蛍光の増大の割合をそれぞれ２〜３
分間モニターした。すべての溶液は、氷浴に保
持した標識複合体以外は、25℃に保つた。 Ｃ 結果−速度試験 標識複合体であるβ−ガラクトシル−ウンベ
リフエロン−シソマイシンの吸収スペクトルは
345nｍに最大吸光度を示した。この複合体を
細菌由来のβ−ガラクトシダーゼで加水分解し
てガラクトース部分を除くと、345nｍにおけ
る吸光度は減少し、402nｍに新たな極大吸収
が現れた。酵素処理した複合体の吸光度は、未
処理の複合体の吸光度の1.46倍であつた。 複合体の蛍光スペクトルの解析をしたところ
最大吸収波長の同様の移動が見られた。酵素処
理の前では、複合体は励起及び発光極大値の波
長を、それぞれ350nｍ及び394nｍに示した。
β−ガラクトシダーゼで加水分解したのちに
は、蛍光が15倍増大し、新たな励起及び発光極
大吸収がそれぞれ409nｍ及び445nｍに現れた。
したがつて、蛍光分析条件下（励起光及び発光
光波長400及び453nｍ）では、未反応複合体
は、無視しうる程度の蛍光しか示さなかつた。
ここで述べるすべての分析においては、蛍光光
度測定に用いた励起光及び発光光の波長は、そ
れぞれ、約400及び450nｍであつた。 標識複合体がβ−ガラクトシダーゼの基質と
して働く能力に対するゲンタマイシンに対する
抗血清の効果を調べた。種々の量の抗血清を緩
衝化されたβ−ガラクトシダーゼ2.0mlに加え
た。標識複合体を加えストリツプ−チヤート記
録計に連結したアミンコ−バウマン・スペクト
ロフルオロメータ（Aminco−Bowman
Spectrofuiorometer）を用いて反応速度を測
定した。反応速度は１分間当りの記録計の単位
（recorder units／分）で表した。抗血清の量
が増加するに従つて、第８図に示すように反応
速度は低下した。この実験に基づいて、反応速
度を70〜80％抑制せしめるに充分な抗血清の量
を競争的結合反応のために選択した。抗体と複
合体間の反応は、これらの試薬を混合するに要
する時間で完了するように思われる。なぜな
ら、酵素加える前に複合体を抗体とインキユベ
ートしても結果は変わらなかつたからである。 標準曲線のために、ゲンタマイシン標準試料
を正常ヒト血清中０〜14μｇ／ml（mg／）と
なるように調製し、上記Ｂに述べたようにして
分析した。第９図は、標準血清中のゲンタマイ
シン濃度に関する反応速度の標準曲線を示す。
反応速度は、標準中に抗原（ゲンタマイシン）
が低い場合の蛍光を差し引いて、抗血清が無い
場合の最大反応速度の百分率として各標準につ
いて計算した。緩衝液中で調製された標準試料
でも血清中で調製された標準試料でも差はなか
つた。標識複合体を加える前の、抗体／酵素試
薬による標準試料のインキユベーシヨン時間を
0.25〜60分と変化させても標準曲線に変化はな
かつた。しかがつて、分析は試薬を混合する時
間で迅速に行うことができる。 Ｄ 分析操作−固定時間分析 試薬を、ゲンタマイシンに対する抗血清
140μ（上記Ｂにおいて調製、最終試薬にお
ける最大反応速度を75％抑制する）を
0.05MBicine緩衝液、PH8.2 40mlに加えること
によつて調製した。キユベツト中のこの試薬
2.0μに対して標準血清7.5μづつを加えた。
混合したのち、上記Ａで調製した標識複合体の
水溶液（１ml当り0.013A345単位）40μを各キ
ユベツトに加えた。さらに混合を行つたのち、
β−ガラクトシダーゼ溶液（21U／μ）の
30μを各キユベツトに加え、溶液を再び混合
した。室温で20分後、各キユベツトに生じた蛍
光をフルオロメータ（fluorometer、蛍光光度
計）で測定し、装置の読みで表した。 Ｅ 結果−固定化時間分析 既知濃度のゲンタマイシンを含む種々の標準
試料を上述の方法によつて試験することによつ
て得られた標準曲線を第１０図に示す。 実施例 ７ シソマイシンの分析 Ａ グリコン−染料−抗原複合体の調製 本実施例で用いた標識複合体は、実施例６の
Ａに従つて調製した。 Ｂ 分析操作 試薬は、ゲンタマイシンに対する抗血清
170μ（実施例１のＢで調製、最終試薬の最
大反応速度を90％抑制する）及び0.6mg／ml
β−ガラクトシダーゼ（6U）150μを50ｍＭ
Bicine緩衝液200mlに添加することによつて
調製した。キユベツト中のこの試薬2.0mlに対
しシソマイシン標準水溶液を20μづつ加え
た。混合後、標識複合体の水溶液（上記Ａにて
調製、１ml当り0.032A345単位）20μを各キユ
ベツトに加えた。蛍光は、Aminco−Bowman
の蛍光光度計で測定し、反応速度は実施例１の
Ｃにおけるようにして各標準試料について計算
した。 Ｃ 結果 シソマイシンの種々の標準試料を上述の方法
によつて試験することによつて得られた標準曲
線を第１１図に示す。
チゾールの量の直接の関数であることが示されて
いる。従つて本発明によれば、液体中のコルチゾ
ールの存在を測定するための、競合結合−蛍光分
析技術を利用する試験用の試薬と方法が提供され
る。 実施例 ６ ゲンタマイシンの分析 Ａ グリコン−染料−抗原複合体の調製 グリコン−染料−抗原複合体を調製するため
の反応経路を次の表に示す。 ３−カルボエトキシ−７−ヒドロキシクマリ
ン（）は、J.Am.Chem.Soc.、63：3452
（1971）に記載されているように酢酸、ベンゼ
ン及びピペリジン中で、２，４−ジヒドロキシ
−ベンズアルデヒド（Aldrich Chemical Co.、
ミルウオーキー、イスコンシン州、U.S.A.）
をマロン酸ジエチルとクノフナーゲル
（Knoevenagel）縮合せしめることによつて調
製された。β−〔７−（３−カルボキシクマリン
オキシ）〕−Ｄ−ガラクトシドのカリウム塩
（）は、Clin.Chim.Acta12：647（1965）にお
いてリーバツク（Leaback）により、メチルウ
ンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシドの調製
について記載されているように３−カルボエト
キシ−７−ヒドロキシクマリン（）と２，
３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−ガラク
トシル−ブロミド（Ｉ、シグマ・ケミカル社、
セントルイス、ミズリー州、U.S.A.）とを反
応させることにより調製した。この化合物のカ
リウム塩はｎ−ブタノール／メタノール／水
（容量比４／２／１）とメタノール／水（１／
６）とのグラジエントを用いてシリカゲル60
（Silica gel−60）（E.Merck、セントルイス、
ミズリー州、U.S.A.）上でグラマトグラフイ
ーにかけることによつて精製した。アセトン−
氷から再結晶したのち、修正された融点は258
〜263℃（分解）であつた。元素分析： 計算値（C16H15O10Kとしての） Ｃ：47.28％、Ｈ：3.73％、Ｋ：9.62％ 実測値 Ｃ：47.28％、Ｈ：3.74％、Ｋ：9.34％ 施光度 〔α〕D20＝−77.40（１ｇ・H2O） NMR（ 2H2O）、δ：8.2（ｓ、1H） 7.6（ｍ、1H） 7.0（ｍ、2H） 5.1（ｓ、1H） 及び4.0（ｍ、6H） 赤外線分析（KBr）：炭素−酸素二重結合及び
炭素−炭素二重結合を示した（1705及び1620
cm-1） β−ガラクトシル−ウンベリフエロン−シソ
マイシン（）を、２mlの水中でβ−〔７−（３
−カルボキシクマリンオキシ）〕−Ｄ−ガラクト
シドのカリウム塩（）50mg（117μmol）を硫
酸シソマイシン171mg（シソマイシンの遊離塩
基として223μmol、Schering Corp.、ブルーム
フイールド、ニユージヤージー州、U.S.A.）
と反応させることにより調製した。PHは、1M
のHClを滴下することによつて3.8に調整した。
溶液を氷浴上で冷却し、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
塩酸塩（Pierce Chemical Co.、ロツクフオル
ド、イリノイ州、U.S.A.）30mg（150μmol）を
加えた。２時間後、混合物を、25℃でCM−
Sephadex Ｃ−25（Phermacia Laboratories
Inc.、ピスカタウエイ、ニユージヤージー州、
U.S.A.）の2.5×50cmカラム上でクロマトグラ
フイーにかけた。5.8mlづつの画分を集め、そ
れらの345nｍにおける吸光度を監視した。カ
ラムを50ｍmol／ギ酸アンモニウム200mlで
洗い未反応のβ−〔７−（３−カルボキシクマリ
ンオキシ）〕−Ｄ−ガラクトシド（）を溶出せ
しめた。50ｍmol／ギ酸アンモニウム400ml
と1.8mol／ギ酸アンモニウムの直線勾配
（グラジエント）の溶離液をカラムに流した。
345nｍで吸収のピークを示す物質は約
1.4mol／ギ酸アンモニウムのところで溶出
した。345nｍで吸収を示す３個のピークをこ
の洗浄において溶出した。溶離した未反応のシ
ソマイシンは、最後の345nｍ吸収ピークから
うまく分離された。 カルボジイミドによつて活性化された反応に
より、β−〔７−（３−カルボキシクマリンオキ
シ）〕−ガラクトシド及びシソマイシンの第一級
アミノ基との間にアミド結合が形成される。β
−ガラクトシル−ウンベリフエロン−シソマイ
シンの主ピーク（最後の345nｍ吸収ピーク）
が本研究のために使用された。ギ酸アンモニウ
ムは凍結乾燥によつて除去された。単離された
標識複合体の吸光係数は、現在未だ判つていな
いので、相対濃度をA345単位で表した。1A345
単位は１cmの光路長で測定したときに345nｍ
で1.0の吸光度を示す、１ml溶液に含まれる物
質の量である。 Ｂ 試験操作法−速度試験 試験法の原理は第７図に摸式的に示されてい
る。 50ｍmol／ Ｎ，Ｎ−ビス−（２−ヒドロ
キシエチル）−グリシン（Bicine）緩衝液（PH
8.2、Nutritional Biochemicals Corp.、クリ
ーブランド、オハイオ州、U.S.A.）中で調製
された試薬は、β−ガラクトシダーゼ（25nｇ
蛋白／ml、エツシユリヒア−コリから得られた
酵素、等級、シグマ・ケミカル社製）及びゲ
ンタマイシンに対する抗血清（Nature New
Biol.239：214（1972）に記載の方法で調製、抗
体が存在しない場合の速度の20〜30％に、最終
の試薬における反応速度を減少せしめるに充分
な量）を含んでいた。酵素の１単位（Ｕ）は、
37℃、PH7.2で１分間当りβ−ニトロフエニル
−β−Ｄ−ガラクトシド1μmolを加水分解する
量であると定義された。使用された酵素製剤は
蛋白１mg当り745Uの比活性を有していた。 キユベツトに入れた試薬2.0mlに対して1μ
の標準血清又は未知試料を入れた。混合したの
ち、上記Ａにおいて調製された標識複合体の水
溶液（１ml当り0.125A345）5μを各キユベツ
トに加え、蛍光の増大の割合をそれぞれ２〜３
分間モニターした。すべての溶液は、氷浴に保
持した標識複合体以外は、25℃に保つた。 Ｃ 結果−速度試験 標識複合体であるβ−ガラクトシル−ウンベ
リフエロン−シソマイシンの吸収スペクトルは
345nｍに最大吸光度を示した。この複合体を
細菌由来のβ−ガラクトシダーゼで加水分解し
てガラクトース部分を除くと、345nｍにおけ
る吸光度は減少し、402nｍに新たな極大吸収
が現れた。酵素処理した複合体の吸光度は、未
処理の複合体の吸光度の1.46倍であつた。 複合体の蛍光スペクトルの解析をしたところ
最大吸収波長の同様の移動が見られた。酵素処
理の前では、複合体は励起及び発光極大値の波
長を、それぞれ350nｍ及び394nｍに示した。
β−ガラクトシダーゼで加水分解したのちに
は、蛍光が15倍増大し、新たな励起及び発光極
大吸収がそれぞれ409nｍ及び445nｍに現れた。
したがつて、蛍光分析条件下（励起光及び発光
光波長400及び453nｍ）では、未反応複合体
は、無視しうる程度の蛍光しか示さなかつた。
ここで述べるすべての分析においては、蛍光光
度測定に用いた励起光及び発光光の波長は、そ
れぞれ、約400及び450nｍであつた。 標識複合体がβ−ガラクトシダーゼの基質と
して働く能力に対するゲンタマイシンに対する
抗血清の効果を調べた。種々の量の抗血清を緩
衝化されたβ−ガラクトシダーゼ2.0mlに加え
た。標識複合体を加えストリツプ−チヤート記
録計に連結したアミンコ−バウマン・スペクト
ロフルオロメータ（Aminco−Bowman
Spectrofuiorometer）を用いて反応速度を測
定した。反応速度は１分間当りの記録計の単位
（recorder units／分）で表した。抗血清の量
が増加するに従つて、第８図に示すように反応
速度は低下した。この実験に基づいて、反応速
度を70〜80％抑制せしめるに充分な抗血清の量
を競争的結合反応のために選択した。抗体と複
合体間の反応は、これらの試薬を混合するに要
する時間で完了するように思われる。なぜな
ら、酵素加える前に複合体を抗体とインキユベ
ートしても結果は変わらなかつたからである。 標準曲線のために、ゲンタマイシン標準試料
を正常ヒト血清中０〜14μｇ／ml（mg／）と
なるように調製し、上記Ｂに述べたようにして
分析した。第９図は、標準血清中のゲンタマイ
シン濃度に関する反応速度の標準曲線を示す。
反応速度は、標準中に抗原（ゲンタマイシン）
が低い場合の蛍光を差し引いて、抗血清が無い
場合の最大反応速度の百分率として各標準につ
いて計算した。緩衝液中で調製された標準試料
でも血清中で調製された標準試料でも差はなか
つた。標識複合体を加える前の、抗体／酵素試
薬による標準試料のインキユベーシヨン時間を
0.25〜60分と変化させても標準曲線に変化はな
かつた。しかがつて、分析は試薬を混合する時
間で迅速に行うことができる。 Ｄ 分析操作−固定時間分析 試薬を、ゲンタマイシンに対する抗血清
140μ（上記Ｂにおいて調製、最終試薬にお
ける最大反応速度を75％抑制する）を
0.05MBicine緩衝液、PH8.2 40mlに加えること
によつて調製した。キユベツト中のこの試薬
2.0μに対して標準血清7.5μづつを加えた。
混合したのち、上記Ａで調製した標識複合体の
水溶液（１ml当り0.013A345単位）40μを各キ
ユベツトに加えた。さらに混合を行つたのち、
β−ガラクトシダーゼ溶液（21U／μ）の
30μを各キユベツトに加え、溶液を再び混合
した。室温で20分後、各キユベツトに生じた蛍
光をフルオロメータ（fluorometer、蛍光光度
計）で測定し、装置の読みで表した。 Ｅ 結果−固定化時間分析 既知濃度のゲンタマイシンを含む種々の標準
試料を上述の方法によつて試験することによつ
て得られた標準曲線を第１０図に示す。 実施例 ７ シソマイシンの分析 Ａ グリコン−染料−抗原複合体の調製 本実施例で用いた標識複合体は、実施例６の
Ａに従つて調製した。 Ｂ 分析操作 試薬は、ゲンタマイシンに対する抗血清
170μ（実施例１のＢで調製、最終試薬の最
大反応速度を90％抑制する）及び0.6mg／ml
β−ガラクトシダーゼ（6U）150μを50ｍＭ
Bicine緩衝液200mlに添加することによつて
調製した。キユベツト中のこの試薬2.0mlに対
しシソマイシン標準水溶液を20μづつ加え
た。混合後、標識複合体の水溶液（上記Ａにて
調製、１ml当り0.032A345単位）20μを各キユ
ベツトに加えた。蛍光は、Aminco−Bowman
の蛍光光度計で測定し、反応速度は実施例１の
Ｃにおけるようにして各標準試料について計算
した。 Ｃ 結果 シソマイシンの種々の標準試料を上述の方法
によつて試験することによつて得られた標準曲
線を第１１図に示す。
第１図は、直接結合−循環分析技術に於ける全
反応速度に対する対象物質（リガンド）の量を変
動させた場合の影響をグラフによつて示すもので
ある。第２及び３図は各々、競合結合−循環分析
技術に於ける全反応速度に対する異なつた二種の
対象物質の量を変動させた場合の影響をグラフに
よつて示すものである。第４図は、直接結合−蛍
光分析技術に於ける異なつた二種の反応、即ち一
方は酵素触媒を用い他はそうでないもの、の正味
の反応速度に対する対象物質の量を変動させた場
合の影響をグラフによつて示すものである。第５
及び６図は各々、異なつた二種の競合結合分析技
術、即ち一方は蛍光監視検出反応を用い、他は分
光測定監視検出反応を用いるもの、に於ける反応
速度に対する対象物質の量を変動させた場合の影
響をグラフによつて示すものである。第７図は、
実施例６及び７に関連する抗原（ハプテン）免疫
分析の原理を示す模式図である。第８図は、実施
例６における、抗血清による酵素反応の抑制を示
す。第９図及び第１０図は、実施例６に関連する
それぞれ、速度試験法及び固定化時間分析法によ
るゲンタマイシン分析用標準曲線を示す。第１１
図は、実施例７に関連するシソマイシン分析用標
準曲線を示す。
反応速度に対する対象物質（リガンド）の量を変
動させた場合の影響をグラフによつて示すもので
ある。第２及び３図は各々、競合結合−循環分析
技術に於ける全反応速度に対する異なつた二種の
対象物質の量を変動させた場合の影響をグラフに
よつて示すものである。第４図は、直接結合−蛍
光分析技術に於ける異なつた二種の反応、即ち一
方は酵素触媒を用い他はそうでないもの、の正味
の反応速度に対する対象物質の量を変動させた場
合の影響をグラフによつて示すものである。第５
及び６図は各々、異なつた二種の競合結合分析技
術、即ち一方は蛍光監視検出反応を用い、他は分
光測定監視検出反応を用いるもの、に於ける反応
速度に対する対象物質の量を変動させた場合の影
響をグラフによつて示すものである。第７図は、
実施例６及び７に関連する抗原（ハプテン）免疫
分析の原理を示す模式図である。第８図は、実施
例６における、抗血清による酵素反応の抑制を示
す。第９図及び第１０図は、実施例６に関連する
それぞれ、速度試験法及び固定化時間分析法によ
るゲンタマイシン分析用標準曲線を示す。第１１
図は、実施例７に関連するシソマイシン分析用標
準曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 液体中のハプテン又は抗原を分析するため
の： (a) 液体を、 (1) 予め定められた特性を有する標識物質とハ
プテン又は抗原との結合体、及び (2) 標識化された結合体の抗体−束縛相及び抗
体−遊離相を生成する、ハプテン又は抗原に
対する抗体 からなる試薬と接触させる工程；及び (b) 束縛相と遊離相を分離することなく、液体中
のハプテン又は抗原の指標としての特性を測定
する工程 からなる均一系免疫分析方法であつて、 結合体中の標識物質が、酵素の作用により蛍光
性生成物を触媒反応により生成することのできる
蛍光原基質であることを特徴とする方法。 ２ 液体中のハプテン又は抗原を均一系免疫分析
方法により分析するための： (1) 予め定められた特性を有する標識物質と、ハ
プテン又は抗原との結合体、及び (2) ハプテン又は抗原に対する抗体 からなる試薬であつて、 試薬とハプテン又は抗原が標識化された結合体
の抗体−束縛相及び抗体−遊離相を生成する結合
反応系を形成し、かつ、束縛相又は遊離相のどち
らかにおける特性が液体中のハプテン又は抗原の
量の関数であつて、 結合体中の標識物質が、酵素の作用により蛍光
性生成物を触媒反応により生成することのできる
蛍光原基質であることを特徴とする試薬。 ３ 担体マトリツクス中に包含されてなる特許請
求の範囲第２項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US57200875A | 1975-04-28 | 1975-04-28 | |
| US572008 | 1975-04-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5942453A JPS5942453A (ja) | 1984-03-09 |
| JPH0137693B2 true JPH0137693B2 (ja) | 1989-08-09 |
Family
ID=24285954
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51047347A Expired JPS604939B2 (ja) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | 液体中のハプテンヌは抗原を分析するための均一系免疫分析方法及びそれに用いる試薬 |
| JP51047348A Expired JPS6052378B2 (ja) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 |
| JP58122466A Granted JPS5951354A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 |
| JP58122463A Granted JPS5942453A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための均一系免疫分析方法及び試薬 |
| JP58122465A Granted JPS5951353A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 |
| JP58122464A Granted JPS5942454A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための均一系免疫分析方法及び試薬 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51047347A Expired JPS604939B2 (ja) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | 液体中のハプテンヌは抗原を分析するための均一系免疫分析方法及びそれに用いる試薬 |
| JP51047348A Expired JPS6052378B2 (ja) | 1975-04-28 | 1976-04-27 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 |
| JP58122466A Granted JPS5951354A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58122465A Granted JPS5951353A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための不均一系免疫分析方法及び試薬 |
| JP58122464A Granted JPS5942454A (ja) | 1975-04-28 | 1983-07-07 | 液体中のハプテン又は抗原を分析するための均一系免疫分析方法及び試薬 |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (6) | JPS604939B2 (ja) |
| AT (1) | AT357685B (ja) |
| AU (2) | AU502726B2 (ja) |
| BE (1) | BE841179A (ja) |
| BR (1) | BR7602561A (ja) |
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| DD (1) | DD125231A5 (ja) |
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Families Citing this family (54)
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|---|---|---|---|---|
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