JPH06279292A - 生理活性を有するグリコーゲンの製法及び生理活性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目 的】 グリコーゲンを生理活性を保持した状態で
抽出し、さらに得られたグリコーゲンの抗腫瘍剤として
の用法。 【構 成】 グリコーゲンの抽出をタンパク質分解酵素
を用いて行うことにより生理活性を保持した状態での抽
出が可能となる。更に、この方法により抽出されたグリ
コーゲンをガン患者に投与しガンを治癒させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はグリコーゲンを有効成分
とする抗腫瘍剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】医学、薬学分野の高度に発達した現代に
おいても、ガンは人類の死亡原因の第一位の座を一向に
譲ろうとはしていない。そのため、ガン治療に関する研
究は猶も各分野において盛んに行われているところであ
る。その結果、数多くの生命を救うことのできた有効な
薬剤、療法が生み出されたことは言うまでもない。特に
化学療法剤については、その数たるや知る術もないほど
である。しかしながら、従来の薬剤は、その物質自体の
持つ毒性或いはその物質が薬剤として作用するための機
序故に引き起こされる副作用、或いは、有効症例に関す
る範囲の狭さ故に決定的なところを欠いているものであ
る。そのため、目下、低毒性、ワイドスペクトルの薬剤
が望まれているものである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は前記の欠点を除き、タンパク質分解酵素等を用いて得
られたグリコーゲンをガン患者に投与することにより、
安全且つ効率的にガンを治癒させる用法を提供すること
にある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、通常食用
に供されているホタテ、アワビ、カキ等の貝類に多く含
まれ、更に、動物のエネルギー源としてたいへん重要な
役割を果たしているグリコーゲンを、タンパク質分解酵
素を用いることにより抽出し、且つその得られたグリコ
ーゲンの抗腫瘍活性に関する研究を行った結果、強い抗
腫瘍活性があることを見いだした。本物質には細胞毒性
が見られないことより、従来の細胞毒性を有する抗腫瘍
剤とは作用機序が異なり、免疫機構、つまり、生体の本
来持つべき自己防御機構を活性化することにより腫瘍細
胞に対する抵抗性を高め、その結果腫瘍細胞の増殖を抑
制し、更には治癒してしまうと考えられる。

【０００５】本発明においては、以上のような性質を有
するタンパク質分解酵素により処理することにより得ら
れるグリコーゲンを、高活性、且つ極めて安全性の高い
画期的な抗腫瘍剤としてガン治療に用いようとするもの
である。

【０００６】グリコーゲンはデンプン、アミロペクチン
と同様にＤ−グルコースより構成される多糖であり、Ｄ
−グルコースが、アルファ１−４結合でグリコシド結合
した主鎖中の数カ所にアルファ１−６結合でＤ−グルコ
ースがグリコシド結合し、さらにそのＤ−グルコースに
Ｄ−グルコースが、アルファ１−４結合でグリコシド結
合した側鎖を有する、樹枝状の複雑な構造を取っている
ことを特徴とするものである。グリコーゲンは動物にお
いては肝臓で生合成され一般にエネルギーの貯蔵、代謝
に関与するたいへん重要な化合物である。また、食品に
おいては、魚介類、特にホタテ、カキ、アワビ等貝類の
うま味の中心を成す物質でもある。従って、本発明にお
いて用いるグリコーゲンの起源は多種に亙り、容易に大
量且つ安価に入手可能なものと考えられる。

【０００７】上記の如く、グリコーゲンは、古くより周
知の物質であるが、抗腫瘍剤として利用されている例は
ない。従来、グリコーゲンは強アルカリ或いは強酸を用
いることにより抽出、構造研究が行なわれ、標品として
利用且つ供給されてきた。しかし、この抽出条件による
と生体内で存在していた状態であるところの微細な分岐
構造が失われてしまっている。

【０００８】そこで本発明においてはこの化学的に過酷
な条件で抽出する従来の方法に代わり、タンパク質分解
酵素を用いることにより生体内での機能を保持した状態
での抽出を可能ならしめることに成功した。すなわち、
従来、強アルカリ、或いは強酸により処理することによ
り除去していたタンパク質などの夾雑物質を、タンパク
質分解酵素を用いるという温和な条件により可能成らし
めた。本発明においてグリコーゲンの抽出にはタンパク
質分解酵素として、好ましくはプロナーゼ、トリプシ
ン、パパインを用いる。グリコーゲンの抽出には、グリ
コーゲンが含まれていると考えられる試料を必要に応じ
てアセトン或いはエタノール等の親水性有機溶剤と共に
攪拌或いはホモジナイズすることにより脱脂乾燥して用
いる。或は試料を冷水、熱水、各種緩衝液等中に浸漬、
或いは攪拌することにより得られる抽出液を、透析、限
外濾過、電気透析等により脱塩し用いる。上記処理を施
した試料をトリス塩酸緩衝液などの、使用する酵素に至
適の水素イオン濃度に調整した溶液に溶解し、酵素を添
加作用させ、遠心分離後上清に、アルコール等、好まし
くはエタノールを加えることにより、グリコーゲンをほ
ぼ純粋な状態で抽出することが可能である。更に精製す
るためにはゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、或
いは高速液体クロマトグラフィを用いることにより可能
である。抗腫瘍効果は上記粗抽出物の状態でも期待でき
るが、好ましくはゲル濾過及び陰イオン交換クロマトグ
ラフィにより高度に精製した状態により効率的且つ高い
効果が得られる。グリコーゲンは白色の粉末として得ら
れ乾燥した状態では変質することもなく、且つ熱水或は
高温の蒸気による抽出によっても活性が保持されること
より、熱安定性が極めて高いこどが確認され、長期の保
存が可能である。粗グリコーゲン及び精製されたグリコ
ーゲンは共に水及び各種緩衝液に易溶であるが、完全に
透明な溶液とは成らず濾別不可能な白色のコロイド状粒
子により微かに白色を呈した溶液となる。

【０００９】本発明の方法によって抽出分離精製された
グリコーゲンの性質は次のとおりである。

【００１０】「平均分子量」図１の画分Ａ、Ｂおよび従
来法であるトリクロロ酢酸を用いホタテ貝閉殻筋より抽
出されたグリコーゲンをセファロース ＣＬ−２Ｂゲル
（商品名、ファルマシア社製）を用いたゲルカラムクト
マトグラフィにより分子量の比較を行った結果、本発明
の方法により得られたグリコーゲンはトリクロロ酢酸に
より抽出されたグリコーゲンよりも平均分子量が大き
く、１０万以上であった（図２）。

【００１１】「ベーターアミラーゼ限界分解率」ベータ
ーアミラーゼによる限界分解率はトリクロロ酢酸抽出グ
リコーゲンでは３３％であったのに対し、本発明の方法
により得られたグリコーゲンは２０％以下であった。

【００１２】「単位平均鎖長」イソアミラーゼ処理後、
全糖量を還元末端糖量で除することによって、単位平均
鎖長を求めた結果、トリクロロ酢酸抽出グリコーゲンで
は９．３であったのに対し、本発明の方法により得られ
たグリコーゲンは７．０であった。

【００１３】「プロトンＮＭＲ」図３に示した。

【００１４】「化学成分分析値」表１に示した。

【表１】

【００１５】グリコーゲンを用いた腫瘍に対する治療法
としては、グリコーゲンを水、生理食塩水、或いは各種
塩溶液に溶解の後、病巣部に直接注射による投与、静脈
投与等が可能である。また、本来生体内に存在する物質
であるため、毒性は無く、従って、その病状によりその
投与量を広い範囲でコントロールし得る。本発明におい
てこの抗腫瘍活性を以下の方法により確認することがで
きた。即ち、マウスの腹腔内に腫瘍細胞を移植し、この
マウスにグリコーゲンを生理食塩水に溶解させ投与する
ことにより腫瘍を治癒することができた。この実験にお
いて治癒されたマウスに副作用が観察されなかったこと
より急性毒性はないものと考えられ、腫瘍に対したいへ
ん有望な物質であることを確認し、本発明の完成に至っ
た。

【００１６】この様な特徴を有する抗腫瘍活性多糖とし
てはキノコなどより抽出されたベーター（１，３）
（１，６）−グルガンが有名であるが、本発明における
グリコーゲンは各糖残基間のグリコシド結合が逆のアル
ファ結合を取っており、物質的に全く異なるものであ
る。抗腫瘍活性を示す多糖はこのほかにも幾つか存在す
ることが報告されており（ホイストラーら、アドバンシ
ズ イン カルボハイドレート ケミストリー アンド
バイオケミストリー（Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．
Ｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）３２巻、２３５
〜２７５ページ、１９７６年発行）、これら多糖は、現
在においても、広く使われているが、何れの場合も、本
発明のグリコーゲンとは全く構造の異なる物質である。

【００１７】以下に本発明において行ったグリコーゲン
の製造法、及び、有効画分の投与法の例を更に詳しく説
明する。

【００１８】

【実施例１】（グリコーゲンの抽出）

【００１９】 「抽出例１」（ホタテより熱水による抽出） 生ホタテ貝を沸騰水中に浸漬し１５分間煮沸した。デカ
ンテーション及びガーゼによる瀘過により上澄みを採取
し、減圧下約１０倍に濃縮した。この濃縮抽出液を流水
中にて透析し、脱塩した。この抽出液を凍結乾燥し脱塩
乾燥粉末を得る。脱塩乾燥粉末を２．５ミリモル／リッ
トルの塩化カルシウム含有の５０ミリモル／リットルの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）に溶解し、脱塩乾燥粉
末の１％量のプロナーぜを添加し、５０℃で２４時間処
理した。更に再度、脱塩乾燥粉末の１％量のプロナーゼ
を添加し、５０℃で２４時間処理した。この酵素処理液
を１００℃で５分間処理し、酵素を失活させた後、遠心
分離し、固形分を除去し、塩化ナトリウムを飽和させた
エタノールを３倍の体積加え、４℃にて放置することに
より、粗グリコーゲンが沈殿した。遠心分離により沈殿
を回収し、乾燥させることにより白色粉末を得た。

【００２０】 「抽出例２」（ホタテより熱蒸気による抽出） 生ホタテ貝に約１２０ないし１３０℃の蒸気にて１５分
間蒸煮した。滴下される凝集液を回収し、減圧下約１３
倍に濃縮した。この濃縮抽出液を流水中にて透析し、脱
塩した。この抽出液を凍結乾燥し脱塩乾燥粉末を得る。
脱塩乾燥粉末を２．５ミリモル／リットルの塩化カルシ
ウム含有の５０ミリモル／リットルのトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．８）に溶解し、脱塩乾燥粉末の１％量のプロ
ナーゼを添加し、５０℃で２４時間処理した。更に再
度、脱塩乾燥粉末の１％量のプロナーゼを添加し、５０
℃で２４時間処理した。この酵素処理液を１００℃で５
分間処理し、酵素を失活させた後、遠心分離し、固形分
を除去し、塩化ナトリウムを飽和させたエタノールを３
倍の体積加え、４℃にて放置することにより、粗グリコ
ーゲンが沈殿した。遠心分離により沈殿を回収し、乾燥
させることにより白色粉末を得た。

【００２１】

【実施例２】（分離精製例） 粗グリコーゲンをセファデックスＧ−２５ゲル（商品
名、ファルマシア社製）カラムにより溶出液として脱い
オン水を用い、精製した。更に、このグリコーゲンの画
分をＤＥＡＥ セファデックス Ａ−２５陰イオン交換
ゲル（商品名、ファルマシア社製）を用いた陰イオン交
換クロマトグラフィにより分画精製した。溶出緩衝液に
は０．１モル／リットルのリン酸緩衝液を用い０〜０．
３モル／リットルの直線濃度勾配法により塩化ナトリウ
ム濃度を変化させることにより分離した。図１にはその
結果を示した。

【００２２】

【実施例３】（生物活性試験） マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，２０〜３０ｇ）腹腟内培養腫瘍
細胞（Ｍｅｔｈ−Ａ）をマウス腹腔内に移植し、２日
目、４日目、６日目に、毎回、マウス１匹あたり２００
μｇ及び５０μｇのグリコーゲンを、０．５ミリリット
ルの生理食塩水に溶解し腹腔内注射により投与した。活
性の判定は、６０日目において腫瘍死しないマウスを治
癒マウスとし治癒率により行った。結果は表２のとおり
であった。

【表２】

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年７月２２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２２

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２２】

【実施例３】（生物活性試験） マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，２０〜３０ｇ）腹腔内培養腫瘍
細胞（Ｍｅｔｈ−Ａ）をマウス腹腔内に移植し、２日
目、４日目、６日目に、毎回、マウス１匹あたり２００
μｇ及び５０μｇのグリコーゲンを、０．５ミリリット
ルの生理食塩水に溶解し腹腔内注射により投与した。活
性の判定は、６０日目において腫瘍死しないマウスを治
癒マウスとし治癒率により行った。結果は表２のとおり
であった。

【表２】 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年４月８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図面の簡単な説明

【補正方法】追加

【補正内容】

【図面の簡単な説明】

【図１】グリコーゲンをＤＥＡＥセファデックスＡ−２
５イオン交換カラムを用い、食塩濃度を０Ｍ、０Ｍから
０．４Ｍの直線濃度勾配法、および２Ｍと変化させ溶出
させた結果、画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅの５つの画分が得
られたことを表す図である。

【図２】グリコーゲンをセファロースＣＬ−２Ｂカラム
に供し溶出させることにより、トリクロロ酢酸を用いて
抽出したグリコーゲンとの分子量の比較を行った結果を
表す図であり、本発明において得られたグリコーゲンは
トリクロロ酢酸を用いて抽出したものに比較し分子量が
大きいことを示す図である。

【図３】図１中の画分Ａ〜Ｅおよびトリクロロ酢酸を用
いて抽出したグリコーゲンの、２７０ＭＨｚ、重水中、
７０゜Ｃの条件下でのプロトンＮＭＲスペクトルを表す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松江 一 青森県青森市大字八ッ役字芦谷202−４ 青森県産業技術開発センター内 (72)発明者 佐々木 甚一 青森県弘前市在府町５ 弘前大学医学部内 (72)発明者 石田 邦夫 青森県弘前市在府町５ 弘前大学医学部内 (72)発明者 一戸 秀隆 青森県青森市大字西田沢字沖津257−10 株式会社青森ともや内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グリコーゲンを有効成分とすることを特
   徴とする抗腫瘍剤
2. 【請求項２】 グリコーゲンが、タンパク質分解酵素を
   用いることによって処理、抽出されたものであることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の抗腫瘍剤