JPH06284900A

JPH06284900A - 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット

Info

Publication number: JPH06284900A
Application number: JP21835992A
Authority: JP
Inventors: Kunio Kawakatsu; 邦夫川勝; Yoshiyuki Amano; 善之天野; Ayumi Obara; 歩美小原
Original assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Current assignee: Sanyo Chemical Industries Ltd
Priority date: 1992-07-08
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 1994-10-11
Anticipated expiration: 2011-09-18
Also published as: JP2535290B2

Abstract

(57)【要約】【目的】過酸化物とベンジジン系発色剤を含有する過
酸化物分解性物質測定用指示薬の性能を向上する。【構成】緩衝液を媒体とし、過酸化物、ベンジジン系
発色剤とともにクラウンエーテルまたは環状オリゴ糖を
配合し、ベンジジン系発色剤を溶解させた過酸化物分解
性物質測定用指示薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法等の分
野に利用され、ペルオキシダーゼなどの過酸化物分解性
物質を測定する目的で使用される、ベンジジン系発色剤
含有指示薬及びこの指示薬を含む試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素免疫測定法、生化学測定法等の分野
においては、水性媒体中に過酸化水素などの過酸化物お
よびベンジジン系発色剤を溶解させた指示薬が知られて
いる。この指示薬は、過酸化物分解性物質やこの物質で
標識された化合物等を測定対象として使用するものであ
り、この過酸化物分解性物質の測定を、この物質と過酸
化物との反応に伴うベンジジン系発色剤の発色により行
うものである。

【０００３】この指示薬に用いられるベンジジン系発色
剤は、以前より用いられているオルトフェニレンジアミ
ン等の発色剤と異なり、低毒性のものが多く、高感度で
あるという利点があるが、水にはわずかしか溶解しな
い。そのため、メタノール、１−メチル−２−ピロリド
ン等の有機溶剤を含む水溶液に、ベンジジン系発色剤を
高濃度溶解させ、使用前に緩衝液等で適当な濃度に希釈
して使用されていた（例えば、特開昭６３−１９９２７
０、特開昭６２−５００８８２、特開昭５９−１６６８
６５、特開昭４９−１３３０９２号公報）。

【０００４】しかしこれらの指示薬は、希釈する前の有
機溶剤が高濃度の時は比較的安定であるのに対し、使用
濃度に希釈した場合には、保存安定性は十分でなく、経
日で発色剤が析出する、感度が低下する、更には、ペル
オキシダーゼ等の過酸化物分解性物質の酸化反応を阻害
するため、ペルオキシダーゼの量に正しく比例した吸光
度が得られず、正確な値を測定することが困難である
等、問題となる点も多かった。

【０００５】一方、有機溶剤を含まない系での使用につ
いては、キレート剤或はβ−シクロデキストリン（β−
ＣＤ）による保存安定性の改良が試みられてきた（例え
ば、特開昭５９−１９３３５４、特開昭６２−５０２１
００、特開昭６３−６１９５３号公報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の系でも、依然、経日での発色剤の析出が認められ、そ
の結果、感度の低下が見られ、かつ過酸化物分解性物
質、特にペルオキシダーゼに正比例した正確な値の測定
も未だ困難であった。これらのことは、正確性を重要な
要素として考える酵素免疫測定等の分析手段において、
その有用性を著しく制限するものである。本発明はベン
ジジン系発色剤を測定用指示薬として使用する際、調製
時の感度が高く、経日的に感度の低下が認められず、更
には過酸化物分解性物質の量に比例した正確な吸光度を
示す指示薬の提供を目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を改善するため鋭意検討した結果、ベンジジン系発色剤
の安定剤として、特定の化合物を用いることにより、調
製時の感度が高く、かつ長期間感度の低下がなく、ま
た、過酸化物分解性物質の量に比例した正確な値を測定
できることを見いだし、本発明に到達した。すなわち本
発明は、下記＜１＞及び＜２＞により構成される。＜１＞水性媒体中に過酸化物（Ａ）及びベンジジン系発
色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解性物質
（Ｃ）の測定を（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う（Ｂ）の
発色により行うことができる指示薬において、更に、ク
ラウンエーテル（Ｄ１）またはＤ−フルクトースがβ−
フラクシド結合した環状オリゴ糖（Ｄ２）を含有するこ
とを特徴とする過酸化物分解性物質測定用指示薬。＜２＞過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識
された化合物を構成品として含む試薬キットにおいて、
少なくとも上記＜１＞記載の指示薬もしくはこの指示薬
の各成分を共に構成品とすることを特徴とする試薬キッ
ト。

【０００８】本発明において、過酸化物（Ａ）として
は、例えば、過酸化水素、無機過酸化物（過ホウ酸ナト
リウム、過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（クメン
ペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシド、ジイソプロピ
ルベンゼンペルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−
２，５−ペルオキシド等）が挙げられる。これらのうち
好ましいものは過酸化水素である。

【０００９】本発明において、ベンジジン系発色剤
（Ｂ）としては、例えば、ベンジジン、核置換ベンジジ
ン、Ｎ，Ｎ’−置換ベンジジン、これらの塩酸塩などの
従来公知の各種ベンジジン系発色剤が挙げられる。
（Ｂ）の具体例としては、ベンジジン、ベンジジン・２
ＨＣｌ、Ｏ−トリジン、Ｏ−トリジン・２ＨＣｌ、Ｏ−
ジアニシジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級アル
キル）ベンジジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級
アルキル）ベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ₂Ｏ、２，７−
ジアミノフルオレンなどが挙げられる。ここで用いる用
語「低級アルキル」は炭素数１〜６のアルキル基（メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル、並びに種
々のブチル、ペンチル及びヘキシル異性体）を意味す
る。以上（Ｂ）として例示したものは２種以上併用して
もよい。これらのうち好ましいのは３，３’，５，５’
−テトラ（低級アルキル）ベンジジンで、特に好ましい
のは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで
ある。これらのベンジジン系発色剤（Ｂ）の調製は、塩
の形のものはそのまま水性媒体中に添加することがで
き、塩の形でないものは少量の有機溶剤に溶解して水性
媒体中に添加し、性能に影響を与えない程度に溶剤を除
去してもよい。

【００１０】本発明において、過酸化物分解性物質
（Ｃ）としては、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ、牛
乳、白血球等から抽出したペルオキシダーゼ）またはカ
タラーゼのような活性酵素、この酵素と同様の作用を現
すヘモグロビン、チトクロームＣ及びそれらの誘導体、
紫外線、有機及び無機金属塩等が挙げられる。これらの
うち好ましいのは、ペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビ
から抽出したペルオキシダーゼである。

【００１１】本発明において（Ｄ１）としては、例えば
ジベンゾ−１８−クラウン−６、ジシクロヘキシル−１
８−クラウン−６、ジベンゾ−２４−クラウン−８、シ
クロヘキシル−１８−クラウン−６、シクロヘキシル−
１５−クラウン−５、ジシクロヘキシル−２４−クラウ
ン−８、ジシクロヘキシル−１４−クラウン−４、１２
−クラウン−４、１５−クラウン−５、１８−クラウン
−６、２１−クラウン−７、２４−クラウン−８、が挙
げられる。これらのうち好ましくは１８−クラウン−６
である。

【００１２】本発明において（Ｄ２）としては、例え
ば、文献［ミシオカワムラ；カルボハイドレートリ
サーチ（Mishio Kawamura;Carbohydrate Research）Vo
l.192,83-90,1989］、特開平２−２５２７０１及び特開
平２−２５５０８５号公報に記載の方法で調製される。
すなわち、重合度が８以上のβ−２，１結合フラクトー
スポリマーに作用してフラクトース６〜８分子からなる
環状オリゴ糖を分子内転移反応により生じさせる酵素
（シクロイヌロ−オリゴサッカライドフラクタノトラン
スフェラーゼ（略称：ＣＦＴase）または該酵素を菌体
外に産生する微生物をイヌリンに作用させることにより
調製することができる。該酵素ＣＦＴaseを産生する微
生物の例としては、バチルス・サーキュランスＭＺ
Ｎｏ．３１がある。これらの環状オリゴ糖（Ｄ２）はＤ
−フルクトースが２〜１０個環状に連結した糖の混合物
であり、このままでも有意の効果を示すが、必要に応じ
てカラムクロマト等の精製手段で単一の組成物を得るこ
とも可能である。

【００１３】本発明において、カチオン界面活性剤
（Ｅ）としては、アミン塩型、第４級アンモニウム塩型
等があり、好ましいのは第４級アンモニウム塩型であ
る。第４級アンモニウム塩型としては塩化ベンザルコニ
ウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ステアリルジメチルベ
ンジルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベンジル
アンモニウム、塩化メチルラウリルジメチルベンジルア
ンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウムなどが
挙げられる。これらのうち特に好ましいのは、塩化ベン
ザルコニウムである。

【００１４】本発明の指示薬を構成する各成分の含有量
について説明する。本発明の指示薬中の過酸化物
（Ａ）、ベンジジン系発色剤（Ｂ）、（Ｄ１）もしくは
（Ｄ２）及びカチオン系界面活性剤（Ｅ）の各濃度は、
測定方法および発色反応を進めるための条件によって最
適濃度が設定されなくてはならない。また、これら
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ１）もしくは（Ｄ２）および
（Ｅ）の相互の濃度のバランスも考慮するとよい。これ
らの前提はあるが、本発明の指示薬中の各成分の含有量
のうち、（Ａ）の含有量は通常０．００５〜５ｍｇ／ｍ
ｌ、好ましくは０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌである。
（Ｂ）については、通常０．０１〜５．０ｍｇ／ｍｌ、
好ましくは０．０３〜１．０ｍｇ／ｍｌである。（Ｄ
１）または（Ｄ２）については通常０．１〜５０ｍｇ／
ｍｌ、好ましくは０．５〜３０ｍｇ／ｍｌである。ま
た、カチオン系界面活性剤（Ｅ）についても特に限定し
ないが通常使用する濃度でよい。具体的には０．０１〜
５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｍｌで
ある。

【００１５】本発明の指示薬を用いた過酸化物分解性物
質（Ｃ）の測定は、酸性サイド（ｐＨ２．５〜６．５）
でおこなわれることが好ましく、特にｐＨ３．０〜５．
５で測定すると安定で良好な感度が得られる。発色反応
の場として用いられる緩衝液は前記のｐＨを満足させる
ものであればどのような種類の緩衝液を用いることも可
能であるが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム
緩衝液、クエン酸二ナトリウム／塩酸緩衝液、クエン酸
二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、コハク酸／
四ホウ酸ナトリウム緩衝液、クエン酸水素カリウム／四
ホウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム／ク
エン酸緩衝液、酢酸ナトリウム／塩酸緩衝液、酢酸／酢
酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。この際、好まし
い緩衝液濃度は０．１〜１００ｍＭ、特に１〜５０ｍＭ
である。

【００１６】本発明の指示薬の調製方法としては、
（Ｂ）を直接添加してもよく、予め他の溶剤等に（Ｂ）
を高濃度に溶解させたものを添加し、溶解後必要に応じ
て溶剤を除去してもよい。これらに上記過酸化物（Ａ）
及び過酸化物分解性物質を添加し、本発明の指示薬を得
るが、特にこれらに限定されるものではない。

【００１７】発色反応を行う際の温度は（Ｃ）の反応に
最も適した温度（ペルオキシダーゼなどの酵素の場合、
通常２０〜５０℃）で実施することが好ましい。

【００１８】測定の対象となる過酸化物分解性物質
（Ｃ）は遊離の状態でも、（Ｃ）により免疫活性物質等
の結合性物質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチン、核酸）が標識された状態で
もよく、この標識物質が更に他の物質と結合後の複合体
の状態であってもよい。

【００１９】本発明の試薬キットは、過酸化物分解性物
質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識された化合物とともに、
少なくとも本発明の指示薬もしくは本発明の指示薬の各
成分を構成品とするものである。ここで言う化合物とし
ては、上記に例示したような免疫活性物質等の結合性物
質を用いることができる。

【００２０】本発明の指示薬は、感度が高く、長期保存
でき、またペルオキシダーゼ等の過酸化物分解性物質の
濃度に比例して正確に測定できることから、このように
本発明の試薬キットの構成品とすることができ、そうす
れば従来のように指示薬の各成分を使用の都度配合しな
くてもよい利点がある。また、本発明の指示薬の各成分
の状態で本発明のキットの構成品とすることもでき、使
用時の配合は必要であるが、それでも感度及び正確性が
向上するなどの利点がある。

【００２１】以下、酵素免疫測定に利用される例とし
て、「酵素標識抗体」及び「本発明の指示薬」を構成品
として含むキットの例を挙げる。試験管、ガラスビー
ズ、プラスチックビーズ、マイクロパーティクル、ナイ
ロン膜、濾紙等の固相担体に抗体を予め結合させてお
く。これに試料を加え、測定対象物質である抗原と最初
の反応を行い、“抗体結合担体−抗原”の複合体を形成
する。未反応物を除去し、次に、先の複合体に親和性の
ある「酵素標識抗体」を加え、二番目の反応を行い、
“抗体結合担体−抗原−酵素標識抗体”なる複合体を形
成する。再度未反応物を除去し、最終的に担体に結合し
た酵素と本発明の指示薬と反応させ、吸光度を測定す
る。この吸光度は、試料中の測定対象物質の量に比例す
るので、既知濃度の標準物質を測定して作成した検量線
から試料中の測定対象物質量を求めることができる。

【００２２】本発明の試薬キットは、例えば酵素免疫反
応を利用し、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児
性蛋白（ＣＥＡ）、フェリチンなどの腫瘍マーカー、甲
状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（Ｌ
Ｈ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、インシュリンなど
のホルモン、コルチゾール、トリヨードサイロニン（Ｔ
３）、サイロキシン（Ｔ４）などのハプテンホルモン、
ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、細菌、ウイルス
等の感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥなどの抗体の測定に
利用することができるが、必ずしもこれらの項目に限定
されるものではない。

【００２３】また、酵素免疫測定以外の検査試薬とし
て、「本発明の指示薬」を構成品として含むヘモグロビ
ン定量試薬キットの例を挙げる。「本発明の指示薬」、
過酸化ストロンチウムを混合する。その後、ヘモグロビ
ンを含む試料を添加して一定時間反応する。吸光度をブ
ランクを対照として測定する。既知濃度のヘモグロビン
を測定して作成した検量線から、試料中のヘモグロビン
濃度を求める。

【００２４】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。また、本発
明の指示薬は必要に応じて、種々の溶剤（例えば、エタ
ノール、エチレングリコール、ジエチレングリコールモ
ノメチルエーテル、１−メチル−２−ピロリドン、２−
メチル−２、４−ペンタンジオール等）や添加剤（例え
ば、キレート剤、腐敗を防ぐ殺菌剤及び防腐剤、界面活
性剤、着色剤、消泡剤等）を更に添加することも可能で
ある。

【００２５】実施例１ 1) 指示薬［１］〜［３］の調製２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、１８−クラウン−６を最終濃度が２．０、
４．０及び８．０ｍｇ／ｍｌになるように添加し、更
に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・２
ＨＣｌ（以下ＴＭＢ塩と略す）を５．０ｍｇ添加し、よ
く攪拌することにより、それぞれ本発明の指示薬［１］
〜［３］を得た。

【００２６】2) 指示薬［比１］及び［比２］の調製２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジア
ミン三酢酸鉄キレート（Fe-HEDTA）^*1及びβ−シクロデ
キストリンをそれぞれ５．０ｍｇ／ｍｌになるように添
加し、更に、ＴＭＢ塩を５．０ｍｇ添加し、よく攪拌す
ることにより、指示薬［比１］及び［比２］を得た。^*1 市販のHEDTA及びFeCl₃・6H₂Oの等モル量を水溶液中
で混合して鉄:キレートの１：１（モル：モル）Fe-HEDT
A溶液を調製

【００２７】 3) ペルオキシダーゼ溶液（ＰＯＤ溶液と略す）の調製１％牛血清アルブミン及び０．８５％ＮａＣｌを含むｐ
Ｈ７．２、０．０２Ｍリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと略
す）１ｍｌに、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略す）
０．５ｍｇを溶解し、更に、ＰＢＳで５００倍希釈し
て、ＰＯＤ溶液〈１〉（１μｇ／ｍｌ）を得た。また、
ＰＯＤ溶液〈１〉を、ＰＢＳを用いて２、４、８倍に希
釈し、ＰＯＤ濃度が０．５、０．２５、０．１２５μｇ
／ｍｌのものを調製し、それぞれＰＯＤ溶液〈２〉、
〈３〉及び〈４〉とした。

【００２８】4) 指示薬の感度試験指示薬［１］〜［３］、［比１］及び［比２］各３００
μｌに、ＰＯＤ溶液〈１〉を５０μｌ添加し、３７℃、
１５分反応させた。その後、分光光度計を用いて、６５
０ｎｍにおける吸光度を、ＰＯＤ溶液の代わりに水を添
加して反応させた液を対照に測定した。更に、４℃、２
５℃に１、３、６ヶ月保存した同様の指示薬について
も、それぞれＰＯＤ溶液〈１〉を反応させ、同様に吸光
度を測定した。結果を表１に示す。表１の結果から明ら
かなように、本発明の指示薬［１］〜［３］は、指示薬
［比１］及び［比２］に比べて、調製時及び経日での感
度の低下は著しく少ない。

【００２９】

【表１】

【００３０】5) 希釈直線性試験指示薬［２］、［比１］及び［比２］各３００μｌに、
ＰＯＤ溶液〈１〉、〈２〉、〈３〉及び〈４〉の各５０
μｌを添加し、３７℃、１５分反応させ、実施例１の4)
の感度試験に準じて各ＰＯＤ溶液の吸光度を測定した。
その結果を表２及び図１に示す。図１は、横軸にＰＯＤ
濃度、縦軸に６５０ｎｍの吸光度をとり、ＰＯＤ濃度と
吸光度の関係を示したグラフである。指示薬［比１］及
び［比２］に比べ指示薬［２］は全領域のＰＯＤ濃度に
おいても直線性があり、正確な測定が可能であることを
示している。

【００３１】

【表２】

【００３２】実施例２ 1) 指示薬［４］の調製２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、塩化ベンザルコニウム及び１８−クラウン−
６をそれぞれ最終濃度が５．０ｍｇ／ｍｌ及び４．０ｍ
ｇ／ｍｌになるように添加する。更に、ＴＭＢ塩を５．
０ｍｇ添加し、よく攪拌することにより、本発明の指示
薬［４］を得た。

【００３３】2) 指示薬［比３］及び［比４］の調製１８−クラウン−６の代わりにFe-HEDTA及びβ−シクロ
デキストリンを添加する以外は指示薬［４］と同様の調
製方法で、指示薬［比３］及び［比４］を得た。

【００３４】3) 指示薬の感度試験指示薬［１］〜［３］、［比１］及び［比２］の代わり
に指示薬［４］、［比３］及び［比４］を用いる以外は
実施例１の4)と同様の方法で吸光度を測定した。結果を
表３に示す。表３の結果から明らかなように、本発明の
指示薬［４］は、指示薬［比３］及び［比４］に比べ
て、調製時及び経日での感度の低下は著しく少ない。

【００３５】

【表３】

【００３６】4) 希釈直線性試験指示薬［１］〜［３］及び［比１］の代わりに指示薬
［４］、［比３］及び［比４］を用いる以外は実施例１
の5)と同様の方法で吸光度を測定した。その結果を表４
及び図２に示す。図２は、横軸にＰＯＤ濃度、縦軸に６
５０ｎｍの吸光度をとり、ＰＯＤ濃度と感度の関係を示
したグラフである。指示薬［比３］及び［比４］に比べ
指示薬［４］は全領域においても直線性があり正確な測
定が可能であることを示している。

【００３７】

【表４】

【００３８】実施例３ 1) 指示薬［５］〜［７］の調製２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、（Ｄ２）を最終濃度が１．０、４．０及び１
６．０ｍｇ／ｍｌになるように添加し、更に、ＴＭＢ塩
を５．０ｍｇ添加し、よく攪拌することにより、それぞ
れ本発明の指示薬［５］〜［７］を得た。

【００３９】2) 指示薬［比１］及び［比２］の調製実施例１．2)と同様の指示薬を用いた。

【００４０】 3) ペルオキシダーゼ溶液（ＰＯＤ溶液と略す）の調製実施例１．3)と同様のＰＯＤ溶液を用いた。

【００４１】4) 指示薬の感度試験指示薬［５］〜［７］、［比１］及び［比２］各３００
μｌに、ＰＯＤ溶液〈１〉を５０μｌ添加し、３７℃、
１５分反応させた。その後、分光光度計を用いて、６５
０ｎｍにおける吸光度を、ＰＯＤ溶液の代わりに水を添
加して反応させた液を対照に測定した。更に、４℃、２
５℃に１、３、６ヶ月保存した同様の指示薬について
も、それぞれＰＯＤ溶液〈１〉を反応させ、同様に吸光
度を測定した。結果を表５に示す。表５の結果から明ら
かなように、本発明の指示薬［５］〜［７］は、指示薬
［比１］及び［比２］に比べて、調製時及び経日での感
度の低下は著しく少ない。

【００４２】

【表５】

【００４３】5) 希釈直線性試験指示薬［６］、［比１］及び［比２］各３００μｌに、
ＰＯＤ溶液〈１〉、〈２〉、〈３〉及び〈４〉の各５０
μｌを添加し、３７℃、１５分反応させ、実施例１の4)
の感度試験に準じて各ＰＯＤ溶液の吸光度を測定した。
その結果を表６及び図３に示す。図３は横軸にＰＯＤ濃
度、縦軸に６５０ｎｍの吸光度をとり、ＰＯＤ濃度と吸
光度の関係を示したグラフである。指示薬［比１］及び
［比２］に比べ指示薬［６］は全領域のＰＯＤ濃度にお
いても直線性があり、正確な測定が可能であることを示
している。

【００４４】

【表６】

【００４５】実施例４ 1) 指示薬［８］の調製２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、塩化ベンザルコニウム及び（Ｄ２）をそれぞ
れ最終濃度が５．０ｍｇ／ｍｌ及び４．０ｍｇ／ｍｌに
なるように添加する。更に、ＴＭＢ塩を５．０ｍｇ添加
し、よく攪拌することにより、本発明の指示薬［８］を
得た。

【００４６】2) 指示薬［比３］及び［比４］の調製実施例２．2)と同様の指示薬を用いた。

【００４７】3) 指示薬の感度試験指示薬［５］〜［７］、［比１］及び［比２］の代わり
に指示薬［８］、［比３］及び［比４］を用いる以外は
実施例３の4)と同様の方法で吸光度を測定した。結果を
表７に示す。表７の結果から明らかなように、本発明の
指示薬［８］は、指示薬［比３］及び［比４］に比べ
て、調製時及び経日での感度の低下は著しく少ない。

【００４８】

【表７】

【００４９】4) 希釈直線性試験指示薬［５］〜［７］及び［比１］の代わりに指示薬
［８］、［比３］及び［比４］を用いる以外は実施例３
の5)と同様の方法で吸光度を測定した。その結果を表８
及び図４に示す。図４は、横軸にＰＯＤ濃度、縦軸に６
５０ｎｍの吸光度をとり、ＰＯＤ濃度と感度の関係を示
したグラフである。指示薬［比３］及び［比４］に比べ
指示薬［８］は全領域においても直線性があり正確な測
定が可能であることを示している。

【００５０】

【表８】

【００５１】

【発明の効果】

（１）感度の向上本発明の指示薬は、使用するペルオキシダーゼ濃度領域
において、調製時の感度が高い。そのため、ペルオキシ
ダーゼの含有量が極めて少ない領域での測定でも有意差
が明確に判別される。このことは高感度が要求される検
査試薬には大変適している。（２）保存安定性の向上本発明の指示薬は、保存安定性が良好なので、試薬キッ
トの構成品とすることができる。従来の指示薬は、感度
が経日的に低下するため、使用直前に調製しなければな
らない等の問題があったのを解決するものである。ま
た、経日における発色剤の析出についても、結晶の析出
は起こらず、長期間に亙って安定な試薬の供給が可能で
ある。（３）正確性の向上本発明の指示薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化物分解
性物質の高濃度域或は低濃度域においても、過酸化物分
解性物質の量に正しく比例することから、極めて正確に
測定できるという利点がある。即ち、従来の指示薬で見
られた様な、発色反応を阻害することによる低値領域で
の感度低下が起こらず、その結果測定誤差が生じない。
このことは厳しい性能が要求される検査試薬にとって大
変好ましいものである。（４）キャリーオーバーの防止本発明の指示薬は、特にカチオン系界面活性剤の添加
で、キャリーオーバー（フローセル等の測定機器で感度
の高い試料を測定をした場合、次の試料の測定値が実際
より高くなる）が防止できる。このことは大量の試料を
自動測定する場合等に大変有利である。（５）防腐効果カチオン系界面活性剤を含む本発明の指示薬は、その殺
菌作用により防腐される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例１における指示薬［２］、［比
１］及び［比２］のＰＯＤ濃度と発色度の関係を示した
ものである。

【図２】図２は、実施例２における指示薬［４］、［比
３］及び［比４］のＰＯＤ濃度と発色度の関係を示した
ものである。

【図３】図３は、実施例３における指示薬［６］、［比
１］及び［比２］のＰＯＤ濃度と発色度の関係を示した
ものである。

【図４】図２は、実施例４における指示薬［８］、［比
３］及び［比４］のＰＯＤ濃度と発色度の関係を示した
ものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水性媒体中に過酸化物（Ａ）及びベンジ
ジン系発色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解性
物質（Ｃ）の測定を（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う
（Ｂ）の発色により行うことができる指示薬において、
更に、クラウンエーテル（Ｄ１）またはＤ−フルクトー
スがβ−フラクシド結合した環状オリゴ糖（Ｄ２）を含
有することを特徴とする過酸化物分解性物質測定用指示
薬。
【請求項２】（Ｄ１）が１８−クラウン−６である請
求項１記載の指示薬。
【請求項３】（Ｄ１）または（Ｄ２）の含有量が０．
１〜５０ｍｇ／ｍｌである請求項１または２記載の指示
薬。
【請求項４】（Ｂ）が３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンジジンである請求項１〜３のいずれか記載の指
示薬。
【請求項５】（Ｂ）の含有量が０．０１〜５ｍｇ／ｍ
ｌである請求項１〜４のいずれか記載の指示薬。
【請求項６】（Ｃ）がペルオキシダーゼである請求項
１〜５のいずれか記載の指示薬。
【請求項７】更にカチオン系界面活性剤（Ｅ）を含有
する請求項１〜６のいずれか記載の指示薬。
【請求項８】過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは
（Ｃ）で標識された化合物を構成品として含む試薬キッ
トにおいて、少なくとも請求項１〜７のいずれか記載の
指示薬もしくはこの指示薬の各成分を共に構成品とする
ことを特徴とする試薬キット。