JPH06298797A - ペプチド誘導体およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 癌転移阻害活性の高い新規なペプチド誘導体
を提供する。 【構成】 下記一般式（Ｉ）で表されるペプチド誘導体
またはその薬学上許容できる塩。一般式（Ｉ） 【化１】 一般式（Ｉ）中、Ｚは酸素原子または硫黄原子を表す。
ＲはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを必須構成単位として有す
る３残基以上７残基以下のオリゴペプチド残基を表す。 【効果】 本発明のペプチド誘導体は、細胞接着性蛋白
質様の活性を充分に保持しており、簡便な手段で合成可
能であり、血液中での安定性が高い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は特定の構成を有するペプ
チドの誘導体に関するものであり、より詳しくは細胞接
着性蛋白質であるフィブロネクチンの接着コア配列ペプ
チドの誘導体またはその薬学上許容可能な塩、およびそ
の用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネ
クチン等は細胞と結合組織との結合に関与し、また動物
細胞の細胞機能に関連した種々の生物活性を有する蛋白
質であり、細胞接着性蛋白質と総称される。例えばフィ
ブロネクチンは肝臓で生合成され、ヒト血漿中に約0.3
mg/mlの濃度で存在する糖蛋白質である。

【０００３】フィブロネクチンはその１次構造が分子ク
ローニングを用いて決定されており（Koarnblihtt, A.
R. et al., EMBO Journal, 4巻, 2519 (1985)）、分子
量約２５０ＫのポリペプチドであるＡ鎖と約２４０Ｋの
Ｂ鎖がＣ末端附近でジスルフィド結合した２量体蛋白質
であることが明らかにされている。またラミニンについ
ても佐々木ら（Sasaki, M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA., 81巻, 935 (1987), Sasaki, M. et al.,
J. Biol. Chem., 262巻, 17111 (1987)）によりその１
次構造が決定されている。ラミニンはＡ、Ｂ１、Ｂ２と
よばれる３本のポリペプチド鎖から構成されており、十
字架状の構造をとっていることが知られている。

【０００４】そして細胞接着性に関与する結合部位の研
究も行われ、フィブロネクチンの細胞接着部のコア配列
はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）なるトリペプチド
であることが1984年に報告された（Pierschbacher, M.
D. et al., Nature 309巻, 30(1984))。またラミニンの
細胞接着部位のコア配列はＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ（ＹＩＧＳＲ）で表されるペンタペプチド
であることも解明されている（Graf, J. et al., Cell
48巻, 989 (1987)）。

【０００５】これらフィブロネクチンやラミニンは、上
記コア配列を介して細胞のレセプターと結合することに
より各種の情報を細胞に伝達し、またヘパリン、コラー
ゲン、フィブリン等の生体高分子とも結合して細胞と結
合組織との接着、細胞の分化、増殖に関与しているもの
と考えられている。

【０００６】このように細胞接着性蛋白質は多様な生物
活性を有するため、その活性部位配列ペプチドを用いた
研究が精力的になされている。例えばフィブロネクチン
の細胞結合部のコア配列の利用としては、ポリマーにＲ
ＧＤ配列を有するペプチドを共有結合させ、人工臓器用
基体や動物細胞培養用基体として用いる方法（特開平1-
309682号公報、特開平1-305960号公報、WO 90/05036 A
特許）、ＲＧＤ配列を有するペプチドに疎水性領域を連
結することにより目的とするペプチドを固体表面に付着
させ、歯科用埋め込み剤や組織培養基体に利用する方法
（WO 90/11297A特許）、ＲＧＤ配列を有する種々の環状
及び鎖状オリゴペプチドまたはその類縁体を用いて血小
板凝集を阻害する方法あるいは血栓症を予防、治療する
方法（高分子学会予稿集第38巻、3149 (1989)、特開平2
-174797号公報、特開平3-118330号公報、特開平3-11833
1号公報、特開平3-118398号公報、特開平3-118397号公
報、特開平3-118333号公報、WO 91/01331特許、WO 91/0
7429特許、WO 91/15515特許、WO 92/00995特許）、ＲＧ
Ｄペプチドとヒアルロン酸を共有結合した化合物を用い
て血小板凝集を調節する方法（特開平4-134096号公
報）、ＲＧＤ配列を有するペプチドを細胞移動制御剤と
して用いる方法（特開平2-4716号公報）、ＲＧＤ配列を
有するペプチドを固定化した膜を細胞接着膜として用い
る方法（高分子学会予稿集第37巻、705 (1988)）、ＲＧ
ＤＳ配列を有するポリペプチドを体外血液用血小板保護
剤として用いる方法（特開昭64-6217号公報）、ポリペ
プチド分子内に細胞接着活性を有するペプチドを付加す
ることにより人工機能性ポリペプチドとして利用する方
法（特開平3-34996号公報）等が開示されている。

【０００７】更に近年、細胞接着性蛋白質は癌転移に関
与する生体分子としても注目されてきている。癌転移の
一連の段階では、癌細胞は種々の宿主細胞や生体高分子
と接触する。このときフィブロネクチンやラミニンのよ
うな細胞接着性分子が存在すると、該細胞は多細胞塊を
形成し、癌細胞の増殖や生存がより容易になる。ところ
が、たとえばフィブロネクチンの接着部位コア配列であ
るトリペプチドＲＧＤが共存すると、競争的に癌細胞上
のフィブロネクチンレセプターと結合するため細胞接着
がブロックされ、癌転移抑制作用を示すことが報告され
ている（Science 238巻, 467 (1986)）。

【０００８】しかしながらＲＧＤペプチドはそれ単独で
は細胞接着活性が充分でないため、効果の増強をはかる
目的で該配列を有するオリゴペプチド、環状オリゴペプ
チド、あるいはその繰返し配列を有するポリペプチドを
用いて癌転移を制御する方法（Int. J. Biol. Macromo
l., 11巻, 23 (1989)、同誌, 11巻, 226 (1989)、Jpn.
J. Cancer Res., 60巻, 722, (1989)、特開平2-174798
号公報）、あるいは腫瘍再発を防止する方法（特開平2-
240020号公報）が開示されている。またフィブロネクチ
ン分子中の細胞接着ポリペプチドとヘパリン結合ポリペ
プチドを構成単位とするポリペプチドを用いて癌転移を
抑制する方法（特開平3-127742号公報）も報告されてい
る。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述のように、フィブ
ロネクチンの接着部位コア配列であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−
Ａｓｐペプチドは様々な生物活性を保持しているため、
その応用価値は高いものと考えられる。しかしながら該
コア配列の細胞接着活性が充分でないため、それらの癌
転移抑制作用は実際の医療に応用するには満足できるも
のではなかった。また一般に薬物が生体に投与されたの
ち薬効を維持するためには、それ自体の生物活性の強さ
のみならず薬物の生体内での安定性（例えば血流中での
滞留時間や排泄される時間など）が重要であることが知
られている。細胞接着性蛋白質の活性部位コア配列ペプ
チドも例外ではなく、それ単独ではペプチド類に特有の
速い代謝分解や排泄が起り、結果的に所望の効果が期待
できない場合も生ずる。そこで生体内での安定性を向上
させるため従来技術の項で説明したような種々の方法が
報告されているが、それらの化合物のなかには未だ生物
活性が不充分であったり、合成が困難なものも多い。ま
たポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子と該コ
ア配列を連結する方法や、該コア配列を繰返すことによ
り高分子量化を行い、生体内での安定性を向上させる方
法も試みられているが、これらの方法では目的物の構造
や分子量を特定して合成を行うことは極めて困難であ
り、この点で更に有効な物質の開発が必要とされてい
た。そこで本発明者らは細胞接着性蛋白質であるフィブ
ロネクチンの持つ種々の生物活性を充分に保持し、合成
も容易でかつ血液中での安定性の高い新規な化合物を求
めて鋭意検討を行った結果、公知のフィブロネクチンコ
ア配列ペプチド誘導体に比べて癌転移抑制能が大きく、
さらに簡便な手段で合成可能な新規なペプチド誘導体を
見出し、本発明を完成するに至った。従って本発明の目
的は、細胞接着性蛋白質様の活性を充分に保持してお
り、簡便な手段で合成可能であり、血液中での安定性の
高い新規なペプチド誘導体を提供することにある。本発
明はさらに癌転移阻害活性の高い新規なペプチド誘導体
を提供することを目的とする。本発明はさらに上記ペプ
チド誘導体を含有してなる薬物組成物の提供も目的とす
る。

【００１０】

【課題を解決する手段】上記課題は、下記一般式（Ｉ）
で表されるペプチド誘導体またはその薬学上許容できる
塩を見出したことにより達成された。一般式（Ｉ）

【００１１】

【化２】

【００１２】一般式（Ｉ）中、Ｚは酸素原子または硫黄
原子を表す。ＲはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐなるトリペプ
チドを必須構成単位として有する３残基以上７残基以下
のオリゴペプチド残基を表す。このＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ配列はペプチド鎖中あるいはその末端のいずれに存
在していてもよく、またペプチド鎖のカルボキシ末端側
は任意にアミド化されていてもよい。

【００１３】さらに本発明においては、Ｒとしては下記
一般式（II）で表されるオリゴペプチド残基をより好ま
しいものとして挙げることができる。一般式（II） −［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−［Ｙ］ （II） 一般式（II）中、［ ］は［ ］内の残基が存在しても
存在しなくてもよいことを意味するが、本発明において
は［ ］内の残基は存在するほうが好ましい。存在する
場合、ＸはＡｓｐまたはＧｌｕ残基を表し、ＹはＳｅ
ｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
−Ａｌａからなる群より選択されるアミノ酸残基または
ペプチド残基を表す。ここでＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｌａはそれぞれア
ルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
スレオニン、バリン、プロリン、アラニンを表す。これ
らのアミノ酸残基（グリシン残基は除く）はＬ-体、Ｄ-
体、ラセミ体のいずれでもよいが、好ましくはＬ-体で
ある。

【００１４】本発明において、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
なるトリペプチドを必須構成単位として有するオリゴペ
プチド残基、より好ましくは一般式（II）で表されるオ
リゴペプチド残基をそれを含む一般式（Ｉ）で表される
誘導体とするのは、有効なペプチドの周辺を修飾するこ
とにより生体内酵素等による分解から保護したり、また
高分子量にして徐放効果を付与することを意図したもの
である。また一般式（Ｉ）からも明らかなように、本発
明のペプチド誘導体は、１分子中に２個のＡｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐペプチドを必須構成単位として有するペプチ
ド配列、より好ましくは一般式（II）で表されるペプチ
ド配列を有することになる。従っていわゆるポリマー類
とは異なり、分子構造は明確であることが特徴である。

【００１５】本発明のペプチド誘導体中に存在するイオ
ン性基は、適当な対イオンと塩を形成していてもよい。
塩の状態でも本発明の化合物はその生物学的活性を充分
に維持する。ただしその塩は生理学的、薬理学的に許容
されるものであることが必要である。具体的には塩酸
塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩のような無機酸との塩、
酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩、さらにナ
トリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、なかでも塩
酸塩、ナトリウム塩が特に好ましい。そのような塩への
変換は慣用手段により行うことができる。

【００１６】以下に本発明のペプチド誘導体の具体例を
示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。な
お該ペプチド誘導体のＣ末端が−ＯＨの場合は、該分野
の慣例によりその記載を省略する。またアミノ酸残基が
Ｄ−体の場合はD- と表記するが、天然型のＬ−体の場
合は特に表記していない。

【００１７】

【化３】

【００１８】次に本発明の化合物の合成法について説明
する。本発明のペプチド誘導体は、カルボニル基あるい
はチオカルボニル基の両端にペプチド鎖が結合した、い
わゆる尿素型化合物である。本発明のペプチド誘導体は
種々の方法でこれを合成することが可能であるが、まず
保護ペプチド部を合成ののちアミノ末端側の保護基を除
去し、これを尿素型化合物に誘導体化し、しかるのちに
保護基を除去することにより合成する方法が実用的かつ
有利である。まずペプチド部の合成方法としては、特に
限定しないが例えば固相法及び固相法を利用したペプチ
ド自動合成装置による合成法が挙げられる。固相法及び
固相法を利用したペプチド自動合成装置による合成法に
関しては、生化学実験講座・タンパク質の化学IV p.207
（日本生化学会編、東京化学同人）、続生化学実験講座
・タンパク質の化学（下） p.641（日本生化学会編、東
京化学同人）等に記載されている。

【００１９】本発明の化合物のペプチド部は、液相法に
よって合成することも可能である。すなわちＣ末端成分
となる保護アミノ酸から出発し、Ｃ末端を保護あるいは
修飾ののちアミノ末端保護基を除去、以下保護アミノ酸
残基を逐次縮合あるいはフラグメント縮合を行うことに
よりペプチド部の全保護体を合成する方法である。保護
アミノ酸あるいは保護ペプチドを縮合する方法として
は、公知の方法、例えば泉屋信夫ら編「ペプチド合成の
基礎と実験」（丸善）に記載の方法のなかから適宜選択
することができるが、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
とＤＣＣを用いるDCC-Additive法、あるいはカルボニル
ジイミダゾールを用いる縮合法が最も良い結果を与え
た。

【００２０】以上の方法により合成した保護ペプチドの
アミノ末端保護基を除去し、これを尿素型化合物に誘導
体化する。アミン化合物を尿素型化合物に変換する方法
としては、例えば新実験化学講座１４「有機化合物の合
成と反応 (III)」 P.1628 〜1644に記載の公知の方法の
なかから適宜選択することができるが、適当な不活性溶
媒中、カルボニルジイミダゾールあるいはチオカルボニ
ルジイミダゾールとアミノ末端側アミノ基のみ遊離の保
護ペプチドを反応させる方法が最も良い結果を与えた。

【００２１】保護基の除去の条件は用いた保護基の種類
に依存する。通常用いられる方法は、加水素分解、ＨＦ
処理、トリフルオロメタンスルホン酸／チオアニソール
／m-クレゾール／トリフルオロ酢酸混合系処理等である
が、保護基の種類によってはさらにさまざまな方法も可
能であることは言うまでもない。目的とするペプチド誘
導体は脱保護ののち公知の方法、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどで精
製することができる。

【００２２】つぎに本発明のペプチド誘導体の作用及び
用途について説明する。本発明のペプチド誘導体は、１
分子中にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を複数
個有し、さらにある程度の大きい分子量を有するため酵
素分解や代謝によって排泄されにくく、そのため顕著な
癌転移抑制活性を示す。本発明のペプチド誘導体は悪性
細胞上のフィブロネクチン受容体に多点で作用し、フィ
ブロネクチンへの結合を阻害することにより悪性細胞の
接着、コロニー化、破壊的浸食を阻止するものと考えら
れる。本発明のペプチド誘導体は乳癌、表皮癌、筋線メ
ラノーマ（muscle line melanoma）、表皮線神経芽細胞
腫xグリオマ（epidermal line neuroblastoma x glioma
）、軟骨細胞、フィブロザルコーマを含め種々の細胞
の接着及び転移を阻止するのに有効である。

【００２３】さらに本発明のペプチド誘導体は、創傷治
癒作用等の広範な生物活性が認められた。また本発明の
ペプチド誘導体はマウスを用いて毒性試験を行ったとこ
ろ、毒性は全く認められなかった。

【００２４】本発明のペプチド誘導体またはその薬学上
許容可能な塩は、ペプチド系医薬に一般に使用されてい
る投与方法によって使用することができ、通常賦形剤を
含む薬物組成物として投与される。この薬物組成物はレ
ミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Scien
ces, Merck, 16, (1980)）に開示されているように、知
られているどのような方法で製造してもよい。賦形剤と
しては蒸留水、生理食塩水、リン酸塩あるいは酢酸塩の
ような緩衝塩類を含有する緩衝液、浸透圧調節剤として
の塩化ナトリウムやショ糖、もしくはアスコルビン酸の
ような酸化防止剤、または許容し得るこれらの組合せが
ある。

【００２５】このような薬物組成物は溶液、錠剤の様な
種々の形態とすることができる。投与形態としては経
口、経鼻、非経口（静脈注射、皮下注射、腹腔内投与な
ど）等のなかから適宜選択することができる。例えば生
理食塩水に溶解して注射用製剤としてもよく、あるいは
0.1規定程度の酢酸緩衝液に溶解したのち凍結乾燥剤と
してもよい。またリポソーム中に内包したマイクロカプ
セル剤あるいはミクロスフェアー等の形態で利用するこ
とも可能である。

【００２６】また本発明のペプチド誘導体は他の薬理作
用を有する化合物、より具体的には抗癌性化合物と併用
して使用することも可能であり、これらは本発明の範疇
に属するものである。本発明のペプチド誘導体と併用し
て使用することの可能な抗癌性化合物としては、癌化学
療法において通常用いられる公知の制癌剤のなかから適
宜選択する事が可能であるが、具体的にはアドリアマイ
シンやシスプラチン、マイトマイシン等を挙げることが
可能である。一般に従来の化学療法においては、制癌剤
の副作用による危険性は避けられない問題であることが
知られている。それゆえ本発明のペプチド誘導体との併
用投与により制癌剤の投与量を減らし、制癌剤による副
作用を軽減する事は非常に有用であると思われる。また
これは癌転移抑制効果をより向上させることをも意味す
る。本発明のペプチド誘導体は組成物中に通常0.1〜99
%（重量）含有され、その投与量はペプチド誘導体とし
て１日あたり通常0.2 μg/kgから200 mg/kgの範囲であ
るが、患者の年齢、性別、体重、症状、投与方法によっ
て決定されるものである。

【００２７】

【実施例】以下実施例によって本発明を更に詳細に説明
する。なお通常用いられる溶媒や試薬、保護基の表記に
は以下の略号を使用した。

【００２８】Ｂｏｃ ：t-ブトキシカルボニル Ｂｎ ：ベンジル ＡｃＯＥｔ ：酢酸エチル Ｍｔｓ ：メシチレンスルホニル ＨＯＢｔ ：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＣＣ ：ジシクロヘキシルカルボジイミド ｉＰｒ₂ＮＥｔ ：ジイソプロピルエチルアミン ＤＭＦ ：ジメチルホルムアミド ＣＤＩ ：カルボニルジイミダゾール ＴＦＡ ：トリフルオロ酢酸 ＴＦＭＳＡ ：トリフルオロメタンスルホン酸

【００２９】実施例１ 化合物１の合成 化合物１の液相法による合成法について詳細に説明す
る。化合物１の合成経路を以下に示す。

【００３０】

【化４】

【００３１】

【化５】

【００３２】１）中間体１の合成 Boc-Ser(Bn)-OH (20.4 g, 69 mmol)、ベンジルブロミド
(13 g, 76 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (9.8
g, 76 mmol)を酢酸エチル (100 ml)に溶解し、反応混合
物を５時間加熱還流した。室温まで放冷した後生成した
塩を濾過して除き、濾液を水、1 M クエン酸溶液、飽和
重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥
ののち減圧濃縮して中間体１を無色油状物として得た。
このものは精製することなく次の反応に用いた。

【００３３】２）中間体２の合成 前項記載の方法により得た中間体１の塩化メチレン (80
ml) 溶液にトリフルオロ酢酸 (80 ml)を加え、反応混
合物を室温で４０分間撹拌した。反応終了後減圧濃縮し
て大部分の溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルで希釈し、
飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで
乾燥ののち減圧濃縮してアミン体を無色油状物として得
た。得られたアミン体とBoc-Asp(Bn)-OH (22.6 g, 70 m
mol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (10.7 g, 70 m
mol)をDMF (80 ml) 及び塩化メチレン (80 ml)の混合溶
媒に溶解し、氷冷しながらDCC (14.4 g, 70 mmol) を加
えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温し
ながら終夜撹拌した後、セライト濾過して生成した沈殿
を除去した。濾液を適当量の酢酸エチルで希釈し、水、
5 % 炭酸ナトリウム溶液、1Mクエン酸溶液、飽和食塩水
で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮して
油状物を得た。シリカゲルカラムクロマトグフラフィー
で精製（溶出液：ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）し、
目的とする中間体２を無色結晶として35 .8 g（３段階
で収率87 %）得た。

【００３４】３）中間体３の合成 中間体２ (35.7 g, 60.5 mmol) の塩化メチレン (100 m
l) 溶液にトリフルオロ酢酸 (100 ml) を加え、反応混
合物を室温で４０分間撹拌した。反応終了後溶媒を留去
し、残渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸
塩32.5 gを得た。得られたトリフルオロ酢酸塩 (18.9
g, 31.3 mmol)とBoc-Gly-OH (5.75 g, 33mmol)、1-ヒド
ロキシベンゾトリアゾール (5.04 g, 33 mmol)、ジイソ
プロピルエチルアミン (4.45 g, 34.4 mmol) をDMF (20
ml) 及び塩化メチレン (50 ml)の混合溶媒に溶解し、
氷冷しながらDCC (6.8 g, 33 mmol)を加えた。反応混合
物を氷冷下２時間、更に室温まで昇温しながら終夜撹拌
した後、セライト濾過して生成した沈殿を除去した。濾
液を適当量の酢酸エチルで希釈し、水、5 % 炭酸ナトリ
ウム溶液、1Mクエン酸溶液、飽和食塩水で洗浄、無水硫
酸ナトリウム で乾燥ののち減圧濃縮して無色固形物を
得た。このものをヘキサン／酢酸エチル（２／１）から
再結晶して中間体３を17.9 g（87 %）得た。

【００３５】４）中間体４の合成 中間体３ (17.9 g, 27 mmol)の塩化メチレン (60 ml)溶
液にトリフルオロ酢酸(60 ml)を加え、反応混合物を室
温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残渣を
エーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩15.9 gを
得た。一方、Boc-Arg(Mts)-OH (4.56 g, 10 mmol)をDMF
(20 ml) に溶解し、このものに氷冷しながらCDI（1.63
g, 10 mmol) のDMF (10 ml) 溶液を加えた。反応混合
物を氷冷しながら１時間撹拌したのち、上記操作により
得られたトリフルオロ酢酸塩 (6.61 g, 10 mmol)とジイ
ソプロピルエチルアミン (1.42 g, 11 mmol)のDMF (20
ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、更に室
温まで昇温しながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒を留去
した。残渣を適当量のクロロホルムで希釈し、水、1Mク
エン酸溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸
ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮した。残渣をエーテル
から結晶化させて目的とする中間体４を無色結晶として
9.8 g （定量的）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 986.

【００３６】５）中間体５の合成 中間体４ (5.5 g, 5.6 mmol) の塩化メチレン (20 ml)
溶液にトリフルオロ酢酸 (20 ml)を加え、反応混合物を
室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残渣
をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩を5.3
g得た。一方、Boc-Asp(Bn)-OH (1.71 g, 5.3 mmol)をDM
F (10 ml) に溶解し、このものに氷冷しながらCDI（860
mg, 5.3 mmol) のDMF (10 ml) 溶液を加えた。反応混
合物を氷冷しながら１時間撹拌したのち、上記操作によ
り得られたトリフルオロ酢酸塩 (5.3 g, 5.3 mmol) と
ジイソプロピルエチルアミン (770 mg, 6.0 mmol)のDMF
(15 ml) 溶液を加えた。反応混合物を氷冷下２時間、
更に室温まで昇温しながら終夜撹拌した後、減圧下溶媒
を留去した。残渣を適当量のクロロホルムで希釈し、
水、1 M クエン酸溶液、飽和重曹水、飽和食塩水で洗
浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥ののち減圧濃縮した。残
渣をエーテルから結晶化させて目的とする中間体５を無
色結晶として5.9 g （94.3 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1191.

【００３７】６）中間体６の合成 中間体５ (5.0 g, 4.2 mmol) のクロロホルム (20 ml)
溶液にトリフルオロ酢酸 (20 ml) を加え、反応混合物
を室温で１時間撹拌した。反応終了後溶媒を留去し、残
渣をエーテルから結晶化させてトリフルオロ酢酸塩を4.
9 g得た。得られたトリフルオロ酢酸塩（1.4 g, 1.2 mm
ol）をジイソプロピルエチルアミン (190 mg, 1.5 mmo
l)及びDMF（5 ml）からなる混合溶媒に溶解し、CDI（97
mg, 0.6 mmol)を加えた。反応混合物を室温に終夜放置
したのち減圧下溶媒を留去した。残渣を適当量のクロロ
ホルムで希釈し、水、飽和食塩水で洗浄、無水硫酸ナト
リウムで乾燥ののち減圧濃縮した。残渣をエーテルから
結晶化させて目的とする中間体６を1.2 g（90.6 %）得
た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 2207.

【００３８】７）化合物１の合成 中間体６ (1.1 g, 0.5 mmol) のトリフルオロ酢酸 (7 m
l) 溶液に、トリフルオロメタンスルホン酸 (6 g)、チ
オアニソール (4 ml)、m-クレゾール (3.5 ml)、トリフ
ルオロ酢酸 (18 ml) からなる混合溶液を氷冷しながら
加え、反応混合物を氷冷下２時間撹拌した。反応液をエ
ーテル (700 ml) に滴下して３０分間ゆっくり撹拌し
た。沈殿した粗生成物を少量の水にとかし、イオン交換
クロマトグラフィー（アンバーライトIRA-400、対イオ
ンCl^-）により精製、凍結乾燥して目的とする化合物１
を無色粉末として420 mg（75 %）得た。 FAB-MS: (M+H)⁺ 1121.

【００３９】実施例２ メラノーマ細胞を用いた実験的
肺転移モデル系による癌転移抑制作用に関する検討 本発明のペプチド誘導体の癌転移抑制作用について、実
験的肺転移モデル系によって検討した。実施例に記載し
た本発明の化合物１と、比較例としてフィブロネクチン
の接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serを用い
た。これらのペプチド各々1000μgと非常に転移性の強
い癌細胞であるB16-BL6メラノーマ細胞（対数増殖期の
もの5 x 10⁴個）を各々PBS 0.2 ml中で混合し、これを
１群５匹のC57BL/6の雌マウスに尾静脈注射により投与
した。投与後14日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移
した癌のコロニー数を計測して対照のPBS投与群と比較
した。その結果を以下の表１に示す。

【００４０】

【表１】 表１ ──────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ──────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 154±35 (116-206) Arg-Gly-Asp-Ser 160±48 (94-239) 化合物１ 49±21 (27-78)^* ──────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.001

【００４１】この結果によれば、本発明の化合物１の投
与によって肺への癌転移は有意に抑制された。これに対
し従来から知られているフィブロネクチンの接着コア配
列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serは、マウス１匹あた
り1000 μgの投与量では転移抑制効果を示さなかった。

【００４２】実施例３ メラノーマ細胞を用いた自然肺
転移モデル系による癌転移抑制作用の検討 本発明の化合物の癌転移抑制作用について、より現実的
な病態治療モデルである自然肺転移抑制試験により検討
した。本発明の化合物１と、比較化合物としてフィブロ
ネクチンの接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Se
rを用いた。１群７匹のC57BL/6の雌マウスを用い、これ
らの右足かかと部分にB16-BL6メラノーマ細胞（対数増
殖期のもの5 x 10⁴/50 μl)を移植した。移植後14、1
6、18、20、22、24、26日目に被試験化合物を尾静脈注
射により投与した（１回あたり100μg/200 μl PBS）。
移植癌は21日目に外科的に切除した。メラノーマ移植後
35日目にマウスを屠殺、解剖し、肺に転移した癌のコロ
ニー数を計測して対照のPBS投与群と比較した。その結
果を以下の表２に示す。

【００４３】

【表２】 表２ ─────────────────────────────── 投与化合物 肺への転移数 平均±SD (範囲) ─────────────────────────────── ＰＢＳ（未処理） 59±12 (47-79) Arg-Gly-Asp-Ser 63±20 (47-96) 化合物１ 32±18 (3-59)* ─────────────────────────────── * t-検定で未処理区と比較して P<0.01

【００４４】この結果によれば、本発明の化合物１の投
与によって、現実的な病態治療モデルである自然肺転移
抑制試験においても癌の転移数は有意に抑制された。こ
れに対して、従来から知られているフィブロネクチンの
接着コア配列ペプチドであるArg-Gly-Asp-Serには、自
然肺転移モデル系における癌転移の抑制効果はなかっ
た。この実験事実は、本発明の重要な目的の１つである
修飾による活性の増強が目論見通り達成されていること
を示している。従って本発明のペプチド誘導体の癌転移
抑制効果、およびその有用性、優位性は明白である。

【００４５】以上実施例により本発明を特定の例に関し
て説明したが、限定して解釈されるべきではない。本発
明の本質及び範囲から逸脱しない種々の変更や修正が可
能であることは明らかである。そしてそのような発明は
本発明に含まれると考える。

【００４６】

【発明の効果】以上説明したように本発明のペプチド誘
導体は細胞接着性蛋白質であるフィブロネクチンのコア
配列と比較して細胞接着性が大きく、癌転移抑制作用等
の種々の生物活性を充分に保持し、毒性の問題もほとん
ど無い。さらにより現実的な病態治療モデルである自然
肺転移抑制試験においても癌転移抑制作用を示す。また
その構造は単純であるため合成も容易であり、医薬とし
て価値の高いものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 済木 育夫 北海道札幌市厚別区厚別北３条西５丁目12 −６ (72)発明者 東 市郎 北海道札幌市南区真駒内上町５丁目３−２

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ）で表されるペプチド誘
   導体またはその薬学上許容できる塩。一般式（Ｉ） 【化１】 一般式（Ｉ）中、Ｚは酸素原子または硫黄原子を表す。
   ＲはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを必須構成単位として有す
   る３残基以上７残基以下のオリゴペプチド残基を表す。
2. 【請求項２】 Ｒが下記一般式（II）で表されるオリゴ
   ペプチド残基である、請求項１に記載のペプチド誘導体
   またはその薬学上許容できる塩。一般式（II） −［Ｘ］−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−［Ｙ］ （II） 一般式（II）中、［ ］は［ ］内の残基が存在しても
   存在しなくてもよいことを意味し、存在する場合ＸはＡ
   ｓｐまたはＧｌｕ残基を表し、ＹはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖ
   ａｌ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａからな
   る群より選択されるアミノ酸残基またはペプチド残基を
   表す。
3. 【請求項３】 薬学上許容できる賦形剤及び請求項１ま
   たは２に記載のペプチド誘導体またはその薬学上許容で
   きる塩を有効成分として含有してなる、癌転移抑制剤。