JPH0630576B2 - Ｂａｎ▲Ｉ▼制限エンドヌクレア−ゼの製造法 - Google Patents
Ｂａｎ▲Ｉ▼制限エンドヌクレア−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPH0630576B2 JPH0630576B2 JP62171746A JP17174687A JPH0630576B2 JP H0630576 B2 JPH0630576 B2 JP H0630576B2 JP 62171746 A JP62171746 A JP 62171746A JP 17174687 A JP17174687 A JP 17174687A JP H0630576 B2 JPH0630576 B2 JP H0630576B2
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- Japan
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- restriction endonuclease
- bani
- dna
- restriction
- plasmid
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子を含
む染色体ＤＮＡ断片を組み込んでなる新しい組換えプラ
スミドを導入して形質転換した微生物及び該微生物より
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関す
る。
む染色体ＤＮＡ断片を組み込んでなる新しい組換えプラ
スミドを導入して形質転換した微生物及び該微生物より
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する方法に関す
る。
（従来の技術） II型制限酵素はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖中のある
特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性
の高い酵素であり、このすぐれた特異性により遺伝子工
学の分野で幅広く利用されている。
特定の塩基配列を認識し、これを切断する極めて特異性
の高い酵素であり、このすぐれた特異性により遺伝子工
学の分野で幅広く利用されている。
現在までのところ、細菌等から約１００種類のII型制限
酵素が発見され、商品化されている。本発明に記載のＢ
ａｎＩも、このII型制限酵素のひとつであり、ＤＮＡの
塩基配列中のＧＧＰｙＰｕＣＣを意識し、これを切断す
る酵素であり、バチルス アノイリノリテイカス（Baci
llus Aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７において生産さ
れることが知られている［Nucleic Acids Research 10,
5747(1982)］。
酵素が発見され、商品化されている。本発明に記載のＢ
ａｎＩも、このII型制限酵素のひとつであり、ＤＮＡの
塩基配列中のＧＧＰｙＰｕＣＣを意識し、これを切断す
る酵素であり、バチルス アノイリノリテイカス（Baci
llus Aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７において生産さ
れることが知られている［Nucleic Acids Research 10,
5747(1982)］。
II型制限酵素を遺伝子工学の分野で利用するには最低
限、次の４つの条件を満足する必要がある。
限、次の４つの条件を満足する必要がある。
すなわち他の制限酵素を含まない。
フォスファターゼを含まない。
非特異的ＤＮaseを含まない。
３′および５′−エキソヌクレアーゼを含まない。
であり、そのため市販されている制限酵素は除核酸法、
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。本発明者らは
ＢａｎＩについても他の制限酵素と同様の方法を試みた
が、特にＢａｎＩにおいては、バチルス アノイリノリ
テイカス（Bacillus aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７
はＢａｎＩ以外にＡＴＣＧＡＴを認識し、これを切断す
る制限酵素ＢａｎIII及びＧＰｕＧＣＰｙＣを認識し、
これを切断する制限酵素ＢａｎIIをも同時に生産するた
め、これを除くことが非常に困難であった。
塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー
法、アフィニティークロマトグラフィー法等を組み合わ
せることにより高純度に精製されている。本発明者らは
ＢａｎＩについても他の制限酵素と同様の方法を試みた
が、特にＢａｎＩにおいては、バチルス アノイリノリ
テイカス（Bacillus aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７
はＢａｎＩ以外にＡＴＣＧＡＴを認識し、これを切断す
る制限酵素ＢａｎIII及びＧＰｕＧＣＰｙＣを認識し、
これを切断する制限酵素ＢａｎIIをも同時に生産するた
め、これを除くことが非常に困難であった。
（発明の目的） 本発明者らは上記方法の欠点であるＢａｎIII及びＢａ
ｎIIを同時に生産するという点を解消し、ＢａｎＩだけ
を生産する菌株を造成すべく鋭意研究を行なった。その
結果、前記バチルス アノイリノリテイカス（Bacillus
neurinolyticus）ＩＡＭ１０７７からＢａｎＩ制限エ
ンドヌクレアーゼの遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽
出し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミドを
作成し、該プラスミドの導入により形質転換させた微生
物を得ることに成功するとともに、該微生物がＢａｎＩ
のみを生産するという事実を発見した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。
ｎIIを同時に生産するという点を解消し、ＢａｎＩだけ
を生産する菌株を造成すべく鋭意研究を行なった。その
結果、前記バチルス アノイリノリテイカス（Bacillus
neurinolyticus）ＩＡＭ１０７７からＢａｎＩ制限エ
ンドヌクレアーゼの遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽
出し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミドを
作成し、該プラスミドの導入により形質転換させた微生
物を得ることに成功するとともに、該微生物がＢａｎＩ
のみを生産するという事実を発見した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。
（発明の構成） 即ち、本発明はバチルス アノイリノリテイカス（Baci
llus aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７由来のＢａｎＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Ｓａ
ｕ３ＡＩにより切断された３．６ｋｂである染色体ＤＮ
Ａを組み込んだ大腸菌にて複製できる組換えプラスミド
で形質転換されたエシエリヒア（Escherichia）属に属
する微生物及び該形質転換微生物を培養して、培養物か
らＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼを採取することを特
徴とするＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの製造法に係
わる。
llus aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７由来のＢａｎＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Ｓａ
ｕ３ＡＩにより切断された３．６ｋｂである染色体ＤＮ
Ａを組み込んだ大腸菌にて複製できる組換えプラスミド
で形質転換されたエシエリヒア（Escherichia）属に属
する微生物及び該形質転換微生物を培養して、培養物か
らＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼを採取することを特
徴とするＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの製造法に係
わる。
本発明の上記組換えプラスミドを導入した形質転換株は
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するためそ
の精製工程においてＢａｎIII制限エンドヌクレアーゼ
及びＢａｎII制限エンドヌクレアーゼを除去する必要が
なく、大量のＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼを容易に
製造することが可能となった。
ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するためそ
の精製工程においてＢａｎIII制限エンドヌクレアーゼ
及びＢａｎII制限エンドヌクレアーゼを除去する必要が
なく、大量のＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼを容易に
製造することが可能となった。
以下本発明につき詳細に説明する。
（ａ）プラスミド及びその調製 本発明の新規プラスミドは、例えばエシエリヒア（Esch
erichia）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラス
ミド）として知られるコリシンＥ１因子等の、培養され
た細胞内で増殖しうる形式をとるプラスミドにバチルス
アノイリノリテイカス（Bacillus aneurinolyticus）
ＩＡＭ１０７７由来のＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含む、制限酵素、Ｓａｕ３ＡＩにより切断され
たＤＮＡ断片を組み込んでなるプラスミドであり、前記
ベクターＤＮＡとしては、天然に存在するものを抽出し
たものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分が一
部欠落しているものでもよく、例えばColE1の系統、ｐ
ＭＢ９の系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐＳＣ１０１の系
統、Ｒ６Ｋの系統、ラムダーファージの系統等が挙げら
れる。
erichia）属に属する微生物の染色体外遺伝子（プラス
ミド）として知られるコリシンＥ１因子等の、培養され
た細胞内で増殖しうる形式をとるプラスミドにバチルス
アノイリノリテイカス（Bacillus aneurinolyticus）
ＩＡＭ１０７７由来のＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子を含む、制限酵素、Ｓａｕ３ＡＩにより切断され
たＤＮＡ断片を組み込んでなるプラスミドであり、前記
ベクターＤＮＡとしては、天然に存在するものを抽出し
たものの他、増殖に必須な部分以外のＤＮＡの部分が一
部欠落しているものでもよく、例えばColE1の系統、ｐ
ＭＢ９の系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐＳＣ１０１の系
統、Ｒ６Ｋの系統、ラムダーファージの系統等が挙げら
れる。
また前記ベクターＤＮＡに前記染色体ＤＮＡ断片を組み
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例え
ば、適当な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体
ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベク
ターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法
が用いられる。
込む方法は、既知のいずれの方法も適用しうる。例え
ば、適当な制限酵素（Endonuclease）で処理して染色体
ＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベク
ターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法
が用いられる。
ベクターＤＮＡとして、ｐＢＲ３２２プラスミドを用
い、これにバチルス アノイリノリテイカス（Bacillus
aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７から調製された染色
体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、新規プラスミドｐ
ＢＡＮ１１が得られる。ｐＢＡＮ１１プラスミドの制限
酵素地図を第１図に示す。第１図において、白枠で表さ
れる部分がＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
む染色体ＤＮＡ断片を示す。第１図から明らかなよう
に、このプラスミドはｐＢＲ３２２プラスミドの制限酵
素サイトのＢａｍＨＩサイトに、バチルス アノイリノ
リテイカス（Bacillus aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７
７のＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が組み込まれた８Ｋｂの塩基対を有する円形分子
である。
い、これにバチルス アノイリノリテイカス（Bacillus
aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７７から調製された染色
体ＤＮＡ断片を組み込むことにより、新規プラスミドｐ
ＢＡＮ１１が得られる。ｐＢＡＮ１１プラスミドの制限
酵素地図を第１図に示す。第１図において、白枠で表さ
れる部分がＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含
む染色体ＤＮＡ断片を示す。第１図から明らかなよう
に、このプラスミドはｐＢＲ３２２プラスミドの制限酵
素サイトのＢａｍＨＩサイトに、バチルス アノイリノ
リテイカス（Bacillus aneurinolyticus）ＩＡＭ１０７
７のＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が組み込まれた８Ｋｂの塩基対を有する円形分子
である。
（ｂ）微生物の調製 このようにして得られた前記染色体ＤＮＡ断片とベクタ
ーＤＮＡの結合物を既知の形質転換法、例えばショット
・ガン法（shot gun method）により受容菌の微生物菌
体中に導入すると、所望の遺伝形質とベクターＤＮＡの
形質を併せもつ形質転換株が得られる。
ーＤＮＡの結合物を既知の形質転換法、例えばショット
・ガン法（shot gun method）により受容菌の微生物菌
体中に導入すると、所望の遺伝形質とベクターＤＮＡの
形質を併せもつ形質転換株が得られる。
受容菌としては、前記のエシエリヒア・コリＨＢ１０
１、同Ｃ６００、同ＤＰ、ｓｕｐＦ、同ｘ１７７６、同
ＬＥ３９２等の通常この種の技術分野で用いられる微生
物が有利に用いられる。その典型的な例としてエシエリ
ヒア・コリＨＢ１０１株が挙げられる［モレキュラー・
クローニング・エイ・ラボラトリー・マニュアル、（Mo
lecular Cloning Laboratory Manual P.504(1982)参
照；遺伝形質Ｆ−、hsd s20(r8,M8)rec A13、ara-14、pro
A2、lacY1、gal K2、rps L20(Sm′)、xy1-5、mtl-1、sup E44
λ−）］。
１、同Ｃ６００、同ＤＰ、ｓｕｐＦ、同ｘ１７７６、同
ＬＥ３９２等の通常この種の技術分野で用いられる微生
物が有利に用いられる。その典型的な例としてエシエリ
ヒア・コリＨＢ１０１株が挙げられる［モレキュラー・
クローニング・エイ・ラボラトリー・マニュアル、（Mo
lecular Cloning Laboratory Manual P.504(1982)参
照；遺伝形質Ｆ−、hsd s20(r8,M8)rec A13、ara-14、pro
A2、lacY1、gal K2、rps L20(Sm′)、xy1-5、mtl-1、sup E44
λ−）］。
このエシエリヒア・コリＨＢ１０１株に、前記プラスミ
ドｐＢＡＮ１１を導入して形質転換法により得られる微
生物は、新規微生物であり、エシエリヒア・コリＨＢ１
０１（ｐＢＡＮ１１）［Echerichia coli ＨＢ１０１
（ｐＢＡＮ１１）］と呼称され、昭和６２年６月１８日
付にて工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託され、そ
の寄託番号は、微工研寄第９４２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−
９４２４）である。このようにして得られたエシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１（ｐＢＮＡ１１）の菌学的性質を、
ＤＮＡ受容菌であるエシエリヒア・コリＨＢ１０１株の
性質と比較すると、前者がＢａｎＩ制限エンドヌクレア
ーゼの生産及びアンピシリン耐性を有するのに対し、後
者がこれらの特性を有しない点以外は全く同一である。
ドｐＢＡＮ１１を導入して形質転換法により得られる微
生物は、新規微生物であり、エシエリヒア・コリＨＢ１
０１（ｐＢＡＮ１１）［Echerichia coli ＨＢ１０１
（ｐＢＡＮ１１）］と呼称され、昭和６２年６月１８日
付にて工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託され、そ
の寄託番号は、微工研寄第９４２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−
９４２４）である。このようにして得られたエシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１（ｐＢＮＡ１１）の菌学的性質を、
ＤＮＡ受容菌であるエシエリヒア・コリＨＢ１０１株の
性質と比較すると、前者がＢａｎＩ制限エンドヌクレア
ーゼの生産及びアンピシリン耐性を有するのに対し、後
者がこれらの特性を有しない点以外は全く同一である。
（ｃ）制限エンドヌクレアーゼの生産 工程（ｂ）で得られた形質転換株を培養するには、特定
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培地
であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、エシエリヒア・コリの生育
培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、ＢＰＢ培地（Difco；ボリペプトン、酵母
エキス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（Difco000
1）、トリプトン・食塩培地等を基本培地として調製し
たものを用いればよい。
の遺伝情報によって生成される物質の生産に適した培地
であって且つ宿主微生物の生育に適した培地を用い得る
が、本発明方法では、通常、エシエリヒア・コリの生育
培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母エキ
ス、食塩）、ＢＰＢ培地（Difco；ボリペプトン、酵母
エキス、リン酸カリウム）、栄養・寒天培地（Difco000
1）、トリプトン・食塩培地等を基本培地として調製し
たものを用いればよい。
その他、必要に応じて炭素源、窒素源の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は、pH、温度、酸素供給量等の条件として通常
のエシエリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り得
るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が生
育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖後
期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常３０
〜３７℃、pH条件は、pH５〜８の範囲、特に中性付近が
適当である。
のエシエリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り得
るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が生
育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖後
期まで生育させるのが好ましい。培養温度は、通常３０
〜３７℃、pH条件は、pH５〜８の範囲、特に中性付近が
適当である。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法、ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりＢａｎＩ制限
エンドヌクレアーゼを得ることができる。
より抽出し、次いで除核酸法、塩析法、ゲル濾過法、イ
オン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマト
グラフィー法等を組み合わせることによりＢａｎＩ制限
エンドヌクレアーゼを得ることができる。
（発明の効果） 本発明のプラスミド及びこれを導入した形質転換株はＢ
ａｎＩ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するため、そ
の精製工程においてＢａｎIII制限エンドヌクレアーゼ
及びＢａｎII制限エンドヌクレアーゼを除去する必要が
なく、これにより大量のＢａｎII制限エンドヌクレアー
ゼを容易に製造することが可能となった。
ａｎＩ制限エンドヌクレアーゼだけを生産するため、そ
の精製工程においてＢａｎIII制限エンドヌクレアーゼ
及びＢａｎII制限エンドヌクレアーゼを除去する必要が
なく、これにより大量のＢａｎII制限エンドヌクレアー
ゼを容易に製造することが可能となった。
（実施例） 以下本発明を実施例により、更に詳細に説明するが、本
発明は何らこれらに限定されるものではない。
発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１． (1)ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの遺伝子をもつ染
色体ＤＮＡの調製 バチルス アノイリノリテイカス（Bacillus aneurinol
yticus）ＩＡＭ１０７７をＬ−broth培地［純粋１あ
たりトリプトン（Difco）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎ
ａＣｌ１０ｇをpH７．０に調製したもの］５０ｍに接
種し、３０℃で振盪培養を行なった。１４時間後に菌体
を集めた。次に集めた菌体を１０ｍｇ／ｍのリゾチー
ム［太陽化学（株）製］、２０％ショ糖、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．６）２０
ｍに懸濁し、３７℃で１０分間静置した。次に１％ラ
ウロイルサルコシン酸を含む０．１ＭＥＤＴＡ溶液（pH
９．６）４４ｍ及び５．４４ｍｇ／ｍのプロナーゼ
溶液２．０ｍを加え、５０℃で３０分間静置した。次
に塩化セシウム６６ｇ、１０ｍｇ／ｍのエチジウムブ
ロマイド溶液３．３ｍを加え、混合した後に３８，０
００ｒｐｍ、４０時間の遠心分離を行なった。ＤＮＡ層
を注射器で抜きとり、ｎ−ブタノール抽出によってエチ
ジウムブロマイドを除去し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に透析することに
より約５００μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
色体ＤＮＡの調製 バチルス アノイリノリテイカス（Bacillus aneurinol
yticus）ＩＡＭ１０７７をＬ−broth培地［純粋１あ
たりトリプトン（Difco）１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎ
ａＣｌ１０ｇをpH７．０に調製したもの］５０ｍに接
種し、３０℃で振盪培養を行なった。１４時間後に菌体
を集めた。次に集めた菌体を１０ｍｇ／ｍのリゾチー
ム［太陽化学（株）製］、２０％ショ糖、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH７．６）２０
ｍに懸濁し、３７℃で１０分間静置した。次に１％ラ
ウロイルサルコシン酸を含む０．１ＭＥＤＴＡ溶液（pH
９．６）４４ｍ及び５．４４ｍｇ／ｍのプロナーゼ
溶液２．０ｍを加え、５０℃で３０分間静置した。次
に塩化セシウム６６ｇ、１０ｍｇ／ｍのエチジウムブ
ロマイド溶液３．３ｍを加え、混合した後に３８，０
００ｒｐｍ、４０時間の遠心分離を行なった。ＤＮＡ層
を注射器で抜きとり、ｎ−ブタノール抽出によってエチ
ジウムブロマイドを除去し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８．０）に透析することに
より約５００μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
(2)染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入 (1)で得られた染色体ＤＮＡ３μｇについて０．０２ユ
ニットのＳａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、
３７℃、１時間の反応を行なうことにより、これを部分
分解した。次にベクタープラスミドｐＢＲ３２２［東洋
紡績（株）製］１μｇについて４ユニットのＢａｍＨＩ
制限エンドヌクレアーゼを加え、３７℃、１時間の反応
を行なうことによりこれを完全分解し、更に１ユニット
のアルカリフォファターゼを加え、３７℃、１時間の反
応を行なうことにより、５′末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体ＤＮＡ断片と
１μｇのｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を混合し、更に１ｍ
Ｍ ＡＴＰ及び５ｍＭジチオスレイトールの存在下に５
ユニットのＴ４ファージ由来のＤＮＡリカーゼを用いて
１５℃、１６時間の連結反応を行なうことにより染色体
ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを取得した。
ニットのＳａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼを加え、
３７℃、１時間の反応を行なうことにより、これを部分
分解した。次にベクタープラスミドｐＢＲ３２２［東洋
紡績（株）製］１μｇについて４ユニットのＢａｍＨＩ
制限エンドヌクレアーゼを加え、３７℃、１時間の反応
を行なうことによりこれを完全分解し、更に１ユニット
のアルカリフォファターゼを加え、３７℃、１時間の反
応を行なうことにより、５′末端のリン酸を除去した。
以上の方法により得られた３μｇの染色体ＤＮＡ断片と
１μｇのｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を混合し、更に１ｍ
Ｍ ＡＴＰ及び５ｍＭジチオスレイトールの存在下に５
ユニットのＴ４ファージ由来のＤＮＡリカーゼを用いて
１５℃、１６時間の連結反応を行なうことにより染色体
ＤＮＡを組み込んだプラスミドＤＮＡを取得した。
(3)ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む組み
換えプラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫ−１２株とエシエリヒア・コリＢ
株のハイブリッド株であるエシエリヒア・コリＨＢ１０
１株をＬＢ培地［純水１あたりトリプトン（Difco）
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇをpH７．０に
調製したもの］１０ｍに接種し、３７℃で振盪培養を
行ない、対数増殖期まで生育させた後に集菌した。これ
を氷冷下、最終濃度で０．０３Ｍ ＣａＣｌ２の溶液に
懸濁させてコンピテントな細胞とした。この細胞懸濁液
に(2)で得たプラスミドＤＮＡの溶解液を加えて、氷冷
下で６０分反応させ、４２℃、１〜２分間ヒートショッ
クを与えて、前記プラスミドＤＮＡを細胞内に取り込ま
せた。次いでこの細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種
し、３７℃、３〜５時間振盪培養して形質転換反応を行
なった後、アンピリシン耐性を有し、且つＢａｎＩ制限
エンドヌクレアーゼを生産する株を分離し、エシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１（ｐＢＡＮ１１）（微工研菌寄第９
４２４号）を得た。
換えプラスミドによる形質転換 エシエリヒア・コリＫ−１２株とエシエリヒア・コリＢ
株のハイブリッド株であるエシエリヒア・コリＨＢ１０
１株をＬＢ培地［純水１あたりトリプトン（Difco）
１０ｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ１０ｇをpH７．０に
調製したもの］１０ｍに接種し、３７℃で振盪培養を
行ない、対数増殖期まで生育させた後に集菌した。これ
を氷冷下、最終濃度で０．０３Ｍ ＣａＣｌ２の溶液に
懸濁させてコンピテントな細胞とした。この細胞懸濁液
に(2)で得たプラスミドＤＮＡの溶解液を加えて、氷冷
下で６０分反応させ、４２℃、１〜２分間ヒートショッ
クを与えて、前記プラスミドＤＮＡを細胞内に取り込ま
せた。次いでこの細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種
し、３７℃、３〜５時間振盪培養して形質転換反応を行
なった後、アンピリシン耐性を有し、且つＢａｎＩ制限
エンドヌクレアーゼを生産する株を分離し、エシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１（ｐＢＡＮ１１）（微工研菌寄第９
４２４号）を得た。
(4)エシエリヒア・コリＨＢ１０１（ｐＢＡＮ１１）に
よるＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの生産 (3)で得られた形質転換株エシエリヒア・コリＨＢ１０
１（ｐＢＡＮ１１）（微工研菌寄第９４２４号）を前記
ＬＢ培地５００ｍを含む２容のフラスコで３７℃、
１６時間振盪培養を行なった。これを遠心分離して集
菌、洗浄後１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，７ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（pH７．５）２５ｍに懸濁し、０℃で１０分間の超音
波破砕を行なった。更に１２，０００ｒｐｍで１０分間
の遠心分離により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出
液に硫安粉末を氷冷下添加溶解し、３０〜８０％飽和画
分を（飽和度はOsborne法で表示）を遠心分離により回
収した。この回収沈殿物を２ｍＭメルカプトエタノー
ル、５％グリセロールを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液
（pH７．５）２ｍに溶解し、更に透析チューブに入れ
て、１００倍量の同緩衝液に対して１夜透析した。続い
て同緩衝液にて平衡化したホスホセルロース（ワットマ
ン社製）のカラム（容量２０ｍ）に吸着させた。５倍
量の同緩衝液で洗浄後０〜１．０ＭＫＣｌグラジエント
溶出を行なった。ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼはＫ
Ｃｌ濃度０．５Ｍ付近で溶出された。溶出した酵素液を
透析チューブに入れ、２ｍＭメルカプトエタノール、５
０％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析すること
により０．２ｍの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性を測定したところ１０，０００ユニットであ
った。
よるＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの生産 (3)で得られた形質転換株エシエリヒア・コリＨＢ１０
１（ｐＢＡＮ１１）（微工研菌寄第９４２４号）を前記
ＬＢ培地５００ｍを含む２容のフラスコで３７℃、
１６時間振盪培養を行なった。これを遠心分離して集
菌、洗浄後１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，７ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液
（pH７．５）２５ｍに懸濁し、０℃で１０分間の超音
波破砕を行なった。更に１２，０００ｒｐｍで１０分間
の遠心分離により酵素抽出液を得た。次にこの酵素抽出
液に硫安粉末を氷冷下添加溶解し、３０〜８０％飽和画
分を（飽和度はOsborne法で表示）を遠心分離により回
収した。この回収沈殿物を２ｍＭメルカプトエタノー
ル、５％グリセロールを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液
（pH７．５）２ｍに溶解し、更に透析チューブに入れ
て、１００倍量の同緩衝液に対して１夜透析した。続い
て同緩衝液にて平衡化したホスホセルロース（ワットマ
ン社製）のカラム（容量２０ｍ）に吸着させた。５倍
量の同緩衝液で洗浄後０〜１．０ＭＫＣｌグラジエント
溶出を行なった。ＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼはＫ
Ｃｌ濃度０．５Ｍ付近で溶出された。溶出した酵素液を
透析チューブに入れ、２ｍＭメルカプトエタノール、５
０％グリセロールを含んだリン酸緩衝液に透析すること
により０．２ｍの酵素液が得られた。得られた酵素液
の酵素活性を測定したところ１０，０００ユニットであ
った。
この様にして得られた酵素液は他の制限エンドヌクレア
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的ＤＮaseなどを含ん
でおらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能であ
った。なおＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの活性の測
定は、１μｇのλ−ＤＮＡを２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液、１０ｍＭ絵塩化マグネシウム溶液、５０ｍＭ硫酸ア
ンモニウム、７ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる
反応液４５μに溶解し、その混合液に５μの酵素液
を加えて、３７℃で１時間の反応を行なった後、アガロ
ース電気泳動を行なうことにより測定する。酵素活性に
おける１単位は３７℃、pH７．５において１時間に１μ
ｇのγ−ＤＮＡを完全に分解する酵素活性をいう。
ーゼ、フォスファターゼ、非特異的ＤＮaseなどを含ん
でおらず、遺伝子工学の分野で利用することが可能であ
った。なおＢａｎＩ制限エンドヌクレアーゼの活性の測
定は、１μｇのλ−ＤＮＡを２０ｍＭトリス塩酸緩衝
液、１０ｍＭ絵塩化マグネシウム溶液、５０ｍＭ硫酸ア
ンモニウム、７ｍＭ２−メルカプトエタノールからなる
反応液４５μに溶解し、その混合液に５μの酵素液
を加えて、３７℃で１時間の反応を行なった後、アガロ
ース電気泳動を行なうことにより測定する。酵素活性に
おける１単位は３７℃、pH７．５において１時間に１μ
ｇのγ−ＤＮＡを完全に分解する酵素活性をいう。
第１図は本願発明のｐＢＡＮ１１のプラスミドの制限酵
素地図を示す。
素地図を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】バチルス アノイリノリティカス（Bacill
us aneurinolyticus）ＩＡＭ １０７７由来のＢａｎＩ
制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、制限酵素、Ｓａ
ｕ３ＡＩにより切断された３．６ｋｂである染色体ＤＮ
Ａ断片を組み込んだ、大腸菌にて複製できる組換えプラ
スミドで形質転換されたエシェリヒア（Escherichia）
属に属する微生物を培養し、該培養物からＢａｎＩ制限
エンドヌクレアーゼを採取することを特徴とするＢａｎ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62171746A JPH0630576B2 (ja) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Ｂａｎ▲Ｉ▼制限エンドヌクレア−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62171746A JPH0630576B2 (ja) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Ｂａｎ▲Ｉ▼制限エンドヌクレア−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6416585A JPS6416585A (en) | 1989-01-20 |
| JPH0630576B2 true JPH0630576B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=15928922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62171746A Expired - Fee Related JPH0630576B2 (ja) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Ｂａｎ▲Ｉ▼制限エンドヌクレア−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0630576B2 (ja) |
-
1987
- 1987-07-09 JP JP62171746A patent/JPH0630576B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6416585A (en) | 1989-01-20 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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