JPH0665305B2 - 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法 - Google Patents

組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法

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JPH0665305B2
JPH0665305B2 JP57208370A JP20837082A JPH0665305B2 JP H0665305 B2 JPH0665305 B2 JP H0665305B2 JP 57208370 A JP57208370 A JP 57208370A JP 20837082 A JP20837082 A JP 20837082A JP H0665305 B2 JPH0665305 B2 JP H0665305B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えＤＮＡクローニングベクターに乗つて
いる遺伝子によつて抑制される致死染色体マーカによ
り、組換えＤＮＡ宿主細胞を安定化し、かつ選択する手
段を提供する選択系に関する。プラスミドの様な組換え
ＤＮＡクローニングベクターは細菌集団から急速に失な
われることが多く、工業的規模の発酵では１０１６以上
の細胞が必要となるので、上記手段は非常に重要な意義
を有する。従つて、所望の生成物を暗号化している組換
えＤＮＡをプラスミドに挿入したら、このプラスミドを
含有している微生物培養を安定化させ、この培養を含む
全細胞が所望のプラスミドを含有するようにすること
が、必須ではないにしても、望ましい。外来性ＤＮＡを
持つた組換えＤＮＡは全て不安定であり、一夜培養した
後では、細胞群の９０％以上が組換えプラスミドを含ん
でいなかつたということが多いので、このことは極めて
重要である。この様な場合、所望の遺伝子の発現は、プ
ラスミドを保持している細胞においてのみ可能であるの
で、生産能力は著しく減少する。
本発明は、機能的ポリペプチドを発現する組換えＤＮＡ
を含有している宿主細胞を安定化させ、かつ選択するた
めの方法であつて、該方法は、 ａ）バクテリオフアージλのＰｓｔＩ−ＨincIIｃＩリ
プレツサー含有制限フラグメントおよび機能的ポリペプ
チドを発現する遺伝子を含んでいる組換えＤＮＡクロー
ニングベクタを宿主細胞に導入して形質転換し、 ｂ）宿主細胞に於いては致死的であるかまたは条件的に
致死的であるマーカであるが、該形質転換宿主細胞に於
いては該組換えＤＮＡクローニングベクターに含まれて
いる該リプレツサー遺伝子（抑制遺伝子）により抑制さ
れるマーカを含有している溶原性生物によつて、該形質
転換宿主細胞を溶原化するものであつて、 該組換えＤＮＡクローニングベクターは該リプレツサー
に感受性を持たないプロモーターとレプリコンを有し、
そして条件的に致死的である遺伝子を含有している溶原
性生物で形質転換宿主細胞を溶原化した場合は、得られ
た宿主細胞を制限的条件下で培養することからなる方法
を提供するものである。
本発明はまた、宿主細胞を安定化し、かつ選択する上記
方法に使用される組換えＤＮＡクローニングベクターお
よび該ベクターによつて形質転換した宿主細胞を提供す
るものである。
組換えプラスミドを安定化させる有効な方法については
ほとんど記載がなく、また有効と称する方法も全て著し
い欠点を有する。１つの方法は、組換えプラスミドに抗
生物質耐性遺伝子を挿入し、培養培地に適当な抗生物質
を添加する方法である。抗生物質耐性遺伝子を有するプ
ラスミドを含んでいる細胞は選択され、プラスミドを失
なつたものは選択されずに除去される。この方法の主な
欠点は、抗生物質耐性菌を大規模に増殖しなければなら
ず、培養培地に高価な抗生物質を使用しなければなら
ず、そしてまた所望の生産物から抗生物質を除去するた
めに精製しなければならないことである。
組換えプラスミドを安定化する為のもう１つの既知の方
法は、染色体上に栄養素要求突然変異を補充することで
ある。この方法では、発酵培地の組成が厳しく制限さ
れ、宿主細菌を要求栄養素を含んでいない培地で発酵さ
せる必要がある。更に、細胞はプラスミドを失なつた後
も、栄養共生により生育し続けることもある。従つて、
両タイプの選択法とも、培地の特異な操作に依存してい
る。この様な束縛によつて発酵コストが増大し、生産性
を改善するための選択の余地が制限される。
培地組成に依存しない、あらゆる発酵条件下に於いて組
換ＤＮＡクローニングベクターを維持し得る、そしてポ
リペプチド生産物の生合成を増強し得る選択法の開発が
待ち望まれている。細胞の自滅はこの要求を満たすのに
適したものである。というのは、染色体上に致死マーカ
ーを含み、組換えＤＮＡクローニングベクター上にリプ
レツサーまたは相補遺伝子を含んでいる自滅細胞を組み
立てることができるからである。これらの仕様通り組み
立てられた細胞は、このベクターを失うと死滅する。本
発明はこの原理を改良し、培地中の実質的に全ての生存
細胞が所望の組換クローニングベクターを含んでいる様
にすると共に、クローニングベクターに含まれている遺
伝子の発現を強化するものである。
生産物遺伝子の強力な発現、並びにプラスミドの分離
（segregation）がないことは特に有利であり、かつ、
これらはバクテリオフアージλｃＩリプレツサーが関与
する他の選択系と本発明を区別するのに役立つものであ
る。バクテリオフアージλの、ｃＩリプレツサー遺伝子
含有〜２．５ｋｂＢｇｌＩＩ制限フラグメントと機能的
ポリペプチドを発現する遺伝子を含んでいるクローニン
グベクターからなるこの様な選択系が開示されている。
機能的ポリペプチドを暗号化している遺伝子は発現され
るけれども、そこに開示された特定のプラスミドの構造
は、多少の分離を示しており、また強力な、そして最良
の生産物生産を行ないうるものではない。本発明の改良
法は、組換えＤＮＡを含有している宿主細胞を安定化
し、かつ選択し、同時に機能的ポリペプチドの遺伝子発
現および生合成を最大にする優れた方法であり、上記問
題点を解決するものである。
本発明において、組換えＤＮＡクローニングベクター
は、プラスミド、バクテリオフアージ、およびウイルス
など、１種若しくはそれ以上のＤＮＡ断片を付加するこ
とのできる、あるいは付加されたＤＮＡ分子で構成され
ているあらゆるものを包含するものである。
本明細書に於いて、形質転換（導入）とは、受容宿主細
胞にＤＮＡを導入し、その遺伝子型を変化させ、従つて
受容細胞に遺伝性の変化をもたらすことである。
形質転換体とは、形質転換した受容細胞のことをいう。
リプレツサーは、組換ＤＮＡクローニングベクター上に
位置し、宿主細胞の染色体中の致死遺伝子または条件的
致死遺伝子の発現を抑制、阻止する遺伝子である。
機能的ポリペプチドとは、回収可能な生物活性を有する
全部外来性（ヘテロローガス）のポリペプチドまたは前
駆体、外来性ポリペプチドおよび同質（ホモローガス）
のポリペプチドの一部または全部からなる回収可能な生
物活性を有するポリペプチド、外来性ポリペプチドおよ
び特異的に切断し得る生物活性のない同種ポリペプチド
からなる回収可能な生物活性のない融合ポリペプチド、
またはその存在を検出し得る生物活性ポリペプチドをい
う。
融合遺伝子生産物とは、同種（ホモローガス）ポリペプ
チドの一部または全部と融合した回収可能な外来性ポリ
ペプチドをいう。
マーカーとは、染色体、組換ＤＮＡクローニングベクタ
ーまたはウイルス中の位置および機能が既に知られてい
る遺伝子または遺伝子の組み合せをいう。
Aprはアンピシリン耐性表現型を、Apsはアンピシリン感
受性表現型を、Tcrはテトラサイクリン耐性表現型を、
そしてTcsはテトラサイクリン感受性表現型をそれぞれ
意味する。
既述した様に、本発明は組換ＤＮＡで暗号化されている
生産物を生産する培養を増殖するのに使用することがで
きる。有効な選択系がないと、この様な培養中の細胞の
多くは所望のプラスミドを失ない、従つて所望の生成物
の生産が著しく減少する。本発明は、培養内の実質的に
全ての生存細胞が組換えＤＮＡクローニングベクターを
含有することおよび、より多量の機能的ポリペプチドが
生合成される様に遺伝子発現を強化することを保証する
ものである。従つて本発明は、プラスミドの分離がない
こと、遺伝子発現のレベルが強化されていること、およ
びこの方法を実施した場合、非改良方法と比較して、有
意に多量の機能的ポリペプチドが生産されることなどの
点で特に有利であり、優れたものである。
本発明は、合成が組換えＤＮＡクローニングベクターに
よつて決定されるあらゆる物質の生産に使用し得る点で
特に万能のものである。好ましい組換えＤＮＡクローニ
ングベクターはプラスミドであるが、バクテリオフアー
ジや、本発明を例示するのに有用なその他のベクター
も、本発明で使用し得ることは当業者には明らかであろ
う。本発明の有用性は機能的ポリペプチドを発現する遺
伝子に依存するものではないので、１種若しくはそれ以
上の商業的価値のある遺伝子を持つた組換え株を使つて
も本発明を実施することができる。さらに、既述した遺
伝子発現の増強は、特定の生産物遺伝子に限られるもの
ではない。この様に、本発明の改良法は、組換えＤＮＡ
技術を使つてあらゆる機能的ポリペプチドまたはその他
の遺伝子生成物を生産するのに有用である。
組換えＤＮＡ宿主細胞を安定化させ、かつ保持するため
に、細胞の自滅を応用することを例示するために、バク
テリオフアージλとＥ．Ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２の相
互作用を利用することにする。バクテリオフアージλ
は、Ｅ．ＣｏｌｉＫ１２に感染する際、２つの互いに排
他的なサイクルのいづれかに従う穏和バクテリオフアー
ジである。溶菌相に於いて、バクテリオフアージＤＮＡ
は自発的に複製し、バクテリオフアージ成分の合成及び
組み立てを指揮し、成熟バクテリオフアージの放出と共
に細胞を死滅させる。溶原相に於いては、バクテリオフ
アージはプロフアージとして宿主の染色体内に統合さ
れ、染色体上のマーカーとして複製し、バクテリオフア
ージ成分の合成をブロツクする。バクテリオフアージ遺
伝子、λｃＩは、溶原状態を維持し、バクテリオフアー
ジ成分および成熟の遺伝子の発現をブロツクするリプレ
ツサーを暗号化している。もしリプレツサーが不活性化
されたり細胞から除去されると、このプロフアージは染
色体から分離し、溶菌サイクルに入り、細胞を死滅させ
る。欠損λｃＩ遺伝子を持つたバクテリオフアージは、
機能的リプレツサーを別のソースから与えないと溶原状
態を維持することができず、細胞を死に至らしめる。本
発明に例示する態様では、λｃＩ９０［カイサー（Kais
er，Ａ．Ｄ．），Virology、３：４２−６１（１９５
７）］がリプレツサー依存性プロフアージとして使用さ
れ、制限フラグメントに含まれ、組換えＤＮＡクローニ
ングベクターにクローンされるｃＩ遺伝子が機能的リプ
レツサーとして働いている。
更に詳しくは、本発明の有用性および改良された選択系
はtrpE−インシユリンＡ鎖遺伝子を含んでいるプラスミ
ドpIA7Δ４Δ１〜１．３ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢamＨＩ制限
フラグメントを、新規なプラスミドpPR12にクローンす
ることによつて示すことができる。これは、プラスミド
pPR12.4kbEcoRI−BamHIセグメント（断片）を削除する
様に行なう。プラスミドpIA7Δ４Δ１〜1.3kb制限フラ
グメントの代りに、あらゆる所望のＤＮＡフラグメント
を使用することができるので、プラスミドpPR12は一般
にベクターとして有用である。プラスミドpPR12は、バ
クテリオフアージλｃＩ857リプレツサーを含んでいる
プラスミドpPR3〜．９ｋｂＰstＩ−HincII制限フラグメ
ントをプラスミドpBR322に挿入することにより組み立て
られる。プラスミドpPR3は、バクテリオフアージλｃＩ
857の２．５kbBglIIフラグメントをプラスミドpIB7Δ４
Δ１の唯一のBamHI制限サイトに挿入することにより組
み立てられる。このバクテリオフアージλｃＩ857の
２．５ｋｂBalII制限フラグメントは、ｃＩリプレツサ
ー遺伝子を含むほか、rex遺伝子およびcro遺伝子の一部
をも含んでいる。驚くべきことに、このｃＩリプレツサ
ー遺伝子含有制限フラグメントから、cro遺伝子およびr
ex遺伝子の大部分を除去すると、遺伝子発現が強化、増
大し、機能的ポリペプチドの生産が著しく増大する。本
発明を例示するのに使用される特に好適な、croおよびr
exを除去したλcI含有制限フラグメントは、プラスミド
pPR12の〜.9kbPstI−HincII制限フラグメントである。
プラスミドpIA7Δ４Δ１、pIB7Δ４Δ１、pPR3およびpP
R12の制限サイトおよび機能地図を添付の第１図〜第４
図に示した（図中、矢印は転写の方向を示している）。
プラスミドpIA7Δ４Δ１は、Ｅ．coliトリプトフアンプ
ロモーター、抗生物質耐性マーカー、およびヒトインシ
ユリンのＡポリペプチド鎖と融合したＥ．coli trpE蛋
白質の一部からなる融合遺伝子生産物を発現する遺伝子
を含んでいる。プラスミドpIB7Δ４Δ１は、ヒトインシ
ユリンのＡポリペプチド鎖の代りにＢポリペプチド鎖と
融合したtrpE蛋白質の一部からなる融合遺伝子生産物を
発現する遺伝子を含んでいることを除けば上記のものと
類似している。
プラスミドpIA7Δ４Δ１は、プラスミドpBR322から導か
れ、実施例１Ａ−１に開示した方法で組み立てられる。
慣習により、記号「Δ」は削除を意味する。従つて、例
えばプラスミドの後に「ΔEcoRI−XbaI」と書かれたも
のは、EcoRIおよびXbaI制限酵素サイト間のヌクレオチ
ド配列が、これらの酵素によつて消化されて除去された
プラスミドを意味する。簡略化のため、削除を数字で表
わすこともある。例えば親プラスミドpBR３２２のテト
ラサイクリン耐性遺伝子の前のEcoRI認識サイトの最初
の塩基対（bp）から開始して、「Δ１」はbp1−30（即
ちΔEcoRI−HindIII）を削除したことを意味し、従つ
て、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター系を
不能にしたことを意味する。「Δ２」は、bp1−375（即
ちΔEcoRI−BamHI）の削除を意味し、従つて、テトラサ
イクリンプロモーター／オペレーターとテトラサイクリ
ン耐性を暗号化している構造遺伝子の一部を除去したこ
とを意味する。「Δ４」は、trpオペロンフラグメント
からbp〜900−〜1500の削除、trpDポリペプチドの構造
遺伝子の除去を意味する。
この〜１．３kbEcoRI−BamHI trpＥ−インシユリンＡ鎖
遺伝子を含んでいるプラスミドpIA7Δ４Δ１の制限フラ
グメントを、プラスミドpPR12の〜４．７kbEcoRI−BamH
I制限フラグメント（以下、pPR12Δ２という）にクロー
ニングすると、新規プラスミドpPR17が得られる。この
プラスミドpIA7Δ４Δ１〜1.3kbEcoRI−BamHI制限フラ
グメントはΔ２の部分を含んでおり、従つてその構造は
Δ２からΔ１に復活している。プラスミドpPR17は、バ
クテリオフアージλcI857の〜．９ｋｂＰｓｔＩ−HincI
I制限フラグメントを含んでおり、従つて溶原化された
宿主細胞中でのバクテリオフアージ・ラムダの溶菌活性
を阻止する。さらに、プラスミドpPR17は、既知の他の
λcI遺伝子含有プラスミドより有意に高いレベルで、前
記trpＥ−インシユリンＡ鎖融合遺伝子生産物を暗号化
し、発現する。プラスミドpPR17の制限サイトおよび機
能地図は第５図に示した（図中、矢印は転写の方向を示
している）。
新規pPR17組換えプラスミドは、大腸菌、例えばE.coliK
12294（Goeddelら、１９７９、Proc.Nat.Acad.Sci.Ｕ．
Ｓ．Ａ．76：106）、E.coliＫ１２ RV３０８（Mauer
ら、１９８０、Ｊ．Mol.Biol.１３９：１４７〜１６
１）、E.coli K12 C600（Bachman、１９７２、Bacterio
l.Rev.３６：５２６〜５５７）、E.coli K12Ｃ６００Ｒ
Ｋ−ＭＫ−（ChangおよびCohen、１９７４、Proc.Nat.A
cad.Sci.71：1030−1034）などの形質転換に使用するこ
とができる。こうして得られた株は、機能的cIリプレツ
サーを産生しないバクテリオフアージλ、例えばバクテ
リオフアージλcI90で溶原化することができる。組み立
てられた株E.coli K12 294λcI90／pPR17、E.coli K12
RV308λcI90／pPR17、E.coli K12 c600λcI90／pPR17お
よびE.coli K12 C600ＲＫ−Ｍｋ−λcI9C／pPR17はpPR1
7プラスミドの保持が必要であるが、組み立てられた株
E.coli K12 294／pPR17、E.coli K12 RV308／pPR17、E.
coli K12 C600／pPR17、およびE.coli K12 C600ＲＫ−
ＭＫ−／pPR17は、このプラスミドがなくても同様に生
きのびることができる。株中のプラスミド保持を比較す
ると、本発明の株の実質的に全ての生存細胞が所望のプ
ラスミドを含んでいることがはつきりとわかる。さら
に、このE.coli K12 294λcI90／pPR17、E.coli K12 RV
308λcI90／pPR17、E.coli K12 C600λcI90／pPR17、お
よびE.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−λcI90／pPR17株は、
pPR17プラスミドを保持しているばかりではなく、所望
の融合遺伝子生産物を産生する。
本発明の改良選択系および有用性はまた、trpＥ−イン
シユリンＢ鎖遺伝子を含むプラスミドpIB7Δ４Δ１〜1.
3kb EcoRI−BamHI制限フラグメントを、プラスミドpPR1
7について記載したものと同じ方法で、プラスミドpPR12
にクローニングすることによつても例示することができ
る。プラスミドpIB7Δ４Δ１は、pIA7Δ４Δ１について
の記載と類似の方法で、プラスミドpBR322から誘導され
る。プラスミドpIB7Δ４Δ１の構造については実施例２
で述べる。
前記〜1.3kb EcoRI−Bam HI trpＥ−インシユリンＢ鎖
遺伝子を含有している。プラスミドpIB7Δ４Δ１の制限
フラグメントを、プラスミドpPR12の〜4.7kb EcoRI−Ba
mHI制限フラグメントにクローンすると、新規プラスミ
ドpPR18が得られる。プラスミドpPR18はバクテリオフア
ージλcI857の〜.9kb pstI−HincII制限フラグメントを
含んでおり、溶原化された宿主細胞中でのバクテリオフ
アージ・ラムダの溶菌活性を阻害する。更に、プラスミ
ドpPR18は、既知の他のλcI遺伝子含有プラスミドより
有意に高いレベルで、前記trpＥ−インシユリンＢ鎖融
合遺伝子生産物を暗号化し、発現する。プラスミドpPR1
8の制限サイトおよび機能地図は第６図に示した（図
中、矢印は転写の方向を示している。）。
新規pPR18組換えプラスミドを大腸菌、例えばE.coli K1
2 294、E.coli K12 RV308、E.coli K12 C600、E.coli K
12 C600ＲＫ−ＭＫ−などに入れて形質転換することが
でき、得られた株を機能的cIリプレツサーを産生しない
バクテリオフアージλ、例えばバクテリオフアージλcI
90で溶原化することができる。溶原化したpPR17含有株
について既述した様に、組み立てられたE.coli K12 294
λcI90／pPR18、E.coli K12 RV308λcI90／pPR18、E.co
li K12 C600λcI90／pPR18およびE.coli K12 C600ＲＫ
−ＭＫ−λcI90／pPR18株は、pPR18プラスミドの保持を
必要とするが、一方、組み立てられた株E.coli K12 294
／pPR18、E.coli K12 RV308／pPR18、E.coli K12 C600
／pPR18およびE.coli K12C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR18はこ
のプラスミドを必要とせず、このプラスミドなしで同様
に生存し続けることができる。株中のプラスミド保持を
比較すると、本発明の株の実質的に全ての生存細胞が所
望のプラスミドを含んでいることがはつきりとわかる。
更に、このE.coli K12 294λcI90／pPR13、E.coli K12
RV308λcI90／pPR18、E.coli K12 C600λcI90／pPR18お
よびE.coli K12C600ＲＫ−ＭＫ−λcI90／pPR18株は、
それらのプラスミドを保持しているばかりでなく、所望
の融合遺伝子生産物を産生する。
新規プラスミドpPR12は、種々の宿主細胞、例えばE.col
i K12 C600ＲＫ−ＭＫ−に入れることができる。得られ
た株を、プラスミドpPR17およびpPR18形質転換体の場合
と同様にして、溶原化し、このプラスミドなしには生存
できない株をつくることができる。即ち、組み立てられ
た株、E.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−λcI90／pPR12は、
pPR12プラスミドの保持が必要であるが、一方、組み立
てられた株E.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR12はこの
プラスミドがなくても同様に生存し続けることができ
る。株中のプラスミド保持を比較すれば、本発明に係る
株の実質的に全ての生存細胞が所望のプラスミドを持つ
ていることがはつきりとわかる。
本発明を例示するために使用したλcI857リプレツサー
遺伝子は温度に敏感であり、３８〜４４℃またはそれ以
上で不活性化される。従つて温度が３８〜４４℃になる
と、本発明によつて宿主細胞株に導入されたラムダ−プ
ロフアージの溶菌サイクルが誘発されて細胞が溶解す
る。容易に理解されるであろうが、宿主細胞の溶菌を引
き起こす致死マーカーまたは条件的致死マーカーを抑制
する温度感受性リプレツサーを使用し、次いでその宿主
細胞を、リプレツサーを不活性化する温度で培養する
と、そして条件的致死マーカーの場合は宿主細胞を培養
し得る温度範囲外の温度で培養すると、本発明に係る改
良選択法は、細胞内生産物を精製するための、簡単かつ
容易な、そして経済的な溶菌法となる。
例示した様に、本発明では致死染色体マーカーを抑制す
るのに、プラスミド担持遺伝子を使用する。細胞の選択
は、プラスミド上のレプリコン、および他の遺伝子には
依存せず、本発明の好ましい実施態様ではバクテリオフ
アージλcI857の〜.9kb PstI−HincIIcI含有制限フラグ
メントを使用しているが、機能的リプレツサーを産生す
るその他のあらゆるバクテリオフアージλ株の〜.9kb P
stI−HincIIcI含有制限フラグメントも使用することが
できる。更に、本発明を例示するために使用されたプロ
フアージはλcI90ミユーテーシヨンをもつており、機能
的λcIリプレツサーを産生しないが、その他のバクテリ
オフアージλミユータント（突然変異体）も、機能的cI
リプレツサー遺伝子を持つていなければ、使用すること
ができる。容易に理解されようが、この様なミユータン
トは、溶原状態を保持するために、他のリプレツサーソ
ースを必要とする。
本発明の選択法により機能的ポリペプチドの発現を増強
させることができ、有用な種々の生産物を発現するプラ
スミド担持遺伝子を持つた宿主細胞に適用することがで
きる。例えば、プラスミドの担なつている遺伝子は、天
然の遺伝子、天然にない遺伝子、または一部が天然の遺
伝子であり一部が合成のあるいは非天然の遺伝子からな
るものであつてもよい。具体的には、本発明はヒトプレ
プロインシユリン、ヒトプロインシユリン、ヒトインシ
ユリンＡ鎖、ヒトインシユリンＢ鎖、ヒト成長ホルモ
ン、非ヒト成長ホルモン、非ヒトインシユリン、ヒトイ
ンターフエロン、非ヒトインターフエロン、ウイルス抗
原、ウロキナーゼ、あらゆるペプチドホルモン、あらゆ
る酵素、あらゆるポリペプチド、および実質的に全て
の、研究的または商業的価値を有するものを暗号化して
いる遺伝子を担なつているプラスミドを含有する細胞を
選択し、そして維持するのに使用することができる。
本明細書に記載した本発明の具体的な実施態様では、プ
ラスミドの複製および遺伝子生産物の発現は、それぞれ
pMB1からのレプリコン（Bolivar Life Sei.25：807−91
8、1979参照）およびtrpプロモーターによつて決定され
る。その他のレプリコンおよびプロモーターも、それら
がE.coli K12内で機能し、そして使用している特定のリ
プレツサーに感受性を有しない限り、使用することがで
きる。どの様なレプリコンおよびプロモーターがE.coli
K12内で機能するか、そして特定のリプレツサーに感受
性を持たないかは、当業者の知るところであり、あるい
は容易に決定され得るものである。その他のレプリコン
の例としては、Co1E1、NR1、RK2、RK6、PSC101、RP1、R
P4、Ｆなどからのレプリコン、E.coli K12内で複製する
バクテリオフアージのものなどを挙げることができる
が、こらに限定されるものではない。一方、その他のプ
ロモーターの例としては、lacプロモーター、リポプロ
テインプロモーター、リボゾーム蛋白質またはＲＮＡプ
ロモーター、およびその他のあらゆるプロモーターが含
まれる。その他のレプリコンおよびプロモーターを組み
立て得ることは、当業者の知るところである。
E.coli K12は、バクテリオフアージλにとつて好適な宿
主であるという事実のほか、この株についての遺伝学的
および生化学的情報が豊富であるので、この株は本発明
の目的に好適である。E.coli K12 RV308株は最も好まし
いものであるが、本発明は１つの属、種、あるいは株に
限定されるものではなく、あらゆるE.coli（大腸菌）あ
るいは、バクテリオフアージλが溶原化を起こし、機能
的リプレツサーをクローンし得るその他の細胞も使用す
ることができる。
本発明の全ての実施態様の共通した特徴は、それらが培
地組成の影響を受けないということである。従つて、本
発明においては、生産性を改良するために広範囲に発酵
操作を変えることができる。
以下の実施例は本発明を例示し、その好ましい実施態様
を示すものである。必要に応じて本発明を実施するため
の実際の手法および説明をつけた。
実施例１ プラスミドpIA7Δ４Δ１の組み立て Ａ．プラスミドpBRH trpの組み立て プラスミドpGM1は、欠失部ΔLE1414（Mio−zzariら、１
９７８、J.Bacteriology.1457−1466）を有するE.coli
トリプトフアンオペロンを持つており、従つて、trpプ
ロモーター−オペレーター系の支配下に、trpＤポリペ
プチド全体と、trpリーダー配列の最初の６個のアミノ
酸とtrpＥポリペプチドの最後のほゞ1/3（以降合わせて
LE′という）からなる融合蛋白質を発現する。E.coli K
12 W3110 tna 2trp−Δ102／pGM1はアメリカン・タイプ
・カルチユア・コレクシヨンに寄託されており（ATCC N
o.31622）、この株から、以下に述べる方法でpGM1を簡
単に取り出すことができる。
このプラスミド約２０μｇを、このプラスミドを５ケ所
（サイト）で切断する制限酵素＊PvuIIで消化した。次
いでこの遺伝子フラグメントをEcoRIリンカー（配列pCA
TGAATTCATGの自己相補性オリゴヌクレオチドからなつて
いる）と結合させると、後に、EcoRIサイトを持つたプ
ラスミドにクローンするためのEcoRI開裂サイトができ
る。
pGM1から得たＤＮＡフラグメント２０μｇをＴ４ＤＮＡ
リガーゼ緩衝液（２０mMトリス、pH7.6、0.5mMATP、10m
M MgCl2、５mMジチオトレイツト）２０μ中、５′−
燐酸化合成オリゴヌクレオチドpCATGAATTCATG２００ピ
コモルの存在下、４℃で一夜、１０単位のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで処理した。次いでこの溶液を７０℃で10分間加
熱してリゲーシヨン（結紮）を停止させた。このリンカ
ーをEcoRI消化によつて開裂させ、EcoRI末端を持つたフ
ラグメントを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
（以降、PAGEという）によつて分離した。先づエチジウ
ムブロミドで着色し、次いで紫外線でフラグメントの位
置を確かめ、該当箇所のゲル部分を切断することによ
り、３個の最も大きなフラグメントをゲルから分離し
た。各ゲルフラグメントを、０．１×TBE300μで、透
析袋に入れ、０．１×TBE緩衝液（TBE緩衝液は水１
中、トリス塩基１０．８gm、ホウ酸5.5gm、Na2EDTA0.09
gmを含む）中、１００ｖで１時間電気泳動にかけた。水
溶液を透析袋から集め、フエノール抽出、クロロホルム
抽出し、塩化ナトリウムについて0.2Mとした。次いでエ
タノール沈澱の後、ＤＮＡを水にとつた。EcoRI粘着性
末端を持つたこのtrpプロモーター／オペレーター含有
遺伝子を、後記の方法で同定した（これは、プロモータ
ー／オペレーターの挿入により、テトラサイクリン耐性
になるテトラサイクリン感受性プラスミドへのフラグメ
ントの挿入についての説明も含むものである）。以降、
全てのＤＮＡフラグメントの分離はPAGEを用い、次いで
上記の電気溶出法によつて行なつた。＊ 前記の制限酵素およびその他の酵素は、Be thesda Re
serch Laboratories Inc.（Box6010 Rockuille,Marylan
d 20850）；Boehringer Mannheim Biochemicals（7941
Castleway Drive P.O.Box 50816 Indianapolis.Indiana
46250）；およびReseach Products Miles Laboratorie
s Inc.（ELKhart.Indiana 46515）から容易に入手する
ことができる。
B.Trpプロモーター／オペレーターの支配下にテトラサ
イクリン耐性を発現するプラスミドpBRHtrpの組み立て
および上記Ａで分離したTrpプロモーター／オペレータ
ー含有ＤＮＡフラグメンノ同定および増幅 プラスミドpBRH1（Rodriguezら、1979、Nucleic Acids
Reserch6、3267〜3287）はアンピシリン耐性を発現す
る。そしてテトラサイクリン耐性遺伝子も持つている
が、それに関連するプロモーターが存在しないのでその
耐性を発現しない。従つて、このプラスミドはテトラサ
イクリン感受性である。このEcoRIサイトにプロモータ
ー／オペレーター系を導入することにより、このプラス
ミドをテトラサイクリン耐性にすることができる。
プラスミドpBRH1をEcoRIで消化した。この酵素をフエノ
ール抽出、次いでクロロホルム抽出により除去し、次い
でこのＤＮＡを水中、エタノール沈澱させて回収した。
得られたＤＮＡ分子を、別々の反応混合物中、実施例１
Ａで得た３種のＤＮＡフラグメントのそれぞれと混合
し、既述した様に、Ｔ４DNAリガーゼで結合させた。こ
の反応混合物中に存在するＤＮＡを使つて、受容能力の
あるE.coli K12株２９４（Backmanら、1976、Proc.Nat.
Acad.Sci.USA 73：4174−4198、ATCCNo.31446）を、標
準的な方法（Hershfieldら、１９７４、Rroc.Nat.Acad.
Sci.USA 71：3455−3459）によつて形質転換し、この細
菌をアンピシリン20μｇ／mlおよびテトラサイクリン５
μｇ／mlを含有するLBプレート（Miller.1972）上に置
いた。
いくつかのテトラサイクリン耐性コロニーを選択し、そ
のプラスミドを分離し、これをpBRHtrpと命名した。所
望のフラグメントの存在は、制限酵素分析により確認し
た。プラスミドpBRHtrpはβ−ラクタマーゼを発現し、
アンピシリン耐性を示し、trpプロモーター／オペレー
ターを含むDNAフラグメントを含有している。このＤＮ
Ａフラグメントは、trpリーダーの最初の６個のアミノ
酸とtrpＥポリペプチドのほゞ最後の1/3の融合からなる
第１蛋白質（LE′という）、trpＤポリペプチドの最初
のほゞ半分に相当する第２蛋白質（Ｄ′という）、およ
びテトラサイクリン耐性遺伝子によつて暗号化されてい
る第３蛋白質、をも暗号化している。
Ｃ．プラスミドpSOM7Δ２の組み立て プラスミドpBRHtrpをEcoRI制限酵素で消化し、得られた
フラグメントをPAGEおよび電気溶出で分離し、EcoRIで
消化したプラスミドpSOM11（Itakuraら、1977、Sci.19
8：1056、イギリス国特許出願公告第2.007.676A号）と
混合した。この混合物をＴ４DNAリガーゼで結合させ、
得られたDNAを、既述した方法でE.coli K12株２９４に
導入（形質転換）した。形質転換菌をアンピシリン含有
プレート上で選択し、得られたアンピシリン耐性コロニ
ーをコロニー雑種形成法（Gruensteinら、１９７５、Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 72：３９５１−３９６５）によつ
てスクリーニングした。上記操作において、pBRHtrpか
ら分離しP32を用いて放射活性標識を施したtrpプロモー
ター／オペレーター含有フラグメントをプローブとして
用いた。いくつかのコロニーがコロニー雑種形成によつ
て陽性であることがわかり、従つて選択された。プラス
ミドDNAを分離し、挿入フラグメントの位置を酵素BglII
およびBamHIを用いた二重消化で、制限分析によつて決
定した。適切な位置にtrpプロモーター／オペレーター
フラグメントを持つた所望のプラスミドを含有している
コロニーを、アンピシリン１０μｇ／mlを含有している
ＬＢ培地（Miller.1972）で培養した。この所望のプラ
スミドをpSOM7Δ２と命名し、次の工程に使用した。
Ｄ．プラスミドpTrp24の組み立て １．その暗号鎖の５′および３′末端にそれぞれBglII
およびEcoRI制限サイトを持つたＬＥ′ポリペプチドの
遠位領域のコドンを含有する遺伝子フラグメントの組み
立て プラスミドpSOM7Δ２をHindIII消化し、次いでラムダエ
キソヌクレアーゼ（５′→３′エキソヌクレアーゼ）
で、ＬＥ′暗号領域内のBglII制限サイトを越えて消化
する様に選んだ条件下で消化した。HindIII−消化pSOM7
Δ２の約２０μｇを緩衝液（２０mMグリシン緩衝液、pH
9.6、１mMMgCl2、１mMβ−メルカプトエタノール）に溶
解した。得られた混合物をラムダエキソヌクレアーゼ５
単位で、６０分間室温で処理した。得られた反応混合物
をフエノール抽出、次いでクロロホルム抽出した後エタ
ノール沈澱させた。
ＬＥ′遺伝子フラグメントの遠位末端にEcoRI残部をつ
くるために、改良ホスホトリエステル法（Creaら、197
8、Proc.Nat.Acad.Sci.USA75：5765）によつてプライマ
ー32pCCTGTGCATGATを合成し、ラムダエキソヌクレアー
ゼ消化により得たLE′遺伝子フラグメントの１本鎖末端
と雑種形成させた。この雑種形成は、プラスミドpSOM7
Δ２のラムダエキソヌクレアーゼー処理HindIII消化生
成物２０μｇを水２０μに溶解し、これを上記の５′
−燐酸化オリゴヌクレオチド約８０ピコモルを含有する
溶液６μと混合することにより行なつた。この合成フ
ラグメントをLE′暗号配列の３′末端に交配（雑種形
成）し、LE′フラグメントの残りの１本鎖部分を、dAT
P、dTTP、dGTPおよびdCTPを使つてKlenowポリメラーゼ
Ｉによつて埋めた。KlenowポリメラーゼＩは、ＤＮＡポ
リメラーゼＩの蛋白質分解開裂によつて得たフラグメン
トであり、５′→３′ポリメリ化活性、および３′→
５′エキソヌクレアーゼ活性（exonucleolytic activit
y）を持つているが、親酵素の持つ５′→３′エキソヌ
クレアーゼ活性は持つていない（Kornberg、1974、W.H.
FreemanおよびCo.，SFO,98）。
反応混合物を５０℃に加熱し、徐々に１０℃に冷却した
後、Klenow酵素４μを添加した。室温で１５分間、次
いで３７℃で３０分間インキユベートした後、０．２５
モルのEDTA５μを加えて反応を停止させた。反応混合
物をフエノール、次いでクロロホルム抽出し、エタノー
ルで沈澱させた。次いでＤＮＡを制限酵素BglIIで開裂
し、そのフラグメントをPAGEで分離した。ゲルから得ら
れた放射能写真から、約470bpの期待した長さの32P標識
フラグメントを検出し、これを電気溶出により回収し
た。概説した様に、このフラグメントLE′(d)は、プラ
イマーのはじまりと一致する鈍感末端（ブラントエン
ド）とBglII末端を持つている。
２．プラスミドpThα１の組み立て チモシンアルフア（thymosin alpha）１の合成遺伝子を
プラスミドpBR322に挿入することによりプラスミドpTh
α１を組み立てた。このチモシンアルフア１暗号DNAの
合成は、チモシンアルフア１遺伝子を示した第７図にお
いて双頭矢印で示してある１６個のオリゴヌクレオチド
（Ｔ１からＴ１６）の合成およびそれらの結合からな
る。Ｎ末端にMetコドンATGを挿入し、５′末端を、EcoR
IとBamH1で開裂されたプラスミドに結合しやすい様に、
１本鎖粘着末端でデザインした。容易に理解される様
に、この遺伝子の中央のBglIIサイトは、組換プラスミ
ドの分析に役立つ。
オリゴデオキシリボヌクレオチドＴ１〜Ｔ１６は、完全
に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド組み立てブ
ロツクを使つて、改良ホスホトリエステル法で合成し
た。（Itakuraら、1977、Science198：1056およびCrea
ら、1978）。種々のオリゴデオキシリボヌクレオチドを
以下の表１に示す。
上記の合成は、第８図に示したフラグメントＴ１５の合
成法によつて代表させることができる。この図には、Ｔ
１５の合成に使用される各種のヌクレオチドフラグメン
トが数字で示してある。略号は以下の意味を持つ：TPST
e＝２，４，６−トリイソプロピルベンゼンスルホニル
テトラゾール；BSA＝ベンゼンスルホン酸；TLC＝薄層ク
ロマトグラフイー；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフ
イー；ＤＭＴ＝４，４′−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝
２−シアノエチル；Ｒ＝ｐ−クロロフエニル；Ｂｚ＝ベ
ンゾイル；An＝アニソイル；iBu＝イソブチル；Py＝ピ
リジン；AcOH＝酢酸；Et3N＝トリエチルアミン。
完全に保護されたトリデオキシリボヌクレオチド４（８
５mg、０．０５mM）および２（180mg、０．１mM）の
５′水酸基の位置を、それぞれ１０および２０mlのクロ
ロホルム／メタノール（７／３（Ｖ／Ｖ））混合中、２
％ＢＳＡで処理することにより脱保護した。飽和重炭酸
アンモニウム水溶液（２ml）を加えて反応を停止させ、
クロロホルム（25ml）で抽出し、水（２×10ml）で洗浄
した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、少量（約５
ml）になるまで濃縮し、石油エーテル（35°〜60℃のフ
ラクシヨン）を加えて沈澱させた。無色の沈澱を遠心分
離で集め、デシケーターに入れて減圧下で乾燥すると、
それぞれ化合物６および８がそれぞれ得られた。いづれ
もシリカゲルTLCで均一であつた（MerK60F254、クロロ
ホルム／メタノール（９／１））。
トリマー１および３（それぞれ270mg、0.15mM；145mg、
0.075mM）を、トリエチルアミン／ピリジン／水（１：
３：１、Ｖ／Ｖ、10ml）で、２５分間室温で処理するこ
とにより、ホスホジエステル体５および７に変換した。
試薬をロータリーエバポレータで除去し、残渣を無水ピ
リジン（３×１０ml）を加えて繰り返し蒸発させること
により乾燥した。トリマー８（0.05mM）とトリマー７を
無水ピリジン（３ml）中、TPSTe（50mg、0.15mM）と混
合し、この反応混合物を減圧下、室温で２時間放置し
た。TLC分析により、トリマー８の９５％がヘキサマー
に変換したことがわかつた（１０％水性硫酸を噴霧し、
６０℃で加熱することによりＤＭＴ基を検出して確認さ
れる）。水（1.0ml）を加えて反応を停止し、減圧下で
溶媒を留去した。トルエンとの共沸によつてピリジンを
除去した後、トリマー４および２について既述した様
に、２％BSA（８ml）を用いてヘキサマーの５′位を脱
保護した。生成物１０を、クロロホルム／メタノール
（９８：２から９５：５（Ｖ／Ｖ）の段階的グラジエン
ト溶出）を用い、シリカゲルカラム（Merck 60H、3.5×
５cm）で精製した。生成物１０を含むフラクシヨンを蒸
発乾固した。
同様にして、トリマー５を６と結合し、この完全に保護
した生成物をシリカゲルで直接精製した。後者の化合物
を既述した様にトリエチルアミン／ピリジン／水で処理
して３′末端を脱保護するとフラグメント９が得られ
た。
最後に無水ピリジン（２ml）中、縮合剤としてTPSTe
（７５mg、0.225mM）を用いてヘキサマー９と１０をカ
ツプリングさせた。反抗終了後（室温で４時間）、反応
混合物をロータリーエバポレータにかけ、残渣をシリカ
ゲルカラムにかけた。石油エーテルで沈澱させると、生
成物１１が得られた。これはTLCにおいて均質であつ
た。化合物１１の１部（20mg）をピリジン（0.5ml）に
入れ、濃水酸化アンモニウム処理（７ml、８時間、６０
℃）、次いで８０％酢酸中での処理（１５分、室温）に
より、完全に脱保護した。酢酸を蒸発させた後、固状残
留物を４％水酸化アンモニウム水（Ｖ／Ｖ、４ml）に溶
解し、エチルエーテル（３×２ml）で抽出した。水相を
１〜２mlまで濃縮し、１部をHPLCにかけて化合物１２を
精製した。主ピークに相当するフラクシヨン（約2.0O.
D.254単位）をプールし、約５mlに濃縮した。最終生成
物１２をBio−gel−２により、２０％水性エタノールで
溶出することにより脱塩し、乾燥させ、水（200μ）
に再懸濁するとＡ２５４＝１０の溶液が得られた。１２
の配列は２次元配列分析によつて確認した。
ソマトスタチン（ITaKuraら、1977）インユリン（Goedd
elら、1979）および生長ホルモン（Goeddel、Heyneker,
ら、1979、Nature281：544）について詳細に報告されて
いる方法に従つて、１６個の合成オリゴヌクレオチドか
ら、完全なチモシンアルフア１遺伝子を組み立てた。Ｔ
２からＴ１５までのオリゴヌクレオチド10μｇを、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（Goeddelら、1979）の存在
下、〔−３２Ｐ〕−ATP（New England Nuclear）で定
量的に燐酸化すると約１Ci／mMの比活性が得られた。放
射能標識フラグメントを２０％ポリアクリルアミド／7M
尿素ゲル電気泳動で精製し、溶出したフラグメントの配
列を、部分的蛇毒消化液の２次元電気泳動／ホモクロマ
トグラフイー（Jayら、1974、Nucleic Acids Res.１：3
31）によつて確認した。次の結合反応において、望まし
くない重合を最小限にするために、フラグメントＴ１と
Ｔ１６は脱燐酸化しなかつた。発表されている方法（Go
eddelら、１９７９）を使つて、Ｔ４DNAリガーゼによ
り、これらのオリゴヌクレオチド（各２μｇ）を、４つ
のフラグメントの４つのグループに組み合わせた（第９
図参照）。この反応生成物を、７Ｍの尿素を含む１５％
ポリアクリルアミドゲル上、ゲル電気泳動によつて精製
した（MaxamおよびGilbert.1977.Proc.Nat.Acad.Sci.US
A71：3455）。４つの単離した生成物を結合させ、この
反応混合物を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よつて分析した。チモシンアルフア１遺伝子のサイズ範
囲のDNA（90〜105bp）を電気溶出した。
プラスミドpBR322（0.5μｇ）をBamHIおよびEcoRI制限
エンドヌクレアーゼで処理し、フラグメントをポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分離した。このゲルから電気
溶出によつて大きいフラグメントを回収し、次いで結合
させて合成DNAを組み立てた（Goeddel.Heynekerら、197
9）。この混合物を使つてE.coli K12株294、ATCCNo.３
１４４６を形質転換した。形質転換混合物の５％を２０
μｇ／mlのアンピシリンを含有するLBプレート上に置い
た。得られた４個のアンピシリン耐性コロニーはテトラ
サイクリンに感受性を持つていた。このことはテトラサ
イクリン耐性遺伝子内への挿入を暗示している。これら
４つのコロニーからのプラスミドを分析した結果、いづ
れの場合もpThα１と命名されたプラスミドは(a)pBR322
自身にはなかつたBglIIサイト（第７図に示したチモシ
ンα１の存在を示す）および(b)BamHI／EcoRI開裂によ
つて生成した約１０５塩基対のフラグメント、を含んで
いることがわかつた。プラスミドpThα１の組み立てル
ートを第９図に示した（同じ比率で描かれていない）。
ここで、大い点は５′−燐酸エステル基を表わしてい
る。
３．処理pThα１とLE′（ｄ）フラグメントの反応 プラスミドpThα１は、アンピシリン耐性を指定してい
る遺伝子、および、５′暗号鎖末端においてEcoRIサイ
ト内に、そして３′末端においてBamHIサイト内にクロ
ーンされたチモシンアルフアー１を指定している構造遺
伝子を含有している。このチモシン遺伝子はBglIIサイ
トをも含有している。前記の如く調製したLE′（ｄ）フ
ラグメントを受け入れることのできるプラスミドを調製
するために、pTHα１をEcoRI消化し、dTTPおよびdATPを
用いてKlenowポリメラーゼＩ反応を行ないEcoRI残渣を
鈍感化（blunt）した。得られた生成物のBglII消化によ
り、アンピシリン耐性遺伝子および、相対する末端に、
粘着BglII残渣と鈍感末端を有する直鎖状ＤＮＡフラグ
メントを作成した。得られた生成物は、BglII粘着末端
と鈍感末端を含有するLE′（ｄ）フラグメントと、Ｔ４
リガーゼの存在下で反応させることにより再環化し、か
くしてプラスミドpTrp24を得ることができる。こうする
ことにより、鈍感末端結合が起る位置で、EcoRIサイト
が再生される。
Ｅ．プラスミドpSOM7Δ２Δ４の組み立て pTrp24をBglII、次いでEcoRIで消化し、PAGEおよび電気
溶出を行なうと、３′暗号末端に燐接したΔEcoRI粘着
末端およびBglII粘着末端を持つたLE′（ｄ）ポリペプ
チドを暗号化しているフラグメントが得られる。このL
E′（ｄ）フラグメントをプラスミドpSom7Δ２のBglII
サイトにクローンすることができ、トリプトフアンプロ
モーター／オペレーターのコントロール下で発現される
LE′ポリペプチド／ソマトスタチン融合蛋白質を形成さ
せることができる。そうするために、(1)トリプトフア
ンプロモーター／オペレーターから遠位のEcoRIサイト
を開裂するためにpSom7Δ２を部分的にEcoRI消化し、
(2)適切にコドン読み取り枠（フレーム）を維持し、Eco
RI開裂サイトを復活させるためにプライマー配列を適切
に選択することが必要である。
即ち、プラスミドpSom7Δ２（16μｇ）を、20mMトリ
ス、pH7.5、５mMMgCl2、0.02NP40洗浄剤および100mMNaC
lを含有している緩衝液200μに入れて希釈し、EcoRI
0.5単位で処理した。３７℃で１５分間処理した後、こ
の反応混合物をフエノール抽出し、クロロホルム抽出
し、エタノール沈澱させ、次いでBglIIで消化した。得
られた比較的大きいフラグメントをPAGE次いで電気溶出
により分離した。このフラグメントは、LE′ポリペプチ
ドの近位末端のためのコドン「LE′（Ｐ）」、即ちBglI
Iサイトから上流のコドンを含んでいる。次いでこのフ
ラグメントを、Ｔ４DNAリガーゼの存在下で上記LE′(d)
フラグメントと結合させてプラスミドpSom7Δ２Δ４を
調製し、これをE.coli株２９４に形質転換導入すること
により、トリプトフアンプロモーター／オペレーターの
コントロール下で、完全に復元されたLEポリペプチドと
ソマトスタチンからなる融合蛋白質が効率よく生産され
る。
Ｆ．テトラサイクリン耐性を指定する遺伝子に隣接する
５′末端にBglII残渣をそして３′末端にPstI残渣を持
つた線状DNAの組み立て プラスミドpBR322をHindIII消化し、突出したHindIII末
端をＳ１ヌクレアーゼで消化した。そのＳ１ヌクレアー
ゼ消化は、HindIII開裂pBR322（10μｇ）を、Ｓ１緩衝
液（0.3M NaCl、１mM ZnCl2、25mM酢酸ナトリウム、pH
4.5）３０μ中、Ｓ１ヌクレアーゼ３００単位を用い
て１５℃で３０分間処理することにより行なつた。３０
×Ｓ１ヌクレアーゼ停止溶液（0.8Ｍトリス塩基、５０m
M EDTA）１μを加えることにより反応を停止させた。
この混合物をフエノール抽出、クロロホルム抽出し、エ
タノール沈澱を行ない、次いで既述した様にしてEcoRI
消化した。PAGE処理、次いで電気溶出することにより得
たフラグメントは、その暗号鎖がヌクレオチドチミジン
で始まる鈍感末端およびEcoRI粘着末端を含んでいる。
チミジンで始まるＳ１−消化HindIII残渣をKlenowポリ
メラーゼＩ処理したBglII残渣と結合させ、結紮によりB
glII制限サイトを復活させることができる。
従つて、実施例１Ｃで調製したプラスミドpSoM7Δ２をB
glII消化し、得られたBglII粘着末端を、全ての４種の
デオキシヌクレオチドトリホスフエートを使つてKlenow
ポリメラーゼＩで処理することにより、２本鎖にした。
得られた生成物をEcoRI開裂し、ＰＡＧＥ次いで小さい
フラグメントを電気溶出すると、BglIIサイトより上流
のLE′近位配列のコドン「LE′（Ｐ）」、およびトリプ
トフアンプロモーター／オペレーターを含有している線
状ＤＮＡが得られた。この生成物は、BglIIサイトを埋
めることによつて生成した鈍感末端とEcoRI末端を持つ
ていた。しかし、この鈍感末端を、前記Ｓ１−消化Hind
IIIフラグメントの鈍感末端に結合することによりBglII
サイトを復活させる。即ち、この２つのフラグメントを
Ｔ４DNAリガーゼの存在下で結紮して再環化したプラス
ミドpHKY10を得、これをコンピテントE.coli株294細胞
に形質転換導入することによつて増殖させた。この組換
えプラスミドpHKY10を持つたテトラサイクリン耐性細胞
を選択し、そのプラスミドＤＮＡを抽出した。BglIIお
よびPstIで消化し、PAGE法で分離し、大きいフラグメン
トを電気溶出することによつて、PstIおよびBglII粘着
末端を持つた所望の線状ＤＮＡを得た。この様にしてpH
KY10から調製したこのＤＮＡフラグメントは、複製の起
源を含んでおり、従つて、trpLE′ポリペプチド融合蛋
白質およびテトラサイクリン耐性を暗号化している両方
の遺伝子がtrpプロモーター／オペレーターのコントロ
ール下にあるプラスミドpIA7Δ４Δ１を組み立てるため
の成分として有用である。
Ｇ．Trpプロモーター／オペレーターを持つた線状DNAの
組み立て 実施例１Ｅで調製したプラスミドpSoM7Δ２Δ４を、部
分的EcoRI消化次いでPstI消化にかけた。得られたフラ
グメントはプロモーター／オペレーターを含んでおり、
PAGE操作次いで電気溶出により分離した。部分的EcoRI
消化は、ソマトスタチン遺伝子の５′末端隣接部が開裂
され、アンピシリン耐性遺伝子とtrpプロモーター／オ
ペレーターの間に存在するEcoRIサイトでは開裂してい
ないフラグメントを得るために必要であつた。
アンピシリン耐性遺伝子内でのPstI切断によつて失われ
たアンピシリン耐性は、実施例１Ｆで調製された最終的
なpHKY10線状DNA誘導体との結合によつて復活させるこ
とができる。
Ｈ．インシユリンＡ鎖構造遺伝子の分離 インシユリンＡ鎖構造遺伝子は、プラスミドpIA1（その
組み立てはGoeddelらにより、proc.Nat.Acad.Sci.USA7
6：106に記載されている）のEcoRIおよびBamHI消化によ
つて得た。所望のフラグメントをPAGEおよび電気溶出に
より精製した。これはEcoRIおよびBamHI末端を持つてい
た。
Ｉ．インシユリンＡ鎖構造遺伝子、Trpプロモーター／
オペレーターおよびPstIおよびBglII末端を持つたpHKY1
0線状DNAフラグメントの結合 インシユリンＡ鎖構造遺伝子、trpプロモーター／オペ
レーター含有線状ＤＮＡフラグメント（実施例１Ｇで調
製）およびpHKY10線状ＤＮＡフラグメント（実施例１Ｆ
で調製）を、適切な方向で、第１図に示した様に結合
し、所望のプラスミドpIA7Δ４Δ１を調製した。プラス
ミドpIA7Δ４Δ１にはアンピシリンおよびテトラサイク
リン耐性が復活しているので、簡単に選択することがで
きる。
実施例２ プラスミドpIB7Δ４Δ１の組み立て 最後の結合に於いて、インシユリンＡ鎖の代りにインシ
ユリンＢ鎖を指定している構造遺伝子を用いるほかは、
実施例１Ａ−Ｉに従つて所望のプラスミドを組み立て
た。インシユリンＢ鎖構造遺伝子は、プラスミドpIB1
（その組み立てはGoeddelら、1979に記載されている）
のEcoRIおよびBamHI消化によつて得られた。このインシ
ユリンＢ鎖暗号化ＤＮＡフラグメントをPAGEおよび電気
溶出により精製した。これはEcoRIおよびBamHI末端を持
つていた。
プラスミドpIB7Δ４Δ１を第２図に示す。これは、アン
ピシリンおよびテトラサイクリン耐性が復活しているの
で簡単に選択することができる。
実施例３ プラスミドpPR3の組み立て Ａ．cI、rexおよびcroの一部の遺伝子を含有しているバ
クテリオフアージλの〜2.5kb BglII制限フラグメント
の分離 バクテリオフアージλcI857のいくつかのBglII制限サイ
トおよびプラスミドpIB7Δ４Δ１の単一のBamHI制限サ
イトによつて、バクテリオフアージフラグメントをpIB7
Δ４Δ１クローニングベクターにクローンすることがで
きる。バクテリオフアージλcI857は、BglIIに感受性の
ある７個のサイトを含んでいる。BglIIフラグメントの
１つは、λcI遺伝子およびλrex遺伝子を含む2.5kbを含
んでいる（SzybalskiおよびSzybalski、1979、Gene７：
217〜280；およびＣ′Brien.ed.，March 1980，Genetic
Maps，第１巻、ＮＩＨ）。BglIIフラグメントは、BamHI
フラグメントの５′拡張部と相補的な配列GATCを持つた
５′拡散部（extensions）を含んでいる。ヒトインシユ
リンプラスミドpIB7Δ４Δ１は、BamHIによつて開裂さ
れる唯一のサイトを持つている。このBamHIサイト内に
クローニングするとpIB7Δ４Δ１上のTc耐性遺伝子が不
活性化される。BglIIフラグメントとBamHIフラグメント
を結紮すると、その接合点で または の配列を持つた組換え体ができる。これらの配列は、Bg
lIIまたはBamHIによつて開裂されない。従つて、両酵素
による制限化（restriction）によつて、pIB7Δ４Δ１
のBamHIサイト内に結合したλBglIIフラグメントを含有
するもの以外の全ての結紮生成物が除去される。
制限酵素は、実施例１Ａに記載した商業的ソースから入
手し、既知の方法に従つて常法通りに使用した。さら
に、その製造業者からの指示を受けた。即ち、バクテリ
オフアージλcI857 susＳ７DNAを、１００μｇのＤＮ
Ａ、１２mMトリス・HCl、pH7.5、12mM MgCl2、１２mM２
−メルカプチエタノールおよび１００単位（容量１ml
中）のBglII制限酵素を含む反応混合物中、３７℃で完
全に制限化した。この制限フラグメントをアガロースゲ
ル電気泳動（以降、ＡＧＥという）で分離した。分離し
たフラグメントを、エチジウムブロミドで発色させ、紫
外線によつて螢光帯が見える様にすることによつてゲル
上の位置づけを行なつた。目的とする〜2.5kbのフラグ
メントをゲルから切り取り、実施例１Ａに示した様に、
ＴＢＥ内に電気溶出した。透析袋からの水溶液を集め、
平衡緩衝液（．１MKCl、10.0mMトリス・HCl、pH7.8）で
平衡化したDEAEセルロースカラム＊（．5Rmlワツトマン
ＤＥ５２）に通した。カラムを平衡緩衝液2.5mlで洗浄
し、DNA（約５μｇ）を溶出緩衝液（１ＭNaCl、10mMト
リス・HCl、pH7.8）1.5mlで溶出した。この溶出液のNa
＋イオン濃度を約.35Mに調節し、100％エタノール２倍
量（約９ml）を加え、０20℃で１６時間冷却することに
よりDNAを沈澱させた。このDNA沈澱物を遠心分離によつ
てペレツト化し、７５％エタノールで洗浄して乾燥し
た。このDNAフラグメントの分離は、AGE、電気溶出、DE
AE−セルロースクロマトグラフイー、およびここに記載
したエタノール沈澱によつて行なつた。このDNAをTE緩
衝液（１mM EDTA、10mMトリス、HCl、pH7.8）に再溶解
した。＊ 注）：DEAEセルロースカラムおよびDE52はWhatman In
c.，９Bridewell Place，CIifton.New Jersey 07014か
ら入手できる。
B.BamHI制限酵素によるプラスミドpIB7Δ４Δ１の消化 プラスミドpIB7Δ４Δ１を、20mMトリス・HCl、pH7.0、
１００mM NaCl、７mMMgCl2、２mM２−メルカプトエタノ
ールおよび１０単位のBamHI制限エンドヌクレアーゼを
含有する50μの反応混合物中、３７℃で完全に制限化
した。
C.BglII末端を持つたλcIフラグメントのBamHI消化PIB7
Δ４Δ１への結合 約1.4μｇの2.5kbBglIIフラグメント（実施例３Ａで調
製）、約1.5μｇのBamHI制限化pIB7Δ４Δ１（実施例３
Ｂで調製）、５０mMトリス・HCl、pH7.8、１０mMジチオ
トレイツト、５％グリセロール、１０mM MgCl2、１mM A
TPおよび．１単位のＴ４DNAリガーゼを含む反応混合物1
00μを用いて、Ｔ４DNAリガーゼによる結合反応を行
なつた。反応混合物を４℃で１８時間インキユベート
し、６５℃で５分間加熱して反応を終了させた。この様
にして調製したプラスミドpPR3は４℃で貯蔵した。
実施例４ プラスミドpPR3のE.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ
−への形質転換導入 E.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ−の新鮮なオーバナイト培養
（ChangおよびCohen.1974.Proc.Nat.Acad.Sci.71：1030
−1034参照）を新鮮なＬブロス中（Miller.1972.Experi
ments in Molecular Genetics.Cold Spring Harbor Lab
s.Cold Spring Harbor.New York参照）１：１０継代培
養し、37℃で１時間増殖させた。６６０Klett単位の細
胞を全て収穫し、１００mM NaCl2.5mlで洗浄し、１０％
グリセロールの１５０mM CaCl2に懸濁し、室温で２０分
間インキユベートした。遠心分離により細胞を集め、Ca
Cl2−グリセロール．５mlに再懸濁し、３〜５分間氷で
冷やして凍結した。この細胞懸濁液は、使用時まで液体
窒素中に貯蔵した。保存および貯蔵は、その生活力、ま
たは共有結合で閉鎖している環状DNAによる形質転換の
頻度に悪影響を与えなかつた。氷浴中で細胞を融解し、
細胞．１mlに対してDNA.05ml（実施例３Ｃに従つて５μ
のpPR3を調製し、．１×SSC（標準的クエン酸塩食塩
水）４５μで希釈した）の割合で混合した。この様に
して調製した試料を氷で２０分間冷却し、４２℃で１分
間ヒートシヨツクし、氷でさらに１０分間冷却し、Ｌ−
ブロス．８５mlで希釈し、３２℃で２時間インキユベー
トし、λKH５４ｈλおよびλKH54h80（両者ともBackman
ら、１９７７、Science１９６：１８２に記載されてい
る）をそれぞれ約１×１０９含有しているＬ−ブロス
（Miller，１９７２参照）上に広げ、３２℃でインキユ
ベートした。形質転換体を、３２℃においてバクテリオ
フアージλKH54hλおよびλKH54h80に対する免疫で選択
した。組換体を、Apr、Tcs、λKH54hλおよびλKH54h80
免疫を確認するために３２℃で試験し、λKH54hλおよ
びλKH54h80感受性を確認するために４２℃で試験し
た。１つの形質転換体を選択し、E.coliK12C600ＲＫ−
ＭＫ−／pPR3と命名した。この生存コロニーを、期待し
た表現型について試験し、組み立てられた組換えプラス
ミドpPR3の増幅および単離に使用した。プラスミドpPR3
5の制限酵素分析により、λrex遺伝子がλcI遺伝子よ
り、trpE−インシユリンＢ鎖遺伝子にずつと近いことが
わかつた。
実施例５ プラスミドＰＲ３の増幅および単離E.coliK1
2C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR3のプラスミドDNAをクロラムフ
エニコールと共に増幅させ、清澄化溶解質法（cleared
lysate procedure）（BazaralおよびHelinski，１９６
８，Ｊ．Mol.Biol.３６：１８５−１９４）により分離
した。共有結合によつて環化した環状DNAを、CsClおよ
びプロピジウム・ジーヨージド中、平衡超遠心分離によ
つて精製した。プロピジウム・ジーヨージドを２−プロ
パノールで抽出し、DNAをCsCl中、−２０℃で貯蔵し
た。DNAの処理液を、セフアデツクス（ＰＤ１０＊）ク
ロマトグラフイーカラムにより、SSC／１０緩衝液（.01
5MNaCl、.0015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0）に交換し
た。＊ PD10はPharmacia，８００Centennial Ave,Piscatawa
y,New Jersey０８８５１から入手可能。
実施例６ プラスミドpPR12の組み立て Ａ．PstIおよびHincII末端を持つたλcI遺伝子含有線状
DNAの分離 プラスミドpPR3（実施例５と実質的に同様にして単離）
約７０μｇを、７０μの１０×PstI緩衝液（２００mM
トリス・HCl、pH7.5、１００mM MgCl2、５００mM（N
H4）２SO4）、５０μ（１mg／ml）のBSA（牛血清アル
ブミン）および５５５μの水に溶解し、６５℃で約１
５分間インキユベートした。約２５μのPstI（１単位
／μ）制限酵素を加えた後、混合物を３７℃で約4.5
時間インキユベートした。次いで得られたPst制限フラ
グメントを常法により、AGEで分離した。プラスミドpPR
3には２個のPstI制限サイトがあるので、完全にPstI消
化すると〜３．６kbフラグメントと〜4.2kbフラグメン
トが得られる。後者のフラグメントがバクテリオフアー
ジλcI遺伝子を含んでいる。従つて、既述した様にし
て、〜4.2kbフラグメントを回収した。得られた所望の
〜4.2kb制限フラグメントを含んでいるＤＮＡペレツト
をTE緩衝液５０μに懸濁した。このDNA懸濁液を６５
℃で１５分間インキユベートし、使用するまで４℃で貯
蔵した。
上で調製した〜4.2kbPstI制限フラグメント約５０μ
、１０μの１０×HincII緩衝液（100mMトリス・HC
l、pH7.9、６００mM NaCl、６６mM MgCl2、１０mMジチ
オトレイツト）、３８μの水および２μ（１０単位
／μ）のHincII制限酵素を３７℃で約２０分間、次い
で６５℃で約５分間インキユベートした。この混合物を
約２０℃に冷却し、約２００μのＴＢＥを加えた後、
制限フラグメントを常法に従い、ＡＧＥにより分離し
た。バクテリオフアージλcI遺伝子を含んでいる所望の
〜．９kbPstI−HincII制限フラグメントをＴＥ緩衝液１
０μに溶解し、４℃で貯蔵した。
Ｂ．HincIIおよびPstI末端を持つた、レプリコンおよび
tcr遺伝子含有線状ＤＮＡ 約１００μ（3.2μｇ）のプラスミドpBR３２２、１５
μの１０×HincII緩衝液、３４μの水および１μ
（１０単位／μ）のHincII制限酵素を３７℃で約２０
分間、次いで６５℃で約５分間インキユベートした。こ
の反応混合物を４℃に冷却し、実施例３に記載した様
に、エタノール沈澱をかけた。所望の部分的HincII消化
pBR３２２を１０μの１０×PstI緩衝液および７９μ
の水からなる溶液に懸濁し、得られた懸濁液を６５℃
で５分間インキユベートした後４℃に冷却した。次いで
ＢＳＡ１０μ（１mg／ml）およびPstI制限酵素２μ
（１０単位／ml）を加えた。得られた反応混合物を３７
℃で１時間、次いで６５℃で５分間インキユベートし、
４℃に冷却した。この様にして調製したHincII−PstI制
限フラグメントを常法によりＡＧＥで分離した。このDN
AをＴＥ緩衝液に溶解し、使用するまで４℃で貯蔵し
た。
Ｃ．λcI遺伝子を持つたフラグメントとPstIおよびHinc
II末端を有する線状pBR322DNAフラグメントとの結合 〜．９kbHincII−PstIフラグメント（実施例６Ａで調製
したもの）約１０μ（1.8μｇ）および〜４kbpstI−H
incIIフラグメント（実施例６Ｂで調製したもの）10μ
（．９μｇ）を混合し、２回エタノール沈澱を行なつ
た。得られたDNAを２μの５×リゲーシヨン（結紮）
緩衝液（２５０mMトリス・HCl、pH7.8、５０mM MgCl2、
２５mMジチオトレイツトおよび２５％グリセロール）お
よび4.67μのＨ２Ｏに溶解した。この溶液を６５℃で
１０分間インキユベートした後、約３μの.66mMATPお
よび.33μ（２単位／μ）のT4DNAリガーゼを加え
た。得られた結紮混合物を周囲温度で1.5時間反応さ
せ、所望のプラスミドpPR12を調製した。この様にして
得たプラスミドpPR12DNAを、使用するまで４℃で貯蔵し
た。
実施例７ プラスミドpPR12のE.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ
−への形質転換導入 プラスミドpPR3の代りにプラスミドpPR12を使用するほ
かは実施例４と実質的に同じ方法で所望の形質転換を行
なつた。形質転換体は、３２℃において、バクテリオフ
アージλKH54hλおよびλKH54h80に対する免疫性で選択
した。組換体のAPS、Tcr、λKH54hλおよびλKH54h80免
疫性を調べるためには３２℃で、λKH54hλおよびλKH5
4h80感受性を調べるためには４２℃で試験を行なつた。
１個の組換体が選択され、E.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ−
／pPR12と命名された。この生存コロニーを、予想した
表現型について試験し、プラスミドpPR12の増幅および
単離に使用した。
実施例８ プラスミドpPR12の増幅および分離 実施例５と実質的に同じ方法でプラスミドpPR12を増幅
し、分離した。
実施例９ プラスミドpPR17の組み立て Ａ．λcI遺伝子およびレプリコンを含有しているプラス
ミドpPR12の〜4.7kb EcoRI−BamHI線状フラグメントの
分離 プラスミドpPR12DNA（実施例８で調製）約１５０μ
（20μｇ）、２０μの１０×BamHI緩衝液（２００mM
トリス・HCl、pH7.0、１ＭNaCl、70mMMgCl2、20mM ２
−メルカプトエタノール）、２μ（20単位／μ）の
BamHI制限酵素および２８μのＨ２Ｏを３７℃で３０
分間、次いで周囲温度で１、３時間、最後に６５℃で５
分間インキユベートした。この反応混合物を４℃に冷却
した後、約４μ（１０単位／μ）のEcoRI制限酵素
を加えた。次いでこの反応混合物を３７℃で１時間イン
キユベートし、所望の〜4.7kb制限フラグメントを生成
せしめた。常法によりAGEで分離した後、所望のDNAペレ
ツトをTE緩衝液に懸濁し、使用するまで−４℃で貯蔵し
た。
Ｂ．ヒトインシユリンのＡ鎖およびtrp1′Ｅ′の融合ポ
リペプチドの遺伝子を含有しているプラスミドpIA7Δ４
Δ１の〜1.3kbEcoRI−BamHI線状フラグメントの分離 プラスミドpPR12の代りにプラスミドpIA7Δ４Δ１を使
用するほかは、実施例９Ａと実質的に同じ方法での所望
の分離を行なつた。更に、EcoRI制限酵素は、部分的Eco
RI消化が所望であるので、確かに約３０分間だけ反応さ
せた。常法に従つてAGEで分離した後、所望の〜1.3kbEc
oRI−BamHI制限フラグメントを以下に記載する結合反応
に直ちに使用した。
Ｃ．EcoRIおよびBamHI末端を有する線状pPR１２DNAフラ
グメントとインシユリン融合遺伝子の結合 実施例９Ａの〜4.7kbDNA含有溶液約1.5μｇと実施例９
Ｂの〜1.3kbDNA含有混合物1.5μｇを混合し、２回エタ
ノール沈澱を行なつた。ペレツトを、６μのＨ２Ｏお
よび２μの５×リゲーシヨン緩衝液からなる溶液に溶
解し、６５℃で１０分間インキユベートした。インキユ
ベーシヨンした後、この混合物を１５℃に冷却し、約２
μの．６６mMATPおよび．１μ（１単位／μ）の
Ｔ４DNAリガーゼを加えた。１５℃で約１８時間結合反
応を行ない所望のプラスミドpPR17を調製した。
実施例１０ プラスミドpPR17のE.coliK12C600ＲＫ−Ｍ
Ｋ−への形質転換導入 プラスミドpPR3の代りにプラスミドpPR17を使用するほ
かは実施例４と実質的に同じ方法で所望の形質転換を行
なつた。バクテリオフアージλKH54hλおよびλKH54h80
に対する免疫により、３２℃で形質転換体を選択した。
組換体のAPS、Tcr、λKH54hλおよびλKH54h80免疫性に
ついては３２℃で、λKH54hλおよびλKH54h80感受性に
ついては４２℃で試験して調べた。１個の形質転換体を
選択し、E.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR17と命名し
た。この生存コロニーの期待された表現型を試験し、プ
ラスミドpPR17の増幅および分離に使用した。
実施例１１ プラスミドpPR17の増幅および分離 プラスミドpPR17の増幅および分離は、実施例５と実質
的に同じ方法を使つて行なつた。
実施例１２ プラスミドpPR18の組み立て プラスミドpIA7Δ４Δ１の代りにプラスミドpIB7Δ４Δ
１を使用するほかは実施例９Ａ〜Ｃと実質的に同じ方法
で所望の組み立てを行ない、〜1.3kbEcoRI−BamHI制限
フラグメントを生成させた。
実施例１３ プラスミドpPR18のE.coliK12C600ＲＫ−Ｍ
Ｋ−への形質転換導入 プラスミドpPR3の代りにプラスミドpPR18を使用するほ
かは実施例４と実質的に同じ方向で所望の形質転換を行
なつた。形質転換体は、３２℃で、バクテリオフアージ
λKH54hλおよびλKH54h80に対する免疫性で選択した。
この組換体のApS、Tcr、λKH54hλおよびλKH54h80免疫
性については３２℃で、λKH54hλおよびλKH54h80感受
性については４２℃で試験して調べた。１個の形質転換
体を選択し、E.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR18と命名
した。この生存コロニーの期待される表現型を調べ、こ
のプラスミドpPR18の増幅および分離に使用した。
実施例１４ プラスミドpPR17のE.coliK12 294への形質
転換導入 本発明に係るプラスミドを、E.coliK12 294に形質転換
導入することにより、Ｋ−制限系に対して改変する。E.
coliK12 294はＲＫ−ＭＫ ＋であり、従つて形質転換に
よつて、改変前のプラスミドDNAは改変され、ＲＫ ＋Ｍ
Ｋ ＋特異性を持つた株による制限に対して抵抗する様に
なる。かくして、本発明のプラスミドをＲＫ ＋ＭＫ ＋E.
coli株に形質転換導入するための、このプラスミドを増
幅および分離するために、E.coli K12 294形質転換体を
使用する。
所望の形質転換は、E.coliK12C600ＲＫ−ＭＫ−の代り
にE.coliK12 294を、プラスミドpPR3の代りにプラスミ
ドpPR17を使用するほかは、実施例４と実質的に同じ方
法で行なつた。形質転換体はTcrで選択した。この組換
体のApS、Tcr、λKH54hλおよびλKH54h80に対する免疫
性については３２℃で、λKH54hλおよびλKH54h80に対
する感受性については４２℃で試験して調べた。この形
質転換体は推定上のプラスミド担持マーカーの遺伝子結
合を１００％示した。１個の形質転換体を選択し、E.co
li K12 294／pPR17と命名した。このコロニーを試験し
て期待される表現型を証明し、これを使つてプラスミド
pPR17の増幅および単離を行なつた。
実施例１５ プラスミドpPR17の増幅と分離 E.coli K12 294／pPR17を使用するほかは、実施例５と
実質的に同じ方法でプラスミドpPR17の増幅および分離
を行なつた。
実施例１６ プラスミドpPR18のE.coli K12 294への形
質転換導入 プラスミドpPR17の代りにプラスミドpPR18を使用するほ
かは実施例１４と実質的に同じ方法で形質転換を行なつ
た。
実施例１７ プラスミドpPR18の増幅と分離 E.coli K12 294／pPR18を使用するほかは実施例５と実
質的に同様にして、プラスミドpPR18の増幅および分離
を行なつた。
実施例１８ プラスミドpPR17のE.coli K12 RV308への
形質転換導入 実施例１５のプラスミドpPR17およびE.coli K12 RV308
を使用するほかは、実施例１４と実質的に同じ方法で形
質転換を行なつた。
実施例１９ プラスミドpPR18のE.coli K12 RV308への
形質転換導入 実施例１７のプラスミドpPR18およびE.coli K12 RV308
を使用するほかは、実施例１４と実質的に同じ方法で所
望の形質転換を行なつた。
実施例２０ λcI90で溶原化することによるE.coli K12
RV308λcI90／pPR17の組み立て E.coli K12 RV308／pPR17（実施例１８で調製）を、３
５Klett単位まで３２℃で増殖し、次いで４５℃で６０
分間増殖させた。この細胞にλcI90を暴露多重度２０で
感染させ、４５℃で４０分間インキユベートした。コロ
ニーを、テトラサイクリン１０μｇ／mlを含有するＬ−
寒天上、３２℃で増殖させた。得られたE.coli K12 RV3
08λcI90／pPR17コロニーを、増殖を確かめるために
は、３２℃で感受性を確かめるためには４２℃で試験し
た。
実施例２１ E.coli K12 RV308λcI90／pPR18の組み立
て E.coli K12 RV308／pPR17の代りにE.coli K12 RV308／p
PR18（実施例１９で調製）を使用するほかは、実施例２
０と実質的に同じ方法で所望の組み立てを行なつた。
実施例２２ E.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−λcI90／pPR
12の組み立て E.coli K12 RV308／pPR17の代りにE.coli K12 C600ＲＫ
−ＭＫ−／pPR12（実施例７で調製）を使用するほか
は、実施例２０と実質的に同様にして所望の組み立てを
行なつた。
上記の方法で組み立てられたその他の代表的な株を以下
に列挙する。
選択および選択なしに組換えプラスミドを含有する宿主
細胞の安定性を測定する方法 プラスミドを含有している細胞の頻度を検定するため
に、組換えプラスミド上のTcr遺伝子を利用した。培養
の連続的希釈液をＬ−寒天上に広げ、１０μｇ／mlのテ
トラサイクリンと共に、そしてテトラサイクリンなしで
３２℃で増殖させた。プラスミド＋細胞の頻度を、テト
ラサイクリンなしでＬ−寒天上で増殖したコロニーの全
数に対するテトラサイクリン耐性コロニーの比と見做し
た。あるいはＬ−寒天上のコロニーを１０μｇ／mlのテ
トラサイクリンを含むＬ−寒天にレプリカ法でプレート
し、３２℃で増殖させた。プラスミド＋細胞の頻度は、
テトラサイクリンを含まないＬ−寒天上に増殖した全コ
ロニー数に対するテトラサイクリン耐性コロニーの比で
あると見做した。その結果をE.coli K12 RV308／pIA7Δ
４Δ１株およびE.coli K12 RV308λcI90／pPR17株につ
いては表２に、E.coli K12 RV308／pIB7Δ４Δ１株およ
びE.coli K12 RV308λcI90／pPR18株については表３
に、E.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR12株およびE.co
li K12 C600ＲＫ−ＭＫ−λcI90／pPR12株については表
４に、それぞれ％で示した。
表２〜表４に示した結果から、組換えプラスミドを細菌
群に保持させるのに、本発明の選択系が極めて有効であ
ることがわかる。E.coli K12 RV308／pIA7Δ４Δ１の培
養では約５％の細胞が、E.coli K12 RV308／pIB7Δ４Δ
１の培養では約２１％の細胞が、培養ダブリング３０に
後にプラスミドマイナスとなつた。適所にこの選択系を
持つているE.coli K12 RV308λCI90／pPR17およびE.col
i K12 RV308λcI90／pPR18の培養では、プラスミドマイ
ナスの細胞はなかつた。さらに、E.coli K12 C600ＲＫ
−ＭＫ−λcI90／pPR12の培養も優れたプラスミド安定
性を示した。即ち、E.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−／pPR
12の培養では、培養ダブリング３３の後では１３％の細
胞がプラスミドマイナスであつたが、適所にこの選択系
を持つたE.coli K12 C600ＲＫ−ＭＫ−λcI90／pPR12の
培養では全ての細胞がプラスミドプラスであつた。
本発明に係るプラスミドは、いづれもプラスミド分離
（segregation）を示さなかつた。従つて、本発明に係
る改良プラスミドは、プロフアージによる組換えがない
点で、本発明の改善がなされていないプラスミドと異な
るものである。事実、適切にこの改良選択系を持つて増
殖させた場合、プラスミドマイナスのコロニーは全く観
察されなかつた。
【図面の簡単な説明】
第１図〜第６図はそれぞれプラスミドpIA7Δ４Δ１、pI
B7Δ４Δ１、pPR3、pPR12、pPR17、およびpPR18の制限
サイトおよび機能地図を示す模式図、第７図はチモシン
アルフア１遺伝子を示す模式図、第８図はフラグメント
Ｔ１５の合成法を示すフローシート、第９図はプラスミ
ドpThα１の組み立てルートを示すフローシートであ
る。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ベクターで形質転換された細菌性宿主細胞
    を安定化および選択するために用いる組換えＤＮＡクロ
    ーニングベクターであって、 （ａ）ベクター中に含有されるバクテリオファージλゲ
    ノム部分として、バクテリオファージλｃＩ８５７由来
    の、cro遺伝子とrex遺伝子の大部分を含まない約９００
    bpＰstＩ−ＨincＩＩｃＩリプレッサー遺伝子−含有フ
    ラグメント、 （ｂ）ベクターで形質転換された細菌性宿主細胞内で機
    能的であり、リプレッサー遺伝子によって発現されたリ
    プレッサーに感受性を持たない、レプリコンとプロモー
    ター、とを含有するベクター。
  2. 【請求項２】ｃＩリプレッサー遺伝子−含有フラグメン
    トがバクテリオファージλｃＩ８５７のＰstＩ−Ｈinc
    ＩＩフラグメントである特許請求の範囲第１項のベクタ
    ー。
  3. 【請求項３】さらに、機能的なポリペプチドを発現する
    遺伝子と、形質転換された細菌性宿主細胞内で機能的で
    あり、ｃＩリプレッサーに感受性を持たないプロモータ
    ーとを含有する特許請求の範囲第１項または第２項のベ
    クター。
  4. 【請求項４】機能的なポリペプチドを発現する遺伝子が
    天然に存在する遺伝子、天然に存在しない遺伝子、ある
    いは１部が天然に存在する遺伝子であって、１部が合成
    の遺伝子または天然に存在しない遺伝子である特許請求
    の範囲第３項のベクター。
  5. 【請求項５】機能的なポリペプチドを発現する遺伝子が
    ヒトインシュリンＡ鎖またはヒトインシュリンＢ鎖をコ
    ードする遺伝子である特許請求の範囲第４項のベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】プラスミドである特許請求の範囲第１項〜
    第５項のいずれかのベクター。
  7. 【請求項７】第５図記載の制限地図を有し、プラスミド
    ｐＰＲ１７と命名されている特許請求の範囲第３項のベ
    クター。
  8. 【請求項８】第６図記載の制限地図を有し、プラスミド
    ｐＰＲ１８と命名されている特許請求の範囲第３項のベ
    クター。
  9. 【請求項９】第４図記載の制限地図を有し、プラスミド
    ｐＰＲ１２と命名されている特許請求の範囲第１項また
    は第２項のベクター。
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