JPH0630636B2 - 遺伝的特性決定方法 - Google Patents
遺伝的特性決定方法Info
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- JPH0630636B2 JPH0630636B2 JP62062754A JP6275487A JPH0630636B2 JP H0630636 B2 JPH0630636 B2 JP H0630636B2 JP 62062754 A JP62062754 A JP 62062754A JP 6275487 A JP6275487 A JP 6275487A JP H0630636 B2 JPH0630636 B2 JP H0630636B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
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- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、一般に、ポリヌクレオチド並びにＤＮＡおよ
びＲＮＡプローブ、それらの調製および遺伝的特徴づけ
におけるそれらの使用に関する。このような使用は、例
えば、人間、動物または植物の起源の確立を包含し、こ
うして本発明のポリヌクレオチドおよびプローブは父性
の論争(paternity disputes)または法医学において、あ
るいは遺伝的疾患または素質を予防、診断および処置に
おいて使用できる。
びＲＮＡプローブ、それらの調製および遺伝的特徴づけ
におけるそれらの使用に関する。このような使用は、例
えば、人間、動物または植物の起源の確立を包含し、こ
うして本発明のポリヌクレオチドおよびプローブは父性
の論争(paternity disputes)または法医学において、あ
るいは遺伝的疾患または素質を予防、診断および処置に
おいて使用できる。
〔背景技術〕 英国特許出願第8525252号（公告第2166445号）には、ヒ
トおよび動物のゲノム内の多数の多形性部位において個
々にハイブリダイズし、こうして異なる分子量の標識さ
れたバンドから構成された「フィンガープリント」を生
成するプローブとして使用することができる種々のＤＮ
Ａが記載されている。フィンガープリントは全体として
問題の個体に特徴的であり、そして異なるバンドの起源
を個体の系統を通して追跡することができ、そしてある
場合において、ある遺伝的疾患に関連あると仮定するこ
とができる。
トおよび動物のゲノム内の多数の多形性部位において個
々にハイブリダイズし、こうして異なる分子量の標識さ
れたバンドから構成された「フィンガープリント」を生
成するプローブとして使用することができる種々のＤＮ
Ａが記載されている。フィンガープリントは全体として
問題の個体に特徴的であり、そして異なるバンドの起源
を個体の系統を通して追跡することができ、そしてある
場合において、ある遺伝的疾患に関連あると仮定するこ
とができる。
本発明は、情報に富む遺伝子座を多座プローブ(multi-l
ocus probe)の使用によりゲノム中において同定するこ
とができ、そして単一のこのような情報を与える遺伝子
座に対して各々が特異的であるポリヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドプローブを調製できるという発見に基
づく。
ocus probe)の使用によりゲノム中において同定するこ
とができ、そして単一のこのような情報を与える遺伝子
座に対して各々が特異的であるポリヌクレオチドおよび
ポリヌクレオチドプローブを調製できるという発見に基
づく。
従来、制限された数の超可変遺伝子座(hyper-variablel
oci)がヒトＤＮＡ中において発見されているだけであ
り、これらは次のものを包含する：インシュリン遺伝子
に対して５′側のミニサテライト(Bell.SelbyおよびRut
ter.1982)、ｃ−Ｈａ−rasel遺伝子に対して３′側のサ
テライト(Capon et al.,1983)、II型コラーゲン遺伝子
(Stoker et al.,1985)およびζ２およびψζ１グロビン
遺伝子の間(Goodbourn et al.,1983)、ならびに染色体
１４の長いアームのテロメア領域に由来する特徴のない
ＤＮＡクローンによって定義されるＤ１４Ｓ１遺伝子座
(WymanおよびWhite,1980;Balaz et al.,1982;Whyman,Wo
lfeおよびBotstein,1984)。これらのミニサテライト類
はそれらの可変性を実質的に異にし、コラーゲンの超可
変領域において検出されるわずか６つの異なる対立遺伝
子(Sykes,OgilvieおよびWordsworth,1985)からＤ１４Ｓ
１遺伝子座における８０より多く(Balaz et al.,1986)
の範囲に及ぶ。ヒトゲノムにおける超可変遺伝子座の合
計の数は未知であるが、多いように思われる。事実、ヒ
トゲノムは少なくとも1500の超可変領域を含有するであ
ろう。
oci)がヒトＤＮＡ中において発見されているだけであ
り、これらは次のものを包含する：インシュリン遺伝子
に対して５′側のミニサテライト(Bell.SelbyおよびRut
ter.1982)、ｃ−Ｈａ−rasel遺伝子に対して３′側のサ
テライト(Capon et al.,1983)、II型コラーゲン遺伝子
(Stoker et al.,1985)およびζ２およびψζ１グロビン
遺伝子の間(Goodbourn et al.,1983)、ならびに染色体
１４の長いアームのテロメア領域に由来する特徴のない
ＤＮＡクローンによって定義されるＤ１４Ｓ１遺伝子座
(WymanおよびWhite,1980;Balaz et al.,1982;Whyman,Wo
lfeおよびBotstein,1984)。これらのミニサテライト類
はそれらの可変性を実質的に異にし、コラーゲンの超可
変領域において検出されるわずか６つの異なる対立遺伝
子(Sykes,OgilvieおよびWordsworth,1985)からＤ１４Ｓ
１遺伝子座における８０より多く(Balaz et al.,1986)
の範囲に及ぶ。ヒトゲノムにおける超可変遺伝子座の合
計の数は未知であるが、多いように思われる。事実、ヒ
トゲノムは少なくとも1500の超可変領域を含有するであ
ろう。
１より多い多形性ミニサテライト領域または超可変遺伝
子座を参照することによってＤＮＡを識別できるポリヌ
クレオチドプローブ、例えば、前述の英国特許出願第85
25252号（公告第2,166,445号）中に記載されかつクレイ
ムされているプローブ33.6および33.15とゲノムＤＮＡ
の断片とをハイブリダイズさせることによって同定され
たＤＮＡ断片をクローニングすることが可能であり、そ
してゲノム上の特定の領域または遺伝子座（前記領域ま
たは遺伝子座は情報に富む遺伝子座である）に対して特
異的であるミニサテライトを含有するＤＮＡ断片に対し
てハイブリダイズできるポリヌクレオチドまたはプロー
ブを、前記ＤＮＡ断片から調製することが可能であるこ
とが発見された。情報に富む遺伝子座は、100の不作為
に選択した無関係の個体の試料において少なくとも３つ
の異なる対立遺伝子が識別され得る遺伝子座であると、
この明細書において、定義する。この明細書において
は、この遺伝子座は少なくとも３(100)の対立遺伝子の
変動を有すると述べることによってこれを表現する。不
作為に選択した無関係の個体の試料は、好ましくは50
0、より好ましくは1000であり、そしてこのような試料
において少なくとも３つの異なる対立遺伝子を識別でき
る能力を、それぞれ、３(500)および３(1000)で表わ
す。全体集団の十分に大きい数の構成員をスクリーニン
グすることによって、所定の情報に富む遺伝子座に３よ
り少ない対立遺伝子を有する100，500または1000の個体
を同定することは通常可能であろうから、100，500また
は1000の不作為に選択した無関係の個体の試料を実際に
不作為に選択することが必須である。
子座を参照することによってＤＮＡを識別できるポリヌ
クレオチドプローブ、例えば、前述の英国特許出願第85
25252号（公告第2,166,445号）中に記載されかつクレイ
ムされているプローブ33.6および33.15とゲノムＤＮＡ
の断片とをハイブリダイズさせることによって同定され
たＤＮＡ断片をクローニングすることが可能であり、そ
してゲノム上の特定の領域または遺伝子座（前記領域ま
たは遺伝子座は情報に富む遺伝子座である）に対して特
異的であるミニサテライトを含有するＤＮＡ断片に対し
てハイブリダイズできるポリヌクレオチドまたはプロー
ブを、前記ＤＮＡ断片から調製することが可能であるこ
とが発見された。情報に富む遺伝子座は、100の不作為
に選択した無関係の個体の試料において少なくとも３つ
の異なる対立遺伝子が識別され得る遺伝子座であると、
この明細書において、定義する。この明細書において
は、この遺伝子座は少なくとも３(100)の対立遺伝子の
変動を有すると述べることによってこれを表現する。不
作為に選択した無関係の個体の試料は、好ましくは50
0、より好ましくは1000であり、そしてこのような試料
において少なくとも３つの異なる対立遺伝子を識別でき
る能力を、それぞれ、３(500)および３(1000)で表わ
す。全体集団の十分に大きい数の構成員をスクリーニン
グすることによって、所定の情報に富む遺伝子座に３よ
り少ない対立遺伝子を有する100，500または1000の個体
を同定することは通常可能であろうから、100，500また
は1000の不作為に選択した無関係の個体の試料を実際に
不作為に選択することが必須である。
所定の情報に富む遺伝子座におけるこの多形成が高くな
ればなるほど、遺伝的特徴づけ、例えば、父性または法
医学的評価のための個体の同定における遺伝子座の特異
的プローブは、より有用でありかつ情報に富む。
ればなるほど、遺伝的特徴づけ、例えば、父性または法
医学的評価のための個体の同定における遺伝子座の特異
的プローブは、より有用でありかつ情報に富む。
これに関して、用語「個体」はヒトばかりでなく、さら
にヒト以外の動物及び植物、並びにこのような人間、動
物および植物から誘導される細胞系を意味するために上
で使用したことが理解されよう。しかしながら、各場合
において、不作為に選択した試料はすべて同一種からの
ものであろう。
にヒト以外の動物及び植物、並びにこのような人間、動
物および植物から誘導される細胞系を意味するために上
で使用したことが理解されよう。しかしながら、各場合
において、不作為に選択した試料はすべて同一種からの
ものであろう。
本発明のヒトへの適用に関して、ここで使用する表現
「情報に富む遺伝子座」は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(ATCC)に受託されている次の細胞
系から選択された２０の細胞系から抽出されたＤＮＡに
おいて少なくとも３つの異なる対立遺伝子が識別され得
る遺伝子座としても定義することができる： 前述のすべての細胞系はATCC、米国20852−1776マリー
ランド州ロックビレ、パークローン・ドライブ12301、
から自由に入手可能であり、そしてATCCの細胞系および
ハイブリドーマのカタログに記載されている。前述の細
胞系のすべては、1985年以前にATCCに受託された。
「情報に富む遺伝子座」は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(ATCC)に受託されている次の細胞
系から選択された２０の細胞系から抽出されたＤＮＡに
おいて少なくとも３つの異なる対立遺伝子が識別され得
る遺伝子座としても定義することができる： 前述のすべての細胞系はATCC、米国20852−1776マリー
ランド州ロックビレ、パークローン・ドライブ12301、
から自由に入手可能であり、そしてATCCの細胞系および
ハイブリドーマのカタログに記載されている。前述の細
胞系のすべては、1985年以前にATCCに受託された。
本発明の１つの面によれば、ゲノム中の特定の領域また
は座〔前記領域または座は少なくとも３(100)の対立遺
伝子の変動（上に定義した）を有する〕に対して特異的
であるミニサテライト(minisatellite)を含有するＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズすることができるポリヌクレオ
チドを調製する方法が提供され、この方法は、次の工
程： １より多くの多形性ミニサテライト領域または超可変座
に関連してＤＮＡを識別することのできるポリヌクレオ
チドプローブとゲノムＤＮＡの断片をハイブリダイズせ
しめることによって同定されたＤＮＡ断片をクローニン
グし、そして ゲノム中の少なくとも３(100)の対立遺伝子変動(alleli
c variation)（上に定義した）を有する特定の領域また
は座に関して特異的であるミニサテライトを含有するＤ
ＮＡ断片にハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチドを前記ＤＮＡ断片から調製する、 ことを含む。
は座〔前記領域または座は少なくとも３(100)の対立遺
伝子の変動（上に定義した）を有する〕に対して特異的
であるミニサテライト(minisatellite)を含有するＤＮ
Ａ断片にハイブリダイズすることができるポリヌクレオ
チドを調製する方法が提供され、この方法は、次の工
程： １より多くの多形性ミニサテライト領域または超可変座
に関連してＤＮＡを識別することのできるポリヌクレオ
チドプローブとゲノムＤＮＡの断片をハイブリダイズせ
しめることによって同定されたＤＮＡ断片をクローニン
グし、そして ゲノム中の少なくとも３(100)の対立遺伝子変動(alleli
c variation)（上に定義した）を有する特定の領域また
は座に関して特異的であるミニサテライトを含有するＤ
ＮＡ断片にハイブリダイズすることができるポリヌクレ
オチドを前記ＤＮＡ断片から調製する、 ことを含む。
本発明のほかの面によれば、ゲノム中の少なくとも３の
多形度(a degree of polymorphism)（上に定義した）を
有する特定の領域または座に関して特異的であるミニサ
テライトを含有するＤＮＡ断片にハイブリダイズするこ
とができるポリヌクレオチドを調製する方法が提供さ
れ、この方法は、次の工程： １より多い多形性領域または座に関連してＤＮＡを識別
できるポリヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡ断片と
をハイブリダイズせしめることによって同定されたＤＮ
Ａ断片をクローニングし、そして ゲノム中の少なくとも３の多形度（上に定義した）を有
する特定の領域または座に関して特異的であるミニサテ
ライトを含有するＤＮＡにハイブリダイズすることがで
きるポリヌクレオチドを、前記断片から調製する、 ことを含む。
多形度(a degree of polymorphism)（上に定義した）を
有する特定の領域または座に関して特異的であるミニサ
テライトを含有するＤＮＡ断片にハイブリダイズするこ
とができるポリヌクレオチドを調製する方法が提供さ
れ、この方法は、次の工程： １より多い多形性領域または座に関連してＤＮＡを識別
できるポリヌクレオチドプローブとゲノムＤＮＡ断片と
をハイブリダイズせしめることによって同定されたＤＮ
Ａ断片をクローニングし、そして ゲノム中の少なくとも３の多形度（上に定義した）を有
する特定の領域または座に関して特異的であるミニサテ
ライトを含有するＤＮＡにハイブリダイズすることがで
きるポリヌクレオチドを、前記断片から調製する、 ことを含む。
好ましくは、ポリヌクレオチドプローブは、標識された
成分またはマーカー成分を含めて、少なくとも３つのタ
ンデムの反復（すべてのタンデムに反復する配列の間に
平均して少なくとも７０％の相同性が存在する）の配列
を含むポリヌクレオチドを含んでなり、前記配列は、制
限エンドヌクレアーゼで試料ＤＮＡを断片化することに
よって得られた対応するＤＮＡ断片へのプローブのハイ
ブリダイゼーションを可能とする程度に、ゲノムのミニ
サテライト領域との相同性を有し、ここで、 ａ）反復の各々は、異なるゲノムの座からの複数のミニ
サテライト中に存在する、同様な長さのコンセンサスコ
ア領域(consensus core region)と少なくとも７０％の
相同性をもつコアを含有し、 ｂ）コアは６〜１６クレオチド長さであり、そして ｃ）コアに寄与しない反復単位内のヌクレオチドの合計
の数は、１５以下である。
成分またはマーカー成分を含めて、少なくとも３つのタ
ンデムの反復（すべてのタンデムに反復する配列の間に
平均して少なくとも７０％の相同性が存在する）の配列
を含むポリヌクレオチドを含んでなり、前記配列は、制
限エンドヌクレアーゼで試料ＤＮＡを断片化することに
よって得られた対応するＤＮＡ断片へのプローブのハイ
ブリダイゼーションを可能とする程度に、ゲノムのミニ
サテライト領域との相同性を有し、ここで、 ａ）反復の各々は、異なるゲノムの座からの複数のミニ
サテライト中に存在する、同様な長さのコンセンサスコ
ア領域(consensus core region)と少なくとも７０％の
相同性をもつコアを含有し、 ｂ）コアは６〜１６クレオチド長さであり、そして ｃ）コアに寄与しない反復単位内のヌクレオチドの合計
の数は、１５以下である。
有利には、前記ＤＮＡ断片はミニサテライト領域または
超可変座からのミニサテライトを含有し、前記領域また
は座は、配列（相補的配列を含む）： (A)AGGGCTGGAGG １ （ここでＴはＴまたはＵであり、そして（Ａ）は存在す
ることあるいは存在しないことができる）または配列
（相補的配列を含む）： AGAGGTGGGCAGGTGG ２ （ここでＴはＴまたはＵである） の少なくとも３つのタンデム反復を含むポリヌクレオチ
ドプローブによって検出可能である。
超可変座からのミニサテライトを含有し、前記領域また
は座は、配列（相補的配列を含む）： (A)AGGGCTGGAGG １ （ここでＴはＴまたはＵであり、そして（Ａ）は存在す
ることあるいは存在しないことができる）または配列
（相補的配列を含む）： AGAGGTGGGCAGGTGG ２ （ここでＴはＴまたはＵである） の少なくとも３つのタンデム反復を含むポリヌクレオチ
ドプローブによって検出可能である。
本発明の他の面によれば、分離されたあるいはクローニ
ングされた形態のポリヌクレオチドが提供され、前記ポ
リヌクレオチドは、単一のミニサテライト領域または超
可変座に関して特異的であり、かつ制限エンドヌクレア
ーゼで試料のゲノムＤＮＡを断片化することによって得
られた対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイ
ブリダイゼーションを可能とする程度に前記領域または
座と相同性であるヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ
断片は前記ミニサテライト領域または超可変座からのミ
ニサテライトを含有し、ここで １）前記領域または座は少なくとも３(100)の対立遺伝
子変動（この明細書で定義するような）を有し、そして ２）前記領域または座は、配列（相補的配列を含む）： (A)AGGGGCTGGAGG １ （ここでＴはＴまたはＵであり、そして（Ａ）は存在す
ることあるいは存在しないことができる）、または配列
（相補的配列を含む） AGAGGTGGGCAGGTGG ２ （ここでＴはＴまたはＵである）の少なくとも３つのタ
ンデム反復を含むポリヌクレオチドプローブによって検
出可能である。
ングされた形態のポリヌクレオチドが提供され、前記ポ
リヌクレオチドは、単一のミニサテライト領域または超
可変座に関して特異的であり、かつ制限エンドヌクレア
ーゼで試料のゲノムＤＮＡを断片化することによって得
られた対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイ
ブリダイゼーションを可能とする程度に前記領域または
座と相同性であるヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ
断片は前記ミニサテライト領域または超可変座からのミ
ニサテライトを含有し、ここで １）前記領域または座は少なくとも３(100)の対立遺伝
子変動（この明細書で定義するような）を有し、そして ２）前記領域または座は、配列（相補的配列を含む）： (A)AGGGGCTGGAGG １ （ここでＴはＴまたはＵであり、そして（Ａ）は存在す
ることあるいは存在しないことができる）、または配列
（相補的配列を含む） AGAGGTGGGCAGGTGG ２ （ここでＴはＴまたはＵである）の少なくとも３つのタ
ンデム反復を含むポリヌクレオチドプローブによって検
出可能である。
本発明は、また、前記領域または座が少なくとも３の対
立遺伝子変動と反対に少なくとも３の多形度を有する、
対応するポリヌクレオチドに関する。
立遺伝子変動と反対に少なくとも３の多形度を有する、
対応するポリヌクレオチドに関する。
本発明の他の面によれば、本発明のポリヌクレオチドお
よび上に定義した本発明の方法によって調製されるポリ
ヌクレオチドは、クローニングされた物質の微生物学的
再生産により、あるいは直接合成によって調製される。
よび上に定義した本発明の方法によって調製されるポリ
ヌクレオチドは、クローニングされた物質の微生物学的
再生産により、あるいは直接合成によって調製される。
本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡのポリヌクレオチド、お
よびＤＮＡにハイブリダイズ可能な任意の他の種類のポ
リヌクレオチドに関する。上に定義したポリヌクレオチ
ドは、標識されておらず、そして二本鎖（ｄｓ）または
一本鎖（ｓｓ）の形態であることができる。
よびＤＮＡにハイブリダイズ可能な任意の他の種類のポ
リヌクレオチドに関する。上に定義したポリヌクレオチ
ドは、標識されておらず、そして二本鎖（ｄｓ）または
一本鎖（ｓｓ）の形態であることができる。
本発明は、プローブとして使用するｓｓ形態の標識され
たポリヌクレオチド類ならびにｓｓプローブの生成に使
用できるそれらの標識されたｄｓ前駆体を包含する。
たポリヌクレオチド類ならびにｓｓプローブの生成に使
用できるそれらの標識されたｄｓ前駆体を包含する。
本発明の他の面によれば、上に定義した本発明のポリヌ
クレオチドまたは上に定義した方法によって調製された
ポリヌクレオチドを含んでなる、標識された成分又はマ
ーカー成分を有するポリヌクレオチドプローブが提供さ
れる。一般に、少なくともポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列は一本鎖の形態であるが、好ましくはプローブ
は完全に一本鎖の形態のポリヌクレオチドからなるであ
ろう。
クレオチドまたは上に定義した方法によって調製された
ポリヌクレオチドを含んでなる、標識された成分又はマ
ーカー成分を有するポリヌクレオチドプローブが提供さ
れる。一般に、少なくともポリヌクレオチドのヌクレオ
チド配列は一本鎖の形態であるが、好ましくはプローブ
は完全に一本鎖の形態のポリヌクレオチドからなるであ
ろう。
本発明の他の面によれば、上に定義した本発明のポリヌ
クレオチド、あるいは上に定義した本発明の方法によっ
て調製されたポリヌクレオチドを、標識しまたはマーキ
ング(merking)する工程を含んでなる上に定義したポリ
ヌクレオチドを調製する方法が提供される。
クレオチド、あるいは上に定義した本発明の方法によっ
て調製されたポリヌクレオチドを、標識しまたはマーキ
ング(merking)する工程を含んでなる上に定義したポリ
ヌクレオチドを調製する方法が提供される。
本発明のポリヌクレオチドプローブは、好ましくは任意
の普通の方法によって32Ｐ放射能標識されるが、ハイブ
リダイーゼーション技術においてよく知られた手段によ
って、別の方法で放射能標識して、例えば、35Ｓ放射能
標識プローブを調製することができる。それらは、ま
た、次の文献に記載されている方法によって、ビオチン
または同様な種で標識できる：DC Ward et al,19812年
３月15〜20日にキーストーン(Keystone)で開催された、
精製された遺伝子を使用する発展的生物学についての19
81年ICN−UCLAシンポジウム(1981 ICN-UCLA Symposium
on Developmental Biology using Purified Genes)の会
議録、vol.ＸＸIII 1981、647−658ページ、アカデミッ
ク・プレス；Donald D Brown et al.編；あるいは、次
の文献に記載されている方法によって、酵素で標識する
ことさえできる：A D B Malcolm et al.英国ケンブリッ
ジに於ける第604回生化学学会の会合(the 604th Bioche
mical Society Meeting)（1983年７月１日の会合）のア
ブストラクツ。
の普通の方法によって32Ｐ放射能標識されるが、ハイブ
リダイーゼーション技術においてよく知られた手段によ
って、別の方法で放射能標識して、例えば、35Ｓ放射能
標識プローブを調製することができる。それらは、ま
た、次の文献に記載されている方法によって、ビオチン
または同様な種で標識できる：DC Ward et al,19812年
３月15〜20日にキーストーン(Keystone)で開催された、
精製された遺伝子を使用する発展的生物学についての19
81年ICN−UCLAシンポジウム(1981 ICN-UCLA Symposium
on Developmental Biology using Purified Genes)の会
議録、vol.ＸＸIII 1981、647−658ページ、アカデミッ
ク・プレス；Donald D Brown et al.編；あるいは、次
の文献に記載されている方法によって、酵素で標識する
ことさえできる：A D B Malcolm et al.英国ケンブリッ
ジに於ける第604回生化学学会の会合(the 604th Bioche
mical Society Meeting)（1983年７月１日の会合）のア
ブストラクツ。
本発明の他の面によれば、ゲノムＤＮＡの試験試料を１
または２以上の対照との関連付けによって特徴づける方
法が提供され、この方法は、試料ＤＮＡを１または２以
上の制限酵素で断片化し、前記酵素はタンデム反復に相
当する配列を有意にな程度に切断せず、ＤＮＡ断片をポ
リヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブでプロ
ービングし、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドプローブは、単一のミニサテライト領域または超可
変座に関して特異的であり、かつ前記単一のミニサテラ
イト領域または超可変座からのミニサテライトを含有す
る対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイブリ
ダイゼーションを可能とする程度に前記ＤＮＡ断片と相
同性であるヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡのハイブリ
ダイズした断片を検出し、そしてハイブリダイズした断
片を前記１または２以上の対照と比較することからな
り、ここで １）前記ミニサテライト領域または超可変座は少なくと
も３(100)の対立遺伝子変動を有し、そして ２）前記領域または座は、１より多い多形性ミニサテラ
イト領域又は超可変座に関してＤＮＡを識別できるポリ
ヌクレオチドプローブによって検出可能である。
または２以上の対照との関連付けによって特徴づける方
法が提供され、この方法は、試料ＤＮＡを１または２以
上の制限酵素で断片化し、前記酵素はタンデム反復に相
当する配列を有意にな程度に切断せず、ＤＮＡ断片をポ
リヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブでプロ
ービングし、前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオ
チドプローブは、単一のミニサテライト領域または超可
変座に関して特異的であり、かつ前記単一のミニサテラ
イト領域または超可変座からのミニサテライトを含有す
る対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイブリ
ダイゼーションを可能とする程度に前記ＤＮＡ断片と相
同性であるヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡのハイブリ
ダイズした断片を検出し、そしてハイブリダイズした断
片を前記１または２以上の対照と比較することからな
り、ここで １）前記ミニサテライト領域または超可変座は少なくと
も３(100)の対立遺伝子変動を有し、そして ２）前記領域または座は、１より多い多形性ミニサテラ
イト領域又は超可変座に関してＤＮＡを識別できるポリ
ヌクレオチドプローブによって検出可能である。
本発明は、また、前記領域または座が少なくとも３の対
立遺伝子変動と反対に少なくとも３の多形度を有する、
試験試料を特性づける対応する方法に関する。
立遺伝子変動と反対に少なくとも３の多形度を有する、
試験試料を特性づける対応する方法に関する。
本発明の方法は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチ
ドまたは本発明の方法によって調製されたポリヌクレオ
チド、または上に定義した本発明のポリヌクレオチドプ
ローブを使用することによって実施する。
ドまたは本発明の方法によって調製されたポリヌクレオ
チド、または上に定義した本発明のポリヌクレオチドプ
ローブを使用することによって実施する。
好ましくは、試料ＤＮＡはヒトのＤＮＡである。
本発明の理解を助けるため、次の用語の意味を明らかに
する： 超可変(hypervariable) 認識された座または部位におけるヒト、動物または植物
のＤＮＡの領域は、それが、例えば、長さまたは配列に
関して、多くの異なる形態で存在する場合、超可変であ
るといわれる。
する： 超可変(hypervariable) 認識された座または部位におけるヒト、動物または植物
のＤＮＡの領域は、それが、例えば、長さまたは配列に
関して、多くの異なる形態で存在する場合、超可変であ
るといわれる。
ミニサテライト(minisalellite) 短いＤＮＡ配列のタンデム反復から構成されている、ヒ
ト、動物または植物のＤＮＡの領域。すべての反復単位
は、完全な同一性を必ずしも示さなくてよい。
ト、動物または植物のＤＮＡの領域。すべての反復単位
は、完全な同一性を必ずしも示さなくてよい。
多形性(polymorphic) 個体ごとにあるいは所定の個体の対の染色体の間で可変
性を示す遺伝子または他のＤＮＡセグメントは、多形性
であるといわれる。
性を示す遺伝子または他のＤＮＡセグメントは、多形性
であるといわれる。
反復またはタンデム反復（配列） 直列に完全にまたは不完全に反復しているポリヌクレオ
チド配列。一般に、タンデムに反復しているといわれる
配列は、少なくとも３回反復しているであろう。
チド配列。一般に、タンデムに反復しているといわれる
配列は、少なくとも３回反復しているであろう。
不完全反復（配列） ヌクレオチドの数または種類に関して正確な反復ではな
いが、認識可能にコンセンサス(consensus)配列の反復
である配列。
いが、認識可能にコンセンサス(consensus)配列の反復
である配列。
相同性(homology)％ ２つの反復またはタンデム反復の配列ＡおよびＢを比較
するとき、相同性の百分率は、Ａを与えるために必要で
あるＢ中の塩基対の置換、付加または欠失の数をＡにお
ける塩基対の数から減することによって与えられる。こ
うして、２つの配列ATGGおよびＡＧＣ間の相同性の百分
率は７５％である。
するとき、相同性の百分率は、Ａを与えるために必要で
あるＢ中の塩基対の置換、付加または欠失の数をＡにお
ける塩基対の数から減することによって与えられる。こ
うして、２つの配列ATGGおよびＡＧＣ間の相同性の百分
率は７５％である。
コンセンサスコア(consensus core)配列 多数の反復配列の間、通常２以上の異なるミニサテライ
トの反復単位の間で最も密接に合致するとして同定でき
る配列。
トの反復単位の間で最も密接に合致するとして同定でき
る配列。
ヌクレオチド（ｎｔ）および塩基対（ｂｐ）を同義で使
用する。両者はＤＮＡまたはＲＮＡに関する。略号Ｃ，
Ａ，Ｇ，Ｔは、普通に、（デオキシ）シチジン、（デオ
キシ）アデノシン、（デオキシ）グアノシンおよびデオ
キシチミジンまたはウリジンを意味する。しかしなが
ら、理解されるように、略号Ａ，Ｃ，ＧおよびＴは、普
通のヌクレオシド類（デオキシ）アデノシン、（デオキ
シ）シチジン、（デオキシ）グアノシンおよびデオキシ
チミジンまたはウリジンを使用して塩基対となることの
できる他の塩基修飾ヌクレオシドを包含することができ
る。このような塩基修飾ヌクレオシドは、（デオキシ）
イノシンおよび（デオキシ）８−アザグアノシンを包含
する。
用する。両者はＤＮＡまたはＲＮＡに関する。略号Ｃ，
Ａ，Ｇ，Ｔは、普通に、（デオキシ）シチジン、（デオ
キシ）アデノシン、（デオキシ）グアノシンおよびデオ
キシチミジンまたはウリジンを意味する。しかしなが
ら、理解されるように、略号Ａ，Ｃ，ＧおよびＴは、普
通のヌクレオシド類（デオキシ）アデノシン、（デオキ
シ）シチジン、（デオキシ）グアノシンおよびデオキシ
チミジンまたはウリジンを使用して塩基対となることの
できる他の塩基修飾ヌクレオシドを包含することができ
る。このような塩基修飾ヌクレオシドは、（デオキシ）
イノシンおよび（デオキシ）８−アザグアノシンを包含
する。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプロ
ーブがタンデムに反復する配列からなる場合、このタン
デム反復は完全反復または不完全反復あるいはそれらの
混合体であることができる。プローブ配列中に、好まし
くは少なくとも３反復、より好ましくは少なくとも７反
復が存在する。
ーブがタンデムに反復する配列からなる場合、このタン
デム反復は完全反復または不完全反復あるいはそれらの
混合体であることができる。プローブ配列中に、好まし
くは少なくとも３反復、より好ましくは少なくとも７反
復が存在する。
本発明のプローブは、単一であるいは他の座特異的プロ
ーブと組み合わせて、プローブの混合物すなわちカクテ
ルを用いる、一連の試験または単一の試験において使用
することができ、そして次の分野において有用であろ
う： １．ヒトにおける父性または母性の試験。
ーブと組み合わせて、プローブの混合物すなわちカクテ
ルを用いる、一連の試験または単一の試験において使用
することができ、そして次の分野において有用であろ
う： １．ヒトにおける父性または母性の試験。
２．家族の群の評価、例えば、移民の論争または相続の
論争。
論争。
３．双生児における接合性(zygosity)。
４．ヒトにおける血族結婚についての試験。
５．ヒトにおける一般的血統分析。
６．ヒトにおける遺伝的疾患に関連する遺伝子座の同
定。これにより、特異的プローブを構成して遺伝的疾患
を検出できる。
定。これにより、特異的プローブを構成して遺伝的疾患
を検出できる。
７．法医学、例えば、（ａ）強姦罪からの精液試料のフ
ィンガープリント生成、 ｂ）例えば、汚れた衣服からの、血液、毛および精液の
試料のフィンガープリント生成、 ｃ）ヒト残留物の同定、 ｄ）他の法医学的組織の試料、例えば、皮膚の特性づ
け。
ィンガープリント生成、 ｂ）例えば、汚れた衣服からの、血液、毛および精液の
試料のフィンガープリント生成、 ｃ）ヒト残留物の同定、 ｄ）他の法医学的組織の試料、例えば、皮膚の特性づ
け。
８．細胞のキメリズム(chimaerism)の研究、例えば、骨
髄移植後の供与体細胞対受容体細胞の追跡。
髄移植後の供与体細胞対受容体細胞の追跡。
９．家畜類の飼育および血統の分析／証明。（これは、
例えば、動物の純粋な系統の日常的管理および検査、お
よび、例えば、競争馬および犬の飼育を含む訴訟におけ
る血統の検査を包含する。）また、経済的に重要な遺伝
された特性との関連を示すことがある遺伝標識を提供す
るため。
例えば、動物の純粋な系統の日常的管理および検査、お
よび、例えば、競争馬および犬の飼育を含む訴訟におけ
る血統の検査を包含する。）また、経済的に重要な遺伝
された特性との関連を示すことがある遺伝標識を提供す
るため。
10.培養した動物または植物の細胞系の日常の品質管
理、純粋な細胞系についての検査および日常の同定作業
の検査。
理、純粋な細胞系についての検査および日常の同定作業
の検査。
11.腫瘍細胞および腫瘍の分子の異常についての分析。
12.ポリヌクレオチド類およびそれらから誘導されるプ
ローブは、植物の繁殖において潜在的用途をもつことが
予測される。
ローブは、植物の繁殖において潜在的用途をもつことが
予測される。
しかしながら、本発明の座特異的プローブは、以後の実
施例３において証明されるように、法医学において特に
有用であり、そして少なくともプローブｐλｇ３は胎児
ヘモグロビンの遺伝的に永続する異質細胞形態と同時に
分離することができる。また、プローブは父性の試験お
よび関連する実用性（上の実用性２および５を参照）に
おいて、ならびに細胞のキメリズムの研究における強力
な使用法を提供する。
施例３において証明されるように、法医学において特に
有用であり、そして少なくともプローブｐλｇ３は胎児
ヘモグロビンの遺伝的に永続する異質細胞形態と同時に
分離することができる。また、プローブは父性の試験お
よび関連する実用性（上の実用性２および５を参照）に
おいて、ならびに細胞のキメリズムの研究における強力
な使用法を提供する。
有利には、本発明のポリヌクレオチド、並びに本発明の
方法によって調製されたポリヌクレオチドおよび本発明
のポリヌクレオチドプローブは、次の配列から選択され
る１つの配列もしくはこのタンデム反復又はこれに対し
て相補的な配列を含んでなるポリヌクレオチドプローブ
によって同定される、ミニサテライト領域または超可変
座からのミニサテライトを含有するＤＮＡの断片とハイ
ブリダイズすることができる： （ここでＹはＣ，ＴまたはＵであり、ＸはＧまたはＣで
あり、ＲはＡまたはＧであり、そしてＴはＴまたはＵで
ある）。
方法によって調製されたポリヌクレオチドおよび本発明
のポリヌクレオチドプローブは、次の配列から選択され
る１つの配列もしくはこのタンデム反復又はこれに対し
て相補的な配列を含んでなるポリヌクレオチドプローブ
によって同定される、ミニサテライト領域または超可変
座からのミニサテライトを含有するＤＮＡの断片とハイ
ブリダイズすることができる： （ここでＹはＣ，ＴまたはＵであり、ＸはＧまたはＣで
あり、ＲはＡまたはＧであり、そしてＴはＴまたはＵで
ある）。
本発明のポリヌクレオチド、本発明の方法によって調製
されるポリヌクレオチドおよび本発明のプローブは、単
一の特定のミニサテライト領域または超可変座からのミ
ニサテライトを含有するＤＮＡ断片とハイブリダイズす
ることができ、こうして座特異的である。一般に、本発
明のポリヌクレオチドおよびプローブは、高いストリン
ジエンシーのハイブリダイゼーション条件下で座特異的
であろう。これに関して、表現「座特異的(locus speci
fic)」は、ポリヌクレオチドまたはプローブが単一の特
定の座にのみハイブリダイズすることを保証するハイブ
リダイゼーション条件下でポリヌクレオチドまたはプロ
ーブを使用できることを意味するために、ポリヌクレオ
チドまたはプローブに関してここで使用する。
されるポリヌクレオチドおよび本発明のプローブは、単
一の特定のミニサテライト領域または超可変座からのミ
ニサテライトを含有するＤＮＡ断片とハイブリダイズす
ることができ、こうして座特異的である。一般に、本発
明のポリヌクレオチドおよびプローブは、高いストリン
ジエンシーのハイブリダイゼーション条件下で座特異的
であろう。これに関して、表現「座特異的(locus speci
fic)」は、ポリヌクレオチドまたはプローブが単一の特
定の座にのみハイブリダイズすることを保証するハイブ
リダイゼーション条件下でポリヌクレオチドまたはプロ
ーブを使用できることを意味するために、ポリヌクレオ
チドまたはプローブに関してここで使用する。
しかしながら、理解されるように、本発明の座特異的プ
ローブは、ハイブリダイゼーションのストリンジエンシ
ーが低下した条件下で使用するとき、１より多い多形性
ミニサテライト領域または超可変座に関連してＤＮＡを
識別する(differen-tiate)することができ、こうして他
の情報を与える遺伝子座の同定に使用できる。
ローブは、ハイブリダイゼーションのストリンジエンシ
ーが低下した条件下で使用するとき、１より多い多形性
ミニサテライト領域または超可変座に関連してＤＮＡを
識別する(differen-tiate)することができ、こうして他
の情報を与える遺伝子座の同定に使用できる。
こうして、本発明の他の面によれば、ゲノム中の少なく
とも３(100)の対立遺伝子の変動（ここで定義したよう
な）を有する特定の領域または座に関して特異的であ
る、ミニサテライトを含むＤＮＡ断片にハイブリダイズ
することができるポリヌクレオチドを調製する方法が提
供され、この方法は、 上に定義したポリヌクレオチドとゲノムＤＮＡの断片と
のハイブリダイゼーションによって同定されるＤＮＡ断
片をクローニングし、そしてゲノム上の少なくとも３(1
00)の対立遺伝子の変動（ここに定義したような）を有
する特定の領域または座に関して特異的であるミニサテ
ライトを含有するＤＮＡ断片にハイブリダイズすること
ができるポリヌクレオチドを前記クローニングしたＤＮ
Ａ断片から調製することを含んでなり、 前記方法は、１より多い多形性のミニサテライト領域ま
たは超可変座に関連してプローブがＤＮＡを識別できる
ようにするために有効なハイブリダイゼーション条件下
で実施される。
とも３(100)の対立遺伝子の変動（ここで定義したよう
な）を有する特定の領域または座に関して特異的であ
る、ミニサテライトを含むＤＮＡ断片にハイブリダイズ
することができるポリヌクレオチドを調製する方法が提
供され、この方法は、 上に定義したポリヌクレオチドとゲノムＤＮＡの断片と
のハイブリダイゼーションによって同定されるＤＮＡ断
片をクローニングし、そしてゲノム上の少なくとも３(1
00)の対立遺伝子の変動（ここに定義したような）を有
する特定の領域または座に関して特異的であるミニサテ
ライトを含有するＤＮＡ断片にハイブリダイズすること
ができるポリヌクレオチドを前記クローニングしたＤＮ
Ａ断片から調製することを含んでなり、 前記方法は、１より多い多形性のミニサテライト領域ま
たは超可変座に関連してプローブがＤＮＡを識別できる
ようにするために有効なハイブリダイゼーション条件下
で実施される。
本発明の他の面によれば、分解された形態またはクロー
ニングされた形態のポリヌクレオチドが提供され、前記
ポリヌクレオチドは、単一のミニサテライト領域または
超可変座に関して特異的であり、かつ制限エンドヌクレ
アーゼによる試料ゲノムＤＮＡの断片化によって得られ
た対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイブリ
ダイゼーションを可能とする程度に前記領域または座と
相同性であるヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ断片
は前記ミニサテライト領域または超可変座からのミニサ
テライトを含有し、ここで １）前記領域または座は少なくとも３(100)の対立遺伝
子の変動（ここで定義した）を有し、そして ２）前記領域または座は上に定義した座特異的ポリヌク
レオチドプローブによって検出できる。
ニングされた形態のポリヌクレオチドが提供され、前記
ポリヌクレオチドは、単一のミニサテライト領域または
超可変座に関して特異的であり、かつ制限エンドヌクレ
アーゼによる試料ゲノムＤＮＡの断片化によって得られ
た対応するＤＮＡ断片へのヌクレオチド配列のハイブリ
ダイゼーションを可能とする程度に前記領域または座と
相同性であるヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ断片
は前記ミニサテライト領域または超可変座からのミニサ
テライトを含有し、ここで １）前記領域または座は少なくとも３(100)の対立遺伝
子の変動（ここで定義した）を有し、そして ２）前記領域または座は上に定義した座特異的ポリヌク
レオチドプローブによって検出できる。
本発明は、また、前記領域または座が少なくとも３の多
形度を有する、対応する方法および対応するポリヌクレ
オチドに関する。
形度を有する、対応する方法および対応するポリヌクレ
オチドに関する。
本発明は、さらに、このような座特異的ポリヌクレオチ
ドを含んで成るプローブ、およびこのようなポリヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドプローブを使用する、Ｄ
ＮＡの試験試料を特性づける方法に関する。
ドを含んで成るプローブ、およびこのようなポリヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドプローブを使用する、Ｄ
ＮＡの試験試料を特性づける方法に関する。
本発明の座特異的ポリヌクレオチドおよびプローブは、
ミニサテライト含有ＤＮＡ断片のミニサテライトと相同
性であり、あるいは好ましさに劣るが、ミニサテライト
を挟む(flanking)配列と相同性である。
ミニサテライト含有ＤＮＡ断片のミニサテライトと相同
性であり、あるいは好ましさに劣るが、ミニサテライト
を挟む(flanking)配列と相同性である。
本発明のポリヌクレオチドおよびプローブが特定の配列
のタンデム配列を含むとき、このような配列は一般に少
なくとも３回反復し、そしてこのような反復は必ずしも
正確である必要はない。正確でない反復は不完全反復と
記載する。このような反復は、それにもかかわらず、認
識可能に反復する。一般に、このことは、すべての反復
単位の間に平均して少なくとも７０％の相同性が存在す
ることを意味する。好ましくは、すべての反復単位の間
に、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５
％、ことに９０％の相同性が存在する。しかしながら、
理解されるように、ヌクレオチド配列または「反復単
位」は、必要に応じて、まったく反復する必要はない。
のタンデム配列を含むとき、このような配列は一般に少
なくとも３回反復し、そしてこのような反復は必ずしも
正確である必要はない。正確でない反復は不完全反復と
記載する。このような反復は、それにもかかわらず、認
識可能に反復する。一般に、このことは、すべての反復
単位の間に平均して少なくとも７０％の相同性が存在す
ることを意味する。好ましくは、すべての反復単位の間
に、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５
％、ことに９０％の相同性が存在する。しかしながら、
理解されるように、ヌクレオチド配列または「反復単
位」は、必要に応じて、まったく反復する必要はない。
反復単位の数、ｎ、は有利には少なくとも５であるが、
好ましくは少なくとも１０である。便利にはｎは10〜40
であるが、原理的にはｎは任意の数、１から10,000まで
であることさえできる。
好ましくは少なくとも１０である。便利にはｎは10〜40
であるが、原理的にはｎは任意の数、１から10,000まで
であることさえできる。
本発明のポリヌクレオチドおよびプローブが特定の配列
のタンデム配列を含むとき、フランキング配列はほとん
ど無関係である。フランキング配列は省略することがで
き、あるいは任意の数、例えば、50,000までのヌクレオ
チドで存在することができるが、この様な長いプローブ
を用いることは一般に意味がない。それにもかかわら
ず、このような大きいポリヌクレオチドは、ことにプロ
ーブとして有用な小さいポリヌクレオチドを切り出すこ
とができる担体として役立つことができる。これらのフ
ランキング配列は、反復配列がｓｓ−ＤＮＡを有すると
きでさえ、ｄｓ−ＤＮＡまたはｓｓ−ＤＮＡの一部分を
形成できる。
のタンデム配列を含むとき、フランキング配列はほとん
ど無関係である。フランキング配列は省略することがで
き、あるいは任意の数、例えば、50,000までのヌクレオ
チドで存在することができるが、この様な長いプローブ
を用いることは一般に意味がない。それにもかかわら
ず、このような大きいポリヌクレオチドは、ことにプロ
ーブとして有用な小さいポリヌクレオチドを切り出すこ
とができる担体として役立つことができる。これらのフ
ランキング配列は、反復配列がｓｓ−ＤＮＡを有すると
きでさえ、ｄｓ−ＤＮＡまたはｓｓ−ＤＮＡの一部分を
形成できる。
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチドプローブは、上に定義した式３〜９から選択し
た任意の１つの配列またはそれに対して相補的な配列ま
たはそのタンデム反復（すべてのタンデムに反復する配
列の間に少なくとも７０％の相同性が平均して存在す
る）またはそれに対して相同性の配列を含む。
レオチドプローブは、上に定義した式３〜９から選択し
た任意の１つの配列またはそれに対して相補的な配列ま
たはそのタンデム反復（すべてのタンデムに反復する配
列の間に少なくとも７０％の相同性が平均して存在す
る）またはそれに対して相同性の配列を含む。
こうして、本発明の１つの好ましいポリヌクレオチド
は、上に定義した式３の配列またはそのタンデム反復ま
たはそれに対して相補的な配列を含む。このようなヌク
レオチド配列は、染色体７上に位置する常染色体の座に
関して特異的である。このような配列を含むポリヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドプローブを、ここでｐλ
ｇ３と呼ぶ。
は、上に定義した式３の配列またはそのタンデム反復ま
たはそれに対して相補的な配列を含む。このようなヌク
レオチド配列は、染色体７上に位置する常染色体の座に
関して特異的である。このような配列を含むポリヌクレ
オチドおよびポリヌクレオチドプローブを、ここでｐλ
ｇ３と呼ぶ。
本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式４の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的な配列を含む。このようなヌクレオチド配列は
染色体１上に位置するある座に関して特異的である。こ
のような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチドプローブを、ここでλＭＳ１と呼ぶ。
た式４の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的な配列を含む。このようなヌクレオチド配列は
染色体１上に位置するある座に関して特異的である。こ
のような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレ
オチドプローブを、ここでλＭＳ１と呼ぶ。
本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式５の配列またはそのタンデム反復、またはそれに対
して相補的な配列を含む。このような配列は、染色体７
上に位置するある座に関して特異的である。このような
配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプ
ローブを、ここでλＭＳ31と呼ぶ。
た式５の配列またはそのタンデム反復、またはそれに対
して相補的な配列を含む。このような配列は、染色体７
上に位置するある座に関して特異的である。このような
配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプ
ローブを、ここでλＭＳ31と呼ぶ。
本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式６の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的配列を含む。このようなヌクレオチド配列は染
色体１上に位置するある座に関して特異的である。この
ような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チド配列を、ここでλＭＳ32と呼ぶ。
た式６の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的配列を含む。このようなヌクレオチド配列は染
色体１上に位置するある座に関して特異的である。この
ような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌクレオ
チド配列を、ここでλＭＳ32と呼ぶ。
本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式７および８から選択される配列またはそのタンデム
反復またはそれに対して相補的な配列を含む。このよう
なヌクレオチド配列は染色体５上に位置するある座に関
して特異的である。このような配列を含むポリヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドプローブを、ここでλＭＳ
８と呼ぶ。
た式７および８から選択される配列またはそのタンデム
反復またはそれに対して相補的な配列を含む。このよう
なヌクレオチド配列は染色体５上に位置するある座に関
して特異的である。このような配列を含むポリヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチドプローブを、ここでλＭＳ
８と呼ぶ。
本発明の他の好ましいポリヌクレオチドは、上に定義し
た式９の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的である配列を含む。このようなヌクレオチド配
列は染色体１２上に位置する座に関して特異的である。
このような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチド配列を、ここでλＭＳ43と呼ぶ。
た式９の配列またはそのタンデム反復またはそれに対し
て相補的である配列を含む。このようなヌクレオチド配
列は染色体１２上に位置する座に関して特異的である。
このような配列を含むポリヌクレオチドおよびポリヌク
レオチド配列を、ここでλＭＳ43と呼ぶ。
上に示したように、一般に、反復単位間に少なくとも７
０％、有利には少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性が
存在する。しかしながら、式３〜９の配列のいずれか１
つは正確に反復することがことに好ましい。これに関し
て、理解されるように、この後者の要件は、各単位が所
望の式の範囲内に入る配列を有する場合に満足されう
る。こうして、各反復単位が正確に同一の配列を有する
ことは必要ではない。
０％、有利には少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も８５％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性が
存在する。しかしながら、式３〜９の配列のいずれか１
つは正確に反復することがことに好ましい。これに関し
て、理解されるように、この後者の要件は、各単位が所
望の式の範囲内に入る配列を有する場合に満足されう
る。こうして、各反復単位が正確に同一の配列を有する
ことは必要ではない。
本発明の１つの好ましい実施態様において、試験試料の
供与者と１または２以上の対照の試料供与者と同一性な
どを確立する方法が提供され、この方法においては１ま
たは２以上の対照試料が同様に断片化され、そしてそれ
ぞれの試料からのハイブリダイズした断片の比較が行わ
れる。
供与者と１または２以上の対照の試料供与者と同一性な
どを確立する方法が提供され、この方法においては１ま
たは２以上の対照試料が同様に断片化され、そしてそれ
ぞれの試料からのハイブリダイズした断片の比較が行わ
れる。
他の好ましい実施態様において、試験試料の供与者と１
または２以上の対照試料供与者との間の家族関係を確立
する方法が提供され、この方法においては対照試料が同
様に断片化され、そしてそれぞれの試料からのハイブリ
ダイズした断片が比較される。
または２以上の対照試料供与者との間の家族関係を確立
する方法が提供され、この方法においては対照試料が同
様に断片化され、そしてそれぞれの試料からのハイブリ
ダイズした断片が比較される。
前述の方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはプロー
ブを単独で使用して、あるいは本発明の少なくとも２つ
のポリヌクレオチドまたはプローブを使用して、前記ポ
リヌクレオチドまたはプローブの混合物を使用する一連
の試験、または単一の試験において実施できる。
ブを単独で使用して、あるいは本発明の少なくとも２つ
のポリヌクレオチドまたはプローブを使用して、前記ポ
リヌクレオチドまたはプローブの混合物を使用する一連
の試験、または単一の試験において実施できる。
本発明の他の好ましい実施態様において、遺伝病、異常
または形質を診断する方法が提供され、この方法は試験
試料を上に定義した少なくとも１つのポリヌクレオチド
またはポリヌクレオチドプローブでプロービング(probi
ng)することを含んで成り、前記プローブは特定の遺伝
病、異常または形質と関連をもつものである。
または形質を診断する方法が提供され、この方法は試験
試料を上に定義した少なくとも１つのポリヌクレオチド
またはポリヌクレオチドプローブでプロービング(probi
ng)することを含んで成り、前記プローブは特定の遺伝
病、異常または形質と関連をもつものである。
本発明者等が試験した本発明のプローブのすべては、高
いストリンジエンシーのハイブリダイゼーション条件下
で座特異的プローブとして働く。
いストリンジエンシーのハイブリダイゼーション条件下
で座特異的プローブとして働く。
本発明者等が試験した本発明のプローブによって検出さ
れる座の極端な可変性は、サザンブロックハイブリダイ
ゼーションにおけるプローブの感度と相俟って、とくに
多座ＤＮＡフィンガープリント分析のために入手可能な
ＤＮＡが不十分であるとき、英国特許出願第8525252号
（公告第2,166,445号）に記載されかつクレイムされて
いるように、個体の同定においてことに有用な道具を提
供する。多座ＤＮＡフィンガープリントは、0.5μｇの
ＤＮＡから得ることができるが、これに対して座特異的
プローブは少なくとも１桁感度が高く、そして１μｌ程
度と少ない血液について使用できる。
れる座の極端な可変性は、サザンブロックハイブリダイ
ゼーションにおけるプローブの感度と相俟って、とくに
多座ＤＮＡフィンガープリント分析のために入手可能な
ＤＮＡが不十分であるとき、英国特許出願第8525252号
（公告第2,166,445号）に記載されかつクレイムされて
いるように、個体の同定においてことに有用な道具を提
供する。多座ＤＮＡフィンガープリントは、0.5μｇの
ＤＮＡから得ることができるが、これに対して座特異的
プローブは少なくとも１桁感度が高く、そして１μｌ程
度と少ない血液について使用できる。
なおさらに少ない量の試料の試験を必要とする異常な場
合において、本発明は欧州特許出願第86302299.2号（公
開第0201184号）に記載されている増幅技術と組み合わ
せて特に価値があるであろう。
合において、本発明は欧州特許出願第86302299.2号（公
開第0201184号）に記載されている増幅技術と組み合わ
せて特に価値があるであろう。
本発明はヒト−ゲノムにおける情報に富む遺伝子座の同
定を可能にし、これにより座特異的プローブの調製を可
能にし、各座特異的プローブは単一の情報に富む遺伝子
座に関して特異的である。本発明者等は６つの異なる非
常に情報に富む遺伝子座を特異的に同定したが、この遺
伝子座は試験した集団において非常に高いヘテロ接合度
(heterozygosity)（少なくとも９０％）を有し、かつこ
れまで分離されたうちで最も多形性である。そして、本
発明者等はｐλｇ３，λＭＳ１，λＭＳ８，λＭＳ31，
λＭＳ32およびλＭＳ43（上に定義した）と表示する座
特異的プローブを各座について調製した。
定を可能にし、これにより座特異的プローブの調製を可
能にし、各座特異的プローブは単一の情報に富む遺伝子
座に関して特異的である。本発明者等は６つの異なる非
常に情報に富む遺伝子座を特異的に同定したが、この遺
伝子座は試験した集団において非常に高いヘテロ接合度
(heterozygosity)（少なくとも９０％）を有し、かつこ
れまで分離されたうちで最も多形性である。そして、本
発明者等はｐλｇ３，λＭＳ１，λＭＳ８，λＭＳ31，
λＭＳ32およびλＭＳ43（上に定義した）と表示する座
特異的プローブを各座について調製した。
座特異的プローブによって決定される遺伝子型の個体特
異性の程度は、各座におけるヘテロ接合度Ｈから推定で
きる。ある座における平均対立遺伝子頻度ｑは（１−
Ｈ）により与えられ、そして２つのランダムに選択され
た個体が同じ遺伝子型を共有する確率はｑ2（２−ｑ）
である。２つの個体の誤った結合(false association)
のこの確率は、λＭＳ８についての0.02からλＭＳ31に
ついての0.0002まで多様であり、そしてヘテロ接合度
（ｑ）がこれらの確率を減少するだろうということにお
いて慎重な推定(conservative estimate)である。すべ
ての６つのミニサテライトのプローブについての誤った
結合の累積確率は約１０-16であり、１つの多座プロー
ブによって検出される２つのランダムに選択されたＤＮ
Ａのフィンガープリントが同一であるという可能性に匹
敵する（英国特許出願第8525252号参照）。対照的に、
２つのシブ(sib)が所定の超可変座について同一である
機会は１／４（１＋ｑ）2によって与えられる。すべて
の６つのプローブについてシブの同一性の累積確率は0.
0004であり、これに対して１つの多座プローブを用いる
ＤＮＡフィンガープリントについは約１０-7である。
異性の程度は、各座におけるヘテロ接合度Ｈから推定で
きる。ある座における平均対立遺伝子頻度ｑは（１−
Ｈ）により与えられ、そして２つのランダムに選択され
た個体が同じ遺伝子型を共有する確率はｑ2（２−ｑ）
である。２つの個体の誤った結合(false association)
のこの確率は、λＭＳ８についての0.02からλＭＳ31に
ついての0.0002まで多様であり、そしてヘテロ接合度
（ｑ）がこれらの確率を減少するだろうということにお
いて慎重な推定(conservative estimate)である。すべ
ての６つのミニサテライトのプローブについての誤った
結合の累積確率は約１０-16であり、１つの多座プロー
ブによって検出される２つのランダムに選択されたＤＮ
Ａのフィンガープリントが同一であるという可能性に匹
敵する（英国特許出願第8525252号参照）。対照的に、
２つのシブ(sib)が所定の超可変座について同一である
機会は１／４（１＋ｑ）2によって与えられる。すべて
の６つのプローブについてシブの同一性の累積確率は0.
0004であり、これに対して１つの多座プローブを用いる
ＤＮＡフィンガープリントについは約１０-7である。
これらの座特異的超可変プローブは、第11Ｃ図において
分析する殺人の場合（ＤＮＡフィンガープリント分析の
ために法医学的試料の２つから回収されるＤＮＡは不十
分であった）によって示されるように、法医学において
特に有用であることが証明された。２人の被害者からの
精液はλＭＳ１およびλＭＳ31のプローブで容疑者のそ
れと異なる共通の表現型を示した。上の考察から、被害
者ＸおよびＹが異なる無関係の人間によって性的に攻撃
された確率は２×１０-7であると計算できる。同様に、
２人の仮定の攻撃者が第１親等の血縁関係にある、例え
ば、兄弟である機会は0.07であった。これは、Ｘおよび
Ｙが同一の男性によって性的に攻撃されたという強い証
拠、すなわち、引き続いて、より多い量の法廷の材料の
ＤＮＡフィンガープリント分析によって確証された結論
を提供する。さらに、ＸおよびＹからの精液汚染は、２
人以上の容疑者よりも、ほとんど確実に単一の個体から
由来するものである。例えば、第11Ｃ図の着色ｂについ
て考えると、これは２人の被害者の対立遺伝子および２
人の追加の容疑者の対立遺伝子を示す。３つの個体（２
人の容疑者および１人の被害者）のプールが４以下の分
割可能なされた対立遺伝子を示す機会は、ｑ2(55-210q+
216q2)によって与えられる。この確率はプローブλＭＳ
１について0.02およびプローブλＭＳ31について0.005
であり、Ｘが１人ではなく２人の男性に性的に攻撃され
た組み合わせた確率、１０-4を与える。これにより、Ｘ
およびＹが単一の個体によって攻撃されたことが確率さ
れ、そして座特異的プローブは、多座ＤＮＡフィンガー
プレートプローブと異なり、混合ＤＮＡ試料中に示され
る個体の数の推定に使用できることが示される。
分析する殺人の場合（ＤＮＡフィンガープリント分析の
ために法医学的試料の２つから回収されるＤＮＡは不十
分であった）によって示されるように、法医学において
特に有用であることが証明された。２人の被害者からの
精液はλＭＳ１およびλＭＳ31のプローブで容疑者のそ
れと異なる共通の表現型を示した。上の考察から、被害
者ＸおよびＹが異なる無関係の人間によって性的に攻撃
された確率は２×１０-7であると計算できる。同様に、
２人の仮定の攻撃者が第１親等の血縁関係にある、例え
ば、兄弟である機会は0.07であった。これは、Ｘおよび
Ｙが同一の男性によって性的に攻撃されたという強い証
拠、すなわち、引き続いて、より多い量の法廷の材料の
ＤＮＡフィンガープリント分析によって確証された結論
を提供する。さらに、ＸおよびＹからの精液汚染は、２
人以上の容疑者よりも、ほとんど確実に単一の個体から
由来するものである。例えば、第11Ｃ図の着色ｂについ
て考えると、これは２人の被害者の対立遺伝子および２
人の追加の容疑者の対立遺伝子を示す。３つの個体（２
人の容疑者および１人の被害者）のプールが４以下の分
割可能なされた対立遺伝子を示す機会は、ｑ2(55-210q+
216q2)によって与えられる。この確率はプローブλＭＳ
１について0.02およびプローブλＭＳ31について0.005
であり、Ｘが１人ではなく２人の男性に性的に攻撃され
た組み合わせた確率、１０-4を与える。これにより、Ｘ
およびＹが単一の個体によって攻撃されたことが確率さ
れ、そして座特異的プローブは、多座ＤＮＡフィンガー
プレートプローブと異なり、混合ＤＮＡ試料中に示され
る個体の数の推定に使用できることが示される。
超可変ＤＮＡ断片のメンデル遺伝は、また、例えば、父
性の論争において、家族関係を確立するために使用でき
る。所定の座特異的プローブについて、ある子供の父性
対立遺伝子がランダムに選択された男性中に偶然に存在
する確率は２ｑ−ｑ2で推定できる。すべての６つのミ
ニサテライトについて、父以外の者を誤って含める累積
確率は▲π6 1▼（２ｑi−ｑi 2）＝１０-7であり、２つ
のＤＮＡフィンガープレートプローブを使用して得られ
るものに匹敵する。同様に、真の父の第１親等の関係
者、例えば、兄弟、を誤って含める累積確率は0.02であ
る。これらの超可変座特異的プローブを引き続いて使用
すると、家族関係を確立するための強力な方法を得るこ
とができるが、これらの不安定な座における新しい長さ
の対立遺伝子への突然変異は誤った排除に導く場合があ
ることが警告される。これらの超可変座における突然変
異の割合はまだ知られていない。
性の論争において、家族関係を確立するために使用でき
る。所定の座特異的プローブについて、ある子供の父性
対立遺伝子がランダムに選択された男性中に偶然に存在
する確率は２ｑ−ｑ2で推定できる。すべての６つのミ
ニサテライトについて、父以外の者を誤って含める累積
確率は▲π6 1▼（２ｑi−ｑi 2）＝１０-7であり、２つ
のＤＮＡフィンガープレートプローブを使用して得られ
るものに匹敵する。同様に、真の父の第１親等の関係
者、例えば、兄弟、を誤って含める累積確率は0.02であ
る。これらの超可変座特異的プローブを引き続いて使用
すると、家族関係を確立するための強力な方法を得るこ
とができるが、これらの不安定な座における新しい長さ
の対立遺伝子への突然変異は誤った排除に導く場合があ
ることが警告される。これらの超可変座における突然変
異の割合はまだ知られていない。
これらの座特異的プローブの座特異性および感度は、多
座サザンブロットパターンを発生せしめるためにプール
されたプローブを使用することを可能とする（第１２
図）。５つのプールされたプローブによって生成され
る、これらの「再構成されたＤＮＡフィンガープリン
ト」は、多座プローブによって検出されるそれらの対応
物よりも複雑さがかなり小さく、そしてデンシトメータ
ーの走査後にディジタル的に符号化することができるで
あろう。個体のミニサテライトの可変性が高いにもかか
わらず、プールされたプローブのプロファイルは、主と
して、異なる座からのミニサテライト断片の電気泳動的
同時移動の結果、無関係の北ヨーロッパの個体間で共有
する断片の実質的なレベル（１８％）を示す。このバン
ド共有のレベルは多座プローブによって生成される普通
のＤＮＡフィンガープリント中に見られるレベルに類似
し、後者の場合においてバンド共有のレベルはランダム
に選択された個体間で約２５％である。平均8.4のＤＮ
Ａ断片が混合プローブのパターにおいて分割されるの
で、１つの個体におけるこれらの断片のすべてが第２の
ランダムに選択された個体中に存在する機会は慎重に0.
188.4＝６×１０-7であると推定できる。したがって、
これらのパターンは高いレベルの個体特異性を提供する
が、このような高いレベルは多座プローブの使用によ
り、あるいは座特異的プローブを使用する連続的ハイブ
リダイゼーション（上を参照）によっては達成できな
い。プールされたプローブおよび個々の座特異的プロー
ブの両者は、とくに骨髄移植後の引き続くエングラフメ
ント(engraphment)のための提供者対受容者の遺伝標識
を得るために、細胞キメリズムの研究において特に有用
であることが明らかとなるであろう。ＤＮＡ混合実験
（第１２図）は、これらのプローブを使用して低いレベ
ルのキメリズムを検出できることを示す。
座サザンブロットパターンを発生せしめるためにプール
されたプローブを使用することを可能とする（第１２
図）。５つのプールされたプローブによって生成され
る、これらの「再構成されたＤＮＡフィンガープリン
ト」は、多座プローブによって検出されるそれらの対応
物よりも複雑さがかなり小さく、そしてデンシトメータ
ーの走査後にディジタル的に符号化することができるで
あろう。個体のミニサテライトの可変性が高いにもかか
わらず、プールされたプローブのプロファイルは、主と
して、異なる座からのミニサテライト断片の電気泳動的
同時移動の結果、無関係の北ヨーロッパの個体間で共有
する断片の実質的なレベル（１８％）を示す。このバン
ド共有のレベルは多座プローブによって生成される普通
のＤＮＡフィンガープリント中に見られるレベルに類似
し、後者の場合においてバンド共有のレベルはランダム
に選択された個体間で約２５％である。平均8.4のＤＮ
Ａ断片が混合プローブのパターにおいて分割されるの
で、１つの個体におけるこれらの断片のすべてが第２の
ランダムに選択された個体中に存在する機会は慎重に0.
188.4＝６×１０-7であると推定できる。したがって、
これらのパターンは高いレベルの個体特異性を提供する
が、このような高いレベルは多座プローブの使用によ
り、あるいは座特異的プローブを使用する連続的ハイブ
リダイゼーション（上を参照）によっては達成できな
い。プールされたプローブおよび個々の座特異的プロー
ブの両者は、とくに骨髄移植後の引き続くエングラフメ
ント(engraphment)のための提供者対受容者の遺伝標識
を得るために、細胞キメリズムの研究において特に有用
であることが明らかとなるであろう。ＤＮＡ混合実験
（第１２図）は、これらのプローブを使用して低いレベ
ルのキメリズムを検出できることを示す。
以下の実施例において、温度は℃であり、そしてプロー
ブ33.6および33.15は次のコンセンサス反復配列を有す
る英国特許公告第2,166,445号に記載されているもので
ある： それぞれ、(A)AGGGCTGGAGG、および AGAGGTGGGCAGGTGG。
ブ33.6および33.15は次のコンセンサス反復配列を有す
る英国特許公告第2,166,445号に記載されているもので
ある： それぞれ、(A)AGGGCTGGAGG、および AGAGGTGGGCAGGTGG。
実施例１ この実施例は、ＤＮＡフィンガプリンにおける特定のミ
ニサテライト断片の分離および性質を記載する。
ニサテライト断片の分離および性質を記載する。
一般的方法 Jeffreys A J et al.,(1985)Nature316,76−79に記載さ
れる白血球およびJeffreys et al.,Am.J.Hum,Genet,39,
11−24に記載されるHPFH血統ｏｆ個体III９から誘導さ
れたエプステイン・バール(Epstein Barr)ウイルス形質
転換リンパ芽球系(Nilsson.K et al,(1971)Int.J.Cance
r 8、443−450参照）から、ＤＮＡを分離した。制限消化
およびサザンプロットハイブリダイゼーションを、Jeff
reys A J等の前述の文献中に記載されているようにして
実施した。二本鎖ＤＮＡプローブの断片を、Dretzen.G
et al(1981)Anal.Biochem.112、295−298に記載される
ように、DE81紙上での電気泳動により分離し、そしてFe
inberg,A.P et al(1984)Anal.Biaochem.137、266−267
に記載されているように、ランダム・オリゴヌクレオチ
ド・プライミングによって32Ｐで標識した。一本鎖ミニ
サテライトのプローブ33.15をJeffreys et al(1985)Nat
ure314,67−73に記載されているようにして調製した。
れる白血球およびJeffreys et al.,Am.J.Hum,Genet,39,
11−24に記載されるHPFH血統ｏｆ個体III９から誘導さ
れたエプステイン・バール(Epstein Barr)ウイルス形質
転換リンパ芽球系(Nilsson.K et al,(1971)Int.J.Cance
r 8、443−450参照）から、ＤＮＡを分離した。制限消化
およびサザンプロットハイブリダイゼーションを、Jeff
reys A J等の前述の文献中に記載されているようにして
実施した。二本鎖ＤＮＡプローブの断片を、Dretzen.G
et al(1981)Anal.Biochem.112、295−298に記載される
ように、DE81紙上での電気泳動により分離し、そしてFe
inberg,A.P et al(1984)Anal.Biaochem.137、266−267
に記載されているように、ランダム・オリゴヌクレオチ
ド・プライミングによって32Ｐで標識した。一本鎖ミニ
サテライトのプローブ33.15をJeffreys et al(1985)Nat
ure314,67−73に記載されているようにして調製した。
超可変断片ｇのクローニング Ｓａｕ３Ａで消化した600μｇの個体III９リンパ芽球細
胞系ＤＮＡを0.5％のアガロースゲルを通す電気泳動に
よって分画し、そしてYang,RC A et al.(1979)Meth.Enz
mol.68、176−182に記載されているように、関連する大
きさの分画を透析膜上への電気溶離によって集めた。２
サイクルの調製用ゲル電気泳動後、断片ｇは1000倍精製
された（収量150ｎｇのＤＮＡ）。この部分的に精製さ
れた分画の２０ｎｇを、ＢａｍＨＩで切断後単離された
６０ｎｇのλL47.1アームに連結し(Loenen.WAMおよびBr
anmar.WJ(1980)Gene.20、249−259)［in vitroパッケー
ジされそしてE. coli WL95(803,supE,supF,hsdR k -,hsdM
k +,tonA,trpR -,metβ，Ｐ２について溶原性）上にプレ
イティングされた］［上のLoenenの文献およびJeffrey
s.A J et al(1982)J.Mol.Biol. 156、487−503参照］、
組換え体について選択した。1500の組換えファージの得
られたライブラリーを、ミニサテライトのプローブ33.1
5とのプラークハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングした。４つの陽性プラークを再プレイティング
し、Ｅ．コリ(E. coli)ED8910(803,supE,supF,recB21,r
ecC22,hsdS)上でスクリーニングし［上のLoenenの文献
を参照］そして組換えファージＤＮＡをBlattner et a
l,(1977)Science 194、161−169の方法によって調製し
た。組換えファージｇ３のＳａｎ３ＡインサートをpUC1
3のＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングし「 VieiraJおよびMessing J(1982)Gene19、259−268］そし
てE. coli JM83のrecA誘導体、JM83，Δ(recA−sr1R）3
06::Tn10中で増加させた［Matfield.M(1983)Ph.D.thesi
s.Vniversity of Leicester参照］。
胞系ＤＮＡを0.5％のアガロースゲルを通す電気泳動に
よって分画し、そしてYang,RC A et al.(1979)Meth.Enz
mol.68、176−182に記載されているように、関連する大
きさの分画を透析膜上への電気溶離によって集めた。２
サイクルの調製用ゲル電気泳動後、断片ｇは1000倍精製
された（収量150ｎｇのＤＮＡ）。この部分的に精製さ
れた分画の２０ｎｇを、ＢａｍＨＩで切断後単離された
６０ｎｇのλL47.1アームに連結し(Loenen.WAMおよびBr
anmar.WJ(1980)Gene.20、249−259)［in vitroパッケー
ジされそしてE. coli WL95(803,supE,supF,hsdR k -,hsdM
k +,tonA,trpR -,metβ，Ｐ２について溶原性）上にプレ
イティングされた］［上のLoenenの文献およびJeffrey
s.A J et al(1982)J.Mol.Biol. 156、487−503参照］、
組換え体について選択した。1500の組換えファージの得
られたライブラリーを、ミニサテライトのプローブ33.1
5とのプラークハイブリダイゼーションによってスクリ
ーニングした。４つの陽性プラークを再プレイティング
し、Ｅ．コリ(E. coli)ED8910(803,supE,supF,recB21,r
ecC22,hsdS)上でスクリーニングし［上のLoenenの文献
を参照］そして組換えファージＤＮＡをBlattner et a
l,(1977)Science 194、161−169の方法によって調製し
た。組換えファージｇ３のＳａｎ３ＡインサートをpUC1
3のＢａｍＨＩ部位中にサブクローニングし「 VieiraJおよびMessing J(1982)Gene19、259−268］そし
てE. coli JM83のrecA誘導体、JM83，Δ(recA−sr1R）3
06::Tn10中で増加させた［Matfield.M(1983)Ph.D.thesi
s.Vniversity of Leicester参照］。
ＤＮＡ配列の分析 ｐλｇ３ＤＮＡを超音波処理し、サイズ選択し、そして
M13mp19のＳｍａＩ部位中にショットガン・クローニン
グした［Yanis-Perron C et al (1985)Gene33、103−11
9参照］。ｐλｇ３のタンデム反復領域のＤＮＡ配列を
決定するために、１２のタンデムクローンをジデオキシ
ヌクレオチドチェインターミネーション法によって配列
決定した［Sanger.F et al(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.VS
A74,5463−5467およびBiggin MD et al(1983)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA80、3963−3965参照］。これらのクロー
ンの８つをｐλｇ３のタンデム反復ミニサテライト領域
から誘導し、そしてコンセンサス反復配列を明らかにす
るために使用した。５′および３′フランキング領域を
含有するＭ13クローンを32Ｐ標識フランキングプローブ
ａおよびｂとのハイブリダイゼーションによって検出し
（下記の第１図参照）そして配列決定して、ミニサテラ
イトのフランキング領域の配列および開始点および末端
の点を確立した。
M13mp19のＳｍａＩ部位中にショットガン・クローニン
グした［Yanis-Perron C et al (1985)Gene33、103−11
9参照］。ｐλｇ３のタンデム反復領域のＤＮＡ配列を
決定するために、１２のタンデムクローンをジデオキシ
ヌクレオチドチェインターミネーション法によって配列
決定した［Sanger.F et al(1977)Proc.Nat.Acad.Sci.VS
A74,5463−5467およびBiggin MD et al(1983)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA80、3963−3965参照］。これらのクロー
ンの８つをｐλｇ３のタンデム反復ミニサテライト領域
から誘導し、そしてコンセンサス反復配列を明らかにす
るために使用した。５′および３′フランキング領域を
含有するＭ13クローンを32Ｐ標識フランキングプローブ
ａおよびｂとのハイブリダイゼーションによって検出し
（下記の第１図参照）そして配列決定して、ミニサテラ
イトのフランキング領域の配列および開始点および末端
の点を確立した。
結果 ＤＮＡフィンガープリントからの特定のミニサテライト
の分離 Jeffreys et al[(1986)Am.J.Hum.Genet.39、11−24]に
記載されているグジャラティ(Gujarati)血統からの個体
III９はHPFH（遺伝性高胎児へモグロビン症）冒されて
おり、そして彼女のＤＮＡフィンガープリント（Ｓａｎ
３Ａ消化物中においてミニサテライト33.15により検出
される）は8.2ｋｂの多形性断片（断片「ｇ」；第１Ａ
図）を含有し、この断は、(1986)Am.J.Hum.Genet.39、1
1−24に記載されているように、この血統の他の構成員
におけるHPFHとともに同時に分離する(cosegregate)傾
向がある。このＤＮＡを、２回の調製用ゲル電気泳動に
よって、他のミニサテライト断片から精製した（第１
図）。
の分離 Jeffreys et al[(1986)Am.J.Hum.Genet.39、11−24]に
記載されているグジャラティ(Gujarati)血統からの個体
III９はHPFH（遺伝性高胎児へモグロビン症）冒されて
おり、そして彼女のＤＮＡフィンガープリント（Ｓａｎ
３Ａ消化物中においてミニサテライト33.15により検出
される）は8.2ｋｂの多形性断片（断片「ｇ」；第１Ａ
図）を含有し、この断は、(1986)Am.J.Hum.Genet.39、1
1−24に記載されているように、この血統の他の構成員
におけるHPFHとともに同時に分離する(cosegregate)傾
向がある。このＤＮＡを、２回の調製用ゲル電気泳動に
よって、他のミニサテライト断片から精製した（第１
図）。
第１図は、ゲル電気泳動によるこの精製を示す。Jeffre
ys et alに記載されている血統の個体III９からのＤＮ
ＡをＳａｕ３Ａで消化し、そして６−９ｋｂの断片を調
製用ゲル電気泳動によって集めた。これらの断片を再度
電泳動にかけて分画２−５を得た。Ｓａｕ３Ａで消化し
たIII９ＤＮＡのアリコートおよび各分画のアリコート
を0.8％のアガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてミ
ニサテライトのプローブ33.15とサザンブロットハイブ
リダイズせしめた。HPFHと同時分離する傾向のある断片
ｇ（8.2ｋｂ）は、分画３においてほぼ1000倍精製され
た。
ys et alに記載されている血統の個体III９からのＤＮ
ＡをＳａｕ３Ａで消化し、そして６−９ｋｂの断片を調
製用ゲル電気泳動によって集めた。これらの断片を再度
電泳動にかけて分画２−５を得た。Ｓａｕ３Ａで消化し
たIII９ＤＮＡのアリコートおよび各分画のアリコート
を0.8％のアガロースゲルの電気泳動にかけ、そしてミ
ニサテライトのプローブ33.15とサザンブロットハイブ
リダイズせしめた。HPFHと同時分離する傾向のある断片
ｇ（8.2ｋｂ）は、分画３においてほぼ1000倍精製され
た。
断片「ｇ」（前述のようにＳａｕ３Ａ消化物中に検出さ
れ、そして精製してほぼ1000倍に濃縮された断片「ｇ」
の分画を生成した）を、前述のLoenenおよびBrammarの
文献に記載されているようにして、λL47.1中にクロー
ニングし、そしてＰ２溶原性ｒｅｃ +E.コリ上で増加さ
せて、組換えファージについて選択した。得られるライ
ブラリーをプローブ33.15へのハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。得られた４つの陽性プラ
ークは非常に小さい（プラーク＜0.1mmの直径）が、ｒ
ｅｃＢ．ｒｅｃＣ E.コリ上で低い効率（０〜８ｐｆｕ
／プラーク）で再プレイティングして、正常の大きさの
プラーク（１mmの直径）を生成できた。２つのクローン
λｇ１およびλｇ３をさらに特徴づけ、そしてそれぞれ
7.7ｋｂおよび7.8ｋｂのＳａｕ３Ａインサートを含有す
ることが示された。これらのクローンは両者ともバンド
ｇから誘導された（下を参照）が、それぞれ0.5ｋｂお
よび0.4ｋｂだけ短かった。ｒｅｃＢ．ｒｅｃCE.コリ上
で増殖させたλｇ１またはλｇ３のいずれにおいてもＳ
ａｕ３Ａインサートの大きさの不均質性が存在しない
（データは示されていない）ので、インサートの一部分
がｒｅｃ +E.コリ中での初期の増殖の間に各クローンか
ら失なわれていたと結論される。
れ、そして精製してほぼ1000倍に濃縮された断片「ｇ」
の分画を生成した）を、前述のLoenenおよびBrammarの
文献に記載されているようにして、λL47.1中にクロー
ニングし、そしてＰ２溶原性ｒｅｃ +E.コリ上で増加さ
せて、組換えファージについて選択した。得られるライ
ブラリーをプローブ33.15へのハイブリダイゼーション
によってスクリーニングした。得られた４つの陽性プラ
ークは非常に小さい（プラーク＜0.1mmの直径）が、ｒ
ｅｃＢ．ｒｅｃＣ E.コリ上で低い効率（０〜８ｐｆｕ
／プラーク）で再プレイティングして、正常の大きさの
プラーク（１mmの直径）を生成できた。２つのクローン
λｇ１およびλｇ３をさらに特徴づけ、そしてそれぞれ
7.7ｋｂおよび7.8ｋｂのＳａｕ３Ａインサートを含有す
ることが示された。これらのクローンは両者ともバンド
ｇから誘導された（下を参照）が、それぞれ0.5ｋｂお
よび0.4ｋｂだけ短かった。ｒｅｃＢ．ｒｅｃCE.コリ上
で増殖させたλｇ１またはλｇ３のいずれにおいてもＳ
ａｕ３Ａインサートの大きさの不均質性が存在しない
（データは示されていない）ので、インサートの一部分
がｒｅｃ +E.コリ中での初期の増殖の間に各クローンか
ら失なわれていたと結論される。
ブラットナー(Blattner)法［(1977)Science194、161−1
69］によって調製されたλｇ１およびλｇ３のＤＮＡの
収率は非常に低く（λL47.1組換えＤＮＡの正常の収量
の１％）、再びこれらのミニサテライトのクローンの異
常な増殖特性を指摘している。したがって、Ｓａｕ３Ａ
インサートをpUC13中にサブクローニングし［Vieira.J
およびMessing J(1982)Gene19,259−268参照］そして
Ｅ．コリJM83のｒｅｃＡ誘導体［Matfield M(1983)Ph.D
thesis University of Leicester参照］中で増殖させ
てインサートの転位を最小にした。得られるサブクロー
ンｐλｇ３（下記の第１Ｂ図参照）は、ｇ３中のインサ
ートよりは0.7ｋｂだけ短い7.1ｋｂのＳａｕ３Ａインサ
ートを含有していた。
69］によって調製されたλｇ１およびλｇ３のＤＮＡの
収率は非常に低く（λL47.1組換えＤＮＡの正常の収量
の１％）、再びこれらのミニサテライトのクローンの異
常な増殖特性を指摘している。したがって、Ｓａｕ３Ａ
インサートをpUC13中にサブクローニングし［Vieira.J
およびMessing J(1982)Gene19,259−268参照］そして
Ｅ．コリJM83のｒｅｃＡ誘導体［Matfield M(1983)Ph.D
thesis University of Leicester参照］中で増殖させ
てインサートの転位を最小にした。得られるサブクロー
ンｐλｇ３（下記の第１Ｂ図参照）は、ｇ３中のインサ
ートよりは0.7ｋｂだけ短い7.1ｋｂのＳａｕ３Ａインサ
ートを含有していた。
ミニサテライト断片ｇの構成 ｐλｇ３中のミニサテライト断片の構造を、制限地図の
作成（第１Ｂ図）およびＤＮＡ配列決定（第２図）によ
って決定した。
作成（第１Ｂ図）およびＤＮＡ配列決定（第２図）によ
って決定した。
第１Ｂ図はＤＮＡ断片ｇの構成を示す。ｐλｇ３中のＳ
ａｕ３Ａインサートを、制限エンドヌクレアーゼＡｌｕ
Ｉ（Ａ）、ＤｄｅｌＩ（Ｄ）、ＨａｅIII（Ｈ）、Ｍｂ
ｏII（Ｍ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）およびＳａｕ３Ａ（Ｓ）で
マッピングした。Ｈｉｎ ｆＩまたはＲｓａＩについての切断部位は存在し
ない。7.14ｋｂのインサートは、３７ｂｐの配列（第２
図）＋747ｂｐのフランキングＤＮＡの171タンデム反復
を含有する。５′フランキング領域は、逆位のＡｌｕ要
素の開始部位（斜線）を含有する。ユニーク配列のフラ
ンキングプローブａおよびｂの起源が示されている。
ａｕ３Ａインサートを、制限エンドヌクレアーゼＡｌｕ
Ｉ（Ａ）、ＤｄｅｌＩ（Ｄ）、ＨａｅIII（Ｈ）、Ｍｂ
ｏII（Ｍ）、ＰｓｔＩ（Ｐ）およびＳａｕ３Ａ（Ｓ）で
マッピングした。Ｈｉｎ ｆＩまたはＲｓａＩについての切断部位は存在し
ない。7.14ｋｂのインサートは、３７ｂｐの配列（第２
図）＋747ｂｐのフランキングＤＮＡの171タンデム反復
を含有する。５′フランキング領域は、逆位のＡｌｕ要
素の開始部位（斜線）を含有する。ユニーク配列のフラ
ンキングプローブａおよびｂの起源が示されている。
第２図は、超可変断片ｇのＤＮＡ配列を示す。ミニサテ
ライトの５′および３′フランキング領域および開始お
よび終止配列が、ミニサテライトからの３つのタンデム
領域（ａ〜ｃ）の反復配列と一緒に示されている。逆位
Ａｌｕ要素の開始は下線を付した大文字中に示されてお
り、そして５′フランキング領域中のいくつかの簡単な
配列領域には下線が付されている。３７ｂｐのミニサテ
ライトの反復単位のコンセンサス配列（ｃｏｎ）が示さ
れており、そしてこのコンセンサスとの差異が個々の反
復単位について与えられている。領域Ｃにおける第２の
反復単位はＨａｅIII部位（下線）を含有し、したがっ
てこの領域はミニサテライト中の内部のＨａｅIII部位
にわたる（第１Ｂ図）。コンセンサス反復配列は、ま
た、英国特許公告第2,166,445号中のそれと同様な方法
で「コア」配列と整列させて示されている。
ライトの５′および３′フランキング領域および開始お
よび終止配列が、ミニサテライトからの３つのタンデム
領域（ａ〜ｃ）の反復配列と一緒に示されている。逆位
Ａｌｕ要素の開始は下線を付した大文字中に示されてお
り、そして５′フランキング領域中のいくつかの簡単な
配列領域には下線が付されている。３７ｂｐのミニサテ
ライトの反復単位のコンセンサス配列（ｃｏｎ）が示さ
れており、そしてこのコンセンサスとの差異が個々の反
復単位について与えられている。領域Ｃにおける第２の
反復単位はＨａｅIII部位（下線）を含有し、したがっ
てこの領域はミニサテライト中の内部のＨａｅIII部位
にわたる（第１Ｂ図）。コンセンサス反復配列は、ま
た、英国特許公告第2,166,445号中のそれと同様な方法
で「コア」配列と整列させて示されている。
クローンｐλｇ３は、単一の内部のＨａｅIII部位を除
外して、制限部位を欠く6.3ｋｂのミニサテライトを含
有する。ミニサテライトはGTGGGCAGG配列を含有する３
７ｂｐ単位の171反復から構成されている。この配列
は、前にいくつかの異なるヒトミニサテライトによって
共有されると同定された、11〜16ｂｐのコア配列のほと
んど不変部分に正確に相当する（英国特許公告第2,166,
445号およびここにおける第２図参照）。反復単位は完
全には相同ではない。ミニサテライト内からのいくつか
のランダムに選択された領域の配列の分析は、限定され
た量の反復配列の変動を明らかにした。３３ｂｐの反復
単位のサブセットを生成する４ｂｐの欠失を含む、大部
分の変動は１より多い反復単位にわたって拡散してい
る。１つの変動（領域ＣにおけるＡ→Ｃのトランスバー
ション）はユニーク内部ＨａｅIII部位をつくり、それ
ゆえ多分１つの反復単位中に見い出されるだけである。
ミニサテライトの開始および終りの反復単位は、認めら
れるように、内部の反復単位よりも配列において変化し
ている。
外して、制限部位を欠く6.3ｋｂのミニサテライトを含
有する。ミニサテライトはGTGGGCAGG配列を含有する３
７ｂｐ単位の171反復から構成されている。この配列
は、前にいくつかの異なるヒトミニサテライトによって
共有されると同定された、11〜16ｂｐのコア配列のほと
んど不変部分に正確に相当する（英国特許公告第2,166,
445号およびここにおける第２図参照）。反復単位は完
全には相同ではない。ミニサテライト内からのいくつか
のランダムに選択された領域の配列の分析は、限定され
た量の反復配列の変動を明らかにした。３３ｂｐの反復
単位のサブセットを生成する４ｂｐの欠失を含む、大部
分の変動は１より多い反復単位にわたって拡散してい
る。１つの変動（領域ＣにおけるＡ→Ｃのトランスバー
ション）はユニーク内部ＨａｅIII部位をつくり、それ
ゆえ多分１つの反復単位中に見い出されるだけである。
ミニサテライトの開始および終りの反復単位は、認めら
れるように、内部の反復単位よりも配列において変化し
ている。
ｐλｇ３中のミニサテライトは、正常の密度の制限部位
を含有する非反復ＤＮＡによってフランキングされてい
る（第１Ｂ図）。５′フランキング領域の開始は、逆位
Ａｌｕ要素の頭部から構成されている。ハイブリダイゼ
ーションプローブａおよびｂによって定められる、残り
の５′および３′フランキング領域は、ユニーク配列Ｄ
ＮＡであり、そして全体のＤＮＡ中のこの座にのみハイ
ブリダイズする（データは示されていない）。
を含有する非反復ＤＮＡによってフランキングされてい
る（第１Ｂ図）。５′フランキング領域の開始は、逆位
Ａｌｕ要素の頭部から構成されている。ハイブリダイゼ
ーションプローブａおよびｂによって定められる、残り
の５′および３′フランキング領域は、ユニーク配列Ｄ
ＮＡであり、そして全体のＤＮＡ中のこの座にのみハイ
ブリダイズする（データは示されていない）。
５′フランキング領域は、かなりの量の単純配列のＤＮ
Ａ［ポリプリンおよび（ＡＣＣ）ｎ］を含有する（第２
図）。
Ａ［ポリプリンおよび（ＡＣＣ）ｎ］を含有する（第２
図）。
単一の多形性座を検出するミニサテライト断片ｇ ヒトＤＮＡ中の対応する座を特異的に検出するハイブリ
ダイゼーションプローブとして、クローニングしたミニ
サテライトの断片全体を使用できるかどうかを決定する
ために、ｐλｇ３からのＳａｕ３Ａインサートを、ヒト
競争体(competitor)ＤＮＡの存在下に、ＨｉｎｆＩ（Ｄ
ＮＡフィンガープリント生成に日常的に使用されている
制限酵素）消化ヒトＤＮＡにハイブリダイズさせた。
ダイゼーションプローブとして、クローニングしたミニ
サテライトの断片全体を使用できるかどうかを決定する
ために、ｐλｇ３からのＳａｕ３Ａインサートを、ヒト
競争体(competitor)ＤＮＡの存在下に、ＨｉｎｆＩ（Ｄ
ＮＡフィンガープリント生成に日常的に使用されている
制限酵素）消化ヒトＤＮＡにハイブリダイズさせた。
第３図は、ｐλｇ３によって検出された多形性ＤＮＡ断
片のメンデル遺伝を示す。ヒトＤＮＡの８μｇの試料を
ＨｉｎｆＩで消化し、そして0.8％アガロースゲルの電
気泳動にかけた。消化物をＳａｕ３Ａインサートと、１
×SSC中で６５℃において６％のポリエチレングリコー
ルおよび５０μｇ／mlのアルカリ剪断ヒト胎盤競争体Ｄ
ＮＡの存在下に、サザブロットハイビリダイズさせ、そ
してハイブリダイゼーションの後0.2×SSC中で６５℃に
おいて洗浄した。ｐλｇ３は、示す個体のすべてにおい
てヘテロ接合性である単一座を検出する。対立遺伝子の
遺伝（文献により示される）はメンデル的である。
片のメンデル遺伝を示す。ヒトＤＮＡの８μｇの試料を
ＨｉｎｆＩで消化し、そして0.8％アガロースゲルの電
気泳動にかけた。消化物をＳａｕ３Ａインサートと、１
×SSC中で６５℃において６％のポリエチレングリコー
ルおよび５０μｇ／mlのアルカリ剪断ヒト胎盤競争体Ｄ
ＮＡの存在下に、サザブロットハイビリダイズさせ、そ
してハイブリダイゼーションの後0.2×SSC中で６５℃に
おいて洗浄した。ｐλｇ３は、示す個体のすべてにおい
てヘテロ接合性である単一座を検出する。対立遺伝子の
遺伝（文献により示される）はメンデル的である。
高いストリンジエンシー（0.2×SSC.６５℃）におい
て、１つまたは２つのハイブリダイズする断片がすべて
の検査した個体において検出された。ｐλｇ３は前に試
験したIIIｇの血族において8.2ｋｂの断片を検出し、バ
ンドｇがクローニングされていることを確証した（デー
タは示されていない）。これより低いストリンジエンシ
ー（１×SSC.６５℃）において、追加のかなりハイブリ
ダイズする多形性ＤＮＡ断片が検出された（データは示
されていない）。
て、１つまたは２つのハイブリダイズする断片がすべて
の検査した個体において検出された。ｐλｇ３は前に試
験したIIIｇの血族において8.2ｋｂの断片を検出し、バ
ンドｇがクローニングされていることを確証した（デー
タは示されていない）。これより低いストリンジエンシ
ー（１×SSC.６５℃）において、追加のかなりハイブリ
ダイズする多形性ＤＮＡ断片が検出された（データは示
されていない）。
ｐλｇ３により高いストリンジエンシー検出されるＤＮ
Ａ断片は、メンデル式に、単一座の対立遺伝子として分
離する。この座は性連鎖されていず、そしてまた、２つ
の大きい血統の研究において有意ではないが、不完全な
性連鎖を示した（６１の試験した子孫、 データは示されていない）；それゆえ、それは常染色体
の座として挙動し、そして染色体７上に位置している
（表１参照）。
Ａ断片は、メンデル式に、単一座の対立遺伝子として分
離する。この座は性連鎖されていず、そしてまた、２つ
の大きい血統の研究において有意ではないが、不完全な
性連鎖を示した（６１の試験した子孫、 データは示されていない）；それゆえ、それは常染色体
の座として挙動し、そして染色体７上に位置している
（表１参照）。
このミニサテライト座位における極端な多形性変化 ７６人の任意に選んだ英国の白人からのＤＮＡＨｉｎｆ
Ｉ消化物を、ｐλｇ３からのインサートで選別した。な
おこの場合、選別は最初単独で、次に１４人（１人当り
１μｇＤＮＡ）のプール中で行われた。これを長さ３５
cmの0.7％アガロースゲルを通して電気泳動にかけ、対
立遺伝子の分離を最大にした。この集団試料中において
検出された別々の対立遺伝子の長さは、各対立遺伝子中
における反復単位の推定数および対立遺伝子頻度と共
に、第４図に示されている。従って第４図はミニサテラ
イト対立遺伝子の大きさの分布を示している。最も短い
共通対立遺伝子中におけるミニサテライトの長さは、フ
ランキング単一コピープローブａおよびｂ（第１図）
（データは示されていない）を用いて、ホモ接合体中に
おけるこの断片のゲノム地図を作製することにより測定
した。各対立遺伝子当りの反復配列の数は大よそのもの
であり、ミニサテライト中における37〜33のｂｐ反復単
位の比率によって左右される。短い共通の対立遺伝子を
除いて、１回（４２個の対立遺伝子）、２回（１２個の
対立遺伝子）、３回（１２個の対立遺伝子）または４回
（５個の対立遺伝子）、残りの対立遺伝子をサンプリン
グした。これら対立遺伝子のすべてが均一に希（ｑ＝0.
0081、2〔４ｄ．ｆ．〕＝4.0）であるならば、この分布
は予想されたものとそれほど違いはない。従って上記分
布状態は１つの共通の短い対立遺伝子（ｑ＝0.165）お
よび集団となって存在する103個の均一に希薄な対立遺
伝子（対立遺伝子１個当りｑ＝0.0081の簡単なモデルと
一致している。
Ｉ消化物を、ｐλｇ３からのインサートで選別した。な
おこの場合、選別は最初単独で、次に１４人（１人当り
１μｇＤＮＡ）のプール中で行われた。これを長さ３５
cmの0.7％アガロースゲルを通して電気泳動にかけ、対
立遺伝子の分離を最大にした。この集団試料中において
検出された別々の対立遺伝子の長さは、各対立遺伝子中
における反復単位の推定数および対立遺伝子頻度と共
に、第４図に示されている。従って第４図はミニサテラ
イト対立遺伝子の大きさの分布を示している。最も短い
共通対立遺伝子中におけるミニサテライトの長さは、フ
ランキング単一コピープローブａおよびｂ（第１図）
（データは示されていない）を用いて、ホモ接合体中に
おけるこの断片のゲノム地図を作製することにより測定
した。各対立遺伝子当りの反復配列の数は大よそのもの
であり、ミニサテライト中における37〜33のｂｐ反復単
位の比率によって左右される。短い共通の対立遺伝子を
除いて、１回（４２個の対立遺伝子）、２回（１２個の
対立遺伝子）、３回（１２個の対立遺伝子）または４回
（５個の対立遺伝子）、残りの対立遺伝子をサンプリン
グした。これら対立遺伝子のすべてが均一に希（ｑ＝0.
0081、2〔４ｄ．ｆ．〕＝4.0）であるならば、この分布
は予想されたものとそれほど違いはない。従って上記分
布状態は１つの共通の短い対立遺伝子（ｑ＝0.165）お
よび集団となって存在する103個の均一に希薄な対立遺
伝子（対立遺伝子１個当りｑ＝0.0081の簡単なモデルと
一致している。
少くとも７７個の別々の対立遺伝子は、この集団試料中
において分離することができ、反復数は対立遺伝子１個
あたり14〜525の範囲内にあった。集団試料中における
ホモ結合体は、最も短い対立遺伝子の場合、すべてホモ
接合的であった。対立遺伝子の数の上記推定値および希
対立遺伝子の平均頻度はゲル分離により制限されてお
り、且つこの試料中における別々の長さの対立遺伝子の
実際の数はそれよりと多いと思われる。
において分離することができ、反復数は対立遺伝子１個
あたり14〜525の範囲内にあった。集団試料中における
ホモ結合体は、最も短い対立遺伝子の場合、すべてホモ
接合的であった。対立遺伝子の数の上記推定値および希
対立遺伝子の平均頻度はゲル分離により制限されてお
り、且つこの試料中における別々の長さの対立遺伝子の
実際の数はそれよりと多いと思われる。
対立遺伝子の長さの分布は完全にランダムであるように
は見えないが、３種類の遺伝子（第４図）、即ち短い対
立遺伝子（14〜16反復配列）、中間対立遺伝子（41〜68
反復配列）および長い対立遺伝子（107〜525反復配列）
を明示している。対立遺伝子の長さの二頂分布はヒトの
インスリン遺伝子について５′の位置にある超可変部位
に関して白人の場合について既に述べられている（Bel
l、GI等、1982年、ネイチャー295、31〜35頁参照）。た
だしこの二頂分布は不明確で明らかではない（Lebo,RV
等、1983年、Proc。Nat.Acad.Sci.米国80、4804〜4812
頁）。
は見えないが、３種類の遺伝子（第４図）、即ち短い対
立遺伝子（14〜16反復配列）、中間対立遺伝子（41〜68
反復配列）および長い対立遺伝子（107〜525反復配列）
を明示している。対立遺伝子の長さの二頂分布はヒトの
インスリン遺伝子について５′の位置にある超可変部位
に関して白人の場合について既に述べられている（Bel
l、GI等、1982年、ネイチャー295、31〜35頁参照）。た
だしこの二頂分布は不明確で明らかではない（Lebo,RV
等、1983年、Proc。Nat.Acad.Sci.米国80、4804〜4812
頁）。
断片ｇの分離結果によれば、ＤＮＡフィンガープリント
における大きな且つ高度に多形性のＤＮＡ断片は、各超
可変部位を検査するのに適当な遺伝子座特異性プローブ
を提供するための分子クローニングにかかりやすい。断
片ｇはバクテリオファージλ中においてクローン化する
ことができたが、得られたクローンはｒｅｃ + E. Coli.
上において異常な増殖特性を示した。このことはファー
ジ中の従来の増幅されたヒトライブラリーからのミニサ
テライトクローンの涸渇を導く。クローン化してミニサ
テライトはｒｅｃＡ E. Cali.中におけるpUC13へのサ
ブクローニング中においてもその後においても不安定で
ある。なぜならば最終組換え体ｐλｇ３は断片ｇと比較
して約３０個の反復単位を失ったからである。従ってｐ
λｇ３の物理的地図（第１図）は断片ｇの構成を完全に
は反映していない。
における大きな且つ高度に多形性のＤＮＡ断片は、各超
可変部位を検査するのに適当な遺伝子座特異性プローブ
を提供するための分子クローニングにかかりやすい。断
片ｇはバクテリオファージλ中においてクローン化する
ことができたが、得られたクローンはｒｅｃ + E. Coli.
上において異常な増殖特性を示した。このことはファー
ジ中の従来の増幅されたヒトライブラリーからのミニサ
テライトクローンの涸渇を導く。クローン化してミニサ
テライトはｒｅｃＡ E. Cali.中におけるpUC13へのサ
ブクローニング中においてもその後においても不安定で
ある。なぜならば最終組換え体ｐλｇ３は断片ｇと比較
して約３０個の反復単位を失ったからである。従ってｐ
λｇ３の物理的地図（第１図）は断片ｇの構成を完全に
は反映していない。
クローン化したＤＮＡ断片は、ミニサテライトについて
予想される構造を有しており、断片ｇが長いサテライト
ＤＮＡから誘導されたものではないということを立証し
ている。各反復単位中における「コアー」配列および
５′フランキング領域におけるＡｌｕ配列の一部両方の
存在にもかかわらず、クローン化した断片ｇは競合ヒト
ＤＮＡの存在の下で遺伝子座特異性プローブとして作用
する。ｐλｇ３が他のコア含有ミニサテライトを効率的
に検出することができないのは、他のミニサテライトへ
の交差ハイブリダイゼーションを妨げると考えられる各
反復単位中に存在する付加的なコア不在ＤＮＡのためで
ある（英国特許第2,166,445号参照）。
予想される構造を有しており、断片ｇが長いサテライト
ＤＮＡから誘導されたものではないということを立証し
ている。各反復単位中における「コアー」配列および
５′フランキング領域におけるＡｌｕ配列の一部両方の
存在にもかかわらず、クローン化した断片ｇは競合ヒト
ＤＮＡの存在の下で遺伝子座特異性プローブとして作用
する。ｐλｇ３が他のコア含有ミニサテライトを効率的
に検出することができないのは、他のミニサテライトへ
の交差ハイブリダイゼーションを妨げると考えられる各
反復単位中に存在する付加的なコア不在ＤＮＡのためで
ある（英国特許第2,166,445号参照）。
クローン化したミニサテライトは、多分、各対立遺伝子
における反復単位の数および３７ｂｐ反復型と３３ｂｐ
反復型の比率の両方の点における対立遺伝子変化のため
に、極端に長い多形を示す。158個の染色体のランダム
集団試料中において、１つの共通の対立遺伝子および少
くとも７６個の希対立遺伝子を分離することができた。
この遺伝子座は殆どの、またはすべての今まで特徴付け
られているクローン化したヒト超可変領域よりもずっと
多形性である。なお上記超可変領域は、「コア」配列を
明確にするために最初用いられていた比較的短いクロー
ン化ミニサテライトを含む（英国特許第2,166,455号参
照）。この遺伝子座におけるヘテロ接合性は少くとも9
6.6％であり、殆どのヘテロ接合体は短い共通対立遺伝
子から生じる。
における反復単位の数および３７ｂｐ反復型と３３ｂｐ
反復型の比率の両方の点における対立遺伝子変化のため
に、極端に長い多形を示す。158個の染色体のランダム
集団試料中において、１つの共通の対立遺伝子および少
くとも７６個の希対立遺伝子を分離することができた。
この遺伝子座は殆どの、またはすべての今まで特徴付け
られているクローン化したヒト超可変領域よりもずっと
多形性である。なお上記超可変領域は、「コア」配列を
明確にするために最初用いられていた比較的短いクロー
ン化ミニサテライトを含む（英国特許第2,166,455号参
照）。この遺伝子座におけるヘテロ接合性は少くとも9
6.6％であり、殆どのヘテロ接合体は短い共通対立遺伝
子から生じる。
この遺伝子座における新たな対立遺伝子は、反復数の変
更、即ちＤＮＡ複製中におけるすべりまたは「コア」配
列によって生じる不均一な交換、即ち推定上の組換えシ
グナルによって発生する。中性突然変異ランダム浮動の
仮説の下において、パラメーター４ＮｅＶ（θ）（式
中、Ｎｅは有効な集団の大きさを表し、そしてＶは配偶
子１個当りの新規な長い対立遺伝子への突然変異率を表
す）は、無限の対立遺伝子モデルを用いて集団試料中に
おいて得られた異なる対立遺伝子の数から最も正確に算
出することができる（Ewens W J、1972年、Theor.Popu
l.Biol.3、87〜112頁）。我々はこの遺伝子座について6
0〜90におけるθを測定する。なおこのθは短い共通対
立遺伝子が含まれるか否かで異ってくる。ヒトのＮｅは
〜１０4であるので、この遺伝子座における新規な長い
対立遺伝子への突然変異率Ｖは配偶子１個当り約0.002
である。Ｖのこの値は低すぎる。なぜならば検出された
対立遺伝子の数はゲル分離により制限されているからで
あり、且つ無数の分離可能な対立遺伝子が存在していな
いからである。この遺伝子座におけるミニサテライトＤ
ＮＡの平均的長さは５ｋｂであり、従ってミニサテライ
トｋｂ当りの突然変異（組換え）率は、他の短いコア含
有ミニサテライトについて算出した１０-4／ｋｂおよび
ヒトＤＮＡに対する１０-5／ｋｂの平均減数組換え率と
比べて、＞４×１０-4である（Jeffreys A J等、1985
年、ネイチャー314、67〜73頁参照）。従って、このミ
ニサテライト遺伝子座における新しい対立遺伝子の発生
速度は著しく高く、このことは本願の発明者による先の
提案、即ちコアに富んだ領域は組換えのホットスポット
であるということを一致している。短い対立遺伝子の場
合、突然変異率は比較的低い。このことは最も短い対立
遺伝子がどのように浮動して、この過程中において不均
一な交換により破壊されることなく、集団においてかな
りの頻度を達成するかについて説明していると思われ
る。
更、即ちＤＮＡ複製中におけるすべりまたは「コア」配
列によって生じる不均一な交換、即ち推定上の組換えシ
グナルによって発生する。中性突然変異ランダム浮動の
仮説の下において、パラメーター４ＮｅＶ（θ）（式
中、Ｎｅは有効な集団の大きさを表し、そしてＶは配偶
子１個当りの新規な長い対立遺伝子への突然変異率を表
す）は、無限の対立遺伝子モデルを用いて集団試料中に
おいて得られた異なる対立遺伝子の数から最も正確に算
出することができる（Ewens W J、1972年、Theor.Popu
l.Biol.3、87〜112頁）。我々はこの遺伝子座について6
0〜90におけるθを測定する。なおこのθは短い共通対
立遺伝子が含まれるか否かで異ってくる。ヒトのＮｅは
〜１０4であるので、この遺伝子座における新規な長い
対立遺伝子への突然変異率Ｖは配偶子１個当り約0.002
である。Ｖのこの値は低すぎる。なぜならば検出された
対立遺伝子の数はゲル分離により制限されているからで
あり、且つ無数の分離可能な対立遺伝子が存在していな
いからである。この遺伝子座におけるミニサテライトＤ
ＮＡの平均的長さは５ｋｂであり、従ってミニサテライ
トｋｂ当りの突然変異（組換え）率は、他の短いコア含
有ミニサテライトについて算出した１０-4／ｋｂおよび
ヒトＤＮＡに対する１０-5／ｋｂの平均減数組換え率と
比べて、＞４×１０-4である（Jeffreys A J等、1985
年、ネイチャー314、67〜73頁参照）。従って、このミ
ニサテライト遺伝子座における新しい対立遺伝子の発生
速度は著しく高く、このことは本願の発明者による先の
提案、即ちコアに富んだ領域は組換えのホットスポット
であるということを一致している。短い対立遺伝子の場
合、突然変異率は比較的低い。このことは最も短い対立
遺伝子がどのように浮動して、この過程中において不均
一な交換により破壊されることなく、集団においてかな
りの頻度を達成するかについて説明していると思われ
る。
ＤＮＡフィンガープリントにより、それぞれの同定のた
めの、そして例えば父系および移住争いの点で家族関係
を確立するための強力な方法が立証された。この方法の
精度は、２人の任意に選ばれた人々によってバンドを共
有する低い平均確率Ｘによって決定される。英国の白人
の場合、４ｋｂより大きなＤＮＡフィンガープリントＨ
ｉｎｃＩ断片について経験的にＸは0.2と算出された。
各人々間におけるバンドの共有が生じる場合（即ち、１
人のバンドが、同様な移動度のバンドおよびオートラジ
オグラフィー強度によって別の人のそれに匹敵する場
合）、共有されたバンドが同じミニサテライト遺伝子座
の同一の対立遺伝子を表すかどうかは明らかでない。第
４図における対立遺伝子の分布によれば、４ｋｂ未満の
対立遺伝子のＸを算出することができる。この特定のミ
ニサテライトの遺伝子座の場合Ｘ＝0.016であり、この
値は多遺伝子座ＤＮＡフィンガープリントからの算定値
よりも１桁低い。このクローン化ミニサテライトがＤＮ
Ａフィンガープリント中において表示されている対立遺
伝子について典型的なものであるならば、無関係なＤＮ
Ａフィンガープリント間に殆どのバンドが共有されてい
ることは、異ったミニサテライト断片の偶然の共同移動
の結果である。この重要な実際の結果によれば、例え
ば、子におけるすべての父兄バンドが推定上の父のＤＮ
Ａフィンガープリント中に正確に存在する父系争いにお
いて非除外の場合、Ｘ＝0.2について正確に算出したま
ちがった包含の非常に低い確率は、実際の確率（Ｘ＝0.
016について）よりも著しく高すぎる。
めの、そして例えば父系および移住争いの点で家族関係
を確立するための強力な方法が立証された。この方法の
精度は、２人の任意に選ばれた人々によってバンドを共
有する低い平均確率Ｘによって決定される。英国の白人
の場合、４ｋｂより大きなＤＮＡフィンガープリントＨ
ｉｎｃＩ断片について経験的にＸは0.2と算出された。
各人々間におけるバンドの共有が生じる場合（即ち、１
人のバンドが、同様な移動度のバンドおよびオートラジ
オグラフィー強度によって別の人のそれに匹敵する場
合）、共有されたバンドが同じミニサテライト遺伝子座
の同一の対立遺伝子を表すかどうかは明らかでない。第
４図における対立遺伝子の分布によれば、４ｋｂ未満の
対立遺伝子のＸを算出することができる。この特定のミ
ニサテライトの遺伝子座の場合Ｘ＝0.016であり、この
値は多遺伝子座ＤＮＡフィンガープリントからの算定値
よりも１桁低い。このクローン化ミニサテライトがＤＮ
Ａフィンガープリント中において表示されている対立遺
伝子について典型的なものであるならば、無関係なＤＮ
Ａフィンガープリント間に殆どのバンドが共有されてい
ることは、異ったミニサテライト断片の偶然の共同移動
の結果である。この重要な実際の結果によれば、例え
ば、子におけるすべての父兄バンドが推定上の父のＤＮ
Ａフィンガープリント中に正確に存在する父系争いにお
いて非除外の場合、Ｘ＝0.2について正確に算出したま
ちがった包含の非常に低い確率は、実際の確率（Ｘ＝0.
016について）よりも著しく高すぎる。
ＤＮＡフィンガープリントプローブ33.6および33.15を
使用するならば、大きなヒト血縁関係における３４個以
内の分散常染色遺伝子座の分離をスコアーすることが可
能である。試験した殆どの遺伝子座について、２つの対
立遺伝子の１方のみが大きな（４ｋｂ以上）分離ＤＮＡ
フィンガープリント断片の組においてスコアー可能であ
り、このことはミニサテライト対立遺伝子間に著しい大
きさの差が存在することを暗示しており、多くの対立遺
伝子はＤＮＡフィンガープリントのわずかに分離した
（＜４ｋｂ）領域に位置している。このことはまたクロ
ーン化ミニサテライトについても見ることができる。即
ち、この遺伝子座におけるＨｉｎｆＩ対立遺伝子の長さ
は1.7〜20.4ｋｂの間にあり、且つ第４図における対立
遺伝子頻度分布は、この遺伝子座の両対立遺伝子が個体
のわずか４０％のＤＮＡフィンガープリント中において
分離されており、一方個体の１４％においては対立遺伝
子がスコアー可能ではない。
使用するならば、大きなヒト血縁関係における３４個以
内の分散常染色遺伝子座の分離をスコアーすることが可
能である。試験した殆どの遺伝子座について、２つの対
立遺伝子の１方のみが大きな（４ｋｂ以上）分離ＤＮＡ
フィンガープリント断片の組においてスコアー可能であ
り、このことはミニサテライト対立遺伝子間に著しい大
きさの差が存在することを暗示しており、多くの対立遺
伝子はＤＮＡフィンガープリントのわずかに分離した
（＜４ｋｂ）領域に位置している。このことはまたクロ
ーン化ミニサテライトについても見ることができる。即
ち、この遺伝子座におけるＨｉｎｆＩ対立遺伝子の長さ
は1.7〜20.4ｋｂの間にあり、且つ第４図における対立
遺伝子頻度分布は、この遺伝子座の両対立遺伝子が個体
のわずか４０％のＤＮＡフィンガープリント中において
分離されており、一方個体の１４％においては対立遺伝
子がスコアー可能ではない。
ミニサテライトプローブ33.6および33.15は一緒になっ
て約６０個の超可変遺伝子座を検出し、これら座の多く
はクローニングにかけられ得るものであって、例えばヒ
トにとって連鎖研究に理想的な著しく有益な単一遺伝子
座プローブのバンクを提供するものでなければならな
い。遺伝的異常の連鎖分析は、また完全なＤＮＡ断片を
使用して単一な大きな家族中において可能である。疾患
と共に同時分離するように見える多形性断片が検出され
るならば、この断片をクローン化して、連鎖分析を追付
的な影響家族まで拡大する遺伝子座に特異なプローブを
提供することが必須である。
て約６０個の超可変遺伝子座を検出し、これら座の多く
はクローニングにかけられ得るものであって、例えばヒ
トにとって連鎖研究に理想的な著しく有益な単一遺伝子
座プローブのバンクを提供するものでなければならな
い。遺伝的異常の連鎖分析は、また完全なＤＮＡ断片を
使用して単一な大きな家族中において可能である。疾患
と共に同時分離するように見える多形性断片が検出され
るならば、この断片をクローン化して、連鎖分析を追付
的な影響家族まで拡大する遺伝子座に特異なプローブを
提供することが必須である。
次の実施例２においては、下記において述べられる材料
および方法が用いられる。
および方法が用いられる。
ａ）選択した多量のミニサテライトのクローニング ４０人のランダムに選んだ人々のそれぞれから５μｇの
血液ＤＮＡがプールされ、Ｓａｕ３Ａにより完全消化さ
れ、そして0.6％アガロースゲル中における予備電気泳
動により５〜１５ｋｂの断片が分離され、次に透析膜上
に電気溶離された。精製された分画は第２の調製用ゲル
中において電気泳動にかけられ、すべてのわずかな汚染
Ｓａｕ３Ａ小断片を除去した。５０ｎｇの５〜１５ｋｂ
分画がＢａｍＨ Ｉ（LoenenおよびBrammar、1980年、G
ene20巻、249〜259頁）で開裂した後に単離された100n
gλL47.1アームに連結され、ライブラリーが構成され、
ヒトミニサテライトプローブ33.6および33.15でスクリ
ーニングされ（英国特許第2,166,445号参照）、さらに
陽性プラークが実施例１に述べられているように分離さ
れ、組換えファージＭＳ系を生成した。
血液ＤＮＡがプールされ、Ｓａｕ３Ａにより完全消化さ
れ、そして0.6％アガロースゲル中における予備電気泳
動により５〜１５ｋｂの断片が分離され、次に透析膜上
に電気溶離された。精製された分画は第２の調製用ゲル
中において電気泳動にかけられ、すべてのわずかな汚染
Ｓａｕ３Ａ小断片を除去した。５０ｎｇの５〜１５ｋｂ
分画がＢａｍＨ Ｉ（LoenenおよびBrammar、1980年、G
ene20巻、249〜259頁）で開裂した後に単離された100n
gλL47.1アームに連結され、ライブラリーが構成され、
ヒトミニサテライトプローブ33.6および33.15でスクリ
ーニングされ（英国特許第2,166,445号参照）、さらに
陽性プラークが実施例１に述べられているように分離さ
れ、組換えファージＭＳ系を生成した。
ｂ）ミニサテライトハイブリダイゼーションプローブの
単離 組換えファージＤＮＡがＳａｕ３Ａで消化され、そして
大きなインサート断片が低いゲル化温度アガロース（シ
ープラーク）中における電気泳動によって小さなベクタ
ー断片から分離された。インサートを含むゲルスライス
が６５℃にて３容量の水中に溶解され、１０ｎｇインサ
ートＤＮＡを含むアリコートがランダムオリゴヌクレオ
チドプライミングによって32Ｐで標識された（Feinberg
およびVogelstein、1984年、Anal.Biochem.,137巻、266
〜267頁）。
単離 組換えファージＤＮＡがＳａｕ３Ａで消化され、そして
大きなインサート断片が低いゲル化温度アガロース（シ
ープラーク）中における電気泳動によって小さなベクタ
ー断片から分離された。インサートを含むゲルスライス
が６５℃にて３容量の水中に溶解され、１０ｎｇインサ
ートＤＮＡを含むアリコートがランダムオリゴヌクレオ
チドプライミングによって32Ｐで標識された（Feinberg
およびVogelstein、1984年、Anal.Biochem.,137巻、266
〜267頁）。
ｃ）サザンハイブリダイゼーション ゲノムＤＮＡ試料がJeffreys等、1986年、Am.J.Hum.Gen
et.,39巻、11〜24頁に述べられているように限定酵素処
理され、そして電気泳動にかけられた。ＤＮＡがHybond
−Ｎ(Amersham)に移行され、紫外線照射によって固定さ
れ、そして0.5Ｍリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ、１
ｍＭのEDTA（pH7.2）中で６５℃で５分間予備ハイブリ
ダイズされた（ChurchおよびGilbert、1984年、Proc.Na
tl.Acad.Sci.米国、81巻、1991〜1995頁）。フィルター
が２５μｇ／mlの剪断した単一ストランドヒト胎盤競合
ＤＮＡの存在の下で0.5μｇ／mlの３２ｐ標識ラベルＤ
ＮＡ（比活性〜１０9ｃｐｍ／ｕｇＤＮＡ）で一晩ハイ
ブリダイズされた。ハイブリダイゼーションの後、フィ
ルターが４０ｍＭリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ(pH7.
2)中において６５℃で洗浄され、次に0.1×SSC（１５ｍ
Ｍ NaCl、1.5ｍＭクエン酸３ナトリウム、pH7.0）およ
び0.01％ＳＤＳ中において６０℃で激しく洗浄された。
フィルターが増強スクリーンの存在の下で−８０℃で３
時間から１週間オートラジオグラフで処理された。
et.,39巻、11〜24頁に述べられているように限定酵素処
理され、そして電気泳動にかけられた。ＤＮＡがHybond
−Ｎ(Amersham)に移行され、紫外線照射によって固定さ
れ、そして0.5Ｍリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ、１
ｍＭのEDTA（pH7.2）中で６５℃で５分間予備ハイブリ
ダイズされた（ChurchおよびGilbert、1984年、Proc.Na
tl.Acad.Sci.米国、81巻、1991〜1995頁）。フィルター
が２５μｇ／mlの剪断した単一ストランドヒト胎盤競合
ＤＮＡの存在の下で0.5μｇ／mlの３２ｐ標識ラベルＤ
ＮＡ（比活性〜１０9ｃｐｍ／ｕｇＤＮＡ）で一晩ハイ
ブリダイズされた。ハイブリダイゼーションの後、フィ
ルターが４０ｍＭリン酸ナトリウム、１％ＳＤＳ(pH7.
2)中において６５℃で洗浄され、次に0.1×SSC（１５ｍ
Ｍ NaCl、1.5ｍＭクエン酸３ナトリウム、pH7.0）およ
び0.01％ＳＤＳ中において６０℃で激しく洗浄された。
フィルターが増強スクリーンの存在の下で−８０℃で３
時間から１週間オートラジオグラフで処理された。
ｄ）ＭＳ組換え体のタンデム反復配列の測定 各ＭＳ組換え体ＤＮＡが音波処理され、0.3〜0.6ｋｂの
大きさを有する断片がサイズ選択され、そしてショット
ガンがM13mp19のＳｍａＩ位置にクローン化された（Yan
is−Perron、VieiraおよびMessing、1985年、Gane 33
巻、103〜119頁）。組換え体ファージが32Ｐ標識ＭＳイ
ンサートＤＮＡを用いてプラークハイブリダイゼーショ
ンによって選別された。与えられたＭＳ組換え体からの
１０個の陽性の強い単鎖ファージＤＮＡがＣ−テストに
よって対の形で比較された（WinterおよびFields、1980
年、Nucleic Acids Res.,８巻、1965〜1974頁）。殆ど
のＤＮＡは２つの相補的Ｃ−テストグループになり、従
ってλＭＳインサートの長いタンデム反復領域から誘導
されたようであった。２つの相補的グループのそれぞれ
からの２つのＭ１３組換え体はジデオキシヌクレオチド
チェインターミネーション法（Sanger,NicklenおよびCo
ulson,1977年、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、74巻、5463
〜5467頁；Biggin,GibsonおよびHong,1983年、Proc.Nat
l.Acad.Sci.米国、80巻、3963〜3965頁）によってその
後処理され、両鎖上の各ＭＳ組換え体のコンセンサス反
復配列が決定された。
大きさを有する断片がサイズ選択され、そしてショット
ガンがM13mp19のＳｍａＩ位置にクローン化された（Yan
is−Perron、VieiraおよびMessing、1985年、Gane 33
巻、103〜119頁）。組換え体ファージが32Ｐ標識ＭＳイ
ンサートＤＮＡを用いてプラークハイブリダイゼーショ
ンによって選別された。与えられたＭＳ組換え体からの
１０個の陽性の強い単鎖ファージＤＮＡがＣ−テストに
よって対の形で比較された（WinterおよびFields、1980
年、Nucleic Acids Res.,８巻、1965〜1974頁）。殆ど
のＤＮＡは２つの相補的Ｃ−テストグループになり、従
ってλＭＳインサートの長いタンデム反復領域から誘導
されたようであった。２つの相補的グループのそれぞれ
からの２つのＭ１３組換え体はジデオキシヌクレオチド
チェインターミネーション法（Sanger,NicklenおよびCo
ulson,1977年、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、74巻、5463
〜5467頁；Biggin,GibsonおよびHong,1983年、Proc.Nat
l.Acad.Sci.米国、80巻、3963〜3965頁）によってその
後処理され、両鎖上の各ＭＳ組換え体のコンセンサス反
復配列が決定された。
実施例２ ａ）選択された遺伝子座特異性超可変ＤＮＡプローブの
単離 調製ゲル電気泳動分離によりヒトＤＮＡフィンガープリ
ントから選ばれた断片をクローン化し、次にバクテリオ
ファージ内でクローン化する方法は実施例１に述べられ
ている。様々なミニサテライトを単離するために、４０
人のランダムに選ばれた人々からプールしたＤＮＡから
の大きさ６〜１５ｋｂのＳａｕ３Ａ断片が、BamH I置換
ベクターλL47.1にクローン化された〔LeonenおよびBra
mmar,1980年；「A bacteriophage lambda vector for c
loning large DNA fragments made with several restr
iction enzymes（いくつかの制限酵素により生成された
多量のＤＮＡ断片をクローン化するバクテリオファージ
ラムダベクター）」、Gene，20巻、249〜259頁〕。ヒト
ミニサテライトは実施例１において証明されたように長
さの点で実質的な対立遺伝子変化を示すことができるの
で、多量のＳａｕ３Ａ断片をクローン化するためにプー
ルしたヒトＤＮＡを使用することは、多量のＳａｕ３Ａ
対立遺伝子を有するクローン化可能な超可変遺伝子座の
数を最大限に多くすることができる。2000の組換え体の
ライブラリーから５個のファージが、ヒトミニサテライ
トプローブ33.15へのハイブリダイゼーションにより単
離され、そして５個のファージがプローブ33.6により検
出され、ＭＳ系の組換え体を生成した（第１図参照）。
単離 調製ゲル電気泳動分離によりヒトＤＮＡフィンガープリ
ントから選ばれた断片をクローン化し、次にバクテリオ
ファージ内でクローン化する方法は実施例１に述べられ
ている。様々なミニサテライトを単離するために、４０
人のランダムに選ばれた人々からプールしたＤＮＡから
の大きさ６〜１５ｋｂのＳａｕ３Ａ断片が、BamH I置換
ベクターλL47.1にクローン化された〔LeonenおよびBra
mmar,1980年；「A bacteriophage lambda vector for c
loning large DNA fragments made with several restr
iction enzymes（いくつかの制限酵素により生成された
多量のＤＮＡ断片をクローン化するバクテリオファージ
ラムダベクター）」、Gene，20巻、249〜259頁〕。ヒト
ミニサテライトは実施例１において証明されたように長
さの点で実質的な対立遺伝子変化を示すことができるの
で、多量のＳａｕ３Ａ断片をクローン化するためにプー
ルしたヒトＤＮＡを使用することは、多量のＳａｕ３Ａ
対立遺伝子を有するクローン化可能な超可変遺伝子座の
数を最大限に多くすることができる。2000の組換え体の
ライブラリーから５個のファージが、ヒトミニサテライ
トプローブ33.15へのハイブリダイゼーションにより単
離され、そして５個のファージがプローブ33.6により検
出され、ＭＳ系の組換え体を生成した（第１図参照）。
各λＭＳ組換体が超可変ミニサテライト用の遺伝子座特
異性プローブとして作用することができるかどうかを決
定するために、各組換え体のＳａｕ３Ｓインサートが、
３人の任意に選ばれた個体のＨｉｎｆＩ消化物に対し
て、またはλＭＳ32についてはＡｌｕＩ消化物、即ちＨ
ｉｎｆＩ部位（第５図）を含むミニサテライトタンデム
反復単位に対して、ヒト競合ＤＮＡの存在の下でハイブ
リダイズされた。各ヒトＤＮＡ中における１つまたは２
つの大きな可変ＤＮＡ断片にハイブリダイズした組換え
体の１０個のうちの８個が試験された。プローブ33.6
（λＭＳ８，40，42および47）によって検出された組換
え体の４つが可変ＤＮＡ断片の同じパターンにハイブリ
ダイズし、従って同じ超可変遺伝子座から誘導される
（第５図および第１表）。
異性プローブとして作用することができるかどうかを決
定するために、各組換え体のＳａｕ３Ｓインサートが、
３人の任意に選ばれた個体のＨｉｎｆＩ消化物に対し
て、またはλＭＳ32についてはＡｌｕＩ消化物、即ちＨ
ｉｎｆＩ部位（第５図）を含むミニサテライトタンデム
反復単位に対して、ヒト競合ＤＮＡの存在の下でハイブ
リダイズされた。各ヒトＤＮＡ中における１つまたは２
つの大きな可変ＤＮＡ断片にハイブリダイズした組換え
体の１０個のうちの８個が試験された。プローブ33.6
（λＭＳ８，40，42および47）によって検出された組換
え体の４つが可変ＤＮＡ断片の同じパターンにハイブリ
ダイズし、従って同じ超可変遺伝子座から誘導される
（第５図および第１表）。
第５図は遺伝子座特異的超可変ＤＮＡプローブのための
λＭＳ組換え体のスクリーニングの例を示している。３
人の無関係な人からのＤＮＡの２μｇの試料がＨｉｎｆ
Ｉで消化され、そして0.8％アガロースゲルにより電気
泳動処理され、そして「Materials and Methods」にお
いて述べられているようにして、ｐλｇ３（実施例１）
λＭＳ８およびλＭＳ40からの32ｐ標識Ｓａｕ３Ａイン
サートとサザンブロットハイブリダイズされた。ハイブ
リダイゼーションの後、フィルターが６５℃の0.1×SSC
において洗浄され、そして増強スクリーンの存在の下で
１日（左側のパネル）または１週間（右側のパネル）オ
ートラジオグラフで写真にとられた。なお、λＭＳ８お
よびλＭＳ40は同じ超可変遺伝子座を検出し、そして長
期オートラジオグラフ法において、追加の可変性ＤＮＡ
断片が検出可能である。
λＭＳ組換え体のスクリーニングの例を示している。３
人の無関係な人からのＤＮＡの２μｇの試料がＨｉｎｆ
Ｉで消化され、そして0.8％アガロースゲルにより電気
泳動処理され、そして「Materials and Methods」にお
いて述べられているようにして、ｐλｇ３（実施例１）
λＭＳ８およびλＭＳ40からの32ｐ標識Ｓａｕ３Ａイン
サートとサザンブロットハイブリダイズされた。ハイブ
リダイゼーションの後、フィルターが６５℃の0.1×SSC
において洗浄され、そして増強スクリーンの存在の下で
１日（左側のパネル）または１週間（右側のパネル）オ
ートラジオグラフで写真にとられた。なお、λＭＳ８お
よびλＭＳ40は同じ超可変遺伝子座を検出し、そして長
期オートラジオグラフ法において、追加の可変性ＤＮＡ
断片が検出可能である。
残りの組換え体λＭＳ１，31，32および43が、すでに特
徴づけられているｐλｇ３遺伝子座を含まない異る遺伝
子座から誘導された（実施例１および第５図参照）。こ
れらλＭＳ組換え体はどれも多可変断片のＤＮＡ「フィ
ンガープリント」を生成しなかったけれども、殆どのλ
ＭＳプローブは長期オートラジオグラフ露光において追
加の多形性ＤＮＡ断片に対して弱く交差ハイブリダイズ
するように見えた（第５図）。プローブ33.15、λＭＳ
３およびλＭＳ30によって検出されたλＭＳ組換え体の
２つは、ＨｉｎｆＩまたはＳａｕ３Ａで消化したヒトＤ
ＮＡ中の特異的座を、ヒト競争体ＤＮＡの存在下または
不存在下に検出できなかった。延長したオートラジオグ
ラフで、両者の組換え体は、可変ＤＮＡ断片の同一の淡
いパターンを検出した（データは示されていない）。わ
れわれはこの座特異性の欠如を説明できず、そしてこれ
らの２つのλＭＳ組換え体をこれ以上特性づけなかっ
た。
徴づけられているｐλｇ３遺伝子座を含まない異る遺伝
子座から誘導された（実施例１および第５図参照）。こ
れらλＭＳ組換え体はどれも多可変断片のＤＮＡ「フィ
ンガープリント」を生成しなかったけれども、殆どのλ
ＭＳプローブは長期オートラジオグラフ露光において追
加の多形性ＤＮＡ断片に対して弱く交差ハイブリダイズ
するように見えた（第５図）。プローブ33.15、λＭＳ
３およびλＭＳ30によって検出されたλＭＳ組換え体の
２つは、ＨｉｎｆＩまたはＳａｕ３Ａで消化したヒトＤ
ＮＡ中の特異的座を、ヒト競争体ＤＮＡの存在下または
不存在下に検出できなかった。延長したオートラジオグ
ラフで、両者の組換え体は、可変ＤＮＡ断片の同一の淡
いパターンを検出した（データは示されていない）。わ
れわれはこの座特異性の欠如を説明できず、そしてこれ
らの２つのλＭＳ組換え体をこれ以上特性づけなかっ
た。
こうして従来大きい不安定なヒトミニサテライトのクロ
ーニングにおける報告された困難〔例えば、Nicholls e
t al(1985)Nucleic Acids Res.13,7569-7578およびWyma
n et al(1985)Proc.Nath.Acad.Sci.USA 77,6754−6758
参照〕にかかわらず、ＤＮＡフィンガープレート中に検
出された最大の最も可変性のＤＮＡ断片の少なくともあ
るものは、インサートがrecBC E. coli宿主中のファー
ジの増殖により安定化される場合、バクテリオファージ
中でクローニング可能であることを、われわれは立証す
ることができた。
ーニングにおける報告された困難〔例えば、Nicholls e
t al(1985)Nucleic Acids Res.13,7569-7578およびWyma
n et al(1985)Proc.Nath.Acad.Sci.USA 77,6754−6758
参照〕にかかわらず、ＤＮＡフィンガープレート中に検
出された最大の最も可変性のＤＮＡ断片の少なくともあ
るものは、インサートがrecBC E. coli宿主中のファー
ジの増殖により安定化される場合、バクテリオファージ
中でクローニング可能であることを、われわれは立証す
ることができた。
ｄ）クローニングしたミニサテライトの反復配列単位の
決定 各λＭＳ組換え体からのインサートＤＮＡのランダムセ
グメントを配列決定して、各クローニングした超可変座
がタンデム反復ミニサテライトから成るかどうかを決定
した（材料および方法を参照）。すべてのλＭＳクロー
ンは、長さがλＭＳ１についての９ｂｐないしλＭＳ43
についての４５ｂｐの範囲であるタンデム反復単位から
主として成ることが示された（第６図）。
決定 各λＭＳ組換え体からのインサートＤＮＡのランダムセ
グメントを配列決定して、各クローニングした超可変座
がタンデム反復ミニサテライトから成るかどうかを決定
した（材料および方法を参照）。すべてのλＭＳクロー
ンは、長さがλＭＳ１についての９ｂｐないしλＭＳ43
についての４５ｂｐの範囲であるタンデム反復単位から
主として成ることが示された（第６図）。
第６図は、ミニサテライトのλＭＳ系列のコンセンサス
反復配列単位を示す。各クローニングしたミニサテライ
トのランダムセグメントを配列決定して、コンセンサス
反復単位を定めた。各コンセンサス中の可変位置は、次
のように示される：Ｒ．ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ．ｙ＝Ｃま
たはＴ；Ｎ．ｎ＝任意の塩基。λＭＳ８中のミニサテラ
イトは、長さが２９ｂｐおよび３０ｂｐの２つの相互に
散在する反復単位から成る。ｐλｇ３のコンセンサス反
復配列は、また、第２図に示されている。各反復配列は
コア配列と整列されており、一致するものは大文字で示
されており、そしてｐλｇ３，λＭＳ31およびλＭＳ32
とコアとの比較から誘導される新しいコア配列も開示さ
れている。従来配列決定されたミニサテライトに見られ
る反復単位間の変動と一致する、完全に相同の反復単位
は、ミニサテライト中に存在しない（英国特許公告第2,
166,445号およびここの実施例１参照）。最も顕著なこ
とには、λＭＳ８中のミニサテライトは、長さが２９ｂ
ｐおよび３０ｂｐの２つの密に関連するが、異る反復単
位の相互に混合した列から成る（第６図）。
反復配列単位を示す。各クローニングしたミニサテライ
トのランダムセグメントを配列決定して、コンセンサス
反復単位を定めた。各コンセンサス中の可変位置は、次
のように示される：Ｒ．ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ．ｙ＝Ｃま
たはＴ；Ｎ．ｎ＝任意の塩基。λＭＳ８中のミニサテラ
イトは、長さが２９ｂｐおよび３０ｂｐの２つの相互に
散在する反復単位から成る。ｐλｇ３のコンセンサス反
復配列は、また、第２図に示されている。各反復配列は
コア配列と整列されており、一致するものは大文字で示
されており、そしてｐλｇ３，λＭＳ31およびλＭＳ32
とコアとの比較から誘導される新しいコア配列も開示さ
れている。従来配列決定されたミニサテライトに見られ
る反復単位間の変動と一致する、完全に相同の反復単位
は、ミニサテライト中に存在しない（英国特許公告第2,
166,445号およびここの実施例１参照）。最も顕著なこ
とには、λＭＳ８中のミニサテライトは、長さが２９ｂ
ｐおよび３０ｂｐの２つの密に関連するが、異る反復単
位の相互に混合した列から成る（第６図）。
こうして、５つの新しい超可変座が分離され、各々は主
としてタンデム反復ミニサテライトから成る。ｐλｇ
３，λＭＳ１，λＭＳ31およびλＭＳ32のタンデム反復
単位の各々は、期待されるように、コア配列を含有する
（第６図）。しかしながら、コア配列のコピーは不完全
であり、そしてこれらのミニサテライトの反復単位の比
較は、これらの大きい極めて可変性の座と優先的に関連
する新しいコア配列を明瞭に定めない。その代わり、広
い範囲のコア誘導体を大きいミニサテライトと関連づけ
ることができるように思われる。より顕著には、コア配
列の高度に分岐した異型(Version)のタンデム配列から
成るプローブ33.6（英国特許公告第2,166,445号参照）
によって検出されるミニサテライトλＭＳ８およびλＭ
Ｓ43は、コア配列の高度に分岐した(diversed)異型を含
有する（第２図）。再び、λＭＳ８，λＭＳ43および3
3.6の比較は、これらの３つの座に優先的に関連づけら
れる新しい特異的配列を明瞭に明らかにしない（データ
は示されていない）。明らかなように、最も可変性のミ
ニサテライトに関連づけられる他の配列のモチーフ(mot
if)、とくにプローブ33.6によって検出されるものは、
クローニングしたミニサテライトの非常に大きいスペク
トルの分析を必要とするであろう。
としてタンデム反復ミニサテライトから成る。ｐλｇ
３，λＭＳ１，λＭＳ31およびλＭＳ32のタンデム反復
単位の各々は、期待されるように、コア配列を含有する
（第６図）。しかしながら、コア配列のコピーは不完全
であり、そしてこれらのミニサテライトの反復単位の比
較は、これらの大きい極めて可変性の座と優先的に関連
する新しいコア配列を明瞭に定めない。その代わり、広
い範囲のコア誘導体を大きいミニサテライトと関連づけ
ることができるように思われる。より顕著には、コア配
列の高度に分岐した異型(Version)のタンデム配列から
成るプローブ33.6（英国特許公告第2,166,445号参照）
によって検出されるミニサテライトλＭＳ８およびλＭ
Ｓ43は、コア配列の高度に分岐した(diversed)異型を含
有する（第２図）。再び、λＭＳ８，λＭＳ43および3
3.6の比較は、これらの３つの座に優先的に関連づけら
れる新しい特異的配列を明瞭に明らかにしない（データ
は示されていない）。明らかなように、最も可変性のミ
ニサテライトに関連づけられる他の配列のモチーフ(mot
if)、とくにプローブ33.6によって検出されるものは、
クローニングしたミニサテライトの非常に大きいスペク
トルの分析を必要とするであろう。
ｃ）クローン化ミニサテライトによって検出される座の
メンデル遺伝および変動性 分離された５つの新しいミニサテライト、λＭＳ１，
８，31，32および43の各々は、単一の大きい可変性の座
を検出する。すべての座のメンデル遺伝は、CEPHプログ
ラムによって提供された大きい水平系統における分離を
分析することによって確証された。
メンデル遺伝および変動性 分離された５つの新しいミニサテライト、λＭＳ１，
８，31，32および43の各々は、単一の大きい可変性の座
を検出する。すべての座のメンデル遺伝は、CEPHプログ
ラムによって提供された大きい水平系統における分離を
分析することによって確証された。
第７図は、λＭＳ32によって検出される超可変座のメン
デル遺伝を示す。CEPH家族1413からの１μｇのＤＮＡ試
料をＡｌｕＩで消化し、そしてλＭＳ31からの32Ｐ標識
Ｓａｕ３Ａインサートにサザンブロットハイブリダイズ
させた。この族はこの座において完全に情報に富むもの
である。
デル遺伝を示す。CEPH家族1413からの１μｇのＤＮＡ試
料をＡｌｕＩで消化し、そしてλＭＳ31からの32Ｐ標識
Ｓａｕ３Ａインサートにサザンブロットハイブリダイズ
させた。この族はこの座において完全に情報に富むもの
である。
各プローブについての対立遺伝子の変動性の程度は、ラ
ンダムに選択した英国人の個体の間で共有される対立遺
伝子の頻度を分析することによって推定した（第８
図）。第８図は、λＭＳ43によって検出された超可変座
における対立遺伝子の変動性の推定を提供する。２０人
の不規則に選択した英国人からのＤＮＡの１μｇの試料
を、ＨｉｎｆＩで消化し、そしてλＭＳ43にサザンブロ
ットハイブリダイズさせた。すべての個体はヘテロ接合
性であり、この超可変座におけるヘテロ接合性のレベル
が高い（Ｈ＞0.86、Ｐ＞0.95）ことを示す。ヘテロ接合
性のより正確な推定は、各個体中の対立遺伝子をオート
ラジオグラフ上の６つの最も近い近接体中の対立遺伝子
と比較して、個体間で共有される対立遺伝子のレベルを
推定することによって行うことができる。例えば、個体
５中のより大きい対立遺伝子は７中に存在するが、２，
３，４，６および８中に存在しないように思われる。同
様に、５中のより小さい対立遺伝子は２〜４または６〜
８中に存在しない。検査したすべての個体にわたって、
Ｓ＝0.11であり、これから平均の対立遺伝子の頻度ｑは
ｑ＝１−（１−ｓ）1/2＝0.056と推定することができ、
そしてヘテロ接合性は（１−ｑ）＝９４％と推定するこ
とができる。
ンダムに選択した英国人の個体の間で共有される対立遺
伝子の頻度を分析することによって推定した（第８
図）。第８図は、λＭＳ43によって検出された超可変座
における対立遺伝子の変動性の推定を提供する。２０人
の不規則に選択した英国人からのＤＮＡの１μｇの試料
を、ＨｉｎｆＩで消化し、そしてλＭＳ43にサザンブロ
ットハイブリダイズさせた。すべての個体はヘテロ接合
性であり、この超可変座におけるヘテロ接合性のレベル
が高い（Ｈ＞0.86、Ｐ＞0.95）ことを示す。ヘテロ接合
性のより正確な推定は、各個体中の対立遺伝子をオート
ラジオグラフ上の６つの最も近い近接体中の対立遺伝子
と比較して、個体間で共有される対立遺伝子のレベルを
推定することによって行うことができる。例えば、個体
５中のより大きい対立遺伝子は７中に存在するが、２，
３，４，６および８中に存在しないように思われる。同
様に、５中のより小さい対立遺伝子は２〜４または６〜
８中に存在しない。検査したすべての個体にわたって、
Ｓ＝0.11であり、これから平均の対立遺伝子の頻度ｑは
ｑ＝１−（１−ｓ）1/2＝0.056と推定することができ、
そしてヘテロ接合性は（１−ｑ）＝９４％と推定するこ
とができる。
すべての座は高度に可変性であり、ヘテロ接合性はλＭ
Ｓ８についての９０％からλＭＳ31についての９９％に
及ぶ（表１参照）。１５および150の個体のプールにお
いて分離された対立遺伝子のスペクトルを比較すること
によって、対立遺伝子の長さの変動度をさらに分析した
（第９図）。第９図は、ヒトＤＮＡのプールにおける起
可変座における対立遺伝子の長さの変動を示す。単一の
個体（ａ）、１５の個体のプール（ｂ）および150人の
プール（ｃ）からのＤＮＡの１０μｇの試料を、Ａｌｕ
Ｉ（λＭＳ32について）またはＨｉｎｆＩ（残りのすべ
てのプローブについて）で消化し、そして示した座特異
的超可変プローブとサザンブロットハイブリダイズさせ
た。すべての個体はランダムに選択した北ヨーロッパ人
であった。個体ａはプールｂ内に含まれ、そしてすべて
のプールｂの個体はプールｃ中に含まれた。λＭＳ43は
０でしるしをした短いＨｉｎｆＩ対立遺伝子によって表
わされる第２可変領域を検出することに注意すべきであ
る。この領域はそれ以上特徴づけなかった。
Ｓ８についての９０％からλＭＳ31についての９９％に
及ぶ（表１参照）。１５および150の個体のプールにお
いて分離された対立遺伝子のスペクトルを比較すること
によって、対立遺伝子の長さの変動度をさらに分析した
（第９図）。第９図は、ヒトＤＮＡのプールにおける起
可変座における対立遺伝子の長さの変動を示す。単一の
個体（ａ）、１５の個体のプール（ｂ）および150人の
プール（ｃ）からのＤＮＡの１０μｇの試料を、Ａｌｕ
Ｉ（λＭＳ32について）またはＨｉｎｆＩ（残りのすべ
てのプローブについて）で消化し、そして示した座特異
的超可変プローブとサザンブロットハイブリダイズさせ
た。すべての個体はランダムに選択した北ヨーロッパ人
であった。個体ａはプールｂ内に含まれ、そしてすべて
のプールｂの個体はプールｃ中に含まれた。λＭＳ43は
０でしるしをした短いＨｉｎｆＩ対立遺伝子によって表
わされる第２可変領域を検出することに注意すべきであ
る。この領域はそれ以上特徴づけなかった。
最も可変性の少ない座、λＭＳ８、について、１５人の
プールにおいて分離可能である２つの主要な長さ5.3ｋ
ｂおよび7.2ｋｂの対立遺伝子＋７つの低い頻度の対立
遺伝子が存在する。２つの主要な対立遺伝子がこれらの
１５人の個体におけるサンプリング誤差の結果でないこ
とは、150人のプールにおけるそれらの同様な分布、な
らびに低い頻度の大きいスペクトルによって示される。
同様に、λＭＳ43（94％のヘテロ接合率）は１５および
150の個体のプールによって共有される７つの主要対立
遺伝子、ならびに多くの小比率の対立遺伝子を示す。対
照的に、最も可変性の座λＭＳ１，31および32およびｐ
λｇ３（ヘテロ接合率は97−99％と推定される）は、個
体の両者のプールによって等しい強度で共有される、有
意の集団頻度をもつ対立遺伝子を示さず（前述のｐλｇ
３の最も短い1.6ｋｂのアレルを除く）、こうしてこれ
らの座における対立遺伝子の数は非常に高いと思わる。
例えば、少なくとも５０の異なるλＭＳ32の対立遺伝子
を150の個体のプールにおいて分離することができる。
これはゲル電気泳動によって限定される対立遺伝子の合
計数の最小の推定値であろう。
プールにおいて分離可能である２つの主要な長さ5.3ｋ
ｂおよび7.2ｋｂの対立遺伝子＋７つの低い頻度の対立
遺伝子が存在する。２つの主要な対立遺伝子がこれらの
１５人の個体におけるサンプリング誤差の結果でないこ
とは、150人のプールにおけるそれらの同様な分布、な
らびに低い頻度の大きいスペクトルによって示される。
同様に、λＭＳ43（94％のヘテロ接合率）は１５および
150の個体のプールによって共有される７つの主要対立
遺伝子、ならびに多くの小比率の対立遺伝子を示す。対
照的に、最も可変性の座λＭＳ１，31および32およびｐ
λｇ３（ヘテロ接合率は97−99％と推定される）は、個
体の両者のプールによって等しい強度で共有される、有
意の集団頻度をもつ対立遺伝子を示さず（前述のｐλｇ
３の最も短い1.6ｋｂのアレルを除く）、こうしてこれ
らの座における対立遺伝子の数は非常に高いと思わる。
例えば、少なくとも５０の異なるλＭＳ32の対立遺伝子
を150の個体のプールにおいて分離することができる。
これはゲル電気泳動によって限定される対立遺伝子の合
計数の最小の推定値であろう。
白人における対立遺伝子の長さの分散は、また、これら
の超可変座の間で変化する（第９図および表１参照）。
λＭＳ31の大部分の対立遺伝子は5.5〜9.3ｋｂの比較的
狭い大きさの範囲にわたってかなり均一に分布し、これ
に対してλＭＳ１の対立遺伝子は２〜２０ｋｂの間で大
きさを変化させる。対立遺伝子の長さの分布が不均一で
ある場合が多少あることについての証拠が存在する。と
くにλＭＳ43は５〜６ｋｂおよび８〜１４ｋｂの２つの
主要な対立遺伝子の大きさのクラスを示し、そしてｐλ
ｇ３は1.6〜1.7、2.8〜3.6および５〜１５ｋｂの３つの
大きさのクラスを示し、これらについては実施例１にお
いて前述されている。
の超可変座の間で変化する（第９図および表１参照）。
λＭＳ31の大部分の対立遺伝子は5.5〜9.3ｋｂの比較的
狭い大きさの範囲にわたってかなり均一に分布し、これ
に対してλＭＳ１の対立遺伝子は２〜２０ｋｂの間で大
きさを変化させる。対立遺伝子の長さの分布が不均一で
ある場合が多少あることについての証拠が存在する。と
くにλＭＳ43は５〜６ｋｂおよび８〜１４ｋｂの２つの
主要な対立遺伝子の大きさのクラスを示し、そしてｐλ
ｇ３は1.6〜1.7、2.8〜3.6および５〜１５ｋｂの３つの
大きさのクラスを示し、これらについては実施例１にお
いて前述されている。
上に示したように、検出される座は極めて可変性であ
り、そして事実ヒトＤＮＡからこれまで分離されてきた
大部分の多形性座の中に存在する。
り、そして事実ヒトＤＮＡからこれまで分離されてきた
大部分の多形性座の中に存在する。
ｄ）超可変性座の染色体帰属 超可変座特異的プローブのいずれもげっし類ＤＮＡにハ
イブリダイズせず、それゆえこれらの座の分離は人間−
げっし類体細胞雑種において追跡できた〔第１０および
下表２参照〕。６つの座が４つの異なる常染色体に割当
てられ、染色体１および７の各々は２つの超可変座を共
有する。
イブリダイズせず、それゆえこれらの座の分離は人間−
げっし類体細胞雑種において追跡できた〔第１０および
下表２参照〕。６つの座が４つの異なる常染色体に割当
てられ、染色体１および７の各々は２つの超可変座を共
有する。
第１０図は、ＡｌｕＩで消化したヒト−げっし類体細胞
雑種ＤＮＡのパネルにおいて、λＭＳ32により検出され
た超可変座の分離を示す。この座はヒト染色体１と同時
分離する(cosegregate)（下表２参照）。興味あること
には、雑種細胞系MOG2C2は、λＭＳ32およびλＭＳ１の
両者の２つの対立遺伝子を有した（データは示されてい
ない）。このことが強く示唆するように、ヒト染色体１
の両者の親のコピーはこの雑種中に保持されており、そ
して、すべての他の陽性の雑種はこれらの座の各々にお
いて単一の対立遺伝子のみを含有していたので、これは
λＭＳ１およびλＭＳ32のシンチニー(synteny)につい
て強く支持する証拠を提供する。雑種F4SC13c112は染色
体１ｐを含有するが、λＭＳ32について陰性である。こ
うしてλＭＳ32は染色体１ｑに一時的に局在化してい
る。次のコードを第１０図において使用する： １．ヒト２ ２．ハムスター ３．マウス ４．FG10 ５．PCT BA18 ６．１α9498 ７．SIF4A24EI ８．SIF15P5 ９．CTP34B4 10.TWIN 19 D12 11.TWIN 19 F9 12.TWIN 19 F6 13.TWIN 19 C5 14.MOG 2C2 15.MOG 2E5 16.ヒト１ 17.ラット 18.DUR 4.3 19.FIR 5 20.C4A 21.DUR 4R3 22.3W4 cl 5 23.クローン21 24.WILF 1 25.F4SC13 cl 26.SIF4A31 27.FST 9／10 28.HORL 411B6 29.HORP 9.5 表２はヒト−げっし類体細胞の雑種における超可変座の
染色体帰属を示す。
雑種ＤＮＡのパネルにおいて、λＭＳ32により検出され
た超可変座の分離を示す。この座はヒト染色体１と同時
分離する(cosegregate)（下表２参照）。興味あること
には、雑種細胞系MOG2C2は、λＭＳ32およびλＭＳ１の
両者の２つの対立遺伝子を有した（データは示されてい
ない）。このことが強く示唆するように、ヒト染色体１
の両者の親のコピーはこの雑種中に保持されており、そ
して、すべての他の陽性の雑種はこれらの座の各々にお
いて単一の対立遺伝子のみを含有していたので、これは
λＭＳ１およびλＭＳ32のシンチニー(synteny)につい
て強く支持する証拠を提供する。雑種F4SC13c112は染色
体１ｐを含有するが、λＭＳ32について陰性である。こ
うしてλＭＳ32は染色体１ｑに一時的に局在化してい
る。次のコードを第１０図において使用する： １．ヒト２ ２．ハムスター ３．マウス ４．FG10 ５．PCT BA18 ６．１α9498 ７．SIF4A24EI ８．SIF15P5 ９．CTP34B4 10.TWIN 19 D12 11.TWIN 19 F9 12.TWIN 19 F6 13.TWIN 19 C5 14.MOG 2C2 15.MOG 2E5 16.ヒト１ 17.ラット 18.DUR 4.3 19.FIR 5 20.C4A 21.DUR 4R3 22.3W4 cl 5 23.クローン21 24.WILF 1 25.F4SC13 cl 26.SIF4A31 27.FST 9／10 28.HORL 411B6 29.HORP 9.5 表２はヒト−げっし類体細胞の雑種における超可変座の
染色体帰属を示す。
表２において、次の体細胞雑種を類型に分類した： １、DUR4.3; ２、FIR5; ３、C4A;４、DUR4R3; ５、3
W4c15; ６、クローン21; ７、WILF.1; ８、 F4SC13c112; ９、SIF4A31; 10、FST9／10:11、 HORL411B6; 12、HORP9.5; 13、FG10; 14、 PCTBA18; 15、１α9498; 16、SIF4A24E1; 17、SIF15P5;
18、CTP34B4; 19、TWIN 19D12; 20、TWIN 19F9; 21、T
WIN 19F6; 22、TWIN 19C5; 23、MOG 2C2; 24、MOG2E5お
よびこの表に使用した記号の意味は次の通りである： ＋、染色体または超可変座の存在；−、染色体または座
の不存在；Ｍ、サザンブロットハイブリダイゼーション
によって非常に弱く検出されるある細胞または遺伝子座
中にのみ存在する染色体；Ｎ、試験されないかあるいは
あいまいな結果の染色体、試験されなかった遺伝子座；
Ｐ、短いアームの存在；Ｄ、染色体７pter→q22が７／
Ｘ転位として存在する。各座特異的超可変プローブの推
理した染色体帰属とが与えられており、同時に完全な染
色体および超可変座の存在または不存在いついて一致し
た、不明瞭な情報を与える細胞雑種の分画が与えられて
いる。各超可変プローブについて、１つを除外したすべ
ての染色体はこの分析において多様に排除された。
W4c15; ６、クローン21; ７、WILF.1; ８、 F4SC13c112; ９、SIF4A31; 10、FST9／10:11、 HORL411B6; 12、HORP9.5; 13、FG10; 14、 PCTBA18; 15、１α9498; 16、SIF4A24E1; 17、SIF15P5;
18、CTP34B4; 19、TWIN 19D12; 20、TWIN 19F9; 21、T
WIN 19F6; 22、TWIN 19C5; 23、MOG 2C2; 24、MOG2E5お
よびこの表に使用した記号の意味は次の通りである： ＋、染色体または超可変座の存在；−、染色体または座
の不存在；Ｍ、サザンブロットハイブリダイゼーション
によって非常に弱く検出されるある細胞または遺伝子座
中にのみ存在する染色体；Ｎ、試験されないかあるいは
あいまいな結果の染色体、試験されなかった遺伝子座；
Ｐ、短いアームの存在；Ｄ、染色体７pter→q22が７／
Ｘ転位として存在する。各座特異的超可変プローブの推
理した染色体帰属とが与えられており、同時に完全な染
色体および超可変座の存在または不存在いついて一致し
た、不明瞭な情報を与える細胞雑種の分画が与えられて
いる。各超可変プローブについて、１つを除外したすべ
ての染色体はこの分析において多様に排除された。
染色体１ｐを含有する雑種８(F4SC13c112)へのλＭＳ１
のハイブリダイゼーションは、λＭＳ１が１ｐ上に存在
することを示唆している。逆に、λＭＳ32は雑種８にハ
イブリダイズせず、１ｑへの局在化を示唆している。ｐ
ｇ３は、染色体7pter→q22を含有する雑種２(FIR5)にハ
イブリダイズしない。さらに、それぞれ７pter→q31.3
および7q31.3→qterを含有する雑種JDA 13.1およびＪＤ
Ａ３は、ｐλｇ３についてそれぞれ陰性および陽性であ
り（データは示されていない）、ｐλｇ３を7q31.3→qt
erに位置決定する。逆に、λＭＳ31はFIR5およびJDA 1
3.1にハイブリダイズするが、JDA3にハイブリダイズせ
ず、７pter→ｑ22への帰属を示唆する。この集団化の欠
如は、シンテニック標識(syntenic marker)のいずれか
の対間の有意の連鎖の不存在を示す、大きいCEPHの親類
関係(sibship)における連鎖の分析によって確証され
た。
のハイブリダイゼーションは、λＭＳ１が１ｐ上に存在
することを示唆している。逆に、λＭＳ32は雑種８にハ
イブリダイズせず、１ｑへの局在化を示唆している。ｐ
ｇ３は、染色体7pter→q22を含有する雑種２(FIR5)にハ
イブリダイズしない。さらに、それぞれ７pter→q31.3
および7q31.3→qterを含有する雑種JDA 13.1およびＪＤ
Ａ３は、ｐλｇ３についてそれぞれ陰性および陽性であ
り（データは示されていない）、ｐλｇ３を7q31.3→qt
erに位置決定する。逆に、λＭＳ31はFIR5およびJDA 1
3.1にハイブリダイズするが、JDA3にハイブリダイズせ
ず、７pter→ｑ22への帰属を示唆する。この集団化の欠
如は、シンテニック標識(syntenic marker)のいずれか
の対間の有意の連鎖の不存在を示す、大きいCEPHの親類
関係(sibship)における連鎖の分析によって確証され
た。
実施例１に記載するｐλｇ３を包含する、すべての６つ
のクローニングしたミニサテライトの座は常染色体のも
のであり、そして分散している。見い出されたそのうち
２つのミニサテライトのシンテニック対は、いずれも有
意の対の状態連鎖を示さない。この常染色体の位置決定
およびクラスター化の欠如は、ＤＮＡフィンガープリン
トの分離の分析からの前の結果と完全に一致し、これに
より多コアのプローブによって検出される多数の超可変
ＤＮＡ断片は多数の分散した常染色体の座から誘導され
るが、個々の断片の染色体上の位置はＤＮＡフィンガー
プリントから推理できないであろことが示された。
のクローニングしたミニサテライトの座は常染色体のも
のであり、そして分散している。見い出されたそのうち
２つのミニサテライトのシンテニック対は、いずれも有
意の対の状態連鎖を示さない。この常染色体の位置決定
およびクラスター化の欠如は、ＤＮＡフィンガープリン
トの分離の分析からの前の結果と完全に一致し、これに
より多コアのプローブによって検出される多数の超可変
ＤＮＡ断片は多数の分散した常染色体の座から誘導され
るが、個々の断片の染色体上の位置はＤＮＡフィンガー
プリントから推理できないであろことが示された。
これまで位置決定されたクローニングしたミニサテライ
トは、それらがヒトゲノム上に不規則に分散している場
合に期待されるように、より大きいヒト常染色体から誘
導される傾向がある（表１）。正確な領域の位置決定の
不存在で、これらのミニサテライトは、単純配列のサテ
ライトＤＮＡ中に濃縮されている、動原体およびテロマ
ーに優先的に位置するという可能性が残っている。しか
しながら、マウスの組換え近親交配種におけるＤＮＡフ
ィンガープリント断片の分離分析により、ネズミのミニ
サテライトは動原体またはテロマーに優先的に関連づけ
られないことが示され、そしてそれらのヒト相手は同様
に分散されるように思われる。
トは、それらがヒトゲノム上に不規則に分散している場
合に期待されるように、より大きいヒト常染色体から誘
導される傾向がある（表１）。正確な領域の位置決定の
不存在で、これらのミニサテライトは、単純配列のサテ
ライトＤＮＡ中に濃縮されている、動原体およびテロマ
ーに優先的に位置するという可能性が残っている。しか
しながら、マウスの組換え近親交配種におけるＤＮＡフ
ィンガープリント断片の分離分析により、ネズミのミニ
サテライトは動原体またはテロマーに優先的に関連づけ
られないことが示され、そしてそれらのヒト相手は同様
に分散されるように思われる。
実施例３ ミニサテライトプローブの感度および法医学的応用 試験したタンデ４反復ミニサテライトプローブは非常に
感受性であり、それは多分ハイブリダイゼーションプロ
ーブと標的ミニサテライトＤＮＡの両者の反復的性質の
結果であろう。一夜のハイブリダイゼーションの後に得
られたサザンブロットのオートラジオグラフのシグナル
を＞0.1ｎｇ／mlのプローブＤＮＡ濃度に飽和し（デー
タは示されていない）、そしてシグナルは６０ｎｇ以下
のヒトゲノムＤＮＡから得ることができる（第11Ａ図参
照）。同様に、試験した個体の遺伝子型に依存して、こ
れらのプローブは２％以下の１つの個体のＤＮＡと他の
ものとの混合体を検出できる（第11Ｂ図参照）。
感受性であり、それは多分ハイブリダイゼーションプロ
ーブと標的ミニサテライトＤＮＡの両者の反復的性質の
結果であろう。一夜のハイブリダイゼーションの後に得
られたサザンブロットのオートラジオグラフのシグナル
を＞0.1ｎｇ／mlのプローブＤＮＡ濃度に飽和し（デー
タは示されていない）、そしてシグナルは６０ｎｇ以下
のヒトゲノムＤＮＡから得ることができる（第11Ａ図参
照）。同様に、試験した個体の遺伝子型に依存して、こ
れらのプローブは２％以下の１つの個体のＤＮＡと他の
ものとの混合体を検出できる（第11Ｂ図参照）。
これらの座特異的ミニサテライトプローブの感度および
可変性は、それらをとくに法医学において有用とする。
第11Ｃ図は、性的に攻撃されかつ殺された２人の被害者
からの精液種の分析を示し、ここで第２番目の被害者か
らのＤＮＡの回収は、少なくとも0.5μｇＤＮＡ／試験
を必要とする従来のＤＮＡフィンガープリント分析（英
国特許公告第2,166,445号参照）のためには不十分であ
った。
可変性は、それらをとくに法医学において有用とする。
第11Ｃ図は、性的に攻撃されかつ殺された２人の被害者
からの精液種の分析を示し、ここで第２番目の被害者か
らのＤＮＡの回収は、少なくとも0.5μｇＤＮＡ／試験
を必要とする従来のＤＮＡフィンガープリント分析（英
国特許公告第2,166,445号参照）のためには不十分であ
った。
こうして、第１１図は、座特異的プローブの感度の評
価、および二重強姦／殺人の事件の法医学的分析へのそ
れらの応用を示す。第11Ａ図において、ＨｉｎｆＩで消
化したヒトＤＮＡの減少する量を、ＭＳ１からの32Ｐ標
識インサートＤＮＡとハイブリダイズさせた。フィルタ
ーを増強スクリーンの存在下に１週間オートラジオグラ
フにかけた。第11Ｂ図において、減少する量の個体Ａの
ＤＮＡを４μｇの個体ＢのＤＮＡと示した比で混合し、
そして第11Ａ図におけるように、λＭＳ１とサザンブロ
ットハイブリダイズさせた。第11Ｃ図において、被害者
ＸおよびＹは性的に攻撃されかつ殺されていた。容疑者
ＺはＹの殺人罪で告発されており、そして法廷の証拠は
ＸおよびＹの両者が同一個体によって殺されていたこと
を示唆していた。次の法医学的試料からのＤＮＡを分離
し、そして分析した：ａ、モーテム後(post-mortem)２
日目に採取したＸからの髪；ｂ、Ｘの恥骨の毛から回収
した精液と膣液との混合物；ｃ、容疑者Ｚからの新鮮な
血液；ｄ、Ｙからモーテム後１日目に取った心臓の血
液；ｅ、精液、血液および膣液を有するＹからの膣スワ
ブ；ｆ、精子および血液を有するＹのスカートからの汚
れ。試料ａおよびｂは４度℃で３年間貯蔵されており、
試料ｄおよびｅは４℃で２か月貯蔵され、そして試料ｆ
は４℃で乾燥状態で２か月貯蔵されていた。ＤＮＡはGi
ll,Jeffreysおよびwerrett(1985)Nature318、577−57
9、の手順に従って抽出し、ＨｉｎｆＩで消化し、そし
て32Ｐ標識λＭＳ１インサートにサザブロットハイブリ
ダイズさせた。試料ｅ（0.1μｇのＤＮＡ）およびｆ
（0.04μｇのＤＮＡ）を除外して、各試料において0.8
μｇのＤＮＡを分析した。オートラジオグラフィーは増
強スクリーンの存在下に１週間であった。精子種ｂ、ｅ
およびｆの各々は、被害者に帰属しない２つのハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片を含有することに注意すべきであ
る。さらに、試料ｂは膣ＤＮＡから誘導される被害者の
対立遺伝子を含有する。ｂ、ｅおよびｆにおける精液の
対立遺伝子は区別不可能であり、被害者ＸおよびＹが同
一の男性によって性的に攻撃されていたことを示唆して
いる。容疑者Ｚの対立遺伝子は精液種のそれと合致しな
い。
価、および二重強姦／殺人の事件の法医学的分析へのそ
れらの応用を示す。第11Ａ図において、ＨｉｎｆＩで消
化したヒトＤＮＡの減少する量を、ＭＳ１からの32Ｐ標
識インサートＤＮＡとハイブリダイズさせた。フィルタ
ーを増強スクリーンの存在下に１週間オートラジオグラ
フにかけた。第11Ｂ図において、減少する量の個体Ａの
ＤＮＡを４μｇの個体ＢのＤＮＡと示した比で混合し、
そして第11Ａ図におけるように、λＭＳ１とサザンブロ
ットハイブリダイズさせた。第11Ｃ図において、被害者
ＸおよびＹは性的に攻撃されかつ殺されていた。容疑者
ＺはＹの殺人罪で告発されており、そして法廷の証拠は
ＸおよびＹの両者が同一個体によって殺されていたこと
を示唆していた。次の法医学的試料からのＤＮＡを分離
し、そして分析した：ａ、モーテム後(post-mortem)２
日目に採取したＸからの髪；ｂ、Ｘの恥骨の毛から回収
した精液と膣液との混合物；ｃ、容疑者Ｚからの新鮮な
血液；ｄ、Ｙからモーテム後１日目に取った心臓の血
液；ｅ、精液、血液および膣液を有するＹからの膣スワ
ブ；ｆ、精子および血液を有するＹのスカートからの汚
れ。試料ａおよびｂは４度℃で３年間貯蔵されており、
試料ｄおよびｅは４℃で２か月貯蔵され、そして試料ｆ
は４℃で乾燥状態で２か月貯蔵されていた。ＤＮＡはGi
ll,Jeffreysおよびwerrett(1985)Nature318、577−57
9、の手順に従って抽出し、ＨｉｎｆＩで消化し、そし
て32Ｐ標識λＭＳ１インサートにサザブロットハイブリ
ダイズさせた。試料ｅ（0.1μｇのＤＮＡ）およびｆ
（0.04μｇのＤＮＡ）を除外して、各試料において0.8
μｇのＤＮＡを分析した。オートラジオグラフィーは増
強スクリーンの存在下に１週間であった。精子種ｂ、ｅ
およびｆの各々は、被害者に帰属しない２つのハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片を含有することに注意すべきであ
る。さらに、試料ｂは膣ＤＮＡから誘導される被害者の
対立遺伝子を含有する。ｂ、ｅおよびｆにおける精液の
対立遺伝子は区別不可能であり、被害者ＸおよびＹが同
一の男性によって性的に攻撃されていたことを示唆して
いる。容疑者Ｚの対立遺伝子は精液種のそれと合致しな
い。
これらの結果は、λＭＳ31とのハイブリダイゼーション
（データは示されていない）および大量の法医学的材料
のＤＮＡフィンガープリントの分析によって確証され
た。この証拠に照して、容疑者に対して提出された告発
は主席検察官によって取下げられた。
（データは示されていない）および大量の法医学的材料
のＤＮＡフィンガープリントの分析によって確証され
た。この証拠に照して、容疑者に対して提出された告発
は主席検察官によって取下げられた。
実施例４ プールしたミニサテライトプローブ サザンブロットハイブリダイゼーションにおけるこれら
のミニサテライトの感度は、プローブのプールを、第１
０図における５プローブのプール（ｐλｇ３，λＭＳ
１，λＭＳ８，λＭＳ31およびλＭＳ43）について示す
ように、いくつかの座からの可変ＤＮＡ断片の同時検出
のために使用できるようにする。理論的には、５プロー
ブによって検出可能な異なるＤＮＡ断片の数は であり、ここでＨiは第ｉ番目のプローブのヘテロ接合
性である。これらの５プローブについて、平均9.78の断
片が１個体につき検出されるであろう。実際には、8.4
±1.2（標準偏差）帯＞２ｋｂが分割される（４０のラ
ンダムに選択した個体を試験した）。この分割可能な帯
の損失は部分的に小さく（1.6ｋｂ）比較的共通するｐ
λｇ３対立遺伝子の排除のためである（実施例１、平均
損失／個体＝0.33帯）が、主として異なるミニサテライ
トのアレルの電気泳動の同時の移動の結果である。
のミニサテライトの感度は、プローブのプールを、第１
０図における５プローブのプール（ｐλｇ３，λＭＳ
１，λＭＳ８，λＭＳ31およびλＭＳ43）について示す
ように、いくつかの座からの可変ＤＮＡ断片の同時検出
のために使用できるようにする。理論的には、５プロー
ブによって検出可能な異なるＤＮＡ断片の数は であり、ここでＨiは第ｉ番目のプローブのヘテロ接合
性である。これらの５プローブについて、平均9.78の断
片が１個体につき検出されるであろう。実際には、8.4
±1.2（標準偏差）帯＞２ｋｂが分割される（４０のラ
ンダムに選択した個体を試験した）。この分割可能な帯
の損失は部分的に小さく（1.6ｋｂ）比較的共通するｐ
λｇ３対立遺伝子の排除のためである（実施例１、平均
損失／個体＝0.33帯）が、主として異なるミニサテライ
トのアレルの電気泳動の同時の移動の結果である。
多座サザンブロットパターンは高度に個体特異的であ
り、ＤＮＡ断片のわずかに１８％（標準偏差±１１％）
が不規則に選択した北ヨーロッパ人の対（４０対を試験
した）間で共有される。同胞（ｓｉｂ）について、断片
の共有レベルは、期待されるように、−５７％に上昇す
る（１０の同胞対を試験した）。
り、ＤＮＡ断片のわずかに１８％（標準偏差±１１％）
が不規則に選択した北ヨーロッパ人の対（４０対を試験
した）間で共有される。同胞（ｓｉｂ）について、断片
の共有レベルは、期待されるように、−５７％に上昇す
る（１０の同胞対を試験した）。
父／母／子供のトリオについて、すべての子孫の断片は
親に追跡して戻ることができる（第１２図）。各子孫は
父性起源に特異的である３±0.5（標準偏差）ＤＮＡ断
片と、等しい数の母性特異的ＤＮＡ断片を含有する（１
０の父／母／子供のトリオ）。
親に追跡して戻ることができる（第１２図）。各子孫は
父性起源に特異的である３±0.5（標準偏差）ＤＮＡ断
片と、等しい数の母性特異的ＤＮＡ断片を含有する（１
０の父／母／子供のトリオ）。
こうして上に示すように、第１２図はプールしたミニサ
テライトプローブとのハイブリダイゼーションによる、
ヒトＤＮＡ中の多数の超可変座の検出を示す。英国人の
不規則の選択（１〜６）、同胞の対（７，８および９，
10）および父／母／子供の家族の群(11,12,13および14,
15,16)からの４μｇのＤＮＡの試料を、ＨｉｎｆＩで消
化し、そして２ｋｂより小さいすべの断片がゲルから電
気泳動してしまうまで、0.8％のアガロースゲルの電気
泳動にかけた。消化物をｐλｇ３，λＭＳ31，λＭＳ
８，λＭＳ31およびλＭＳ43の各々からの２ｎｇのイン
サートＤＮＡとサザンブロットハイブリダイズさせた；
インサートはプールした後、ランダムオリゴヌクレオチ
ドのプライミングによって32Ｐで標識した。帯の標識強
度の変動は、個々のプローブの標識付けおよび交雑の効
率の変動性から多分生ずる。
テライトプローブとのハイブリダイゼーションによる、
ヒトＤＮＡ中の多数の超可変座の検出を示す。英国人の
不規則の選択（１〜６）、同胞の対（７，８および９，
10）および父／母／子供の家族の群(11,12,13および14,
15,16)からの４μｇのＤＮＡの試料を、ＨｉｎｆＩで消
化し、そして２ｋｂより小さいすべの断片がゲルから電
気泳動してしまうまで、0.8％のアガロースゲルの電気
泳動にかけた。消化物をｐλｇ３，λＭＳ31，λＭＳ
８，λＭＳ31およびλＭＳ43の各々からの２ｎｇのイン
サートＤＮＡとサザンブロットハイブリダイズさせた；
インサートはプールした後、ランダムオリゴヌクレオチ
ドのプライミングによって32Ｐで標識した。帯の標識強
度の変動は、個々のプローブの標識付けおよび交雑の効
率の変動性から多分生ずる。
第１Ａ図は、ＤＮＡフィンガープリントからの特定の超
可変ＤＮＡのゲル電気泳動による精製を示し、断片は
「断片ｇ」と表示されている。 第１Ｂ図は、クローン化ＤＮＡの制限地図によるＤＮＡ
断片の構成を示す。 第２図は、とくにコンセンサス反復配列および英国特許
公告第2,166,445号の「コア」配列とのその整列を目立
たせた、超可変断片ｇのＤＮＡ配列を示す。 第３図は、ｐλｇ３によって検出される多形性ＤＮＡ断
片のメンデル遺伝を示す。 第４図は、ｐλｇ３へのハイブリダイゼーションによっ
て検出されるミニサテライトの対立遺伝子の大きさの分
布を示す。 第５図は、座特異的超可変ＤＮＡプローブについてのλ
ＭＳ組換え体のスクリーニングを示す。 第６図は、ミニサテライトのλＭＳ系列およびｐλｇ３
ミニサテライトのコンセンサス反復配列の単位を示す。 第７図は、ここでλＭＳ322と表示するプローブによっ
て検出される、超可変座のメンデル遺伝子を示す。 第８図は、ここでλＭＳ43と表示するプローブによって
検出される、超可変座における対立遺伝子の変動の推定
を示す。 第９図は、ヒトＤＮＡのプール中の超可変座における対
立遺伝子長さの変動の分析を示す。 第１０図は、ＡｌｕＩで消化したヒト−げっし類の体細
胞の雑種ＤＮＡのパネルにおける、ここでλＭＳ32と表
示するプローブによって検出される超可変座の分離を示
す。 第１１図は、座特異的超可変プローブの感度の評価、お
よび二重の強姦／殺人の場合における法医学における前
記プローブの応用を示す。 第１２図は、本発明のプールしたミニサテライトプロー
ブとのハイブリダイゼーションによる、ヒトＤＮＡ中の
多数の超可変座の検出を示す。
可変ＤＮＡのゲル電気泳動による精製を示し、断片は
「断片ｇ」と表示されている。 第１Ｂ図は、クローン化ＤＮＡの制限地図によるＤＮＡ
断片の構成を示す。 第２図は、とくにコンセンサス反復配列および英国特許
公告第2,166,445号の「コア」配列とのその整列を目立
たせた、超可変断片ｇのＤＮＡ配列を示す。 第３図は、ｐλｇ３によって検出される多形性ＤＮＡ断
片のメンデル遺伝を示す。 第４図は、ｐλｇ３へのハイブリダイゼーションによっ
て検出されるミニサテライトの対立遺伝子の大きさの分
布を示す。 第５図は、座特異的超可変ＤＮＡプローブについてのλ
ＭＳ組換え体のスクリーニングを示す。 第６図は、ミニサテライトのλＭＳ系列およびｐλｇ３
ミニサテライトのコンセンサス反復配列の単位を示す。 第７図は、ここでλＭＳ322と表示するプローブによっ
て検出される、超可変座のメンデル遺伝子を示す。 第８図は、ここでλＭＳ43と表示するプローブによって
検出される、超可変座における対立遺伝子の変動の推定
を示す。 第９図は、ヒトＤＮＡのプール中の超可変座における対
立遺伝子長さの変動の分析を示す。 第１０図は、ＡｌｕＩで消化したヒト−げっし類の体細
胞の雑種ＤＮＡのパネルにおける、ここでλＭＳ32と表
示するプローブによって検出される超可変座の分離を示
す。 第１１図は、座特異的超可変プローブの感度の評価、お
よび二重の強姦／殺人の場合における法医学における前
記プローブの応用を示す。 第１２図は、本発明のプールしたミニサテライトプロー
ブとのハイブリダイゼーションによる、ヒトＤＮＡ中の
多数の超可変座の検出を示す。
Claims (12)
- 【請求項１】１又は複数の対照と関連付けることにより
ゲノムDNAの試験試料を特性決定する方法であって、タ
ンデム配列に対応する配列を有意な程度に開裂させない
１又は複数の制限酵素により試料DNAを断片化し、単一
のミニサテライト領域又は超可変遺伝子座について特異
的でありそして前記単一のミニサテライト領域又は超可
変遺伝子座からのミニサテライトを含有する対応するDN
A断片とハイブリダイズすることができる程度に該単一
のミニサテライト領域又は超可変遺伝子座に対して相同
性であるヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチ
ド又はポリヌクレオチドプローブにより前記DNA断片を
検索し、DNAのハイブリダイズした断片を検出し、そし
て該ハイブリダイズした断片を前記１又は複数の対照と
比較することを含んで成り； 前記単一のミニサテライト領域又は超可変遺伝子座が次
の配列： （式中、ＹはＣ，Ｔ又はＵであり、ＸはＧ又はＣであ
り、ＲはＡ又はＧであり、そしてＴはＴ又はＵである）
から選択されたいずれか１個の配列もしくはそのタンデ
ム反復又はこれらに対して相補的な配列を含んで成るポ
リヌクレオチドプローブにより特異的に同定され得るも
のである、ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記配列が式４〜９のいずれか１つから選
択されたものである、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項３】前記ヌクレオチド配列が、式４〜９から選
択されたいずれか１つの配列もしくはそのタンデム反復
（タンデムに反復するすべての配列間で70％以上の相同
性が存在する）又はこれらに相補的な配列を含んで成
る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】前記ヌクレオチド配列が、前記DNA断片の
ミニサテライトとハイブリダイズできる程度にそれに対
して相同性である、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項５】タンデムに反復するすべての配列間に平均
80％以上の相同性が存在する、特許請求の範囲第１項に
記載の方法。 - 【請求項６】タンデムに反復するすべての配列間に平均
90％の相同性が存在する、特許請求の範囲第１項に記載
の方法。 - 【請求項７】前記タンデムに反復する配列が正確に反復
している、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項８】前記試料DNAがヒトDNAである、特許請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項９】試験試料提供者と１又は複数の対照試料提
供者との同異を確定するために、該対照試料を同様に断
片化し、そして各試料からのハイブリダイズした断片の
比較を行う、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１０】試験試料提供者と１又は複数の対照試料
提供者との間の家族関連を確定するために、対照試料を
同様に断片化し、そして各試料からのハイブリダイズし
た断片の比較を行う、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項１１】探索を少なくとも２種類のポリヌクレオ
チドプローブを用いて一連の複数の試験により又は該複
数のプローブの混合物を用いて１回の試験により行う、
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１２】前記ポリヌクレオチドプローブがｐλg
3，λMS1，λMS8，λMS31，λMS32又はλMS43のいずれ
か１種を含んで成る、特許請求の範囲第１項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB868606719A GB8606719D0 (en) | 1986-03-19 | 1986-03-19 | Genetic probes |
| GB8606719 | 1986-03-29 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4129750A Division JPH05276948A (ja) | 1986-03-19 | 1992-04-24 | 遺伝的特性決定用ポリヌクレオチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62282600A JPS62282600A (ja) | 1987-12-08 |
| JPH0630636B2 true JPH0630636B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=10594846
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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