JPH0630779A - チトクロムＰ４５０ｃと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法 - Google Patents
チトクロムＰ４５０ｃと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法Info
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- JPH0630779A JPH0630779A JP4183613A JP18361392A JPH0630779A JP H0630779 A JPH0630779 A JP H0630779A JP 4183613 A JP4183613 A JP 4183613A JP 18361392 A JP18361392 A JP 18361392A JP H0630779 A JPH0630779 A JP H0630779A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】酸化活性が上昇した効率的な酸化酵素を提供す
る。 【構成】チトクロムＰ４５０の有する１原子酸素添加活
性およびそれに必要なＮＡＤＰＨからの還元力供給能力
を同一分子内に有する融合酸化酵素をコードする遺伝
子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミド、該発現プラ
スミドにより形質転換された酵母菌株及び該酵素で発現
される組換酸化酵素 【効果】本発明の新規融合酵素発現株の菌体当たりの活
性は、Ｐ４５０ｃとラット還元酵素を用いた融合酵素発
現株の約１５倍に上昇しており、本発明の融合酵素ある
いは融合酵素発現菌株は、バイオリアクターとしての有
用性がきわめて高いものであり、アセトアミノフェノン
を合成する際のバイオリアクターとして有用なものであ
る。
る。 【構成】チトクロムＰ４５０の有する１原子酸素添加活
性およびそれに必要なＮＡＤＰＨからの還元力供給能力
を同一分子内に有する融合酸化酵素をコードする遺伝
子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミド、該発現プラ
スミドにより形質転換された酵母菌株及び該酵素で発現
される組換酸化酵素 【効果】本発明の新規融合酵素発現株の菌体当たりの活
性は、Ｐ４５０ｃとラット還元酵素を用いた融合酵素発
現株の約１５倍に上昇しており、本発明の融合酵素ある
いは融合酵素発現菌株は、バイオリアクターとしての有
用性がきわめて高いものであり、アセトアミノフェノン
を合成する際のバイオリアクターとして有用なものであ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はチトクロムＰ４５０( 以
下Ｐ４５０と称する) の有する１原子酸素添加活性およ
びそれに必要なＮＡＤＰＨからの還元力供給能力を同一
分子内に有する新規な融合酸化酵素、該酸化酵素をコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミド、
該発現プラスミドにより形質転換された酵母菌株および
該融合酵素を用いることを特徴とするアセトアミノフェ
ンの製造方法に関する。
下Ｐ４５０と称する) の有する１原子酸素添加活性およ
びそれに必要なＮＡＤＰＨからの還元力供給能力を同一
分子内に有する新規な融合酸化酵素、該酸化酵素をコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含む酵母内発現プラスミド、
該発現プラスミドにより形質転換された酵母菌株および
該融合酵素を用いることを特徴とするアセトアミノフェ
ンの製造方法に関する。
【０００２】本発明により得られるプラスミドにより形
質転換された酵母菌体はＰ４５０と還元酵素から成る融
合酵素を生産し、これに由来する一原子酸素添加活性を
有しており、この菌体自身、あるいは、菌体から取得し
た融合酵素を医薬品として有用であるアセトアミノフェ
ンの合成のためのバイオリアクターとして用いることが
できる。
質転換された酵母菌体はＰ４５０と還元酵素から成る融
合酵素を生産し、これに由来する一原子酸素添加活性を
有しており、この菌体自身、あるいは、菌体から取得し
た融合酵素を医薬品として有用であるアセトアミノフェ
ンの合成のためのバイオリアクターとして用いることが
できる。
【０００３】
【従来の技術】Ｐ４５０は微生物から哺乳動物にいたる
まで広く生物界に存在するヘム蛋白質であり、広範囲の
脂溶性化合物を基質として、１原子酸素添加反応を触媒
する。Ｐ４５０の示すこうした広範囲な基質特異性はＰ
４５０の分子多様性に起因する。Ｐ４５０には多数の分
子種が存在しているが、各々のＰ４５０に電子を供給す
る系路は共通でありミクロソームでは主として、フラビ
ンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチド
を分子内に補酵素として含有する還元酵素がＮＡＤＰＨ
からの電子を基質を結合したP450へ供給する。従って、
Ｐ４５０は基質と結合し、還元酵素と共役することによ
りはじめて１原子酸素添加反応を発揮する。
まで広く生物界に存在するヘム蛋白質であり、広範囲の
脂溶性化合物を基質として、１原子酸素添加反応を触媒
する。Ｐ４５０の示すこうした広範囲な基質特異性はＰ
４５０の分子多様性に起因する。Ｐ４５０には多数の分
子種が存在しているが、各々のＰ４５０に電子を供給す
る系路は共通でありミクロソームでは主として、フラビ
ンアデニンジヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチド
を分子内に補酵素として含有する還元酵素がＮＡＤＰＨ
からの電子を基質を結合したP450へ供給する。従って、
Ｐ４５０は基質と結合し、還元酵素と共役することによ
りはじめて１原子酸素添加反応を発揮する。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、ラット
Ｐ４５０とラットＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素との融
合酵素を酵母において発現させることに成功しているが
菌体あたりの活性を上昇させることが望まれた。
Ｐ４５０とラットＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素との融
合酵素を酵母において発現させることに成功しているが
菌体あたりの活性を上昇させることが望まれた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、活性が高
い酵母を得ることを目的として誠意検討した結果、Ｎ末
端側にＰ４５０c を、Ｃ末端側に酵母還元酵素を有する
融合酵素を酵母内で発現させた場合、酵母還元酵素を用
いた融合酵素の酵母内発現量は、ラット還元酵素を用い
た場合の約３倍に上昇し、また、融合酵素分子当たりの
活性はラット還元酵素よりも、酵母還元酵素を用いた場
合の方が約５倍高くなることを発見した。本融合酵素
は、融合酵素分子内での電子伝達効率が非常に高いと考
えられる。発現量の上昇および、分子当たりの活性の上
昇により、本発明の新規融合酵素発現株の菌体当りの活
性はラット還元酵素を用いた融合酵素発現株の約１５倍
に上昇しており、本発明の融合酵素及び該酵素発現酵母
株は、バイオリアクターとして極めて有用なものであ
る。
い酵母を得ることを目的として誠意検討した結果、Ｎ末
端側にＰ４５０c を、Ｃ末端側に酵母還元酵素を有する
融合酵素を酵母内で発現させた場合、酵母還元酵素を用
いた融合酵素の酵母内発現量は、ラット還元酵素を用い
た場合の約３倍に上昇し、また、融合酵素分子当たりの
活性はラット還元酵素よりも、酵母還元酵素を用いた場
合の方が約５倍高くなることを発見した。本融合酵素
は、融合酵素分子内での電子伝達効率が非常に高いと考
えられる。発現量の上昇および、分子当たりの活性の上
昇により、本発明の新規融合酵素発現株の菌体当りの活
性はラット還元酵素を用いた融合酵素発現株の約１５倍
に上昇しており、本発明の融合酵素及び該酵素発現酵母
株は、バイオリアクターとして極めて有用なものであ
る。
【０００６】本発明の融合酵素遺伝子は、ミクロソーム
型タンパクのミクロソーム膜結合に関与する領域と、Ｐ
４５０ｃの少なくとも基質結合に関与する領域及びヘム
結合に関与する領域をコードするＤＮＡと、酵母還元酵
素の少なくともフラビンモノヌクレオチドやフラビンア
デニンジヌクレオチド結合に関与する領域とＮＡＤＰＨ
結合に関与する領域をコードするＤＮＡを接続すること
により構築することができる。
型タンパクのミクロソーム膜結合に関与する領域と、Ｐ
４５０ｃの少なくとも基質結合に関与する領域及びヘム
結合に関与する領域をコードするＤＮＡと、酵母還元酵
素の少なくともフラビンモノヌクレオチドやフラビンア
デニンジヌクレオチド結合に関与する領域とＮＡＤＰＨ
結合に関与する領域をコードするＤＮＡを接続すること
により構築することができる。
【０００７】例えば、本発明の融合酵素遺伝子はラット
肝チトクロムＰ４５０c 遺伝子の３’末端側に酵母還元
酵素遺伝子を接続することによって製造することがで
き、本遺伝子の発現によって製造される融合酸化酵素
は、Ｐ４５０c の有する１原子酸素添加活性およびＮＡ
ＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の有するＮＡＤＰＨからの還
元力供給能を同一分子内に併せ持った酸化酸素である。
肝チトクロムＰ４５０c 遺伝子の３’末端側に酵母還元
酵素遺伝子を接続することによって製造することがで
き、本遺伝子の発現によって製造される融合酸化酵素
は、Ｐ４５０c の有する１原子酸素添加活性およびＮＡ
ＤＰＨ−Ｐ４５０還元酵素の有するＮＡＤＰＨからの還
元力供給能を同一分子内に併せ持った酸化酸素である。
【０００８】上述のミクロソーム結合に関与する領域
は、ラット肝Ｐ４５０c あるいは酵母還元酵素由来のも
のの他、他のミクロソーム型Ｐ４５０やミクロソーム型
タンパクのＮ末端領域等のミクロソーム結合能を有する
ものを用いることができる。Ｐ４５０ｃのミクロソ−ム
膜への結合並びに基質の結合およびヘム結合に関与する
領域は、それぞれ、Ｎ末端部分、中央部分およびＣ末端
側のホモロガス・リージョン−２（ＨＲ２）(J.Bioche
m.93,807-817)領域であることがすでに報告されてお
り、本発明ではこれらの領域或いはその機能の必須部分
を用いることができる。
は、ラット肝Ｐ４５０c あるいは酵母還元酵素由来のも
のの他、他のミクロソーム型Ｐ４５０やミクロソーム型
タンパクのＮ末端領域等のミクロソーム結合能を有する
ものを用いることができる。Ｐ４５０ｃのミクロソ−ム
膜への結合並びに基質の結合およびヘム結合に関与する
領域は、それぞれ、Ｎ末端部分、中央部分およびＣ末端
側のホモロガス・リージョン−２（ＨＲ２）(J.Bioche
m.93,807-817)領域であることがすでに報告されてお
り、本発明ではこれらの領域或いはその機能の必須部分
を用いることができる。
【０００９】酵母還元酵素のミクロソ−ム膜への結合、
フラビンモノヌクレオチドやフラビンアデニンジヌクレ
オチド結合およびＮＡＤＰＨ結合に関与する領域はアミ
ノ末端メチオニンを１番とするとそれぞれ１から５０番
目まで、５０から４６５番目まで、および４６５から６
００番目までのアミノ酸であるとされており、これらの
領域或いはその必須領域を用いることができる。
フラビンモノヌクレオチドやフラビンアデニンジヌクレ
オチド結合およびＮＡＤＰＨ結合に関与する領域はアミ
ノ末端メチオニンを１番とするとそれぞれ１から５０番
目まで、５０から４６５番目まで、および４６５から６
００番目までのアミノ酸であるとされており、これらの
領域或いはその必須領域を用いることができる。
【００１０】融合酵素として単一の分子で発現させるた
め、Ｐ４５０ｃ遺伝子は翻訳停止コドンに相当する部位
を含まないようにする。また、両遺伝子の上述の領域を
直接、あるいはリンカーを介して両遺伝子のフレームが
ずれないように接続することにより構築できる。発現プ
ラスミド構築に用いたＰ４５０ｃおよび還元酵素のコー
ディング領域に相当するｃＤＮＡは、本発明の技術分野
において用いられる常法により製造することができる。
例えば、Ｐ４５０ｃについて言えば、このｃＤＮＡを含
むプラスミドpAMP19(特開63-44888）から、また、還元
酵素遺伝子についてはpgCYR(特願62−325527) から常用
によって取り出すことができる。
め、Ｐ４５０ｃ遺伝子は翻訳停止コドンに相当する部位
を含まないようにする。また、両遺伝子の上述の領域を
直接、あるいはリンカーを介して両遺伝子のフレームが
ずれないように接続することにより構築できる。発現プ
ラスミド構築に用いたＰ４５０ｃおよび還元酵素のコー
ディング領域に相当するｃＤＮＡは、本発明の技術分野
において用いられる常法により製造することができる。
例えば、Ｐ４５０ｃについて言えば、このｃＤＮＡを含
むプラスミドpAMP19(特開63-44888）から、また、還元
酵素遺伝子についてはpgCYR(特願62−325527) から常用
によって取り出すことができる。
【００１１】本発明の融合酵素を発現する酵母発現ベク
ターは上述の通り構築した融合酵素遺伝子を適当な発現
ベクターのクローニング部位に常法により挿入すること
によって構築することができる。酵母発現ベクターとし
ては、例えば酵母アルコール脱水素酵素(ADH1)遺伝子の
プロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵母発
現ベクターpAAH5(Washington Research Fundation から
入手可能, Methods in Enzymology, 101 part C 、p192
-201, Ammerer らの方法により製造できる）などを挙げ
ることができるが PGKプロモーター, G3PDH プロモータ
ー、GAL10 プロモーターを有する発現ベクターなど、宿
主酵母内で効率より機能するプロモーター、ターミネー
ターを有するものであればよく、特に限定されるもので
はない。また、発現ベクターの構造も特に限定されるも
のでなく、酵母内で安定に保持されるものであればよ
い。
ターは上述の通り構築した融合酵素遺伝子を適当な発現
ベクターのクローニング部位に常法により挿入すること
によって構築することができる。酵母発現ベクターとし
ては、例えば酵母アルコール脱水素酵素(ADH1)遺伝子の
プロモーターおよび同ターミネーターを保持する酵母発
現ベクターpAAH5(Washington Research Fundation から
入手可能, Methods in Enzymology, 101 part C 、p192
-201, Ammerer らの方法により製造できる）などを挙げ
ることができるが PGKプロモーター, G3PDH プロモータ
ー、GAL10 プロモーターを有する発現ベクターなど、宿
主酵母内で効率より機能するプロモーター、ターミネー
ターを有するものであればよく、特に限定されるもので
はない。また、発現ベクターの構造も特に限定されるも
のでなく、酵母内で安定に保持されるものであればよ
い。
【００１２】本発明の融合酵素の発現に使用する宿主と
なる酵母は、特に限定されるものではなく、例えば、サ
ッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンデイダ属
に属する酵母などを使用できるが、サッカロミセス・セ
レビシェAH22株、サッカロミセス・セレビシェSHY3株や
サッカロミセス・セレビシェNA87-11A株などが宿主とし
て好都合に使用できる。
なる酵母は、特に限定されるものではなく、例えば、サ
ッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、カンデイダ属
に属する酵母などを使用できるが、サッカロミセス・セ
レビシェAH22株、サッカロミセス・セレビシェSHY3株や
サッカロミセス・セレビシェNA87-11A株などが宿主とし
て好都合に使用できる。
【００１３】これら宿主の上記融合酵素遺伝子を含む発
現プラスミドによる形質転換はアルカリ金属(LiCl)を用
いる方法、プロトプラスト法など公知の方法により行な
うことができる。アルカリ金属(LiCl)を用いる方法の場
合、宿主菌体をYPD 培地で培養、集菌し、これをLiclで
洗浄した後、Liclとポリエチレングルコール4000の溶液
にけん濁する。このけん濁液に試料DNA 溶液を加え、1
時間程度静置すればよい。この操作により形質転換酵母
を適当な選択培地平板上で取得することができる。
現プラスミドによる形質転換はアルカリ金属(LiCl)を用
いる方法、プロトプラスト法など公知の方法により行な
うことができる。アルカリ金属(LiCl)を用いる方法の場
合、宿主菌体をYPD 培地で培養、集菌し、これをLiclで
洗浄した後、Liclとポリエチレングルコール4000の溶液
にけん濁する。このけん濁液に試料DNA 溶液を加え、1
時間程度静置すればよい。この操作により形質転換酵母
を適当な選択培地平板上で取得することができる。
【００１４】プロトプラスト法の場合には、YPD 培地で
培養した宿主酵母を集菌し、ソルビトールなどを含む等
調液中で、チモリアーゼなどの細胞壁溶解酵素処理を行
う。これにより、プロトプラスト化した酵母が得られ
る。プロトプラスト溶液に試料DNA とポリエチエングリ
コール溶液を添加し、保温することにより形質転換が可
能である。形質転換体は選択培地平板上にプロトプラス
トけん濁液を重層したのち、30°C で5-7 時間培養する
ことにより得ることができる。
培養した宿主酵母を集菌し、ソルビトールなどを含む等
調液中で、チモリアーゼなどの細胞壁溶解酵素処理を行
う。これにより、プロトプラスト化した酵母が得られ
る。プロトプラスト溶液に試料DNA とポリエチエングリ
コール溶液を添加し、保温することにより形質転換が可
能である。形質転換体は選択培地平板上にプロトプラス
トけん濁液を重層したのち、30°C で5-7 時間培養する
ことにより得ることができる。
【００１５】このようにして得られた形質転換酵母を培
養することにより本発明の融合酵素を製造することがで
きる。本発明により得られる形質転換酵母の培養は通常
の培養方法により行なうことができる。培地としては酵
母の生育が可能な組成であればよいが、プロトプラスト
の脱落を防ぐために、選択圧を加える必要がある。例え
ば、宿主細胞が特定のアミノ酸を要求する変移株で、プ
ラスミド上にマーカーとしてそのアミノ酸要求性を相補
する遺伝子を含む場合は、そのアミノ酸を含まない最小
培地で形質転換酵母を培養することにより、プラスミド
の脱落を防ぎ、目的遺伝子を発現させることができる。
養することにより本発明の融合酵素を製造することがで
きる。本発明により得られる形質転換酵母の培養は通常
の培養方法により行なうことができる。培地としては酵
母の生育が可能な組成であればよいが、プロトプラスト
の脱落を防ぐために、選択圧を加える必要がある。例え
ば、宿主細胞が特定のアミノ酸を要求する変移株で、プ
ラスミド上にマーカーとしてそのアミノ酸要求性を相補
する遺伝子を含む場合は、そのアミノ酸を含まない最小
培地で形質転換酵母を培養することにより、プラスミド
の脱落を防ぎ、目的遺伝子を発現させることができる。
【００１６】本発明の融合酵素或いは融合酵素遺伝子を
発現する本発明の酵母菌株は、アセトアミノフェノンを
合成する際のバイオリアクターとして使用される。形質
転換酵母培養液あるいは形質転換酵母から調製したミク
ロソーム画分、または、精製した融合酸化酵素にアセト
アニリドを終濃度２５ｍＭになるように添加し、一定時
間３０°Ｃでインキュベートしたのち、生成物を、例え
ばＨＰＬＣで、分離することによりアセトアニリドのｐ
位水酸化体であるアセトアミノフェノンを得ることがで
きる。ミクロソーム画分を用いる場合、反応系にＮＡＤ
ＰＨあるいはＮＡＤＰＨ再生系を添加することが必要で
ある。
発現する本発明の酵母菌株は、アセトアミノフェノンを
合成する際のバイオリアクターとして使用される。形質
転換酵母培養液あるいは形質転換酵母から調製したミク
ロソーム画分、または、精製した融合酸化酵素にアセト
アニリドを終濃度２５ｍＭになるように添加し、一定時
間３０°Ｃでインキュベートしたのち、生成物を、例え
ばＨＰＬＣで、分離することによりアセトアニリドのｐ
位水酸化体であるアセトアミノフェノンを得ることがで
きる。ミクロソーム画分を用いる場合、反応系にＮＡＤ
ＰＨあるいはＮＡＤＰＨ再生系を添加することが必要で
ある。
【００１７】
【発明の効果】本発明の新規融合酵素発現株の菌体当た
りの活性は、Ｐ４５０ｃとラット還元酵素を用いた融合
酵素発現株の約１５倍に上昇しており、本発明の融合酵
素あるいは融合酵素発現菌株は、バイオリアクターとし
ての有用性がきわめて高いものであり、アセトアミノフ
ェノンを合成する際のバイオリアクターとして有用なも
のである。
りの活性は、Ｐ４５０ｃとラット還元酵素を用いた融合
酵素発現株の約１５倍に上昇しており、本発明の融合酵
素あるいは融合酵素発現菌株は、バイオリアクターとし
ての有用性がきわめて高いものであり、アセトアミノフ
ェノンを合成する際のバイオリアクターとして有用なも
のである。
【００１８】以下、実施例に基づき、本発明を詳細に説
明するが、本発明は実施例に限られるものではなく、通
常、本発明分野で行われている程度の変更を含むもので
ある。 実施例１ 発現プラスミドpAFCR1の構築 ラットＰ４５０ｃのｃＤＮＡを含むpAMP19（特開63-448
88) を制限酵素HindIIIおよびXhoIで同時消化して、約
1.6kb のDNA断片を得た。一方、酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４
５０還元酵素を含むpBYR717(H)( 特開2-451)をPvuII で
消化し、これに化１のXhoIリンカー
明するが、本発明は実施例に限られるものではなく、通
常、本発明分野で行われている程度の変更を含むもので
ある。 実施例１ 発現プラスミドpAFCR1の構築 ラットＰ４５０ｃのｃＤＮＡを含むpAMP19（特開63-448
88) を制限酵素HindIIIおよびXhoIで同時消化して、約
1.6kb のDNA断片を得た。一方、酵母ＮＡＤＰＨ−Ｐ４
５０還元酵素を含むpBYR717(H)( 特開2-451)をPvuII で
消化し、これに化１のXhoIリンカー
【化１】 配列番号 １ を挿入し、PvuII 部位をXhoI部位に変えた後、XhoIとHi
ndIII で同時消化し、約2.1kb の断片を得た。これら両
断片をベクターpAAH5 のHindIII 部位へ同時に挿入する
ことによりプラスミドpAFCR1を得た。
ndIII で同時消化し、約2.1kb の断片を得た。これら両
断片をベクターpAAH5 のHindIII 部位へ同時に挿入する
ことによりプラスミドpAFCR1を得た。
【００１９】実施例２ プラスミドpAFCR1による酵母の形質転換 ＹＰＤ培地（1% 酵母エキス、2% ポリペプトン、2%グ
ルコース）にサッカロミセス・セレビシェーAH22株を植
菌し、３０℃で振盪し、５×１０7 ／ｍｌ菌体になった
時点で遠心分離により集菌した。１mlの培養液から得ら
れた菌体を1.0ml の0.2M LiCl 溶液に懸濁した後、再度
遠心分離し、得られたペレットに20μlの1M LiCl 溶
液、30μl の70% ポリエチレングリコール4000溶液、約
1.0 μg のpAFCR1を含む10μl の溶液を添加した。十分
に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さら
に140 μl の滅菌水を加えて撹拌した。この溶液をＳＤ
合成培地プレート（2.0% グルコース、0.67% 窒素源ア
ミノ酸不含、20μg/mlヒスチジン、2.0%寒天）上にま
き、３０℃で３日間インキュベートし、プラスミド pAF
CR1 を保有する形質転換株AH22/pAFCR1 を得た。
ルコース）にサッカロミセス・セレビシェーAH22株を植
菌し、３０℃で振盪し、５×１０7 ／ｍｌ菌体になった
時点で遠心分離により集菌した。１mlの培養液から得ら
れた菌体を1.0ml の0.2M LiCl 溶液に懸濁した後、再度
遠心分離し、得られたペレットに20μlの1M LiCl 溶
液、30μl の70% ポリエチレングリコール4000溶液、約
1.0 μg のpAFCR1を含む10μl の溶液を添加した。十分
に混合した後、３０℃で１時間インキュベートし、さら
に140 μl の滅菌水を加えて撹拌した。この溶液をＳＤ
合成培地プレート（2.0% グルコース、0.67% 窒素源ア
ミノ酸不含、20μg/mlヒスチジン、2.0%寒天）上にま
き、３０℃で３日間インキュベートし、プラスミド pAF
CR1 を保有する形質転換株AH22/pAFCR1 を得た。
【００２０】実施例３ AH22/pAFCR1 株における融合酵素の定量 8%グルコース、5.4%窒素源アミノ酸不含、160 μg/mlヒ
スチジンを含む培地でAH22/pAFCR1 およびコントロール
AH22/pAAH5株を各々２×１０7cells/ml まで培養した。
各培養液0.9ml に0.1ml の 2N NaOH-8% 2-メルカプトエ
タノール水溶液を添加し０℃で１０分間インキュベート
した。さらに、0.2ml の30% トリクロロ酢酸水溶液を添
加し、０℃で１０分間インキュベートした後遠心分離し
た（10,000×ｇ、５分）。得られたペレットを1ml アセ
トンで洗浄した後乾燥し、緩衝液〔1% SDS、 50mM Tris-
HCl(pH 8)、 10% 2- メルカプトエタノール、 40% グリセ
ロール、0.02％ブロモフェノールブルー〕50μl を添加
して可溶化した。さらに、これを10% ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中の蛋白質を緩衝液
〔25mM Tris 、192mM グリシン、20% メタノール〕中で
電気泳動的にニトロセルロースフィルター上にブロット
した。
スチジンを含む培地でAH22/pAFCR1 およびコントロール
AH22/pAAH5株を各々２×１０7cells/ml まで培養した。
各培養液0.9ml に0.1ml の 2N NaOH-8% 2-メルカプトエ
タノール水溶液を添加し０℃で１０分間インキュベート
した。さらに、0.2ml の30% トリクロロ酢酸水溶液を添
加し、０℃で１０分間インキュベートした後遠心分離し
た（10,000×ｇ、５分）。得られたペレットを1ml アセ
トンで洗浄した後乾燥し、緩衝液〔1% SDS、 50mM Tris-
HCl(pH 8)、 10% 2- メルカプトエタノール、 40% グリセ
ロール、0.02％ブロモフェノールブルー〕50μl を添加
して可溶化した。さらに、これを10% ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中の蛋白質を緩衝液
〔25mM Tris 、192mM グリシン、20% メタノール〕中で
電気泳動的にニトロセルロースフィルター上にブロット
した。
【００２１】次に、フィルターをＴＢＳ緩衝液〔50mM T
ris-HCl (pH7.5)、 200mM NaCl 〕に浸した後、3%ゼラチ
ン、0.05% Tween20を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で４
０分インキュベートし、さらに30μgの抗−酵母還元酵
素抗体、1%ゼラチン、0.05% Tween20 を含むＴＢＳ緩衝
液中で３７℃で２時間インキュベートした。その後、0.
05% Tween20 を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で３０分イ
ンキュベートする操作を４回繰り返した後、3%ゼラチ
ン、0.05% Tween20 を含む、ＴＢＳ緩衝液中で２０分間
インキュベートした。次に10μCiの〔125I〕−Protein
Ａ、1%ゼラチン、0.05% Tween20 を含むＴＢＳ緩衝液中
３７℃で６０分インキュベートした後、0.05% Tween20
を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で３０分インキュベート
する操作を４回繰り返した。フィルターを風乾した後、
オートラジオグラフィーを行なった。AH22/ pAAH5株に
酵母還元酵素を50ngあるいは100ng添加したサンプルに
おける酵母還元酵素のバンドの黒化濃度と、AH22/pAFCR
1株における融合酵素のバンドの黒化濃度の比較から、A
H22/pAFCR1 株における融合酵素の発現量は約２×１０ 5
分子／菌体と推定された。これは、ラットP450cとラッ
ト還元酵素との融合酵素発現株における融合酵素発現量
の約３倍に相当する。
ris-HCl (pH7.5)、 200mM NaCl 〕に浸した後、3%ゼラチ
ン、0.05% Tween20を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で４
０分インキュベートし、さらに30μgの抗−酵母還元酵
素抗体、1%ゼラチン、0.05% Tween20 を含むＴＢＳ緩衝
液中で３７℃で２時間インキュベートした。その後、0.
05% Tween20 を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で３０分イ
ンキュベートする操作を４回繰り返した後、3%ゼラチ
ン、0.05% Tween20 を含む、ＴＢＳ緩衝液中で２０分間
インキュベートした。次に10μCiの〔125I〕−Protein
Ａ、1%ゼラチン、0.05% Tween20 を含むＴＢＳ緩衝液中
３７℃で６０分インキュベートした後、0.05% Tween20
を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で３０分インキュベート
する操作を４回繰り返した。フィルターを風乾した後、
オートラジオグラフィーを行なった。AH22/ pAAH5株に
酵母還元酵素を50ngあるいは100ng添加したサンプルに
おける酵母還元酵素のバンドの黒化濃度と、AH22/pAFCR
1株における融合酵素のバンドの黒化濃度の比較から、A
H22/pAFCR1 株における融合酵素の発現量は約２×１０ 5
分子／菌体と推定された。これは、ラットP450cとラッ
ト還元酵素との融合酵素発現株における融合酵素発現量
の約３倍に相当する。
【００２２】実施例４ ヘム含有融合酵素量の定量 ＳＤ合成培地で約２×１０7 菌体／ｍｌまで培養したAH
22/pAFCR1 株菌体100ml を集菌し、100mM リン酸カリウ
ム(pH 7.0) 2mlに懸濁した。２本のキュベットに菌懸濁
液を1ml ずつ分注し、サンプル側キュベットに一酸化炭
素を吹き込んだ後、両キュベットにジチオナイト5 〜10
mg添加した。よく攪拌した後、400 〜500nm の差スペク
トルを測定し、447nm と490nm との吸光度差からΔε＝
91mM-1 cm -1という値をもとにしてヘム含有融合酵素量
を算出した。その結果、AH22/pAFCR1 株は菌体当たり約
２×１０5 分子のヘム含有融合酵素を産生することがわ
かった。
22/pAFCR1 株菌体100ml を集菌し、100mM リン酸カリウ
ム(pH 7.0) 2mlに懸濁した。２本のキュベットに菌懸濁
液を1ml ずつ分注し、サンプル側キュベットに一酸化炭
素を吹き込んだ後、両キュベットにジチオナイト5 〜10
mg添加した。よく攪拌した後、400 〜500nm の差スペク
トルを測定し、447nm と490nm との吸光度差からΔε＝
91mM-1 cm -1という値をもとにしてヘム含有融合酵素量
を算出した。その結果、AH22/pAFCR1 株は菌体当たり約
２×１０5 分子のヘム含有融合酵素を産生することがわ
かった。
【００２３】実施例５ 形質転換酵母菌株のアセトアニリドｐ水酸化によるアセ
トアミノフェン生成量の測定 ＳＤ合成培地で約２×１０7 菌体／ｍｌまで培養した形
質転換酵母AH22/pAFCR1 およびAH22/pAMP19 株の培養液
中にそれぞれ1.5Mアセトアニリド（メタノール溶液）を
添加し、終濃度を25mMとした。その後、振盪培養を続け
ながら１時間毎に培養液を一定量ずつ分取し、遠心分離
により菌体を除去した培養液上清をＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）にかけ、生成したアセトアミノフ
ェンを定量した。ＨＰＬＣは、μ Bondapak C18カラム
を用い、メタノール：水：酢酸＝１５：８４：１で溶出
し、245nm の吸光度で検出した。その結果、酵母還元酵
素を含む融合酵素産生株AH22/pAFCR1 における菌体当た
りの活性は、ラット還元酵素を含む融合酵素産生株AH22
/pAMP19 の約１５倍で、また、融合酵素分子当たりの活
性は約５倍であることがわかった。
トアミノフェン生成量の測定 ＳＤ合成培地で約２×１０7 菌体／ｍｌまで培養した形
質転換酵母AH22/pAFCR1 およびAH22/pAMP19 株の培養液
中にそれぞれ1.5Mアセトアニリド（メタノール溶液）を
添加し、終濃度を25mMとした。その後、振盪培養を続け
ながら１時間毎に培養液を一定量ずつ分取し、遠心分離
により菌体を除去した培養液上清をＨＰＬＣ（高速液体
クロマトグラフィー）にかけ、生成したアセトアミノフ
ェンを定量した。ＨＰＬＣは、μ Bondapak C18カラム
を用い、メタノール：水：酢酸＝１５：８４：１で溶出
し、245nm の吸光度で検出した。その結果、酵母還元酵
素を含む融合酵素産生株AH22/pAFCR1 における菌体当た
りの活性は、ラット還元酵素を含む融合酵素産生株AH22
/pAMP19 の約１５倍で、また、融合酵素分子当たりの活
性は約５倍であることがわかった。
配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCTCGAGCTG GTCGAGCTCGAC
【図１】プラスミトｐＡＦＣＲ１の構築の方法を表す図
である。
である。
H 制限酵素Hind IIIによる切断部位 X 制限酵素Xholによる切断部位
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/81 // Ｃ１２Ｐ 13/00 8931−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 13/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 大川 秀郎 兵庫県芦屋市朝日ケ丘町14−３−403
Claims (9)
- 【請求項１】ミクロソーム型タンパクのミクロソーム膜
結合に関与する領域をコードする配列並びにラット肝チ
トクロムＰ４５０ｃの少なくとも基質結合に関与する領
域及びヘム結合に関与する領域をコードする配列からな
るＤＮＡとその３’末端に結合した酵母還元酵素遺伝子
の少なくともフラビンモノヌクレオチドやフラビンアデ
ニンジヌクレオチド結合に関与する領域とＮＡＤＰＨ結
合に関与する領域をコードするＤＮＡからなり、ラット
肝チトクロムＰ４５０ｃの有する１原子酸素添加活性と
酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の有する
還元力供給能を併せ持つ融合酸化酵素をコードする融合
遺伝子 - 【請求項２】請求項１に記載の遺伝子を含み、該酸化酵
素を発現する酵母発現プラスミド - 【請求項３】酵母発現プラスミドpAFCR1
- 【請求項４】請求項２、または３記載の酵母発現プラス
ミドを保持する形質転換酵母菌株 - 【請求項５】サッカロミセス属に属する請求項４の酵母
菌株 - 【請求項６】サッカロミセス セレビシェーAH22(pAFCR
1)株 - 【請求項７】ミクロソーム型タンパクのミクロソーム膜
結合に関与する領域並びにラット肝チトクロムＰ４５０
ｃ遺伝子の少なくとも基質結合に関与する領域及びヘム
結合に関与する領域をＮ末端側に有し、Ｃ末端側は酵母
還元酵素遺伝子の少なくともフラビンモノヌクレオチド
やフラビンアデニンジヌクレオチド結合に関与する領域
とＮＡＤＰＨ結合に関与する領域からなり、ラット肝チ
トクロムＰ４５０ｃの有する１原子酸素添加活性と酵母
ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の有する還元
力供給能を併せ持つ融合酸化酵素 - 【請求項８】請求項４、５または６記載の形質転換酵母
菌株を培養することを特徴とする酸化酵素の製造方法 - 【請求項９】請求項４、５または６記載の形質転換酵母
菌株或いは該酵素が産生する組換え融合酸化酵素によっ
てアセトアニリドのｐ位を水酸化することを特徴とする
アセトアミノフェンの製造方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18361392A JP3387525B2 (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | チトクロムＰ４５０ｃと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18361392A JP3387525B2 (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | チトクロムＰ４５０ｃと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0630779A true JPH0630779A (ja) | 1994-02-08 |
| JP3387525B2 JP3387525B2 (ja) | 2003-03-17 |
Family
ID=16138857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18361392A Expired - Fee Related JP3387525B2 (ja) | 1992-07-10 | 1992-07-10 | チトクロムＰ４５０ｃと酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の融合酸化酵素、該酵素をコードする遺伝子および該酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3387525B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0483596A (ja) * | 1990-07-26 | 1992-03-17 | Ebara Infilco Co Ltd | 有機性汚水の処理方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20250055429A (ko) * | 2023-10-16 | 2025-04-24 | 한국생명공학연구원 | 꿀벌부채명나방 유래 플라스틱 분해 효소 및 이의 용도 |
-
1992
- 1992-07-10 JP JP18361392A patent/JP3387525B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0483596A (ja) * | 1990-07-26 | 1992-03-17 | Ebara Infilco Co Ltd | 有機性汚水の処理方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3387525B2 (ja) | 2003-03-17 |
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