JPH0630584B2 - 複数のチトクロムｐ−４５０遺伝子から構築したキメラチトクロムｐ−４５０遺伝子、およびそれを含む酵母内発現用プラスミドとその製造法、ならびに菌体内にそれらのプラスミドを保有する酵母菌株 - Google Patents

複数のチトクロムｐ−４５０遺伝子から構築したキメラチトクロムｐ−４５０遺伝子、およびそれを含む酵母内発現用プラスミドとその製造法、ならびに菌体内にそれらのプラスミドを保有する酵母菌株

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JPH0630584B2
JPH0630584B2 JP24277385A JP24277385A JPH0630584B2 JP H0630584 B2 JPH0630584 B2 JP H0630584B2 JP 24277385 A JP24277385 A JP 24277385A JP 24277385 A JP24277385 A JP 24277385A JP H0630584 B2 JPH0630584 B2 JP H0630584B2
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秀郎 大川
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、キメラチトクロムＰ−４５０遺伝子、それを
含む酵母発現プラスミド及びそれらのプラスミドは菌体
内に保持する酵母菌株並びにこれらの製造方法に関す
る。
チトクロムＰ−４５０（以下Ｐ−４５０と略称する）
は、微生物から哺乳動物にいたるまで広く生物界に存在
するヘムタンパク質であり、多くの分子種が存在する。
各々のＰ−４５０分子種は基質特異性を異にしている
が、共通して一原子酸素添加機能を有する。
近年、本発明者らは、酵母を宿主としてラット肝チトク
ロムＰ−４５０ｃ（Ｐ−４５０ｃ）を発現させる酵母発
現ベクターpAMC1を構築し酵母でＰ−４５０ｃを大量に
発現させることに成功した（特開昭61-88878)。
チトクロムＰ−４５０ｃは酵母ミクロソームにおいて酵
母NADPH−チトクロムＰ−４５０還元酵素と連携して電
子伝達系を形成し、一原子酸素添加反応を示す。
また、本発明者らは、Ｐ−４５０ｃ発現酵母菌株を用い
てアセトアニリドのパラ位を水酸化するアセトアミノフ
ェンの製法を発明した（特開昭60-139128)。その他、Ｐ
−４５０ｃを発現する酵母菌体あるいは酵母菌体から取
得したＰ−４５０ｃ自体を酸化反応工程や産業排水中の
有機化合物の除去に反応することが可能である。
本発明者らは、Ｐ−４５０遺伝子について更に研究を重
ねた結果、従来のＰ−４５０とは異なる特異な性質を有
するキメラＰ−４５０遺伝子を２以上のＰ−４５０遺伝
子から構築することに成功し、更にこのキメラＰ−４５
０遺伝子を酵母菌体内で発現させる発現用プラスミド及
び当該プラスミドを菌体内に保持し該キメラＰ−４５０
を生産する酵母の製造に成功した。
本発明により得られる酵母は、優れた酸化活性を有する
キメラＰ−４５０を生産し、この酵母菌体自身あるいは
キメラＰ−４５０を各種の酸化反応にバイオリアクター
として使用することが可能である。
本発明のキメラＰ−４５０遺伝子は、例えば、ＨＲ２領
域(J.Biochem.,93p807-817,1983)を他の分子種のＰ−４
５０遺伝子の同領域で変換することにより製造すること
ができる。
その一例として、ラット肝チトクロムＰ−４５０ｃ遺伝
子のＨＲ２領域を含むＣ末端領域をラット肝チトクロム
Ｐ−４５０ｄの同領域に置き換えることにより製造した
図１に記載した塩基配列およびアミノ酸配列で特定され
るキメラＰ−４５０遺伝子（Ｐ−４５０ccd遺伝子と呼
ぶ）を挙げることができる。本発明のキメラＰ−４５０
ccd遺伝子は、例えば、Ｐ−４５０ｃ遺伝子を含むプラ
スミドpTF1、pTF2,pAMClなど（特開昭61-52284)及びＰ−
４５０ｄをコードする領域を含むプラスミドpTZ330〔J.
Biochem.,96,793-804,(1984)に記載の方法で製造するこ
とができる〕からそれぞれ必要部分を分離しＰ−４５０
ｃ遺伝子のＨＲ２領域をＰ−４５０ｄの領域で置き換え
ることにより製造することができる。その具体的例とし
ては図２に本発明のキメラＰ−４５０遺伝子を含むプラ
スミドpACCD1の構築の概要を示した。
本発明のキメラＰ−４５０遺伝子を保持する酵母発現用
プラスミドは、例えば、酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼＩプロモーターと同ターミネーターを保持する酵母発
現用ベクタープラスミドpAAH5(Washington Research Fo
undationから入手、Methods in Enzymology,101 part C
pl92-210,Ammererらの方法により製造できる。なお、
酵母ADH1遺伝子のプロモーターは、Washington Researc
h Foundationの米国特許第229,733に含まれており、米
国において工業的，商業的目的で使用する場合は権利者
からの権利許諾を必要とする。）や酵母発現ベクターpJ
DB219〔Nature,275,104(1979)〕等の酵母発現ベクター
に上述のように製造したキメラＰ−４５０遺伝子を組み
込むことにより製造することができる。この場合におい
て、酵母発現ベクター特に限定されるものではなく、ま
た、使用するプロモーターやターミネーターについて
も、酵母内で効率良く機能するプロモーター、ターミネ
ーターであればよく、これらに限定されるものでない。
また、プラスミド上のプロモーター、キメラチトクロム
Ｐ−４５０遺伝子、ターミネーター以外の構造も限定さ
れるものでなく、酵母内で安定に保持されるものであれ
ばよい。
キメラＰ−４５０ccd遺伝子を保持する酵母発現用プラ
スミドpACCD1により形質転換された酵母菌株における菌
体当たり、あるいはＰ−４５０一分子当たりのアセトア
ニリドのパラ位水酸化活性は、従来のプラスミドpAMC1
によって形質転換された酵母菌株の約３倍であり、バイ
オリアクターとして有用性が高いことがわかる。
また、本発明の酵母菌体は、キメラチトクロムＰ−４５
０遺伝子を含むプラスミドにより、アルカリ金属法、あ
るいはプロトプラスト法などでサッカロミセス属に属す
る酵母を形質転換することによって得られる。サッカロ
ミセス・セレビシェーAH22株を用いることができるが、
この株に限定されるものではない。
以下に実施例を挙げ本発明を更に詳細に説明する。本発
明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、本
発明の技術分野に於ける通常の変更をすることができ
る。
実施例１ プラスミドpACCD1の構築： プラスミドpACCD1を図２にその概要を示した方法により
構築した。
約５μｇのプラスミドpTF1（特開昭61-88878に記載の方
法で製造）を各々２０ユニットの制限酵素StuI、Hind II
Iと混合し１０mMトリスー塩酸（pH7.5)、５０mM NaCl中
で３７℃１時間反応した後、0.6％低融点アガロースゲ
ル電気泳動を行い、約3.9kbのＤＮＡ断片を含むゲルを
切り出してこれを約６５℃で５分間加熱した。融解した
ゲルに２倍容のＴＥ緩衝液〔１０mMトリスー塩酸、0.5m
M EDTA(pH8.0)〕を加え、次にＴＥ緩衝液で飽和したフ
ェノールを等量加えて攪拌した。
遠心分離後、上層を分取し、２倍容のエタノールを加え
て沈澱したＤＮＡを回収した。以後のＤＮＡ断片の回収
はすべてこの方法で行った。
約3.9kbのＤＮＡ断片約１００ngに１ユニットのアルカ
リホスファターゼを添加し５０mMトリスー塩酸（pH8.0)
中で６０℃１時間反応させた後、以下の配列を有する合
成リンカーＤＮＡ約１００ngおよび５ユニットのＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを混合し、６６mMトリス塩酸（pH7.6)、6.6
mM MgCl2、１０mMＤＴＴ、１mMＡＴＰ中で１６℃、１４
時間反応させた。
CCTGGCCACGCTTCTCCAAGTGA GGACCGGTGCGAAGAGGTTCACTTCGA 反応後の混液により大腸菌ＤＨ１（Ｆ−，recAl,endAl,
gyrA96、thi-l、hsdR17、supE44、λ−）を形質転換し、１
００μｇ／mlのアンピリシンを含むプレートに広げ出現
するコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、Hind II
I、あるいはStuIで切断してこれら両制限酵素の切断部
位が新たに生成したことを確認し、得られたプラスミド
をpTFcccと名付けた。
次に、Ｐ−４５０ｄをコードする領域を含む公知のプラ
スミドpTZ330〔J.Biochem.,96,p793-804(1984)〕をStuI
で切断して得られた約４２０bpのＤＮＡ断片約１００ng
と、pTFccをStuIで断片した後、アルカリホスファター
ゼで処理をしたＤＮＡ約１００ngを混合してリガーゼ反
応を行った。反応混液により大腸菌ＤＨ１株を形質転換
し、得られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、
次に、５００ngのプラスミドＤＮＡに２ユニットのPvu
IIを加えて１０mMトリスー塩酸（（pH7.5)、５０mM NaC
l中で３７℃１時間反応させた後、１％アガロースゲル
電気泳動してそのパターンから、４２０bpのＤＮＡ断片
の挿入方向を確認し、正方向に挿入されたプラスミドを
pTFccdと名付けた。
次に、約１００ngのpTFccdに２ユニットのSalIを加え、
１０mMＭトリスー塩酸（pH7.5)、１５０mM NaCl中で３
７℃１時間反応させた後、５ユニットのＤＮＡポリメラ
ーゼＩKlenow酵素を加え、６７mMリン酸カルシウム（pH
7.4）、６．７mM MgCl2、1mM2−メルカプトエタノール、
２５μＭｄＡＴＰ、２５μＭｄＴＴＰ、２５μＭｄＧＴ
Ｐ、２５μＭｄＣＴＰ中で、２５℃、１時間反応させ、
更にアルカリホスファターゼ処理を施した。これに約５
００ngのHind IIIリンカーを加えてリガーゼ反応を行っ
た。反応混液により大腸菌ＤＨ１を形質転換し得られた
コロニーからプラスミドＤＮＡを調製しHind IIIで切断
した後、１％アガロースゲル電気泳動して約1.6kbのＤ
ＮＡ断片の存在を確認した。得られたプラスミドをpTFc
cd(H)と名付けた。
pTFccd(H)をHind IIIで切断し1.6kbのＤＮＡ断片を回収
した。
次に、酵母発現ベクターpAAH５約１００ngをHind IIIで
切断し、アルカリホスファターゼ処理を行った後、1.6k
bのＤＮＡ断片約２００ngと混合し、リガーゼ反応を行
った後、反応混液により大腸菌ＤＨ１を形質転換し、得
られたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。約５
００ngのプラスミドＤＮＡに２ユニットのBamHI、StuI
を加え１０mMトリスー塩酸（pH7.5)、１００mM NaCl
中、３７℃で１時間反応させた後、１％アガロースゲル
電気泳動し、そのパターンから1.6kbのＤＮＡ断片の挿
入方向を確認し、正方向に挿入されたプラスミドをpACC
D1と名付けた。
実施例２：プラスミドpACCD1による酵母の形質転換 ＹＰＤ培地（１％Yeast Extract、２％ポリペプトン、
２％グルコース）１mlにサッカロミセス・セレビシェAH
22株を植菌し、３０℃で１８時間振盪した後、遠心分離
により集菌した。得られた菌体を１mlの0.2ＭLiCl溶液
に懸濁した後、再び遠心分離し、得られたペレットに２
０μｌの１ＭLiCl溶液、３０μｌの７０％ポリエチレン
グリコール4000溶液、約１μｇのpACCD1を含む１０μｌ
の溶液を添加した。十分に混合した後、３０℃で１時間
インキュベートし、さらに１４０μｌの減菌水を加えて
攪拌した。この溶液をＳＤ合成培地プレート（２％グリ
コース、0.67％窒素源アミン酸不含、２０μｇ／mlヒス
チジン、２％寒天）の上にまき、３０℃で３日間インキ
ュベートし、pACCD1を保持する形質転換株AH22(pACCD1)
を得た。
実施例３：キメラチトクロムＰ−４５０タンパク質（Ｐ
−４５０ccdと略記する）の定量 サッカロミセス・セレビシェAH22(pAMCl)（特開昭61-56
072)と実施例２で得られたサッカロミセス・セレビシェ
AH22(pACCD1)株をＳＤ合成培地（２％グルコース、0.67
％窒素源アミン酸不含、２０μｇ／mlヒスチジン）で各
々1.5X107cells/mlまで培養した後、集菌し、ザイモリ
エース溶液〔1.2Ｍソルビトール、５０mMリン酸カリウ
ム（pH7.2)、１４mM２−メルカプトエタノール、0.4mg/
mlザイモリエース60,000〕に懸濁し、３０℃で３０分イ
ンキュベートした。遠心分離により集めたスフェロプラ
ストに１００℃に熱した緩衝液（１％ＳＤＳ、５０mM T
ris-HCl(pH6.8)、１０％メルカプトエタノール、４０％
グリセロール、0.02％ブロモフェノールブルー、１mMフ
ェニルメチルスルホニルフロリド）を添加して可溶化し
た。遠心分離で得られた上清（約３Ｘ１０６菌体分）を
１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。
さらに、ゲル中のタンパク質を２５mM Tris-HCl(pH8.
3)、１９２mMグリシン−２０％メタノール中で電気泳動
的にニトロセルロースフィルター上にブロットした。次
に、フィルターをＴＢＳ緩衝液〔５０mM Tris-HCl(pH7.
5)、２００mM NaCl〕に浸した後、３％ゼラチン、0.05
％Tween20を含むＴＢＳ緩衝液中、３７℃で４０分イン
キュベートし、さらに３０μｇの精製抗Ｐ−４５０ｃＩ
ｇＧ、１％ゼラチン、0.05％Tween20を含むＴＢＳ緩衝
液中３７℃で２時間インキュベートした。その後、0.05
％Tween20を含む緩衝液中３７℃で３０分インキュベー
トする操作を４回繰り返した後、３％ゼラチン、0.05％
Tween20を含むＴＢＳ緩衝液中３７℃で２０分インキュ
ベートした。次に、２μＣｉの〔125I〕−プロテイン
Ａ、１％ゼラチン、0.05％Tween20を含むＴＢＳ緩衝液
中、３７℃で７０分インキュベートした後、0.05％Twee
n20を含む緩衝液中、３７℃で３０分インキュベートす
る操作を４回繰り返した。
フィルターを風乾燥した後、オートラジオグラフィーを
行ったところ、バンドの濃さからAH22(pACCD1)株は菌体
当たり５〜８Ｘ１０５分子のＰ−４５０ccdで生産して
いることが推定され、AH22(pAMCl)株におけるＰ−４５
０ｃの生産量とほぼ同程度であることがわかった。
実施例４：ヘムを含有するＰ−４５０ccdの定量 AH22(pACCD1)株の培養液（ＳＤ合成培地、菌体濃度約1.
5X107cells/ml)100mlを集菌し、１０mlの１００mMリン
酸カリウム緩衝液（pH7.0)に懸濁した後、遠心分離し
た。得られたペレットを新たに２mlの１００mMリン酸カ
リウム緩衝液（pH7.0)に懸濁し２本のキュベットに１ml
ずつ分注した。サンプル側のキュベットに一酸化炭素を
吹き込んだ後、両キュベット内にジチオナイト５〜１０
mgを添加し、攪拌した後、２０分間放置した。その後、
キュベット内の液を攪拌して４００〜５００nmの差スペ
クトルを測定し、△Ｅ447-490＝91mM-1cm-1という大
村、佐藤らの値を元にしてＰ−４５０ccd濃度を算出し
た。
その結果、AH22(pACCD1)は菌体あたり３〜４Ｘ１０５分
子のヘムタンパク質を産生していることがわかり、AH22
(pAMCl)株におけるＰ−４５０ｃの生産とほぼ同程度で
あることがわかった。
実施例５：菌体のアセトアニリドのパラ位水酸化による
アセトアミノフェン生成量の測定 ＳＤ合成培地中で約1.4X107cells/mlまで培養したAH22
(pAMCl)株、AH22(pACCD1)株、それぞれの培養液中に1.5
Ｍアセトアニリド（メタノール溶液）を添加し、終濃度
２５mMとした。その後、３０℃で振盪培養（１２０cycl
e/min)し、１時間ごとに少量ずつ分取し、遠心分離で得
た上清をHPLCで分析し生成したアセトアミノフェンを定
量した。HPLCの条件を以下に示す。
カラム：μBondapak C18（Φ４Ｘ３００mm） 溶媒；メタノール：水：酢酸＝１５：８４：１ 検出；Ａ２４５ｎｍ 流速；2.0ml/min 温度；室温（２０〜２５℃） 図３に示したようにAH22(pACCD1)株の菌体あたりのアセ
トアニリドのパラ位水酸化活性はAH22(pAMCl)株の約３
倍であった。
【図面の簡単な説明】
図１（その１および２）は、本発明のキメラＰ−４５０
遺伝子Ｐ−４５０ccd ｃＤＮＡのコーディング領域の
塩基配列およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す
図である。 図２は、本発明のプラスミドpACCD1の構築の概要を表す
図である。 図３は、AH22(pACCD1)株、AH22(pAMCl)株の培養液中の
生成アセトアミノフェン濃度（nmol/ml)及び菌体濃度
（Ｘ１０8cells/ml)の経時変化を示したものである。
●、○はそれぞれAH22(pACCD1)株のアセトアミノフェン
濃度及び菌体濃度を示す。 ▲、△はそれぞれAH22(pAMCl)株のアセトアミノフェン
濃度及び菌体濃度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (54)【発明の名称】 複数のチトクロムＰ−450遺伝子から構築したキメラチトクロムＰ−450遺伝子、およびそれを含 む酵母内発現用プラスミドとその製造法、ならびに菌体内にそれらのプラスミドを保有する酵母 菌株

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列（Ｉ）で表されるラッ
    ト肝チトクロムＰ４５０ｃをコードする遺伝子におい
    て、その遺伝子中の下記のアミノ酸配列（II）からなる
    ヘム結合領域（ＨＲ２領域）を含むＣ末端領域を、ラッ
    ト肝チトクロムＰ４５０ｄ遺伝子の下記のアミノ酸配列
    （III）からなるヘム結合領域（ＨＲ２領域）を含むＣ
    末端領域に置き換えたキメラチトクロムＰ−４５０遺伝
    子 a)アミノ酸配列（Ｉ） Met Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe Thr Ser Al
    a Thr Glu Leu Leu Leu Ala Val Thr Thr Phe Cys Leu
    Gly Phe Trp Val Val Arg Val Thr Arg Thr Trp Val Pr
    o Lys Gly Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu
    Pro Phe Ile Gly His Val Leu Thr Leu Gly Lys Asn Pr
    o His Leu Ser Leu Thr Lys Leu Ser Gln Gln Tyr Gly
    Asp Val Leu Gln Ile Arg Ile Gly Ser Thr Pro Val Va
    l Val Leu Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys Gln Ala Leu
    Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg Pro Asp Le
    u Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala Asn Gly Gln Ser Met
    Thr Phe Asn Pro Asp Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Ar
    g Arg Arg Leu Ala Gln Asn Ala Leu Lys Ser Phe Ser
    Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser Cys Tyr Le
    u Glu Glu His Val Ser Lys Glu Ala Glu Tyr Leu Ile
    Ser Lys Phe Gln Lys Leu Met Ala Glu Val Gly His Ph
    e Asp Pro Phe Lys Tyr Leu Val Val Ser Val Ala Asn
    Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg Arg Tyr Asp Hi
    s Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser Ile Val Asn Leu Ser
    Asn Glu Phe Gly Glu Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Al
    a Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser
    Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp Leu Asn Lys Lys Phe Ty
    r Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile Lys Gln His Tyr Arg
    Thr Phe Glu Lys Gly His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Se
    r Leu Ile Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu
    Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp Asp Lys Val Ile Th
    r Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly Ala Gly Phe Asp Thr
    Ile Thr Thr Ala Ile Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu Va
    l Thr Asn Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu
    Leu Asp Thr Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln Pro Arg Le
    u Ser Asp Arg Pro Gln Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe
    Ile Leu Glu Thr Phe Arg His Ser Ser Phe Val Pro Ph
    e Thr Ile Pro His Ser Thr Ile Arg Asp Thr Ser Leu
    Asn Gly Phe Tyr Ile Pro Lys Gly His Cys Val Phe Va
    l Asn Gln Trp Gln Val Asn His Asp Gln Glu Leu Trp
    Gly Asp Pro Asn Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Th
    r Ser Ser Gly Thr Leu Asp Lys His Leu Ser Glu Lys
    Val Ile Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gl
    y Glu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe Leu
    Ala Ile Leu Leu Gln Gln Met Glu Phe Asn Val Ser Pr
    o Gly Glu Lys Val Asp Met Thr Pro Ala Tyr Gly Leu
    Thr Leu Lys His Ala Arg Cys Glu His Phe Gln Val Gl
    n Met Arg Ser Ser Gly Pro Gln His Leu Gln Ala b)アミノ酸配列(II) Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gly Glu Thr Il
    e Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe c)アミノ酸配列(III) Phe Gly Leu Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Ile Pr
    o Ala Lys Trp Glu Val Phe Leu Phe
  2. 【請求項２】下記のアミノ酸配列をコードすることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項記載のキメラチトクロム
    Ｐ−４５０遺伝子 Met Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe 10 Thr Ser Ala Thr Glu Leu Leu Leu Ala Val 20 Thr Thr Phe Cys Leu Gly Phe Trp Val Val 30 Arg Val Thr Arg Thr Trp Val Pro Lys Gly 40 Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu 50 Pro Phe Met Gly His Val Leu Thr Leu Gly 60 Lys Asn Pro His Leu Ser Leu Thr Lys Leu 70 Ser Gln Gln Tyr Gly Asp Val Leu Gln Ile 80 Arg Ile Gly Ser Thr Pro Val Val Val Leu 90 Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys Gln Ala Leu 100 Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg 110 Pro Asp Leu Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala 120 Asn Gly Gln Ser Met Thr Phe Asn Pro Asp 130 Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Arg Arg Arg 140 Leu Ala Gln Asn Ala Leu Lys Ser Phe Ser 150 Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser 160 Cys Tyr Leu Glu Glu His Val Ser Lys Glu 170 Ala Glu Tyr Leu Ile Ser Lys Phe Gln Lys 180 Leu Met Ala Glu Val Gly His Phe Asp Pro 190 Phe Lys Tyr Leu Val Val Ser Val Ala Asn 200 Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg Arg 210 Tyr Asp His Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser 220 Ile Val Asn Leu Ser Asn Glu Phe Gly Glu 230 Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Ala Asp Phe 240 Ile Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser 250 Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp Leu Asn Lys 260 Lys Phe Tyr Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile 270 Lys Glu His Tyr Arg Thr Phe Glu Lys Gly 280 His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Ser Leu Ile 290 Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu 300 Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp Asp Lys 310 Val Ile Thr Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly 320 Ala Gly Phe Asp Thr Ile Thr Thr Ala Ile 330 Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu Val Thr Asn 340 Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu 350 Leu Asp Thr Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln 360 Pro Arg Leu Ser Asp Arg Pro Gln Leu Pro 370 Tyr Leu Glu Ala Phe Ile Leu Glu Ile Tyr 380 Arg Tyr Thr Ser Phe Val Pro Phe Thr Ile 390 Pro His Ser Thr Thr Arg Asp Thr Ser Leu 400 Asn Gly Phe His Ile Pro Lys Glu Cys Cys 410 Ile Phe Ile Asn Gln Trp Gln Val Asn His 420 Asp Glu Lys Gln Trp Lys Asp Pro Phe Val 430 Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Thr Asn Asp 440 Asn Thr Ala Ile Asp Lys Thr Leu Ser Glu 450 Lys Val Met Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg 460 Arg Cys Ile Gly Glu Ile Pro Ala Lys Trp 470 Glu Val Phe Leu Phe Leu Ala Ile Leu Leu 480 His Gln Leu Glu Phe Thr Val Pro Pro Gly 490 Val Lys Val Asp Leu Thr Pro Ser Tyr Gly 500 Leu Thr Met Lys Pro Arg Thr Cys Glu His 510 Val Gln Ala Trp Pro Arg Phe Ser Lys 519
  3. 【請求項３】下記の塩基配列により表されることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項記載のキメラチトクロムＰ
    −４５０遺伝子
  4. 【請求項４】下記のアミノ酸配列（Ｉ）で表されるラッ
    ト肝チトクロムＰ４５０ｃをコードする遺伝子におい
    て、その遺伝子中の下記のアミノ酸配列（II）からなる
    ヘム結合領域（ＨＲ２領域）を含むＣ末端領域を、ラッ
    ト肝チトクロムＰ４５０ｄ遺伝子の下記のアミノ酸配列
    (III)からなるヘム結合領域（ＨＲ２領域）を含むＣ末
    端領域に置き換えたキメラチトクロムＰ−４５０遺伝子
    を含む酵母発現用プラスミド a)アミノ酸配列（Ｉ） Met Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe Thr Ser Al
    a Thr Glu Leu Leu Leu Ala Val Thr Thr Phe Cys Leu
    Gly Phe Trp Val Val Arg Val Thr Arg Thr Trp Val Pr
    o Lys Gly Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu
    Pro Phe Ile Gly His Val Leu Thr Leu Gly Lys Asn Pr
    o His Leu Ser Leu Thr Lys Leu Ser Gln Gln Tyr Gly
    Asp Val Leu Gln Ile Arg Ile Gly Ser Thr Pro Val Va
    l Val Leu Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys Gln Ala Leu
    Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg Pro Asp Le
    u Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala Asn Gly Gln Ser Met
    Thr Phe Asn Pro Asp Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Ar
    g Arg Arg Leu Ala Gln Asn Ala Leu Lys Ser Phe Ser
    Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser Cys Tyr Le
    u Glu Glu His Val Ser Lys Glu Ala Glu Tyr Leu Ile
    Ser Lys Phe Gln Lys Leu Met Ala Glu Val Gly His Ph
    e Asp Pro Phe Lys Tyr Leu Val Val Ser Val Ala Asn
    Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg Arg Tyr Asp Hi
    s Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser Ile Val Asn Leu Ser
    Asn Glu Phe Gly Glu Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Al
    a Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser
    Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp Leu Asn Lys Lys Phe Ty
    r Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile Lys Glu His Tyr Arg
    Thr Phe Glu Lys Gly His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Se
    r Leu Ile Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu
    Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp Asp Lys Val Ile Th
    r Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly Ala Gly Phe Asp Thr
    Ile Thr Thr Ala Ile Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu Va
    l Thr Asn Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu
    Leu Asp Thr Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln Pro Arg Le
    u Ser Asp Arg Pro Gln Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe
    Ile Leu Glu Thr Phe Arg His Ser Ser Phe Val Pro Ph
    e Thr Ile Pro His Ser Thr Ile Arg Asp Thr Ser Leu
    Asn Gly Phe Tyr Ile Pro Lys Gly His Cys Val Phe Va
    l Asn Gln Trp Gln Val Asn His Asp Gln Glu Leu Trp
    Gly Asp Pro Asn Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Th
    r Ser Ser Gly Thr Leu Asp Lys His Leu Ser Glu Lys
    Val Ile Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gl
    y Glu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe Leu
    Ala Ile Leu Leu Gln Gln Met Glu Phe Asn Val Ser Pr
    o Gly Glu Lys Val Asp Met Thr Pro Ala Tyr Gly Leu
    Thr Leu Lys His Ala Arg Cys Glu His Phe Gln Val Gl
    n Met Arg Ser Ser Gly Pro Gln His Leu Gln Ala b)アミノ酸配列(II) Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gly Glu Thr Il
    e Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe c)アミノ酸配列(III) Phe Gly Leu Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Ile Pr
    o Ala Lys Trp Glu Val Phe Leu Phe
  5. 【請求項５】下記のアミノ酸配列をコードするキメラチ
    トクロムＰ−４５０遺伝子を含むことを特徴とする特許
    請求の範囲第４項記載の酵母発現プラスミド Met Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe 10 Thr Ser Ala Thr Glu Leu Leu Leu Ala Val 20 Thr Thr Phe Cys Leu Gly Phe Trp Val Val 30 Arg Val Thr Arg Thr Trp Val Pro Lys Gly 40 Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu 50 Pro Phe Met Gly His Val Leu Thr Leu Gly 60 Lys Asn Pro His Leu Ser Leu Thr Lys Leu 70 Ser Gln Gln Tyr Gly Asp Val Leu Gln Ile 80 Arg Ile Gly Ser Thr Pro Val Val Val Leu 90 Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys Gln Ala Leu 100 Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg 110 Pro Asp Leu Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala 120 Asn Gly Gln Ser Met Thr Phe Asn Pro Asp 130 Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Arg Arg Arg 140 Leu Ala Gln Asn Ala Leu Lys Ser Phe Ser 150 Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser 160 Cys Tyr Leu Glu Glu His Val Ser Lys Glu 170 Ala Glu Tyr Leu Ile Ser Lys Phe Gln Lys 180 Leu Met Ala Glu Val Gly His Phe Asp Pro 190 Phe Lys Tyr Leu Val Val Ser Val Ala Asn 200 Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg Arg 210 Tyr Asp His Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser 220 Ile Val Asn Leu Ser Asn Glu Phe Gly Glu 230 Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Ala Asp Phe 240 Ile Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser 250 Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp Leu Asn Lys 260 Lys Phe Tyr Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile 270 Lys Glu His Tyr Arg Thr Phe Glu Lys Gly 280 His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Ser Leu Ile 290 Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu 300 Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp Asp Lys 310 Val Ile Thr Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly 320 Ala Gly Phe Asp Thr Ile Thr Thr Ala Ile 330 Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu Val Thr Asn 340 Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu 350 Leu Asp Thr Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln 360 Pro Arg Leu Ser Asp Arg Pro Gln Leu Pro 370 Tyr Leu Glu Ala Phe Ile Leu Glu Ile Tyr 380 Arg Tyr Thr Ser Phe Val Pro Phe Thr Ile 390 Pro His Ser Thr Thr Arg Asp Thr Ser Leu 400 Asn Gly Phe His Ile Pro Lys Glu Cys Cys 410 Ile Phe Ile Asn Gln Trp Gln Val Asn His 420 Asp Glu Lys Gln Trp Lys Asp Pro Phe Val 430 Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Thr Asn Asp 440 Asn Thr Ala Ile Asp Lys Thr Leu Ser Glu 450 Lys Val Met Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg 460 Arg Cys Ile Gly Glu Ile Pro Ala Lys Trp 470 Glu Val Phe Leu Phe Leu Ala Ile Leu Leu 480 His Gln Leu Glu Phe Thr Val Pro Pro Gly 490 Val Lys Val Asp Leu Thr Pro Ser Tyr Gly 500 Leu Thr Met Lys Pro Arg Thr Cys Glu His 510 Val Gln Ala Trp Pro Arg Phe Ser Lys 519
  6. 【請求項６】下記の塩基配列により表されるキメラチト
    クロムＰ−４５０遺伝子を含むことを特徴とする特許請
    求の範囲第４項記載の酵母発現プラスミド
  7. 【請求項７】下記のアミノ酸配列（Ｉ）で表されるラッ
    ト肝チトクロムＰ４５０ｃをコードする遺伝子におい
    て、その遺伝子中の下記のアミノ酸配列（II）からなる
    ヘム結合領域（ＨＲ２領域）を含むＣ末端領域を、ラッ
    ト肝チトクロムＰ４５０ｄ遺伝子の下記のアミノ酸配列
    （III）からなるヘム結合領域（ＨＲ２領域）を含むＣ
    末端領域に置き換えたキメラチトクロムＰ−４５０遺伝
    子を含む酵母発現用プラスミドを保持する酵母菌株 a)アミノ酸配列（Ｉ） Met Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe Thr Ser Al
    a Thr Glu Leu Leu Leu Ala Val Thr Thr Phe Cys Leu
    Gly Phe Trp Val Val Arg Val Thr Arg Thr Trp Val Pr
    o Lys Gly Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu
    Pro Phe Ile Gly His Val Leu Thr Leu Gly Lys Asn Pr
    o His Leu Ser Leu Thr Lys Leu Ser Gln Gln Tyr Gly
    Asp Val Leu Gln Ile Arg Ile Gly Ser Thr Pro Val Va
    l Val Leu Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys Gln Ala Leu
    Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg Pro Asp Le
    u Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala Asn Gly Gln Ser Met
    Thr Phe Asn Pro Asp Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Ar
    g Arg Arg Leu Ala Gln Asn Ala Leu Lys Ser Phe Ser
    Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser Cys Tyr Le
    u Glu Glu His Val Ser Lys Glu Ala Glu Tyr Leu Ile
    Ser Lys Phe Gln Lys Leu Met Ala Glu Val Gly His Ph
    e Asp Pro Phe Lys Tyr Leu Val Val Ser Val Ala Asn
    Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg Arg Tyr Asp Hi
    s Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser Ile Val Asn Leu Ser
    Asn Glu Phe Gly Glu Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Al
    a Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser
    Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp Leu Asn Lys Lys Phe Ty
    r Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile Lys Glu His Tyr Arg
    Thr Phe Glu Lys Gly His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Se
    r Leu Ile Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu
    Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp Asp Lys Val Ile Th
    r Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly Ala Gly Phe Asp Thr
    Ile Thr Thr Ala Ile Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu Va
    l Thr Asn Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu
    Leu Asp Thr Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln Pro Arg Le
    u Ser Asp Arg Pro Gln Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe
    Ile Leu Glu Thr Phe Arg His Ser Ser Phe Val Pro Ph
    e Thr Ile Pro His Ser Thr Ile Arg Asp Thr Ser Leu
    Asn Gly Phe Tyr Ile Pro Lys Gly His Cys Val Phe Va
    l Asn Gln Trp Gln Val Asn His Asp Gln Glu Leu Trp
    Gly Asp Pro Asn Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Th
    r Ser Ser Gly Thr Leu Asp Lys His Leu Ser Glu Lys
    Val Ile Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gl
    y Glu Thr Ile Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe Leu
    Ala Ile Leu Leu Gln Gln Met Glu Phe Asn Val Ser Pr
    o Gly Glu Lys Val Asp Met Thr Pro Ala Tyr Gly Leu
    Thr Leu Lys His Ala Arg Cys Glu His Phe Gln Val Gl
    n Met Arg Ser Ser Gly Pro Gln His Leu Gln Ala b)アミノ酸配列(II) Phe Gly Leu Gly Lys Arg Lys Cys Ile Gly Glu Thr Il
    e Gly Arg Leu Glu Val Phe Leu Phe c)アミノ酸配列(III) Phe Gly Leu Gly Lys Arg Arg Cys Ile Gly Glu Ile Pr
    o Ala Lys Trp Glu Val Phe Leu Phe
  8. 【請求項８】下記のアミノ酸配列をコードするキメラチ
    トクロムＰ−４５０遺伝子を含む酵母発現プラスミドを
    保持することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
    酵母菌株 Met Pro Ser Val Tyr Gly Phe Pro Ala Phe 10 Thr Ser Ala Thr Glu Leu Leu Leu Ala Val 20 Thr Thr Phe Cys Leu Gly Phe Trp Val Val 30 Arg Val Thr Arg Thr Trp Val Pro Lys Gly 40 Leu Lys Ser Pro Pro Gly Pro Trp Gly Leu 50 Pro Phe Met Gly His Val Leu Thr Leu Gly 60 Lys Asn Pro His Leu Ser Leu Thr Lys Leu 70 Ser Gln Gln Tyr Gly Asp Val Leu Gln Ile 80 Arg Ile Gly Ser Thr Pro Val Val Val Leu 90 Ser Gly Leu Asn Thr Ile Lys Gln Ala Leu 100 Val Lys Gln Gly Asp Asp Phe Lys Gly Arg 110 Pro Asp Leu Tyr Ser Phe Thr Leu Ile Ala 120 Asn Gly Gln Ser Met Thr Phe Asn Pro Asp 130 Ser Gly Pro Leu Trp Ala Ala Arg Arg Arg 140 Leu Ala Gln Asn Ala Leu Lys Ser Phe Ser 150 Ile Ala Ser Asp Pro Thr Leu Ala Ser Ser 160 Cys Tyr Leu Glu Glu His Val Ser Lys Glu 170 Ala Glu Tyr Leu Ile Ser Lys Phe Gln Lys 180 Leu Met Ala Glu Val Gly His Phe Asp Pro 190 Phe Lys Tyr Leu Val Val Ser Val Ala Asn 200 Val Ile Cys Ala Ile Cys Phe Gly Arg Arg 210 Tyr Asp His Asp Asp Gln Glu Leu Leu Ser 220 Ile Val Asn Leu Ser Asn Glu Phe Gly Glu 230 Val Thr Gly Ser Gly Tyr Pro Ala Asp Phe 240 Ile Pro Ile Leu Arg Tyr Leu Pro Asn Ser 250 Ser Leu Asp Ala Phe Lys Asp Leu Asn Lys 260 Lys Phe Tyr Ser Phe Met Lys Lys Leu Ile 270 Lys Glu His Tyr Arg Thr Phe Glu Lys Gly 280 His Ile Arg Asp Ile Thr Asp Ser Leu Ile 290 Glu His Cys Gln Asp Arg Arg Leu Asp Glu 300 Asn Ala Asn Val Gln Leu Ser Asp Asp Lys 310 Val Ile Thr Ile Val Phe Asp Leu Phe Gly 320 Ala Gly Phe Asp Thr Ile Thr Thr Ala Ile 330 Ser Trp Ser Leu Met Tyr Leu Val Thr Asn 340 Pro Arg Ile Gln Arg Lys Ile Gln Glu Glu 350 Leu Asp Thr Val Ile Gly Arg Asp Arg Gln 360 Pro Arg Leu Ser Asp Arg Pro Gln Leu Pro 370 Tyr Leu Glu Ala Phe Ile Leu Glu Ile Tyr 380 Arg Tyr Thr Ser Phe Val Pro Phe Thr Ile 390 Pro His Ser Thr Thr Arg Asp Thr Ser Leu 400 Asn Gly Phe His Ile Pro Lys Glu Cys Cys 410 Ile Phe Ile Asn Gln Trp Gln Val Asn His 420 Asp Glu Lys Gln Trp Lys Asp Pro Phe Val 430 Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Thr Asn Asp 440 Asn Thr Ala Ile Asp Lys Thr Leu Ser Glu 450 Lys Val Met Leu Phe Gly Leu Gly Lys Arg 460 Arg Cys Ile Gly Glu Ile Pro Ala Lys Trp 470 Glu Val Phe Leu Phe Leu Ala Ile Leu Leu 480 His Gln Leu Glu Phe Thr Val Pro Pro Gly 490 Val Lys Val Asp Leu Thr Pro Ser Tyr Gly 500 Leu Thr Met Lys Pro Arg Thr Cys Glu His 510 Val Gln Ala Trp Pro Arg Phe Ser Lys 519
  9. 【請求項９】下記の塩基配列により表されるキメラチト
    クロロムＰ−４５０遺伝子を含む酵母発現プラスミドを
    保持することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の
    酵母菌株
  10. 【請求項１０】酵母菌株がサッカロミセス・セレビシエ
    ーＡＨ２２株である、特許請求の範囲第７項記載の酵母
    菌株
  11. 【請求項１１】酵母菌株がサッカロミセス・セレビシエ
    ーＡＨ２２株である、特許請求の範囲第８項記載の酵母
    菌株
  12. 【請求項１２】酵母菌株がサッカロミセス・セレビシエ
    ーＡＨ２２株である、特許請求の範囲第９項記載の酵母
    菌株
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