JPH0630791A - 糖化蛋白の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】生体組織中、特に血液中の糖化蛋白を、高精度
で正確にしかも迅速かつ簡便に定量すること。 【構成】生体組織由来の検体をヒドラジンで処理した
後、発色試薬と反応させて比色定量することを特徴とす
る糖化蛋白の定量方法。 【効果】本発明によれば、血液中又は毛髪中の糖化蛋白
を、迅速かつ簡便に定量出来る。本定量方法は、血液中
の共存物質による影響が極めて少ないので、高精度で正
確な定量が可能である。更に呈色性もよく測定感度もよ
い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体組織、特に血液や
毛髪中の糖化蛋白の定量方法に関し、糖尿病の診断に有
用である。

【０００２】

【従来技術】従来、糖尿病の治療や診断を目的として、
血糖コントロ−ルの指標となる糖化蛋白濃度を測定する
方法がいくつか知られている。これらの方法は、いずれ
も、グルコ−スにより糖化された蛋白がアマドリ−転位
を経て生成するケトアミン型の糖化蛋白（以下、単に糖
化蛋白という）を直接的または間接的に比色定量する方
法であるが、実施する上で種々の欠点を有している。例
えば、J. Clin. Chem.Clin. Biochem., 19, 81(1981)に
記載のフロシン法、Diabetes,29, 417(1980)に記載のチ
オバルビツ−ル酸法、Diabetes, 29, 1044(1980)に記載
のアフィニィティ− カラム法等では、操作が繁雑な
上、反応温度も高く、反応時間も数１０時間と長い。ま
た、血液中の共存物質、例えば、糖化蛋白以外の還元性
物質（グルコ−ス、アスコルビン酸、グルタチオン、尿
酸等）の影響を避けるためには、透析等の繁雑な操作を
行なう必要がある。更に、定量に際してのキャリブレ−
ションとしては、アルブミンまたは総タンパクの定量を
必要とするので、実際上不便である。

【０００３】特公平１−１３０６２号およびClin. Chi
m. Acta,127,87(1983年)には、発色剤としてニトロブル
−テトラゾリウム塩を使用して定量する方法（以下、Ｎ
ＢＴ−還元法という）が記載されている。この方法で
は、生成するホルマザンが測定器材に付着しやすく、し
かも除去が困難である上、液体試料中に共存する脂質や
蛋白質によって、ホルマザンのみかけの吸光度が変化す
るので、測定精度が低下する問題がある。また、水溶性
標準液と血清標準液とでは反応性がかなり異なるのでキ
ャリブレ−ションも複雑である。更に、この方法は、ア
ルカリ性条件下における糖化蛋白の還元性を利用してい
るので、前記還元性物質による影響を減少させるかまた
は除くためには、レ−トアッセイ法で定量するか、ある
いはこれらの除去を定量前または定量中に行なう必要が
あった。J. Biol. Chem., 255, 7218(1980)には、フェ
ニルヒドラジンによる比色定量法（以下、単にフェニル
ヒドラジン法という）が記載されているが、呈色度も弱
く、臨床上実用化されるには至っていない。

【０００４】

【解決すべき課題】本発明は、上記のような欠点および
困難を伴わずに、しかも簡便かつ迅速に血液中の糖化蛋
白を定量する方法を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題に鑑み、本発明
者らは鋭意検討したところ、生体組織由来の検体をヒド
ラジンで処理した後、発色試薬と反応させて比色定量す
れば、血液中の糖化蛋白を定量出来ることを見出し本発
明を完成した。本明細書において検体とは、糖化蛋白を
含有するものであればよいが、好ましくは、血液検体ま
たは毛髪検体である。血液検体とは、血液自体、血漿ま
たは血清等を意味するが、定量に際しては、測定感度、
測定精度等の観点から、血清を使用するのが好ましい。
毛髪検体とは、毛髪自体または測定し易くするために洗
浄等の処理を施した毛髪を意味する。また、該検体とし
ては、糖化蛋白と共存するグルコ−スが本定量方法に及
ぼす影響を除くために、あらかじめ、該グルコ−スを、
グルコ−スオキシダ−ゼ等で酸化処理したものを使用す
る。通常、血液検体を、約５〜２０単位のグルコ−スオ
キシダ−ゼ存在下、体温程度で数分から数１０分程度イ
ンキュベ−トすればよい。

【０００６】以下、本定量方法について詳細に説明す
る。 （第１工程）本工程は、前処理した検体をヒドラジンで
処理する工程である。この処理反応には、ヒドラジン
を、蒸留水、アルコ−ル類またはその混合液等に溶解し
たもの（以下、単に、ヒドラジン試薬と言う）を使用す
るが、前もって反応液のｐＨを調整しておく必要があ
る。反応が進行するｐＨは、約４.０以上であるが、副
反応を極力制御するためには塩基性条件下で反応を行な
うのが望ましく、好ましいｐＨの範囲は、約８.０〜約
１２.０、更に好ましくは、約９〜１０.０である。ｐＨ
調整のためには、適宜、公知の酸を使用すればよいが、
好ましくは、酢酸等の弱酸である。ヒドラジンの濃度
は、必ずしも制限されないが好ましくは約３〜１０.０
ｍｏｌ／Ｌである。反応温度は、約３０〜１３０℃、好
ましくは約６０〜約１１０℃、特に好ましくは、約１０
０℃である。約３０℃以下であれば反応性が低下する
し、また約１３０℃以上であれば第２工程の比色定量に
悪影響を及ぼすので好ましくない。本工程に要する処理
時間は、約５〜約６０分間、更に好ましくは、約１０〜
約４０分間、特に好ましくは、約３０分間程度である。
約５分以下であると、反応が十分に進行しないので、正
確な定量が困難である。一方、約６０分間加熱すれば反
応はほぼ完結するので、それ以上の反応は、迅速な定量
を行なう観点からは好ましくない。

【０００７】（第２工程）本工程は、第１工程終了後、
引き続き発色試薬と反応させることにより生成するグル
コ−ス誘導体の吸光度を測定し、比色定量する工程であ
る。発色試薬としては、一般式、Ｈ₂Ｎ−ＮＨ−Ｒで示
されるヒドラジン誘導体型の公知のカルボニル発色試薬
を幅広く使用出来、フェニルヒドラジン、ｐ−ニトロフ
ェニルヒドラジン、フェニルヒドラジン−ｐ−スルホン
酸、ｍ−トリルヒドラジン、ｐ−トリルヒドラジン、２
−ヒドラジノベンゾチアゾ−ル、２−ヒドラジノピリジ
ン、１−ヒドラジノフタラジン等が例示されるが、好ま
しくはフェニルヒドラジンである。反応温度は、使用す
る発色試薬の種類によっても異なり必ずしも制限されな
いが、例えば、発色試薬にフェニルヒドラジンを使用す
る場合であれば、約３０〜８０℃、好ましくは、約５０
〜７０℃、特に好ましくは約６０℃である。約８０℃以
上であると呈色性が下がり、また約３０℃以下であると
反応性が低下するので、いずれにしても好ましくない。

【０００８】比色定量は、一般に行なわれる吸光度測定
法により行うことが出来るが、本発明においては、いわ
ゆるエンドポイント法は勿論、発色試薬の選択次第で
は、レ−トアッセイ法も可能である。第２工程の反応を
完結するために必要な時間は、反応温度、使用する発色
試薬の種類等により異なるので、一概に規定できない
が、好ましい発色試薬を使用すれば、通常、数１０分〜
数時間程度である。よって、エンドポイント法による場
合でも、比較的短時間、好ましくは約０.５〜３時間、
第２工程の反応を行なった後に、吸光度を測定すればよ
い。また、反応初期の吸光度が時間依存的に直線性を示
すような発色試薬を使用することにより、第２工程の反
応開始後、数分〜数１０分以内でのレ−トアッセイ法に
よる測定も可能である。特に、本定量方法においては、
発色試薬にフェニルヒドラジンを選択すれば、第２工程
の反応が約３０分〜６０分間でほぼ完結する。よって、
その間の任意の時点でエンドポイント法による定量が可
能であるが、反応生成物であるグルコ−スのフェニルヒ
ドラゾン誘導体（D-Glucose-bis-phenylhydrazone）の
呈色の安定性は極めてよいので、反応終了後、数時間経
過後に測定してもなんら差し支えない。また、発色試薬
添加後、約１〜１５分以内、好ましくは、約５〜約１０
分以内においては、吸光度のタイムコ−スが急勾配の直
線性を示すので、レ−トアッセイ法による定量が可能で
ある。測定波長は、使用する発色試薬の種類により異な
ることもあり、一概には規定できないが、通常、生成し
た発色物質が最大吸光度を示す波長を採用する。特に、
フェニルヒドラジンを使用する場合には、約３９０ｎｍ
が好ましい。

【０００９】また、従来、血液中の糖化蛋白の定量にお
いては、血液中の共存物質、特に糖化蛋白以外の還元性
物質（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、
ピリルビン、グリセルアルデヒド、還元糖）等の影響が
重要な検討課題であったが、本定量方法においては、こ
れらの妨害物質による影響は極めて低く、通常レベルで
の定量に際しては、特に防御手段を講じるまでもない
が、より一層精密な定量を行なう場合には、公知の防御
手段を取り入れて測定を行なうのが当然望ましい。

【００１０】尚、本定量方法におけるキャリブレ−ショ
ンに際しては、市販の合成糖化化合物、例えば、N-p-to
lyl-D-isoglucosamineを使用して、検量線を作成すれば
よい。ところで、血液中で糖化蛋白を形成し得る蛋白質
は、アルブミン、プロトロンビン、グロブリン等、多種
存在するので、本定量方法において、特定の糖化蛋白を
定量しているかどうかは定かではない。しかし、血液中
の糖化蛋白は、その大部分が糖化アルブミンであり、特
に血清においてはそれが顕著である。よって、本定量方
法により得られた測定値は、血液中の糖化アルブミンの
濃度を十分反映していると考えられる。このことは、後
記の実施例で示されるように、ヒト血清アルブミンから
調製した糖化アルブミン（Glc HSA）溶液を検体として
本定量方法を行った場合にも、十分に満足のいく結果が
得られたことからも示唆される。故に、血液中のアルブ
ミンの半減期を考慮するに、本定量方法は、特に、約２
週間前の血糖コントロ−ル状態を知るのに有用であり、
糖尿病等の治療や診断に役立つと考えられる。また、検
体に毛髪を用いた場合には、文献（糖尿病３４,５７１,
１９９１）等の報告から、過去の連続した血糖コントロ
−ル状態、長期間の平均血糖値、糖尿病の発症時期等を
知るのにも有用である。以下に、参考例、実施例および
試験例を示すが、これらは何等本発明を限定するもので
はない。

【００１１】参考例１（Glc HSA溶液の調製） Chem. Pharm. Bull,40, 255(1992)に記載の方法に準じ
て、ヒト血清アルブミン（HSA, human serum albumin,
1g）と D-glucose（2g）をリン酸緩衝液（20mL,0.067mo
l/L, pH 7.4）に溶解して、３７℃で２日間インキュベ
−トした。反応液は、透析チュ−ブを用いて４℃で２日
間透析した。透析液である上記リン酸緩衝液は、毎日更
新した。Glc HSA濃度は、ＮＢＴ−還元法で測定し、Glc
HSA調製液（フルクトサミン値，1480μmol/L；アルブ
ミン，29g/L）は、１.５ｍＬずつ分注し−２０℃で凍結
保存した。

【００１２】実施例（ヒドラジン試薬の調製） ３ｍＬのヒドラジン・１水和物（H₂N-NH₂・H₂O）を１０
ｍＬの蒸留水に溶解し、これに酢酸を加えてｐＨ９.４
に調整した（最終濃度，約４.０ｍｏｌ/Ｌ） （フェニルヒドラジン溶液の調製）フェニルヒドラジン
塩酸塩の４０％酢酸溶液（最終濃度，０.０２ｍｏｌ／
Ｌ)を調製した。 （一般的定量方法）試料とヒドラジン試薬（０.１ｍ
Ｌ，約４.０ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ９.４）の混液を１００℃
で３０分間加熱後、フェニルヒドラジン溶液（０.６ｍ
Ｌ，０.０２ｍｏｌ／Ｌ，４０％酢酸含有）を加えて６
０℃で一定時間（最高６０分間）加熱後、その反応液を
遠心分離（１４００×ｇ １０分）にかけて得られる上
清について、各時間ごとの吸光度を３９０ｎｍで測定し
た。また、試料にヒト血清を使用する場合には、同量の
グルコ−スオキシダ−ゼ（約５単位）を加えて、３７℃
で３０分間のインキュベ−ション後、反応に付した。

【００１３】実施例１（Glc HSAの定量） 前記一般的定量方法に従い、各種濃度のGlc HSA水溶液
（０.１ｍＬ）とヒドラジン試薬（０.１ｍＬ）の混液を
１００℃で１０分間加熱後、フェニルヒドラジン溶液
（０.６ｍＬ）を加えて５０℃で加熱し、各時間ごとの
吸光度を測定した。第２工程の反応を６０分間行なった
時の反応生成物を単離したところ、そのＵＶ吸収スペク
トル（λ_max(in AcOH)_nm(ε):389.8(2.5×10^-4)）か
ら、D-Glucose-bis-phenylhydrazoneであると確認され
た。

【００１４】第２工程の反応を短時間行なった時の吸光
度の変化を図１に示す。約１ないし５分以内の初期反応
では、吸光度は、時間依存的に直線的な上昇を示したこ
とから、レ−トアッセイ法による測定が可能であると予
想される。またGlc HSA（１８５μｍｏｌ／Ｌ）を使用
して、第２工程の温度を変える以外は、上記と同様の方
法で吸光度を測定した。結果を図２に示す。加熱温度が
約５０〜７０℃の条件では、吸光度は、反応開始後約６
０分までほぼ時間依存的に増加した。

【００１５】実施例２（ＮＢＴ−還元法との相関性） 臨床試料（血清，ｎ＝３５）を検体として定量し、同時
に特公平１−１３０６２公報に開示されているＮＢＴ−
還元法との相関性を求めた。 （試験方法）本発明 ：試料（０.０５ｍＬ）とグルコ−スオキシダ−
ゼ溶液（５単位，０.０５ｍＬ）の混液を３７℃で３０
分間のインキュベ−ション後、前記一般的定量方法に従
い、ヒドラジン試薬（０.１ｍＬ）を加え、１００℃で
３０分間加熱した。更に、フェニルヒドラジン溶液
（０.６ｍＬ）を加えて、６０℃で６０分間加熱後、遠
心分離により得た上清の吸光度を測定した。ＮＢＴ−還元法 ：試料（０.０５ｍＬ）と発色試薬（塩
化ニトロブル−テトラゾリウム（0.48mmol/L）含有の
０.２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液，ｐＨ１０.３，１ｍＬ）の
混液を３７℃でインキュベ−ション後、１０分および１
５分後に試薬ブランクを対照に５４６ｎｍの吸光度を測
定した。次式により、蛋白の糖化度（μｍｏｌ／Ｌ）を
求めた。 糖化度＝（△Ｅ_S／△Ｅc）×標準液の糖化度
（但し、△Ｅs、△Ｅcは、それぞれ検体、標準液の１０
分と１５分後の吸光度の差を示す。)結果を図３に示す。
相関係数は、ｒ＝０.９２（ｙ＝１.２ｘ−７.１，SD＝
６３.９，ｎ＝３５）となり両結果は良い相関性を示し
た。

【００１６】実施例３（糖尿病患者と正常人における血
液中の糖化蛋白の定量） （対象） 正常人：集団健康診断で健康と認定された男女（年齢２
２−５２才,ｎ＝３２） 糖尿病患者：ＷＨＯ基準に基き糖尿病と判定された患者
（年齢４７−７５才,ｎ＝３２） （検体の調製）食前に採取した血液（血液凝固阻止剤は
非添加）が凝固した後、遠心分離（１４００×ｇ，１０
分）にかけ、その上清である血清を−２０℃で保存し
た。 （定量方法）試料（０.０５ｍＬ）とグルコ−スオキシ
ダ−ゼ溶液（５単位，０．２ｍｏｌ／Ｌの燐酸緩衝溶液
に溶解，０.０５ｍＬ）の混液を３７℃で３０分間のイ
ンキュベ−ション後、前記一般的定量方法に従い、ヒド
ラジン試薬（０.１ｍＬ）を加え、１００℃で３０分間
加熱した。更に、フェニルヒドラジン溶液（０.６ｍ
Ｌ）を加えて、６０℃で６０分間加熱後、遠心分離（１
４００×ｇ，１０分）により得た上清の吸光度を測定し
た。 （結果）結果を図７に示す。正常人と糖尿病患者におけ
る血中の糖化蛋白濃度の平均値を比較すると、顕著な差
が認められた。実施例４ （糖尿病患者と正常人における毛髪中の糖化蛋
白の定量） （対象） 正常人：集団健康診断で健康と認定された男女（年齢２
２−５２才,ｎ＝３２） 糖尿病患者：ＷＨＯ基準に基き糖尿病と判定された患者
（年齢４７−７５才,ｎ＝３２） （検体の調製）６０℃のエタノ−ル及び蒸留水（それぞ
れ１ｍＬ）で洗浄した毛髪断片（約１０ｍｇ，１ｍｍ以
下）を蒸留水（０．１ｍＬ）に懸濁。 （定量方法）蒸留水懸濁液（０．１ｍＬ）に、前記一般
的定量方法に従い、ヒドラジン試薬（０.１ｍＬ）を加
え、１００℃で３０分間加熱した。更に、フェニルヒド
ラジン溶液（０.６ｍＬ）を加えて、６０℃で６０分間
加熱後、遠心分離（１４００×ｇ，１０分）により得た
上清の吸光度を測定した。 （結果）結果を図８に示す。正常人と糖尿病患者におけ
る毛髪中の糖化蛋白濃度の平均値を比較すると顕著な差
が認められた。よって、本発明定量方法は、検体として
ヒトの毛髪を使用した時にも、糖尿病の診断に有用であ
ることが示唆される。試験例１ （呈色性の比較）呈色性について、前記文献記
載のフェニルヒドラジン法との比較を行なった。 （試料）Glc HSA 溶液（１８０μｍｏｌ／Ｌ，０.１ｍ
Ｌ）（試験方法） 本発明法：前記一般的定量方法に従い、試料とヒドラジ
ン試薬の混液を１００℃で３０分間加熱後、フエニルヒ
ドラジン溶液を加えて６０℃で加熱して、３９０ｎｍで
吸光度を測定した。 フェニルヒドラジン法：試料と蒸留水（０.１ｍＬ）の
混液を、室温下、３０分放置後、フエニルヒドラジン溶
液（０.６ｍＬ）を加えて６０℃で加熱して、３９０ｎ
ｍで吸光度を測定した。 結果を図４に示す。本定量方法は、フェニルヒドラジン
法に比べて著しく強い呈色性を示した。

【００１７】試験例２（呈色安定性） （試料） Glc HSA 溶液（３６０または７２０μmol/L, ０.１m
Ｌ） （試験方法）前記一般的定量方法に従い、試料とヒドラ
ジン試薬の混液を１００℃で３０分間加熱後、フェニル
ヒドラジン溶液を加えて６０℃で６０分間加熱した。反
応液を遠心分離にかけ、その上清を室温（２２−２３
℃）で放置後、吸光度を測定した。結果を図５に示す。
放置後、１０〜６０分後の吸光度の変化は、初期値に対
して約０.４〜２.２％であったことから、本定量方法に
おける呈色安定性は極めて高いことが判る。

【００１８】試験例３（グルコ−スオキシダ−ゼによる
前処理の効果） （試料） 試験検体： グルコ−ス（２７.８ｍｍｏｌ／Ｌ）およ
びグルコ−スオキシダ−ゼ（０〜２０.８単位，５０μ
Ｌ）を含有する Glc HSA溶液（７４０μｍｏｌ／Ｌ，５
０μＬ） 対照検体： 試験検体に対してグルコ−スの代わりに蒸
留水を加えたGlc HSA溶液 （試験方法）各検体をそれぞれ３７℃で３０分間、イン
キュベ−トした後、前記一般的定量方法に従い、試料と
ヒドラジン試薬の混液を１００℃で３０分間加熱後、フ
エニルヒドラジン溶液を加えて６０℃で加熱して、吸光
度を測定した。試験検体の吸光度値をＯＤ(test)、対照
検体の吸光度値をＯＤ(control)として、グルコ−スオ
キシダ−ゼによる前処理の効果を対照比（％）（（ＯＤ
(test)／ＯＤ(control)）×１００（％），（ＯＤ(tes
t)：試験検体の吸光度値，ＯＤ(control)：対照検体の
吸光度値）として図６に示す。グルコ−スオキシダ−ゼ
が約５単位以上では、対照比はほぼ１００％を示し、試
料中のグルコ−スが酸化され本呈色系への影響はほとん
ど除かれることが判った。よって、ヒト血清試料の場合
には、グルコ−スオキシダ−ゼ（約５単位以上）による
前処理を行なえばよく、好ましくは、約３７℃で約３０
分間程度インキュベ−トすればよい。

【００１９】試験例４（測定精度） 本定量方法による同時および日差再現性を求めた。 （試料）Glc HSA（１４４０μｍｏｌ／Ｌ）溶液を蒸留
水で希釈した４〜６種類の試料。 （試験方法）いずれの再現性についても、前記一般的定
量方法に従い測定して求めた。ただし、同時再現性につ
いては、冷凍保存しておいた検体（ｎ＝１０）を、同時
に反応させて測定し、また日差再現性については、冷凍
保存しておいた検体（ｎ＝１０）を、毎日１本ずつ１０
日間、反応させて測定することにより調べた。いずれの
再現性（ＣＶ，％）も、各平均値に対する誤差の割合
（％）より算出した。結果を表１に示す。

【表１】 同時、日差再現性とも試料濃度が約１０μｍｏｌ／Ｌ以
上においては、約１０％以下のＣＶ値を示し、高い測定
精度が得られた。

【００２０】試験例５（正確度） （試料）プ−ルした正常ヒト血清（２５μＬ）に各種濃
度の Glc HSA 溶液２５μＬを添加した試料。 （試験方法）試料（５０μＬ）およびグルコ−スオキシ
ダ−ゼ（５単位，５０μＬ）の混液を３７℃で３０分間
インキュベ−トした後、前記一般的定量方法に従って定
量した（ＯＤ_A）。一方、ブランクとして、プ−ルした
正常ヒト血清に、Glc HSA 溶液の代わりに同量の蒸留水
を添加した試料を用いて、同様に吸光度を求めた（ＯＤ
_B）。同様にして、ヒト血清の代わりに蒸留水に、Glc H
SA 溶液を添加した試料より求めた吸光度を（ＯＤ_C）、
蒸留水に、Glc HSA 溶液の代わりに同量の蒸留水を添加
して求めた吸光度を（ＯＤ_D）とする。回収率を［（Ｏ
Ｄ_A−ＯＤ_B）／（ＯＤ_C−ＯＤ_D）］×１００（％）とし
て求めた結果を表２に示す。

【表２】 回収率は、９０〜１００％に近い値を示したことから、
本定量方法では、選択的かつ定量的に反応が進行し、正
確度の高いことが判る。

【００２１】試験例６（共存物質の影響） 血清成分、その他の化学物質の本定量方法に与える影響
を調べた。 （試料）各物質の水溶液（ただし、尿酸の場合は、アル
カリ溶液）０.１ｍＬをプ−ルした正常ヒト血清（１ｍ
Ｌ）に加えて試料を調製した。各試料中の添加物質の最
終濃度は、正常濃度の２−１０倍である。一方、同量の
蒸留水のみを加えたものを対照とした。 （試験方法）前記一般的定量方法に従い、各試料につい
てそれぞれ３回測定し、各平均値（検体：Ｘ₁，対照：
Ｘ₂）より求めた対照比（％）［（（Ｘ₁−Ｘ₂）／Ｘ₂）
×１００］を表３に示す。

【表３】 いずれの物質を添加した場合も、対照比は数％以内であ
り、正常血中濃度の上限の約２〜３倍以内であれば本定
量方法に影響しないと推定される。また、対照だけを測
定した時の同時再現性（ＣＶ）が約８％であったことか
ら、対照比が８％に達する時の最高濃度を求めた。結果
を表４に示す。

【表４】 代表的な糖類および蛋白質について、対照比が８％に達
する最高濃度は正常濃度を充分上まわった。よって、通
常レベルでは、これらの共存物質は、本定量方法にほと
んど影響しないと推定される。

【００２２】

【発明の効果】本発明によれば、生体組織、特に血液中
または毛髪中の糖化蛋白を緩和な条件下で、迅速かつ簡
便に定量出来る。本定量方法は、高感度である上、呈色
の安定性もよく、また発色物質の吸着等の問題もない。
また、再現性がよく高精度で正確な定量が可能であり、
レ−トアッセイ法による自動分析にも適した実用性の高
い定量方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、各種濃度のＧｌｃ ＨＳＡ を本定量方
法により定量した時の、第２工程の反応時間と吸光度の
関係を表わす。

【図２】図２は、第２工程の反応温度を変えて、Ｇｌｃ
ＨＳＡを本定量方法により定量した時の、第２工程の
反応時間と吸光度の関係を表わす。

【図３】図３は、ヒト血清を検体として糖化蛋白を定量
した時の、本定量方法とＮＢＴ−還元法との相関性を示
す。

【図４】図４は、Ｇｌｃ ＨＳＡを定量した時の、本定
量方法とフェニルヒドラジン法における呈色性の相異を
示す。横軸は、第２工程の反応時間を表わす。

【図５】図５は、Ｇｌｃ ＨＳＡを、本定量方法により
定量した時の呈色安定性を示す。横軸は、第２工程の反
応を６０分間行なった後の時間経過を表わす。

【図６】図６は、グルコ−ス存在下、本定量方法により
Ｇｌｃ ＨＳＡを定量した時の、グルコ−スオキシダ−
ゼによる前処理の効果を示す。縦軸は、グルコ−スを含
有しないブランクに対する対照比を表わし、横軸は、グ
ルコ−スオキシダ−ゼの単位を表わす。

【図７】図７は、正常人と糖尿病患者を対象に、血中の
糖化蛋白濃度を本定量方法により比較測定した結果を示
す。

【図８】図８は、正常人と糖尿病患者を対象に、毛髪中
の糖化蛋白濃度を本定量方法により比較測定した結果を
示す。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】糖化蛋白と共存するグルコ−スを酸化処理
   した検体を、ヒドラジンで処理した後、発色剤と反応さ
   せて比色定量することを特徴とする糖化蛋白の定量方
   法。
2. 【請求項２】該検体が血液検体または毛髪検体である請
   求項１記載の定量方法。
3. 【請求項３】該酸化処理を、グルコ−スオキシダ−ゼで
   行なう請求項１記載の定量方法。
4. 【請求項４】ヒドラジンによる処理を、ｐＨ約８.０〜
   約１２.０ で行なう請求項１記載の定量方法。
5. 【請求項５】ヒドラジンによる処理を、約３０〜約１３
   ０℃で行なう請求項１記載の定量方法。
6. 【請求項６】該発色剤がフェニルヒドラジンである請求
   項１記載の定量方法。
7. 【請求項７】フェニルヒドラジンとの反応を、約３０〜
   約８０℃で行なう請求項６記載の定量方法。
8. 【請求項８】該比色定量を、レ−トアッセイ法により行
   なう請求項１記載の定量方法。