JPH0631316B2 - ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、フイブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉ
ｎ）に関係したポリペプチドに関し、特に細胞表面と相
互に作用して細胞表面への付着を促進する人の血漿フイ
ブロネクチンのポリペプチド・フラグメントに関する。

背景技術 フイブロネクチンは、約４５０×１０^３ダクトン（原子
質量単位）と大きな糖タンパク質であつて、いくつかの
独立した官能ドメインからなる。初期のフイブロネクチ
ンは細胞外マトリツクスの主タンパク質として発見され
た、そしてそれは、試験管内でコラーゲン、グリコサミ
ノグリカン、プロトグリカン、フイブリノーゲン、フイ
ブリンおよびアクチンのような他の構成分子、並びに細
胞表面と相互に作用することが示された。フイブロネク
チンは浮遊細胞のコラーゲンへの付着を促進すると共
に、このコラーゲンへの結合とは無関係に、浮遊細胞の
組織培養基質への直接付着を促進することが発見され
た。従つて、細胞表面と相互に作用するフイブロネクチ
ンの分野についての研究が続けられてきた。

発明の開示 本発明により、フイブロネクチンの細胞付着を促進する
活性を具体的に示すフイブロネクチンのポリペプチド・
フラグメントが単離、精製された、そしてそれは次式を
有する１１．５ｋＤａｌの（キロダルトン）ペプチドと
して特徴づけられる： Ｈ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉ
ｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ． このペプチドは１０８個のアミノ酸残基を有しする、そ
して細胞付着、生物学的活性を有するそのペプチドまた
はそのフラグメントは、細胞が付着する基質の調製に使
用することができる。そのような基質は細胞培養皿に有
用であると共に、ある種の細胞を表面へ引き付けるとこ
ろの人体における移植用医療プロテーゼ（補綴）装置に
用いるのに有効である。

細胞付着活性を有する本発明のポリペプチドは，以下に
示すアミノ酸配列，または該配列のＮ末端から数えて第
１０番目のプロリン残基（Ｐｒｏ）周辺の親水性部分に
相同性のあるアミノ酸配列を有する： Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ− Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ。

基質表面への細胞付着を促進させる本発明の方法は，細
胞付着活性を有する上記ポリペプチドを該基質表面に付
着させることを包含する。

当該分野でよく知られているように，例えば２つ以上の
ポリペプチドの一次構造を比較する際，アミノ酸を無秩
序に並べて比較した偶然の類似性に対する数値に比し
て，これらのポリペプチドのアミノ酸配列間における類
似性が高いと判断できる場合，これらのポリペプチドの
アミノ酸配列には「相同性」があるという。本発明のポ
リペプチドは，そのアミノ酸配列のＮ末端から数えて第
１０番目のプロリン残基（Ｐｒｏ）周辺に親水性部分を
有する。そして，以下の結果の項で詳しく述べるよう
に，本発明のポリペプチドは，この親水性部分の曲がり
（ねじれ）を細胞との相互作用に利用することにより，
細胞付着活性を示すと考えられる。従つて，この親水性
部分に相同性のあるアミノ酸配列を有するポリペプチド
が同様に細胞付着活性を有することは，当業者に容易に
理解される。

図面の簡単な説明 第１図は、細胞付着を誘導する１１．５ｋＤａｌのフイ
ブロネクチン・フラグメントの周知配列の後で考案され
た４つの合成ペプチドを示す。これらのペプチド・フラ
グメントの開裂からの残基に対応する。図示の線は２つ
のペプチドに共通するアミノ酸を示す。

第２図は、人のフイブロネクチン（ＨＦＮ）または合成
ペプチドを被覆したポリスチレン製ミクロタイター縦穴
に普通のネズミの腎臓（ＮＲＫ）細胞を付着することを
示すグラフである。それぞれの縦穴において、１０個の
細胞が１時間温置され、そして付着した細胞を計数し
た。フイブロネクチンおよびペプチドＩ、II、IIIおよ
びIVは、ポリスチレンに直接吸着されたとき、およびア
ルブミン（ＢＳＡ）に結合されたとき分折した。アルブ
ミン単独も試験した。フイブロネクチンのモル数は１つ
のサブ・ユニツト（２４０ｋＤａｌ）の分子質量を用い
て計算した。細胞はフイブロネクチンおよびペプチドIV
を含む縦穴に付着するが、他のペプチドまたはアルブミ
ンのみを含む縦穴には付着しない。

第３図は、ヨウ素標識化ペプチドII、III、およびIVの
プラスチツク・ミクロタイター縦穴への結合を示すグラ
フである。各縦穴において結合されたペプチドの量は各
ペプチドの特定放射能から計算した。

発明を実施するための最良の形態 ポリペプチドを定義するために使用した命名法はＳｃｈ
ｒｏｄｅｒおよびＬｕｂｋｅ（“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９６５））
によつて明記されたものであり、従来の表示に従つてＮ
−末端は左側そしてＣ−末端は右側に示される。アミノ
酸残基が異性体の形をもつ場合には、表示されるのはＬ
形のアミノ酸である。

本発明は次の式を有するポリペプチドを提供する： Ｈ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ
−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａ
ｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉ
ｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ そして同一の細胞付着活性を有する前述の分離フラグメ
ント、例えば次の合成フラグメントを含むことを意図し
ている： Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａ
ｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ． 上記フラグメントとして同一の細胞付着活性を有するよ
り短いフラグメントも細胞が付着する表面を提供するの
に有用であり、本発明に含まれる。このような短いフラ
グメントの一例としては，上記の合成フラグメントのＮ
末端から数えて第１０番目のプロリン（Ｐｒｏ）残基周
辺の親水性部分（例えば，Ｎ末端から数えて第６番目か
ら第８番目のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）からなるフラグ
メントが挙げられる。さらに、ペプチドを表面に結合す
ることが、ある場合にＣ−末端におけるＣｙｓ（システ
イン）残基を添加することによつて細胞付着促進活性に
影響を与えることなく促進される。

ペプチドまたはそのフラグメントは適当な方法、例えば
独占的固相法、部分的固相法、フラグメント縮合法、ま
たは古典的溶液添加法によつて合成することができる。
さらに、その合成は最近開発された組換えＤＮＡ法によ
つても行なわれる。

ペプチドの化学合成に共通することは、種々のアミノ酸
部分の活性側錯基を適当な保護用基（その基が最終的に
除去されるまでその位置で化学反応が生じるのを防ぐ
基）での保護である。また、一般に、カルボキシル基に
おいて反応し、α−アミノ保護基の選択的除去をしてそ
の位置で後続の反応をさせる間、アミノ酸またはフラグ
メントのα−アミノ基も保護される。従つて、一般に、
合成の１工程としてペプチド連鎖に所望の配列で配置さ
れたアミノ酸残基の各々を含む中間化合物が生成され
る、これら種々の残基は側鎖保護基を有する。一般に、
これらの保護基は、次に所望の生成物を得るべく実質的
に同時に除去される。

ペプチドは、前述の種々の化学合成法も使用されるけれ
ども、例えば、メリフイルド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９（１９
６４）参照）によつて開示されたような固相合成法によ
つて調製するのが望ましい。固相合成法は、リビエル
（Ｒｉｖｉｅｒ）らによる１９８２年１月２１日付け米
国特許第４，２４４，９４６号に開示されているよう
に、保護されるα−アミノ酸を適当な樹脂へ結合するこ
とによつて、ペプチドのＣ−末端から始まる。この一般
的な形式の合成例は米国特許第４，３０５，８７２号お
よび第４，３１６，８９１号に示されている。ベールら
（Ｖａｌｅ ｅｔ ａｌ）の論文、すなわちＳｃｉｅｎ
ｃｅ，２１３，１３９４−１３９７（１９８１年９月）
には４１−残基のポリペプチドの固相合成が論議されて
いる、それはさらに詳細な合成の論議をしており、マル
キイら（Ｍａｒｋｉ ａｔ ａｌ）らの論文であるＪ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，３１７８（１９８
１）にみられる。

ペプチドの合成において、適当に保護されるα−アミノ
基を有するＭｅｔ（メチオニン）はクロロメチル化ポリ
スチレン樹脂などに結合される。メチルチオールの側鎖
は任意に保護または保護されないままである。Ｃｙｓ
（システイン）をＣ−末端に用いる場合、それは、その
α−アミノ基およびスルフヒドリル側鎖を保護した後で
樹脂に結合されるα−アミノ保護基の除去後、塩化メチ
レンにトリフルオロ酢酸を使用するような合成における
次の工程を行なう。特定のアミノ保護基を除去する他の
標準開裂用試薬および条件が、前記単行本「ペプチド」
に記載されているように使用される。

次に、アミノ酸を保護する残りのα−アミノおよび側鎖
を所望の順序で段階的に結合して樹脂に結合された中間
化合物を得る。合成においては各アミノ酸を別々に添加
する別の方法としては、固相反応器に添加する前にそれ
らのいくつかが相互に結合されれる。適当な結合試薬の
選択は技術的な問題である。

所望のアミノ酸配列を完成した後、中間ペプチドは、樹
脂からペプチドを開裂するのみならず残りの側鎖保護基
を全て開裂する液体ＨＦのような試薬で処理することに
よつて樹脂担体から除去される。次に、ポリペプチド
は、リビエールらの論文（Ｒｉｖｉｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔｒｕｅｔｕｖｅ ａｎｄ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（１９７
９），ｐｐ．１２５−１２８）に記載されているよう
に、半調製のＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフイ
−）を伴うゲルパーミエーシヨンによつて精製すること
ができる。少なくとも９３％またはそれ以上の純度（存
在する全てのペプチドを基準にした値）が適度に得ら
れ、この純度は臨床試験や使用に望ましい値である。約
９８％と高純度が実際的であるが、ある種の試験管での
用途には、さらに低純度が受け入れられる。従つて、ポ
リペプチドは、この用途のためには、存在する全てのペ
プチドを基準にして少なくとも約５０重量％を意味する
かなりの純粋であるときに特に有用であると考えられ
る。

実験Ｉ 材料および方法 フイブロネクチンおよびそのフラグメントの単離および
精製 フイブロネクチンの細胞付着ドメインは，前述のように
精製した（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ
ａｌ，（１９８１）Ｃｅｌｌ ２６，２５９−２６７
参照）。フイブロネクチンは新鮮な正常血漿からゼラチ
ン−セフアロースアフイニテイークロマトグラフイーに
よつて単離した。寒冷沈降物から得たフイブロネクチン
・フラグメントをＮａＣｌ／Ｐ_１に溶解し１０ｍｇ／ｍ
とする。次いで，キモトリプシン（VII型，シグマ）
により，３７℃にて１時間消化した。ジフエニルカルバ
ミルクロライド（シグマ）を最終濃度が１ｍＭとなるよ
うに添加することにより消化を停止させた。この溶液か
らフラグメントを次のようにして単離した。寒冷沈降物
中に存在するゼラチン結合成分はゼラチン−セフアロー
スで単離した。溶出物は水に対して透析し，凍結乾燥し
た。水に溶解する物質は、さらにヘパリン−セフアロー
ス（フアルマシア）により分別した。ヘパリン−セフア
ロースのカラム（１．５×１０ｃｍ）はリン酸緩衝食塩
水（ＮａＣｌ／Ｐ_１；ｐＨ７．３）により平衡化した。
このカラムを用いて，ＮａＣｌ／Ｐ_１に溶解した１０ｍ
ｇのタンパクを分別した。このカラムはカラム体積の１
０倍量のＮａＣｌ／Ｐ_１で洗浄し，そしてカラムに結合
した物質は、０．５ＭＮａＣｌを含有する５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。カラムに
結合した画分および結合しなかつた画分を水に対して透
析し，凍結乾燥した。結合しなかつた画分は，さらにセ
フアデツクスＧ−２００およびセフアクリルＳ−２００
（フアルマシア）を用いたゲル濾過により分離した。こ
れらゲル濾過には，それぞれＮａＣｌ／Ｐ_１で平衡化し
た２．５×１００ｃｍおよび１．５×９０ｃｍのカラム
を用いた。分別は，２６０ｎｍにおける吸光度の測定，
および硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリル
アミドゲルのスラブゲル電気泳動によりモニターした。
ゲルはコマシーブルーを用いて染色した。ゲル濺過にお
ける分子量マーカーとして，ＩｇＧ（Ｍ_１＝１５０，０
００），ウシ血清アルブミン（Ｍ_１＝６７，０００），
およびオバルブミン（Ｍ_１＝４３，０００）を用いた。
電気泳動は，試料を１％の２−メルカプトエタノールで
還元しない条件下または還元する条件下で実施した。標
準物質として，ミオシン（Ｍ_１＝２００，０００）と，
ホスホリラーゼｂ（Ｍ_１＝９４，０００），アルブミン
（Ｍ_１＝６７，０００）およびオバルブミン（Ｍ_１＝４
３，０００）の混合物（低分子量のキヤリブレーシヨン
用キツト，フアルセシア）とを用いた。フイブロネクチ
ンのトリプシンフラグメント（Ｍ_１＝３０，０００）
は，すでに特徴付けられている。

また，フイブロネクチンの１またはそれ以上の活性部位
を有するフラグメントは，このフイブロネクチン分子を
トリプシンまたはキモトリプシンで消化することにより
単離した。フイブロネクチンはトリプシンまたはα−キ
モトリプシン（シグマ）で消化し，そして上述のように
ゼラチン−セフアロース，次いでヘパリン−セフアロー
ス（フアルマシア）を用いて分別した。ゼラチンに結合
したフラグメントおよびヘパリンに結合したフラグメン
トは，キモトリプシン消化物から，それぞれゼラチン−
セフアロースおよびヘパリン−セフアロースを用いて得
られた。いずれのマトリツクスにも結合しない物質は１
つの大ききなフラグメントから構成されていた。このフ
ラグメントは，さらにセフアクリルＳ−２００を用いた
ゲル濾過により精製した。場合によつては、後者のフラ
グメントは，さらにヘプシンで消化した。この消化は、
２ｍｇ／ｍタンパク濃度のフラグメントを０．２Ｍ酢
酸（ｐＨ２．３）中の１％（ｗ／ｗ）ヘプシン（シグ
マ）で３７℃にて１．５時間インキュベートすることに
より行つた。この溶液に固体状のトリス塩基（シグマ）
を添加することによりｐＨ８とし，消化を停止させた。
消化生成物は抗体マトリツクスで分別した。

硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ポリアクリルアミドの濃度勾配を１０〜２０％と
し，分子量マーカーを用いた）および超遠心分離によつ
て分子量を定量した。１０８個のアミノ酸を有するフラ
グメントの分子量は約１２，０００であつた。

超遠心分離は６−場所のアルミニウム・ロータを備えた
分析用遠心分離機（ＭＳＥ Ｃｅｎｔｒｉｓｃａｎ（Ｔ
Ｍ））で行つた。１ｃｍの単一セクター・セル内の３ｍ
ｍカラムで低速平衡沈降法を適用した。部分的特定体積
はアミノ酸の組成から計算した。

フラグメンテーシヨン法 メチオニン残基での開裂は、７０％ギ酸中１００倍（モ
ル）過剰の臭化シアンで試みた。

アスパルチル・ボンドにおける酸開裂は、密閉した真空
管内の希塩酸中で１１０℃において２時間行つた。その
試料は次に凍結乾燥した。

トリプトフアン残基における開裂は、等体積の８８％ギ
酸とヘプタフルオロ酪酸中、数千倍（モル）過剰の臭化
シアンでタンパク質を処理することによつて行つた。

Ｓｙａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プ
ロテアーゼ（Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，１Ｎ）の消
化は、０．１％硫酸ドデシルナトリウムを含む０．１Ｍ
重炭酸アンモニウム中で酵素と基質との比１：５０（Ｗ
／Ｗ）を用いて行つた。

サーモリシン（ＴＭ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の消化は、酵素と基質との比１：１
００（Ｗ／Ｗ）で５ｍＭ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ
重炭酸アンモニウム中で４５℃において１時間行つた。
その消化はＥＤＴＡを添加することによつて停止した。

カルボキシペプチダーゼＡの消化は、０．１％硫酸ドデ
シル・ナトリウムを含む０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに
溶解された細胞付着フラグメントを処理することによつ
て行つた〔カルボキシペプチダーゼＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）〕での酵素と基質との比は１：
５００（Ｗ／Ｗ）であつた）。種々の時点で一部を取り
出し、最終濃度５０％に酢酸を添加することによつて反
応を停止させた。これらの材料は次に凍結乾燥して、遊
離アミノ酸を分析した。基質を含まないブランクの消化
は平行して行つた。

ペプチドの精製 セフアデツクスＧ−７５（ＴＭ）特級品またはセフアク
リルＳ−２００（ＴＭ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ａ．
Ｂ．，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎのゲル・クロマト
グラフイーを最初の精製工程として採用した。Ｇ−７５
カラムを平衡させて０．１Ｍ重炭酸アンモニウムで溶離
した。Ｓ−２００カラムは６Ｍ塩酸グアニジンで行つ
た。それ以上の精製は、μ−ボンダパーク（Ｂｏｎｄａ
ｐａｋ）Ｃ_１８−カラム（ＴＭ）に関する逆相液体クロ
マトグラフイシ（Ｗａｔｅｒｓ〔Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，Ｍ
Ａ〕二重ポンプ勾配のクロマトグラフイー装置）によつ
て行つた。ペプチドの溶離には０．１Ｍ重炭酸アンモニ
ウム中０〜８０％エタノールの６０分の直線勾配を用い
た、それはＬＤＣスペクトロモニターIII（ＴＭ）の可
変波長検出器を使用して波長２３０ｎｍにおける吸光度
によつて測定された。

ペプチドは、０．１％フエノールを含む６Ｎ塩酸中で１
１０℃において２４時間加水分離し、ベツクマン（Ｔ
Ｍ）１２１Ｍアミノ酸分析装置（Ｔｒａｇｒｄｎ，Ｌ，
ｅｔ ａｌ（１９７０））で分析した。セリンおよびト
レオニンの値は、加水分解中のロスは標準補正係数を用
いて、またそのままの細胞付着フラグメントの場合には
２４．４８および７２時間の加水分解時間を用いて零時
間への直線外挿法によつて補正を行つた。トリプトフア
ンは分光光度法で定量した。システイン酸としてシステ
インの定量には過ギ酸の酸化を用いた。

アミノ酸配列の分析 自動エドマン分解は、ベツクマン１２２９７４迅速タン
パク質フアドロール（ＴＭ）プログラムを使用したベツ
クマン（ＴＭ）８９０Ｃシーケンサーで行つた。クアド
ロール（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラキス（２−ヒドロ
キシプロピル）エチレンジアミンの商品名）の濃度は
０．５Ｍであつた。アミノ酸のフエニルチオヒダントイ
ンの同定および定量は高性能液体クロマトグラフイー
（ＨＰＬＣ）で行つた。

結 果 アミノ−末端アミノ酸配列 そのままの細胞付着ドメインの自動アミノ酸配列の分析
は最初の５０残基の明瞭な同定をさせた。

化学的フラグメンテーシヨン アスパラチル（ａｓｐａｒｔｙｌ）結合における開裂の
ための希塩酸での細胞付着フラグメントの処理は、数種
のペプチドを生成した、その中のいくらかは凍結乾燥後
不溶性であつた。０．１Ｍの重炭酸アンモニウムに可溶
性のペプチドは、セフアデツクスＧ−７５（ＴＭ）のカ
ラムで１つの主ピークと４つの小ピークに分別された。
アミノ酸の組成データおよびＡ_２ペプチドの配列分析は
残基８７〜１０７の同定をさせた。０．１Ｍ重炭酸アン
モニウムに不溶性の部分は６Ｍの塩酸グアニジンに溶解
し、６Ｍ塩酸グアニジンで平衡させたセフアクリルＳ−
２００（ＴＭ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ，Ｓｗｅｄ
ｅｎ）のカラムで分別した。これは、５７残基ペプチド
（フラグメントＡ_１）の単離をさせた、そして自動エド
マン分解法の５３サイクルは細胞付着フラグメントの残
基３０〜８３のアミノ酸配列を生じた。

１つのフラグメントはトリプトフアン配向臭化シアンの
開裂から均一に精勢した。アミノ酸分析はそれが全細胞
付着フラグメントのアミノ−末端２８残基であることを
示した。自動配列分析はこの領域のフラグメントがアミ
ノ酸配列であることを確認した。

完全な細胞付着フラグメントのアミノ酸組成およびそれ
から化学的フラグメンテーシヨンによつて誘導した他の
ペプチドを次表に挙げる。部分Ａ_２における微少汚染物
質はアミノ酸組成と、見出された残基の実際の数との間
に若干の不一致をもたらした。しかしながら、自動配列
分析における良好な収率並びに他のペプチドとの広範囲
の重畳はこのペプチドの配列を明瞭にする。

メチオニンにおける開裂のための臭化シアンでの処理は
検出可能なフラグメンテーシヨンをもたらさなかつた、
これは、アミノ末端配列にメチオニンが見られなかつた
から、単一のメチオニン残基がカルボキシ末端に、また
はその直ぐ近くに位置していることを示す。

酵素の消化 全細胞付着フラグメントのカルボキシペブチダーゼＡに
よる消化によつて、５分でタンパク質１モル当り１モル
のメチオニンを放出した、それはこのアミノ酸をカルボ
キシ−末端残基として決定した。

２つの小ペプチドが、セフアデツクスＧ−７５クロマト
グラフイーの後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｖ８プロテアーゼ
消化から単離された。それらのアミノ酸組成から、それ
らがそれぞれ分子のアミノ−末端部分とカルボキシ−末
端部分に由来することは明らかである。アミノ酸配列の
分析は酸開裂フラグメントのカルボキシ−末端部分の配
列を確認した。

セフアデツクスＧ−７５（ＴＭ）のクロマトグラフイ、
続く高性能液体クロマトグラフイーによる熱分解消化物
から多数のペプチドが単離された。

熱分解ペプチドのアミノ酸配列データは他の配列にペプ
チドから得たデータを確認した。

全ポリペプチドが細胞付着活性により測定された所望の
生物学的活性を示すこと、およびポリペプチドのあるフ
ラグメントも実質的に同一の細胞付着活性を示すことが
わかる。従つて、１０８−アミノ酸残基ポリペプチドの
それら生物学的に活性のフラグメントは、発明の構成部
分、例えば合成、試験そして全配列と同じ活性を示すこ
とがわかつたＣ−末端における３０−残基フラグメント
と考えられる。Ｃ−末端におけるＣｙｓ−残基を有する
または有さない全ペプチド、または生物学的に活性のフ
ラグメントは、表面の処理に使用することによつて細胞
を付着する基質を提供するために細胞付着タンパク質と
して使用することができる。合成プラスチツク樹脂材
料、例えばニトロセルロースのようなセルロース・エス
テル、または同じような材料の表面は、細胞付着を確実
にするために本発明のポリペプチドで処理することがで
きる。細胞付着用の同様の基質は、ポリペプチドを固体
担体、例えばガラスや合成プラスチツク樹脂、またはポ
リペプチドに結合できる反応性基を含むアガロースのよ
うな長鎖多糖類にポリペプチドを共有結合で結合させる
ことによつて生成させることができる。この方法は、ペ
プチド並びに合成３０−残基フラグメントを臭化シアン
−活性化アガロース・ビード〔Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆ
ｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅ
ｄｅｎ）社により商品名セフアロースで販売されてい
る〕に結合させ、それらのビードを高圧滅菌によつて殺
菌し、しかる後にポリペプチドのコーテイングが受動的
吸収によつて得られる値よりも高濃度で細胞をそれらビ
ードに付着さすのを誘導することを示すことによつて証
明された。

細胞の付着位置の構造をさらに規定するために、４つの
合成ペプチドを考案した。各配列は１１．５−ｋＤａｌ
フラグメントから２９または３０のアミノ酸の配列を含
み、共にこの全領域を構成する。これらのペプチドを使
用して、ＣＯＯＨ末端の３０のアミノ酸がフイブロネク
チンの１１．５−ｋＤａｌの細胞付着性フラグメントの
細胞付着活性を説明することが示された。

実験II 材料および方法 ペプチドの原料 前述のゼラチン−セフアロース・クロマトグラフイーを
使用することによつて、新しく吸い出した血漿から人の
フイブロネクチンを得た。フイブロネクチンの消化から
１１．５−ｋＤａｌのペプチドを単離した。メリフイル
ドの固相法を用いて４つのペプチドを化学的に合成し
た、その合成はペニンスラ研究所（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏ
ｓ，ＣＡ）に与えられた仕様書に従つて行つた。合成ペ
プチドのデザインは、各配列が１１．５−ｋＤａｌの細
胞付着フラグメントのアミノ酸配列に従つて、隣接ペプ
チドと共通の３または４つのアミノ酸を有するものであ
つた。各ペプチドは、１１．５−ｋＤａｌのフラグメン
トからの一連の２９または３０のアミノ酸とＣＯＯＨ末
端におけるシステインを有して、ペプチドの固体相への
結合を促進する。ペプチドの組成はアミノ酸の分析によ
つて実証された。ペプチドは、１１．５−ｋＤａｌフラ
グメントのＮＨ_２末端から始まるローマ数字で数えられ
る（第１図）。

各ペプチドは自動ペプチドシンセサイザ（モデル４３０
Ａ；アプライド バイオシステムズ，フオスターシテ
イ，ＣＡ）を用い，製造業者によつて提供された仕様書
に従つて合成した。得られたペプチドは，バイオゲルＴ
ＳＫ ＳＰ−５−ＰＷカチオン変換カラム（バイオ−ラ
ツド−ラボラトリーズ リツチモンド，ＣＡ）を用いた
逆相高性能液体クロマトグラフイーによつて精製した。

このようにして得られた合成ペプチドのうち，特に本発
明のポリペプチドに対応するペプチドIV（そのアミノ酸
配列を第１図に示す）のアミノ酸分析の結果を以下の第
２表に示す。なお，アミノ酸分析は実験Ｉで述べた方法
と同様にして行なった。

第２表から明らかなように，合成されたペプチドIVのア
ミノ酸組成（第２表の実測値）は，第１図に示すアミノ
酸配列から推定されるアミノ酸組成（第２表の配列に基
づく個数）と良く一致している。なお，合成された他の
ペプチドＩ，II，およびIIIについても，同様にアミノ
酸分析を行なうことにより，それらのアミノ酸組成が第
１図に示すアミノ酸配列から推定されるアミノ酸組成と
良く一致することが実証された。

また，上記のペプチドIVの等電点を測定したところ，ｐ
Ｉ＝９．５９という値を得た。

ペプチドのポリスチレンへの結合 ４つの合成ペプチドはプラスチツクの倍養皿内で次のよ
うに細胞付着活性の試験をした。各ペプチド１ｍｇのｐ
Ｈ８．０、２ｍｇ／ｍの濃度で６Ｍの尿素に溶解し
た。ペプチドは次に、リン酸塩緩衝化塩類で平衡させた
５ｍセフアデツクスＧ−２５カラムを通すことによつ
てこれらの反応物質を除去した。ペプチドを含む部分は
収集し、プールして、細胞付着分析に使用した。未処理
のポリスチレン製ミクロタイター板に設けた複数の縦穴
（ｗｅｌｌ）は、それらの穴に２０μｇ／ｍの溶液を
室温で２時間温置することによつてウシの血清アルブミ
ン（以下アルブミンと記す）で被覆または被覆されなか
つた。付着しないタンパク質を除去するために、それら
の縦穴を洗浄した後、そのアルブミン被膜を先ず３−
（２−ピルジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミド・エステル（Ｓｉｇｍａ）、二官能架橋剤
で室温において３０分間、１０μｇ／ｍで誘導し、次
に還元されたペプチドを含む溶液を種々の濃度で前記縦
穴に添加して、少なくとも１時間反応させた（架橋剤は
主にアルブミン内のアミノ基と反応し、続いてペプチド
内のシステインを介してペプチドをアルブミンに橋かけ
する）。未付着のペプチドを除去するためくり返し洗浄
をした後、ミクロタイター板は細胞付着分析に使用し
た。ペプチドで直接被覆した縦穴における細胞付着は、
アルビミンの結合したペプチド、アルブミンの結合した
フイブロネクチン、フイブロネクチン単独、または誘導
されたアルブミン単独で見られるものと比較した。

ペプチドのセフアロース・ビードへの結合 ４つの合成ペプチド並びにフイブロネクチンの１１．５
−ｋＤａｌのフラグメントおよび２００−ｋＤａｌのフ
ラグメントを製造業者の仕様書に従つて臭化シアンで活
性化したセフアロース−６ＭＢビード（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に結合させた。それらのペプチドは先ず前述のよ
うに還元されて、セフアロース１ｍ当りペプチド８ｍ
ｇで使用された。アルブミンを被覆したビードおよびエ
タノールアミンで誘導したビードは対照試料として使用
した。

細胞付着の分析 細胞付着の分析は、人のフイブロブラストまたは普通の
ネズミの腎臓（ＮＲＫ）でルオスラテイらの論文（Ｒｕ
ｏｓｌａｈｔｉ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（１９８１）Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８２，８０３〜８３
１）に記載されているように行つた。要約すると、１０
個の細胞を含む単１細胞けん濁液１００ｍをペプチド
の１つまたはフイブロネクチンで被覆した平底のミクロ
タイターの縦穴に入れた。３７℃で１時間後、未付着細
胞は洗浄して除去し、付着細胞は固定し、計数のために
着色した。ある実験においては、媒質に可溶性のペプチ
ドを添加して、付着中にその存在が阻止作用を有するか
否かを決めた。アガロース・ビードへの細胞付着は、全
く前述のように丸底ミクロタイターの縦穴の底における
ビードの一層に関して行つた。

ペプチドのヨウ素化 周知のクロルアミン−Ｔ法を用いてペプチドII、III、I
Vの５０ｇをそれぞれ０．３３ｍＣｉ（１Ｃｉ（キユリ
ー）＝３．７×１０Ｂｑ）のＩ（ヨウ素）で識別した。
未結合のヨウ化物は除去し、セフアデツクスＧ−２５の
カラムを通すことによつて定量した。

結 果 細胞付着に及ぼす作用を研究した４つの合成ペプチドを
第１図に示す。分裂、およびそれによる細胞識別位置を
失う可能性を避けるために若干の重畳が含まれた。ペプ
チドはポリスチレンのミクロタイター縦欠へ直接吸着さ
せられたか、或いは二官能架橋剤を使用することによつ
てそれらのＣＯＯＨ末端のシステイン残基を介してアル
ブミンを被覆したポリスチレンに付着させられた。この
ように誘導された表面は次に細胞の付着を支える能力を
試験した。第２図はそれらの実験結果を示す。

フイブロネクチンの１１．５−ｋＤａｌの細胞付着フラ
グメントのＣＯＯＨ−末端の３０のアミノ酸（およびシ
ステイン残基）からなるペプチドIVは、アルブミンに結
合または表面に直接吸着されたＮＲＫの細胞および人の
フイブロブラストの付着を助けた。しかしながらアルブ
ミンへの結合はこのペプチドの活性を著しく増した。ア
ルブミンに結合された場合、２０ｎｇとわずかのペプチ
ドIVが、１つのミクロタイター縦穴当りに検出された
（第２図参照）。一方、ペプチドＩ、II、およびIIIは
この分析では活性を有さなかつた。全フイブロネクチン
の活性は架橋剤で誘導したアルブミンでの基質の前処理
には無関係であつた。タンパク質が直接またはアルブミ
ンを介してプラスチツクに結合したか否かのフイブロネ
クチンに対する結合曲線は類似したので、プラスチツク
に結合したフイブロネクチンを使用して得たデータのみ
を示す。

不活性ペプチドの活性欠除がポリスチレン表面への結合
不足のためでないことを確認するために、ペプチドII、
III、およびIVを放射性ヨウ素化して、ミクロタイター
の縦穴中で一晩温置した。第３図は、これら３つのペプ
チドは全てミクロタイターの縦穴に同じ程度に結合する
ことを示す。ペプチドIVが他のペプチドより少し弱い結
合であるのは、多分それが最も親水性であるためと考え
られる。３つのペプチドのポリスチレンへの結合は、対
応する非標識化ペプチドによつて抑制することができ
た。これは放射性ヨウ素化がこの種の表面への結合能を
変えなかつたことを示す。その上、細胞は非標識化ペプ
チドで見られるものと同一の放射線量依存法で^１２５Ｉ
−標識化ペプチドIVに付着した。試験は、可溶性の形で
のペプチドIVの存在がこのペプチドまたはフイブロネク
チンを被覆したミクロタイター縦穴への細胞の付着を抑
制するか否かを決定するために行つた。しかしながら、
１５０μｇ／ｍまでの濃度におけるペプチドIVは１時
間後にこれらの表面への細胞の付着に影響を与えなかつ
た。

ペプチドIVに見られた活性の特異性を確認するために、
全てのペプチドを臭化シアンで活性化したセフアロース
６ＭＢへ結合した。４つのペプチドの結合効率は全て、
紫外線吸収を基準にして判定したものより９０％以上大
であつた。ペプチドIVを結合したビードは、１１．５−
ｋＤａｌフラグメント全体またはフイブロネクチンの２
００−ｋＤａｌフラグメントでビードにしたように、細
胞の付着を助けた。後者のフラグメントは、フラグメン
トで被覆されたビードの安定性および生物学的活性が高
いので、そのままフイブロネクチンの代りに使用した。
エタノールアミンまたはアルブミンで誘導されたアガロ
ース・ビードは、それらの表面にペプチドＩ、II、また
はIIIを有するビードのように、細胞付着活性を欠い
た。

データは、フイブロネクチンの細胞付着活性の大部分
（全てでない場合）を３０のアミノ酸残基によつて説明
できることを示す。これはそのままのフイブロネクチン
・ポリペプチド単量体の約１％に過ぎないので、細胞表
面とフイブロネクチン分子のこの部分との間の極めて特
異な相互作用を推測することができる。活性ペプチドの
ペプチドIVは、フイブロネクチンの細胞付着ドメインを
構成する４つの合成ペプチドの中で最も親水性である、
一方ペプチドIIおよびIIIは極めて疎水性であつて、ペ
プチドＩは中間の特性を示す。多分、これがそのままの
フイブロネクチン分子の対応する部分の表面にされされ
るペプチドIVの３０の雑基をもたらし、フラグメントの
この部分のおける活性の存在と一致する。

ペプチドIVは疎水性のポリスチレン表面と親水性のセフ
アロース・ビードを含む３つの異なるタイプの表面に活
性であつたことに注目することが大切である。これは、
我々が細胞により引きつけさせる表面のある種の非特異
的改良をさせなくする。この意見は、我々がこれら表面
への異なるペプチドの結合が類似し、しかもペプチドIV
のみが細胞の付着に有効なことを示すことができたこと
によつて一層強められた。その上、このペプチドは特異
な高活性を有した。架橋剤で誘導したアルブミンがペプ
チドのポリスチレン表面への結合の媒介に使用されたと
き、ペプチドIVはモルを基準にしてそのままのフイブロ
ネクチン自体と殆んど同じ位活性であつた。ペプチドIV
がポリスチレンのマイクロタイター縦穴の直接被覆に使
用されたとき、細胞付着の促進においてそのままのフイ
ブロネクチンで見られるものと同一の効果を得るために
は、約１．０倍のモル量を必要とした。これは、結合の
結果として機能のそう失のためであるか、或いは大きな
フイブロネクチン分子に比較してこのペプチドのポリス
チレンへの結合の相対的な非効率または可逆性を反映す
るものであろう。

フイブロネクチンの細胞付着場所と相互に作用する細胞
表面における成分（受容体）の性質は知られていない。
ここに、開示されたデータは、個々の細胞表面受容体ま
たは受容体の類が存在することを強く示唆している。合
成ペプチドまたは活性の場合その短い誘導体はこの受容
体の同定に有効である。ペプチドIVのプロリン残基Ｎ
ｏ．１０の周囲の親水性部分におけるペプチド鎖に曲が
り（ねじれ）が予測される。これは細胞との相互作用に
利用されるループをもたらす。次の実験は後で論議する
ようにこの結果を確認した。

十分に理解されない理由であるが、フイブロネクチンの
細胞付着機能の発現はフイブロネクチンがプラスチツク
の表面やコラーゲンのマトリツクスのような固相に結合
された細胞に提供されることが必要であるが、可溶性の
フイブロネクチンは細胞へ分離自在に結合しない。可溶
性ペプチドIVが細胞の固定されたペプチドIVまたはフイ
ブロネクチンへの付着を阻止しないことにおいてペプチ
ドIVは同様に振舞う。生産的な相互作用には細胞表面と
いくつかのフイブロネクチン分子との共同結合が必要の
ようである。細胞表面にさらに強く結合するこのペプチ
ドの類似体を作ることが可能であろう。これはフイブロ
ネクチンに対する細胞表面受容体の同定を促進するのみ
ならず、細胞付着を変えさせるであろう。

周囲の組織との結合を促進するために最適の細胞培養お
よび種々の補綴物質用の表面調製のような実際的な応用
ももくろむことができる。３０のアミノ酸のペプチドは
１つ以上の結合場所を有するようであるから、今扱うこ
とができる問題の１つは、フイブロネクチンと全ての種
類の細胞との相互作用がこの同一領域の分子を含むか否
かである。例えば、血小板はそれらの表面に異なるメカ
ニズムによつてフイブロネクチンを結合する。これは、
このペプチドを細胞付着の調節に使用すること、または
補綴物質の設計において重要な部分である。それは、生
体内においてフイブロネクチンのはたす役割も明らかに
するであろう。

産業上の利用可能性 培養基質の細胞付着ポリペプチドでの被覆は媒質にフイ
ブロネクチンの使用を不要にし、従つて培養の条件をよ
り良好に規定すると共に、再現性を良好にする。細胞付
着表面の商的使用の１例として、フアラマシア社で製造
されたシトデツクス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）粒子はゼラチン
で被覆される。それによつて同数の付着性細胞を皿内で
可能な体積よりも著しく小さい体積で成長させることを
可能にする。これらビードの活性は一般に成長媒質にお
けるフイブロネクチンの使用に依存する、そして細胞付
着ポリペプチドはそのような目的に対して優れた化学的
に規定された被覆を提供することが期待される。

生体内で細胞を表面に引き付けたり、或いは移植前に特
定の表面に所望の細胞の成長を促進さすような基質を使
用させる医用装置を設計することができる。そのような
方法の例は、一般にポリエステル繊維、特にダクロン繊
維（ポリエチレン・テレフタレート）から織るまたは編
んだ補綴血管または空胞皮片に内皮細胞の成長を誘導す
る方法である。殆んどの種類の細胞はフイブロネクチン
およびこのポリペプチドに引き付けられるが、特に内皮
細胞およびフイブロブラスト細胞はフイブロネクチンに
引き付けられる。後者の事項は、事故や手術の傷口の閉
鎖およびゆ合を助けるためにパツチ移植皮片などの被覆
においてこの規定されたポリペプチドの潜在的な有用性
を示す。そのような場合、コラーゲン、グリコサミノグ
リカンまたはプリテオグリカンのような生物学的分子の
ペプチドを結合するのが有利である。例えば、Ｃ−末端
にＣｙｓ残基を有する３０−残基フラグメントを単量体
コラーゲンに結合する。これは、３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオン酸・Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステルのような架橋剤を使用して、システインをコラー
ゲンのリシン残基に橋かけすることによつて行うことが
できる。また、それは、一時的または半永久的に体内、
例えば血管または腹膜腔内に挿入する目的の補綴器具
（経皮器具とも呼ばれる）の表面を被覆することにおい
てその価値を示す。本発明は、例えば細胞付着の促進に
塗布される点眼液またはローシヨン、または軟膏或いは
ゲルのような液体の形、または他の便利な形にされる。
フイブロネクチンはフイブロブラストおよびマクロフア
ージに対して走化性であるように示された。この活性は
細胞付着ドメインの存在に関係する。ここに記載した合
成ペプチドおよびその類似特性のフラグメントの細胞付
着活性の明示は走化性（又は化学走性）、活性である。

以上、本発明を２、３の望ましい実施態様に関して説明
したが、当業者には明らかなように請求の範囲に限定さ
れている発明の範囲を逸脱することなく種々の変化およ
び改良が可能であることを理解されたい。例えば、他の
基によつてアミド化または置換されるように、Ｃ−末端
に遊離酸を有する必要がない。本発明の特徴は次の請求
の範囲において強調される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ル−スラチ・エルキ・アイ アメリカ合衆国カリフオルニア州92024オ リ−ベンハイン・ビア・デル・セリト262

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】細胞付着活性を有するポリペプチドであっ
   て、以下に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド： Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ− Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ。
2. 【請求項２】基質表面への細胞付着を促進させる方法で
   あって、該基質表面に細胞付着活性を有するポリペプチ
   ドを付着させることを包含し、 該ポリペプチドが、以下に示すアミノ酸配列を有する、
   方法： Ｈ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ− Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ− Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ。
3. 【請求項３】前記基質表面が補綴器具の表面である、請
   求の範囲第２項に記載の方法。
4. 【請求項４】前記基質表面が合成樹脂繊維の表面であ
   る、請求の範囲第２項に記載の方法。
5. 【請求項５】前記基質表面が経皮器具の表面である、請
   求の範囲第２項に記載の方法。
6. 【請求項６】前記基質が固体基質である、請求の範囲第
   ２項に記載の方法。
7. 【請求項７】前記固体基質がガラス、合成樹脂または長
   鎖の多糖類である、請求の範囲第６項に記載の方法。
8. 【請求項８】前記固体基質が合成樹脂である、請求の範
   囲第７項に記載の方法。
9. 【請求項９】前記固体基質がニトロセルロースまたはポ
   リエステルである、請求の範囲第８項に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記固体基質がアガロースである、請求
    の範囲第６項に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記ポリペプチドがコラーゲンに結合さ
    れた形で前記基質に付着される、請求の範囲第２項に記
    載の方法。
12. 【請求項１２】前記基質が管移植皮片であり、前記ポリ
    ペプチドは該管移植皮片に結合された形で付着し、その
    一部分を形成する、請求の範囲第２項に記載の方法。
13. 【請求項１３】前記ポリペプチドが液体、ローション、
    軟膏またはゲルの形で前記基質に付着される、請求の範
    囲第２項に記載の方法。